рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез дельта-эндотоксина cry iiia, и штамм bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, полученный на основе рекомбинантной плазмидной днк

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК размером 8,1 т.п.н., включающая полную последовательность плазмиды pUC19 размером 2,7 т.п.н., которая содержит сайты расщепления эндонуклеазой EcoRI, сайты расщепления эндонуклеазой PstI, сайт расщепления эндонуклеазой Bam HI, сайт расщепления HindIII, сайт расщепления эндонуклеазой KpnI, отличающаяся тем, что имеет в своем составе

a) ген устойчивости к эритромицину (ErmC), клонированный с помощью праймеров

5'-TTATCTGCAGTCGGCGTATGTTATTCAAGA-3'

5'-AATAAAGCTTGTAACCAGTCCGTCCAC-3',

b) последовательность фрагмента ДНК В. thuringiensis subsp. tenebrionis 2,9 т.п.н., кодирующего синтез -эндотоксина cryIIIA, клонированную с помощью праймеров

5'-TTATGGATCCGGACGGACTCTACCTCA-3' и

5'-ACAAGGTACCAGAGAAATACACGAGGGC-3',

c) последовательность фрагмента ДНК хромосомы В. thuringiensis subsp. kurstaki размером 448 п.н., клонированную с помощью праймеров

5'-TCTCCTGCAGTCTTCTGGTGGTACAGCAT-3' и

5'-AATCGGATCCCCATGCACCTTCTACTTGAT-3',

d) последовательность фрагмента ДНК хромосомы В. thuringiensis subsp. kurstaki размером 501 п.н., клонированную с помощью праймеров

5'-AGATGGTACCGGTGTTACGAATTGGGACGA-3' и

5'-ATGTGAATTCAATACATAATGAGTCGCTTGA-3',

при этом сайты расщепления эндонуклеазой EcoRI имеют и координаты 5,8; 6,4 и 7,7 т.п.н.; сайты расщепления эндонуклеазой PstI - 3,9 и 4,9 т.п.н.; сайт расщепления эндонуклеазой Bam HI - 4,3 т.п.н.; сайт расщепления эндонуклеазой HindIII - 2,2 т.п.н.; а сайт расщепления эндонуклеазой KpnI - 7,2 т.п.н.

2. Штамм Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki ВКПМ B-8831, полученный на основе рекомбинантной плазмидной ДНК по п.1, предназначенный для получения препарата, обладающего инсектоакарицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Homoptera.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генной инженерии а биотехнологии, а именно к производству бактериальных биопрепаратов, предназначенных дня борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур, являющихся представителями отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Homoptera.

Эффективная борьба с вредителями играет важную роль в сохранении и увеличении урожая. Наиболее широко в качестве микробиологических средств защиты растений используют продукты на основе различных штаммов энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis. Эти бактерии при споруляции синтезируют кристаллические белки, или дельта-эндотоксины, отличающиеся между собой по спектру энтомопатогенного действия [2]. Дельта-эндотоксины обладают избирательным действием и токсичны только по отношению к насекомым.

Некоторые штаммы Bacillus thuringiensis продуцируют еще и термостабильный экзотоксин, который в отличие от эндотоксина не обладает избирательностью и проявляет токсичность в отношении широкого круга беспозвоночных и позвоночных животных, вызывая также аллергические реакции у лиц, работающих с этими препаратами [3].

Известны штаммы, обладающие инсектицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera и Coleoptera [4, 5], но не активные против представителей отряда Homoptera. Рекомбинантный штамм IPM-37, содержащий плазмиду pTV241, обладает активностью против представителей Lepidoptera и Coleoptera [5], но не отряда Homoptera. и, кроме того, синтезирует термостабильный бета-экзотоксин. Рекомбинантный штамм IPM-37 сконструирован на основе плазмиды pTV241, которая не позволяет получать штаммы, относящиеся к категории генетически модифицированных штаммов, поскольку такие штаммы несут признак устойчивости к антибиотику (хлорамфениколу) и по этой причине опасны для дальнейшего применения в промышленности и сельском хозяйстве.

Большинство представителей отряда Homoptera имеют трансконтинентальное распространение и являются опасными вредителями многих культур: зерновых, зернобобовых, овощных, плодово-ягодных и лекарственных растений.

Задача изобретения - расширить арсенал штаммов Bacillus thuringiensis, обладающих широким спектром инсектицидной активности и предназначенных для получения препарата, обладающего инсектицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Homoptera

Задача решена путем

1) конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК (pVGD), содержащей ген, ответственный за синтез дельта-эндотоксина cry III А у бактерий Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis

2) получения на основе сконструированной плазмиды рекомбинантного штамма бактерий Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, обладающего инсектицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Homoptera.

