штамм бактерий bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, обладающий инсектоакарицидной активностью против представителей отрядов lepidoptera, coleoptera, homoptera, thysanoptera и acariformes

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki ВКПМ B-8715, обладающий инсектоакарицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологиии, а именно к производству бактериальных биопрепаратов, предназначенных для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур, являющихся представителями отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes.

Эффективная борьба с вредителями играет важную роль в сохранении и увеличении урожая, поскольку потери сельскохозяйственной продукции, связанные с жизнедеятельностью насекомых-вредителей, составляют до 30% от ожидаемого урожая.

В настоящее время для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур широко применяют химические препараты. Длительное использование последних привело к формированию устойчивых к этим препаратам популяций вредителей [1]. Кроме того, химические препараты токсичны для теплокровных животных и полезных насекомых, а также способны проникать в растения, что ухудшает санитарно-гигиенические показатели сельскохозяйственной продукции. Наиболее широко применяемым из химических препаратов является карбофос.

Все возрастающую роль в защите растений от сельскохозяйственных вредителей играют биологические методы борьбы с использованием препаратов, полученных на основе вирусных, бактериальных и грибных патогенов или синтезируемых ими продуктов. Преимущество большинства известных микробиологических средств защиты растений по сравнению с химическими - их экологическая безопасность.

Наиболее широко в качестве микробиологических средств защиты растений используют продукты на основе различных штаммов энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis. Эти бактерии при споруляции синтезируют кристаллические белки, или, как их еще называют, дельта-эндотоксины, отличающиеся между собой по спектру энтомопатогенного действия [2]. Дельта-эндотоксины обладают избирательным токсичным действием только по отношению к насекомым.

Некоторые штаммы Bacillus thuringiensis продуцируют еще и термостабильный экзотоксин, который, в отличие от эндотоксина, не обладает избирательностью и проявляет токсичность в отношении очень широкого круга беспозвоночных и позвоночных животных, вызывая также аллергические реакции у лиц, работающих с этими препаратами [3].

Альтернативным направлением является использование продуцентов Bacillus thuringiensis, не синтезирующих термостабильный экзотоксин. На их основе созданы такие биопрепараты как DIPEL (США), лепидоцид (РФ), Novodor (США), Колорадо (РФ). Препараты DIPEL (США) и лепидоцид (РФ) эффективны против большого числа представителей отряда чешуекрылых (Lepidoptera), однако не обладают инсектицидной активностью против представителей отряда жесткокрылых (Coleoptera). В отличие от них препараты Novodor (США), Колорадо (РФ) эффективны только против представителей отряда жесткокрылых (Coleoptera).

Известны штаммы Bacillus thuringiensis, которые обладают инсектицидной активностью против представителей как отряда Coleoptera, так и отряда Lepidoptera [4, 5]. Однако они не токсичны для представителей отрядов Homoptera, Thysanoptera(инсектицидная активность) и Acariformes (акарицидная активность).

Представители этих отрядов (тли, трипсы, растительноядные клещи) имеют трансконтинентальное распространение и являются опасными вредителями многих экономически значимых культур: зерновых, зернобобовых, овощных, плодово-ягодных, а также наносят вред хлопчатнику, лесным, декоративным и лекарственным насаждениям.

Задача заявляемого изобретения - получить штамм бактерий Bacillus thuringiensis, обладающий как инсектицидной, так и акарицидной активностью.

Задача решена путем получения штамма бактерий Bacillus thuringiensis, обладающего инсектоакарицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes.

Заявляемый штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715.

Он получен в результате скрещивания методом Гонзалеса [6] двух родительских штаммов Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-1226 и Bac.thuringiensis ssp.tenebrionis ВКПМВ-5081.

Штамм ВКПМ В-8715 имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки размером 4,1-1,6 мкм. В стационарной фазе роста образуют кристаллы эндотоксинов и овальные споры.

Хорошо растет на гидролизатах казеина (панкреатический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,2, MnSO₄,- 0,5, MgSO₄ - 3, KH₂ PO 4-0,1, глюкоза - 0,6, вода - остальное, рН среды - 7,4-7,5, состав среды в мас.%) при 27-29°С и рН 6,8-7,5. На агаризованной среде казеина (панкреатический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, хлористый натрий - 0,05, агар - 1,5, вода - остальное, рН среды - 7,4-7,5, состав среды в мас.%) на 10 сутки при 27-29°С образует однородные колонии 3-5 мм в диаметре, светло-серого цвета со слабо изрезанным краем. Структура мелкозернистая.

По Н-антигену относится к сероварианту III (3а3в).

При культивировании штамма как в жидких, так и на твердых питательных средах выхода фага не наблюдается.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: усваивает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку. Не усваивает лактозу, ксилозу, арабинозу, лецитин. Пептонизирует молоко, гидролизует крахмал, желатину не разжижает.

Отношение к источникам азота: восстанавливает нитраты, усваивает аммонийные формы азота.

Отношение к температуре: хорошо растет при 27-29°С, оптимальная температура 28°С.

Отношение к рН среды: хорошо растет при 6,8-7,5, оптимум рН-7,2.

Отношение к кислороду: аэроб.

Отношение к фагам: устойчив к основным производственным фагам П, 22, С/П, И-77, 25-16.

Бета-экзотоксин не синтезирует.

Не патогенен для человека, домашних и диких животных, полезных насекомых, птиц и рыб.

Не является генетически модифицированным штаммом.

Заявляемые свойства: синтезирует компоненты, обладающие инсектоакарицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes.

Маркерные признаки: активность против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes, отсутствие способности синтезировать бета-экзотоксин.

Хранение штамма: штамм хранят в ампулах после лиофилизации спорокристаллической смеси обычным способом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Технологические характеристики заявляемого штамма.

Оценку заявляемого штамма на лабораторных питательных средах проводили по двум основным параметрам, а именно титру спор и концентрации основного инсектицидного белка (дельта-эндотоксина) в сравнении с родительскими штаммами.

Для этого штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715, а также родительские штаммы (ВКПМ В-1226 и ВКПМ В-5081) выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 200 мл до стадии полной споруляции на круговой качалке при 28°С и встряхивании 250 об/мин. Для выращивания использовали среды следующего состава (мас.%):

1. Среда №1:
	панкреатический гидролизат казеина -1,
	дрожжевой экстракт - 0,2,
	MnSO4, - 0,5
	MgSO 4 - 3,
	KH2PO4 - 0,1
	глюкоза - 0,6,
	вода - остальное
	рН среды - 7,4-7,5

2. Среда №2:
	триптический гидролизат казеина -1,
	дрожжевой экстракт - 0,2,
	MnSO4, - 0,5
	MgSO 4 - 3,
	KH2PO4 - 0,1
	глюкоза - 0,6,
	вода - остальное
3. Среда №3:	рН среды - 7,4-7,5
	пептон - 1,
	дрожжевой экстракт - 0,2,
	MnSO 4, - 0,5
	MgSO4 - 3,
	КН2РО 4 - 0,1
	глюкоза - 0,6,
	вода - остальное
	рН среды - 7,4-7,5

Выращенную культуру отделяли центрифугированием и отмывали 1М NaCl в присутствии 0.001М ЭДТА. Кристаллические белки из спорокристаллической смеси растворяли в карбонатном буфере рН 11,0 в течение часа, не растворившийся осадок отделялся центрифугированием, рН надосадочной жидкости доводили до 10,0. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [7], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Полноту растворения контролировали повторной экстракцией в том же буфере. При повторной экстракции растворялось не более 7% белка. Определение титра жизнеспособных спор проводили на чашках Петри с агаризованной средой следующего состава (мас.%)

панкреатический гидролизат казеина -1,

дрожжевой экстракт - 0,5,

хлористый натрий - 0,05

агар- 1,5

вода - остальное

рН среды - 7,4 - 7,5

Результаты исследований приведены в таблице 1:

Таблица 1.
Питательные среды	Среда №1:			Среда №2:			Среда №3:
Штаммы	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ
Bacillus	В-8715	В-1226	В-5081	В-8715	В-1226	В-5081	В-8715	В-1226	В-5081
thuringiensis
Титр спор, ×108 на мл	5	6	4	2	1	1,6	3	1	1
Концентрация белка (мг/мл)	0,3	0,1	0,03	0,4	0,1	0,03	0,3	0,1	0,05

Как следует из таблицы 1, заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 на трех исследованных лабораторных питательных средах превосходит исходные родительские штаммы как по титру спор, так и по концентрации основного инсектицидного белка, дельта-эндотоксина.

Оценку заявляемого штамма на промышленной питательной среде проводили по параметру - микробиологическая продуктивность (титр спор).