Заявляемая рекомбинантная плазмидная ДНК (pVGD) обеспечивает встраивание и экспрессию гена дельта-эндотоксина cryIIIA Bacillus thuringiensis ssp.tenebrionis ВКПМ В-5081, ответственного за синтез дельта-эндотоксина против представителей отряда Coleoptera в хромосому бактерий Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki штамма ВКПМ В-1226, обладающего инсектицидной активностью против представителей отряда Lepidoptera.

Плазмида размером 8,1 т.п.н. включает в себя следующие конструктивные элементы:

- полную последовательность векторной плазмиды pUC19 размером 2,7 т.п.н;

- последовательность фрагмента ДНК В.thuringiensis subsp. tenebrionis размером 2,9 т.п.н., кодирующею синтез -эндотоксина cryIIIA;

- последовательность фрагмента ДНК В.thuringiensis subsp. kurstaki размером 448 п.н.;

- последовательность фрагмента ДНК В.thuringiensis subsp. kurstaki размером 501 п.н.;

- ген устойчивости к эритромицину (ErmC);

- сайты расщепления эндонуклеазой EcoRI с координатами 5,8; 6,4 и 7,7 т.п.н.;

- сайты расщепления эндонуклеазой PstI с координатами 3,9 и 4,9 т.п.н.;

- сайт расщепления эндонуклеазой Barn HI с координатой 4,3 т.п.н.;

- сайт расщепления эндонуклеазой HindIII с координатой 2,2 т.п.н.;

- сайт расщепления эндонуклеазой Kpnl с координатой 7,2 т.п.н.

Заявляемый рекомбинантный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Bacillus thuringiensis T-11 ВКПМ В-8831.

Штамм ВКПМ В-8831 имеет следующие характеристики:

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки размером 4,1-1,6 мкм. В стационарной фазе роста образуют кристаллы эндотоксинов и овальные споры.

Хорошо растет на гидролизатах казеина (панкреатический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,2, MnSO₄ - 0,5, MgSO₄ - 3, KH₂ PO₄ - 0,1, глюкоза - 0,6, вода - остальное, рН среды - 7,4-7,5, состав среды, мас.%: при 27-29°С и рН 6,8-7,5. На агаризованной среде казеина (панкреатический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, хлористый натрий - 0,05, агар - 1,5, вода - остальное, рН среды - 7,4-7,5, состав среды в мас.%) на 10 сутки при 27-29°С образует однородные колонии 3-5 мм в диаметре, светло-серого цвета со слабо изрезанным краем. Структура мелкозернистая.

По Н-антигену относится к сероварианту III (3а3в).

При культивировании штамма как в жидких, так и на твердых питательных средах выхода фага не наблюдается.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: усваивает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку. Не усваивает лактозу, ксилозу, арабинозу, лецитин. Пептонизирует молоко, гидролизует крахмал, желатину не разжижает.

Отношение к источникам азота: восстанавливает нитраты, усваивает аммонийные формы азота.

Отношение к температуре: хорошо растет при 27-29°С, оптимальная температура 28°С.

Отношение к рН среды: хорошо растет при 6,8-7,5, оптимум рН - 7,2. Отношение к кислороду: аэроб.

Отношение к фагам: устойчив к основным производственным фагам П, 22, С/П, И-77, 25-I6.

Бета-экзотоксин не синтезирует.

Не патогенен для человека, домашних и диких животных, полезных насекомых, птиц и рыб.

Решением экспертной комиссии при ВКПМ депонированный штамм не является генетически модифицированным штаммом.

Заявляемые свойства: синтезирует инсектицидные компоненты, обладающие активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Homoptera.

Маркерные признаки: Н-антиген ЗаЗв, штамм обладает инсектицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Homoptera, термостабильный бета-экзотоксин не синтезирует.

Хранение штамма: штамм хранят в ампулах после лиофилизации спорокристаллической смеси обычным способом.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графического изображения.

Фиг.1 - клонирование левого участка, гомологичного хромосоме Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki.

Фиг.2 - клонирование правого участка, гомологичного хромосоме Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki.

Фиг.3 - клонирование гена, кодирующего устойчивость к эритромицину

Фиг.4 - плазмида pVGD.

Фиг.5 - схема гомологичной рекомбинации.

Изобретение подтверждено следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Конструирование плазмиды pVGD.

Все этапы конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК проводили в Е. coli, с использованием стандартных методик [6]. За основу взята плазмида pUC19 и четыре функциональных участка ДНК.