Для подготовки посевного материала заявляемый и родительские штаммы выращивали в 2 мл среды №1 в течение 12 часов при 28°С, как было описано выше. Затем 1 мл микробной культуры засевают в колбы емкостью 750 мл с объемом среды выращивания 50 мл дрожже-полисахаридной среды (ДПС) следующего состава (мас.%): дрожжи кормовые - 36, кукурузная мука - 26,8, соевая мука - 5,0, мел - 3,0, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,5 и культивировали на круговой качалке до стадии полной споруляции. Определение титра жизнеспособных спор проводили на чашках Петри с агаризованной средой как описано выше.

Таблица 2.
Штаммы Вас. thuringiensis	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ
	В-1226	В-5081	В-8715
Микробиологическая	4,3	4,0	4,6
продуктивность
(млрд. сп./мл)

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что продуктивность заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 на промышленной среде выше продуктивности исходных родительских штаммов и превосходит продуктивность штаммов-продуцентов промышленного препарата «Лепидоцид», составляющую 3,5-4 млрд спор /мл [8] и промышленного препарата «Колорадо», составляющую 2-3 млрд спор /мл [9].

ПРИМЕР 2. Оценка инсектоакарицидной активности заявляемого штамма.

Определение токсичности заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 для представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes проводили в лабораторных условиях.

Заявляемый штамм ВКПМ В-8715 и контроль (родительские штаммы) выращивали до стадии полной споруляции как в примере 1 на среде 1.

Оценку инсектицидной активности для представителей отряда Lepidoptera проводили на двух объектах: гусеницах непарного шелкопряда Lymantria dispar 2 возраста и гусеницах мельничной огневки Galleria mellonella 7 возраста.

Гусениц непарного шелкопряда выращивали из хранящихся в холодильной камере при температуре +4°С яйцекладок на среде следующего состава (мас.%):

Семена фасоли набухшие	72
Дрожжи пивные сухие	5,4
Агар	5,4
Бумага фильтровальная мелко нарезанная	2
Сахароза	4
Калий фосфорно-кислый двузамещенный	1,4
Аскорбиновая кислота	1,4
Масло льняное	0,7
Бензойная кислота + спирт	3,5
Формалин (40%)	1,8
КОН	1,4
Лист дуба сухой (измельченный)	1

При биотестировании 3 г среды смешивали с 1 мл испытуемой суспензии споро-кристаллической смеси (дважды отмыты физраствором), и хорошо растирали смесь в фарфоровой ступке с помощью пестика. Полученную смесь шпателем переносили на крышку чашки Петри и размещали в виде кольца диаметром около 3 см. Внутрь этого кольца сажали по десять гусениц. На дно чашки Петри помещали диск фильтровальной бумаги. Каждый образец суспензии испытывали в 3-х параллельных повторностях. Эксперимент проводили при комнатной температуре и естественном освещении. Число погибших насекомых подсчитывали на 6-й день.

Смертность в опыте с Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis ВКПМ В-5081 составила 10%, для заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 - 58%, а для Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-1226 - 100%. Из этого следует, что для непарного шелкопряда инсектицидная активность заявляемого штамма значительно превосходит активность одного из родительских штаммов Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis ВКПМ В-5081, но уступает активности другого родительского штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-1226.

Оценку инсектицидной активности против мельничной огневки (Galleria mellonella) проводили методом подсадки личинок мельничной огневки в чашки Петри с кормом (мерва + пшеничные отруби).

Корм расфасовывали в чашки Петри (по 9 г в каждую), в которые вносили по 3 мл препарата.

В каждую чашку Петри (после подсыхания корма) подсаживали по 10 гусениц огневки 7 возраста (массой 75±5 мг) в трех повторностях. Чашки Петри с гусеницами содержали на лабораторных столах при температуре воздуха 25±20°С и относительной влажности воздуха 60-80%. Гибель гусениц подсчитывали на 6 сутки.

Смертность в опыте с родительским штаммом Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis ВКПМ В-5081 составила 3,3%, для заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 - 26,7%, а для другого родительского штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-1226 - 63,3%. Инсектицидная активность для гусениц мельничной огневки у заявляемого штамма значительно превосходит активность штамма ВКПМ В-5081 и уступает ВКПМ В-1226.

Заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 обладает инсектицидной активностью для представителей отряда Lepidoptera, сопоставимой с таковой у известных штаммов Bacillus thuringiensis [8].

Оценку инсектицидной активности заявляемого штамма ВКПМ В-8 715 для представителей отряда Coleoptera проводили на личинках колорадского жука Leptinotarsa decemlineata и мучного хрущака Tenebrio molitor L.