Сконструированная плазмида pVGD (фиг.4), содержит ген CryIIIA, ген устойчивости к эритромицину ErmC для отбора в Bacillus thuringiensis, и два фрагмента Left region. Right region гомологичные участку хромосомы Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, вблизи PLC гена. Эти два участка необходимы для рекомбинации между плазмидой и хромосомой.

На первом этапе проведено клонирование левого (Left region) (фиг.1), а затем правого (Right region) (фиг.2), участков гомологичных хромосоме Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, вблизи PLC гена.

На втором этапе клонирован ген, кодирующий устойчивость к эритромицину (фиг.3).

На третьем, заключительном этапе осуществлено клонирование гена CryIIIA, ответственного за синтез кристаллического белка дельта-эндотоксина cry III Bacillus thuringiensis ssp. tentbeionis (фиг.4).

Для получения фрагментов ДНК, использованных при клонировании, применена методика ПЦР с праймерами (фирма «Синтол», г.Москва), последовательность которых представлена в таблице 6:

Таблица 6
Праймеры	Последовательность праймеров	Ген
c3a117F	5'-TTATGGATCCGGACGGACTCTACCTCA-3'	CryIIIA
c3a2958R	5'-ACAAGGTACC AGAGAAATACACGAGGGC-3'	CryIIIA
ermC1803F	5'-TTAT CTGCAGTCGGCGTATGTTATTCAAGA-3'	ErmC
ermC3391R	5'-AATAAAGCTTGTAACCAGTCCGTCCAC-3'		ErmC
lh1251F	5'-TCTCCTGCAGTCTTCTGGTGGTACAGCAT-3'		PLC
lh1681R	5'-AATCGGATCCCCATGCACCTTCTACTTGAT-3'		PLC
rh1716F	5'-AGATGGTACCGGTGTTACGAATTGGGACGA-3'		PLC
rh2197R	5'-ATGTGAATTCAATACATAATGAGTCGCTTGA-3'		PLC

Все этапы конструирования плазмиды pVGD подтверждены рестрикционным анализом и методом полимеразной цепной реакции.

ПРИМЕР 2. Получение заявляемого штамма путем трансформации штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ-B 1226 с помощью плазмиды pVGD.

Трансформацию проводили методом электропорации [7] с использованием электропоратора "Bio-Rad Gene Pulser 2" и 1 мм кюветы.

Культуру штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ-B 1226 выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды 100 мл до оптической плотности 0,3-0,4 ОЕ при длине волны 600 нм на круговой качалке (250 об/мин) при 28°С. Использовали среду следующего состава, мас.%: триптический гидролизат казеина - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, MgSO ₄ - 0,5, глюкоза - 0,5, вода - остальное, рН среды - 7,4-7,5.

Клетки отделяли центрифугированием при 4000 g, t=3°C в течение 5 минут и отмывали один раз 1 объемом и два раза 1/10 объема стерильной дистиллированной воды. Затем клетки суспендировали 100 мкл стерильного 10% раствора глицерина и использовали для проведения электропорации со следующими параметрами: 1,5 кВ и 25 мкФ.

После осуществления процесса электропорации клетки помещали в 4 мл жидкой среды, состав которой приведен выше, и выращивали в течение 3 часов на круговой качалке (250 об/мин) при 28°С. Затем клетки осаждали центрифугированием и рассевали на чашки Петри со средой следующего состава, мас.%: триптический гидролизат казеина - 1, NaCl - 1, агар - 1,8, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН среды 7,4-7,5, дополнительно в среду добавляли эритромицин из расчета 10 мкг/мл.

Все 20 полученных клонов анализировали иммунологическим методом [10], с высокоочищенными антисыворотками против дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis ssp.tenebrionis и дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki. Все полученные клоны давали реакцию с обеими антисыворотками, в то время как дельта-эндотоксины ssp.tenebrionisi и ssp.kurstaki давали иммунологическую реакцию только с индивидуальными антисыворотками. Путем последовательной селекции исследуемых клонов на агаризованных средах, содержащих и не содержащих эритромицин, получен клон, утративший способность расти на среде с этим антибиотиком и дающий положительную реакцию с антисыворотками против дельта-эндотоксинов ssp.tenebrionisi и ssp. kurstaki. Это свидетельствует о том, что родоначальником клона явилась клетка, в которой произошла генетическая гомологичная рекомбинация между плазмидой pVGD и хромосомной ДНК-штамма-реципиента (фиг.5).

ПРИМЕР 3. Технологическая характеристика заявляемого штамма на лабораторных и промышленных средах

Оценку микробиологических параметров заявляемого штамма на лабораторных питательных средах проводили по двум основным параметрам, а именно титру спор и концентрации инсектицидного кристаллического белка в сравнении с контрольными штаммами, а именно ВКПМ В -5081 и ВКПМ В-1226.