Личинок колорадского жука младшего возраста (2 и начало 3 возраста) подсаживали в чашки Петри с листьями картофеля, обработанными путем погружения в растворы препаратов. В таблице 3 приведены результаты учета гибели личинок колорадского жука на 5-е сутки.

Таблица 3.
Штаммы	Смертность
Bacillus thuringiensis	(%)
	2-3 возраст
ВКПМВ-5081	25,1
ВКПМ В-8715	92,5
ВКПМ В-1226	10

Заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 значительно превосходит по своей инсектицидной активности против личинок колорадского жука исходные родительские штаммы. Статистическая обработка результатов, проведенная с помощью компьютерной программы пробит-анализа, позволила нам вычислить ЛК₅₀ заявляемого штамма ВКПМ В-8715 на 4 сутки эксперимента. Величина ЛК₅₀ составила 0,04% КЖ, что значительно превосходит этот показатель у других штаммов Bacillus thuringiensis [5,9].

С целью оценки инсектицидной активности заявляемого штамма ВКПМ В-8715 для личинок мучного хрущака проверяли инсектицидную активность спорокристаллических комплексов заявляемого штамма и родительских штаммов путем применения их в качестве добавок к питательной среде для личинок 1-11 возраста. Личинки предварительно голодали 24 ч. Каждую водную суспензию смешивали с молотым геркулесом из расчета 3 мл исходной суспензии на 3 г геркулесовой муки. Полученную однородную смесь разделяли на 3 приблизительно равные части, каждую из которых разминали до состояния тонкой лепешки в пластмассовой чашке Петри. В каждую чашку Петри на влажную лепешку сразу же помещали по 16 экспериментальных личинок (в целом 48 личинок). Чашки накрывали крышками с вентиляционными отверстиями и инкубировали в термостате при температуре 27°С. Через сутки и далее на протяжении 15 суток с разными интервалами проверяли состояние личинок и пищевого субстрата. Последний по мере его высыхания измельчали. Регистрировали суммарную смертность личинок на протяжении опыта. В таблице 4 приведены результаты учета гибели личинок мучного хрущака на 19-е сутки.

Таблица 4.
Штаммы	Смертность
Bacillus thuringiensis	(%)
	1-2 возраст
ВКПМВ-5081	10
ВКПМ В-8715	100
ВКПМВ-1226	16,7

Заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 по своей активности против личинок мучного хрущака значительно превосходит родительские штаммы. Другие штаммы Bacillus thuringiensis [4, 5, 8, 9] не активны для личинок мучного хрущака.

Сравнительную оценку инсектоакарицидной активности заявляемого штамма против представителей отрядов Homoptera, Thysanoptera и Acariformes проводили на трех объектах: бахчевая тля, западный цветочный трипе и паутинный клещ.

Для тест-объектов в лабораторных условиях использовали метод погружения растений-хозяев в растворы культуральной жидкости со спорами и кристаллами исследуемых штаммов, полученные после окончания споруляции как в примере 1 на среде выращивания 1.

Для бахчевой тли (Aphis gossypii Glov., Homoptera) срезанные листья огурца погружали в растворы испытуемых образцов на 6 секунд, после чего их помещали на влажную фильтровальную бумагу в чашку Петри и заселяли самками тли.

Для западного цветочного трипса (Frankliniella occidentalis Pergande, Thysanoptera) использовали двухлистковые растения фасоли. За 7 дней до опыта на растения самки трипса откладывали яйца. После отрождения личинок растения срезали и листьями погружали в растворы испытуемых образцов на 6 секунд, после чего устанавливали в стаканы с водой, подставляя под черешки пластмассовые кружки, обмазанные по краям вазелином.

В случае обыкновенного паутинного клеща (Tetranychus urticae Koch, Acariformes) срезанные двухлистковые растения фасоли за сутки до опыта заселяли самками клеща. Растения погружали в растворы препаратов на 6 секунд и устанавливали в сосуды с водой.

Результаты гибели тест-объектов на 5-е сутки приведены в таблице 5.

Таблица 5.
Штаммы
Bacillus thuringiensis	ВКПМВ-5081	ВКПМ В-8715	ВКПМ В-1226
Бахчевая тля Смертность (%)	12,8	59,2	17,4
Паутинный клещ Смертность (%)	21,7	91,45	23,6
Западный цветочный трипе	12,4	53,3	9,4
Смертность (%)

Как следует из результатов, представленных в таблице 5, заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 по инсектоакарицидной активности против представителей отрядов Homoptera, Thysanoptera и Acariformes более чем в четыре раза превосходит исходные родительские штаммы. Другие штаммы Bacillus thuringiensis [4, 5, 8, 9] не активны против этого вида вредителей.

ПРИМЕР 3. Оценка токсичности заявляемого штамма в полевых условиях.

Оценку токсичности заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 в полевых условиях проводили для представителей отрядов Homoptera и Thysanoptera.

Заявляемый штамм ВКПМ В-8715 выращивали до стадии полной споруляции как в примере 1 на среде 1.

В каждом варианте опыта было по 100 растений. Доза биопрепарата во всех опытах составляла 4,1×10 ⁸ спор/мл. Обработку проводили ранцевым опрыскивателем. Перед обработкой определяли численность тлей и трипсов на каждом растении. Чтобы избежать естественных миграции тлей и трипсов учетные растения в естественных условиях покрывали плотномарлевыми мешочками. Через 3, 5, 7 и 10 дней учитывали количество погибших и живых особей. Повторность каждого варианта 4-кратная. Количество тлей и трипсов подсчитывали лупой при 10-кратном увеличении. В таблице 6 приведены результаты испытаний заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 в сравнении с наиболее широко применяемым химическим препаратом карбофосом (50% концентрат эмульсии).

Таблица 6.
№	Название вариантов	Численность вредителя на 10 растений (в абсолютных числах) до обработки	Средняя численность живых насекомых в (%) к предварительному учету, по дням учета
			3	5	7	10
Опыт с хопчатником. Хлопковая тля (Aphis gossypii, Homoptera)
1.	Контроль вода	173	146	262	360	510
2.	Карбофос - 50% к. эм. 0,7 л/га	165	0,4	0,9	6,5	9,2
3.	ВКПМ В-8715	194	24,0	17,1	11,2	10,3
Опыт с хопчатником. Табачный трипс (Thrips tabaci Lind, Thysanoptera)
1.	Контроль вода	82	116	124	161	186
2.	Карбофос - 50% к.эм. 0,7 л/га	91	1,1	2,6	8,4	14,6
5.	ВКПМ В-8715	68	48,7	43,1	32,1	26,0
Опыт с лимоном. Бахчевая тля (Aphis gossypii Glov, Homoptera).
1	Контроль - вода	248	161	174	216	345
2.	Карбофос, 50% к.эм. 0,7 л/га	265	1,9	2,6	8,9	13,4
3.	ВКПМ В-8715	202	33,4	26,8	20,3	14,6
Опыт с розой. Персиковая тля (Myzodes persicae, Homoptera).
1.	Контроль-вода	86	147	192	240	316
2.	Карбофос - 50% к.эм. 0,7 л/га	106	2,6	3,1	7,9	11,6
3.	ВКПМ В-8715	116	29,8	17,6	11,4	6,8

Как следует из таблицы 6 токсичность заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 для трипсов (отряд Thysanoptera ) незначительно уступает, а для тлей (отряд Homoptera) на 10 сутки практически соответствует токсичности химического препарата карбофоса.

Таким образом впервые получен штамм бактерий Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715, обладающий инсектоакарицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes.

Результаты опытов с использованием штамма в полевых условиях показывают, что заявляемый штамм по токсичности против вредителей сельскохозяйственных культур из отрядов Homoptera и Thysanoptera может успешно конкурировать с химическим препаратом карбофос на таких экономически значимых культурах, как хлопок, табак и розы.

Источники информации:

1. National Research Council. 1986. Pesticide reistance: strategies and tactics for management. National Academy of Sciences, Washington, D.C.

2. Crickmore, N., Zeigler, D.R., Feitelson J., Schenepf, E., van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J. and Dean, D.H. 1998. Revision of the nomenclature for Bacillus thuringienis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813.

3. McConnell, E. and Richards, A.G. 1959. The production by Bacilllus thuringiensis Berliner of a heat-stable exotoxin toxic to insects. Can. J. Microbiol. 5: 161-168.

4. USA patent 6156308.

5. Патент РФ №2125091.

6. Gonzalez, J.M., Brown, B.J. and Carlton, B.C. 1982. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for delta endotoxin among strains of B. thuringiensis and B. cereus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:6951-6955.

7. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 72:248-254.

8. Патент РФ №2080065

9. Патент РФ №2204598