Для этого штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8831, а также штаммы ВКПМ В-1226 и ВКПМ В-5081 выращивали на круговой качалке (250 об/мин) при 28°С в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 200 мл до стадии полной споруляции. Использовали среду выращивания следующего состава, мас.%: панкреатический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,2, MnSO₄ - 0,5, MgSO ₄ - 3, KH₂PO₄ - 0,1, глюкоза - 0,6, вода - остальное, рН среды - 7,4-7,5.

Выращенную культуру отделяли центрифугированием и отмывали 1М NaCl в присутствии 0.001М ЭДТА. Кристаллические белки из спорокристаллической смеси растворяли в карбонатном буфере рН 11,0 в течение часа, не растворившийся осадок отделялся центрифугированием, рН надосадочной жидкости доводили до 10,0. Концентрацию белка определяли, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта [7]. Полноту растворения контролировали повторной экстракцией в том же буфере. При повторной экстракции растворялось не более 7% белка. Определение титра жизнеспособных спор проводили на чашках Петри с агаризованной средой следующего состава, мас.%: панкреатический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, хлористый натрий - 0,05, агар - 1,5, вода - остальное, рН среды - 7,4-7,5

Результаты исследования микробиологической продукции приведены в таблице 1

Таблица 1
Штаммы Bacillus thuringiensis	ВКПМ В-8831	ВКПМ В-1226	ВКПМ В-5081
Титр спор, ×10 8 на мл	5	6	4
Концентрация белка (мг/мл)	0,3	0,1	0,03

Как следует из таблицы 1, заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ВКПМ В-8831 на лабораторной питательной среде превосходит контрольные штаммы по концентрации кристаллического инсектицидного белка.

Оценку заявляемого штамма на промышленной питательной среде проводили по параметру - микробиологическая продуктивность (титр спор в 1 мл).

Для подготовки посевного материала заявляемый и контрольные штаммы выращивали в 2 мл среды в течение 12 часов при 28°С, как было описано выше. Затем 1 мл микробной культуры засевали в колбы емкостью 750 мл с объемом среды выращивания 50 мл дрожжеполисахаридной среды (ДПС) следующего состава, мас.%: дрожжи кормовые - 36, кукурузная мука - 26,8, соевая мука - 5,0, мел - 3,0, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,5 и культивировали на круговой качалке до стадии полной споруляции. Определение титра жизнеспособных спор проводили на чашках Петри с агаризованной средой, как описано выше. Результаты исследований приведены в таблице 2.

Таблица 2
Штаммы	ВКПМ	ВКПМ	ВКПМ
Bacillus	В-8831	В-1226	В-5081
thuringiensis
Микробиологическая	4,6	4,3	4,0
продуктивность
(млрд. сп./мл)

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что продуктивность заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ВКПМ В-8831 на промышленной среде выше продуктивности контрольных штаммов и превосходит продуктивность штаммов-продуцентов промышленного препарата «Лепидоцид», составляющую 3,5-4 млрд спор/мл, и промышленного препарата «Колорадо», составляющую 2-3 млрд спор/мл [8, 9].

ПРИМЕР 4. Инсектицидная активность заявляемого штамма.

Определение инсектицидной активности заявляемого штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8831 против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Homoptera проводили в лабораторных условиях.

Заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8831 и контрольные штаммы (ВКПМ В-1226 и ВКПМ В-5081) выращивали до стадии полной споруляции на круговой качалке, как в примере 3, на среде с панкреатическим гидролизатом казеина.

Сравнительную оценку инсектицидной активности против представителей отряда Lepidoptera проводили на гусеницах мельничной огневки Galleria mellonella 7 возраста методом подсадки личинок мельничной огневки в чашки Петри с кормом (мерва + пшеничные отруби). Корм расфасовывали в чашки Петри (по 9 г в каждую), в которые вносили по 3 мл препарата.

В каждую чашку Петри (после подсыхания корма) подсаживали по 10 гусениц огневки 7 возраста (массой 75±5 мг) в трех повторностях. Чашки Петри с гусеницами содержали на лабораторных столах при температуре воздуха 25±20°С и относительной влажности воздуха 60-80%. Результаты гибели гусениц мельничной огневки учитывали на 6-е сутки.

Таблица 3
Штаммы Bacillus thuringiensis	Смертность (%)
ВКПМ В-8831	53,3
ВКПМ В-1226	63,3
ВКПМ В-5081	3,3

Как видно из таблицы, инсектицидная активность заявляемого штамма против гусениц мельничной огневки значительно превосходит активность штамма Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis ВКПМ В-5081, и несколько уступает активности штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-1226.

Сравнительную оценку инсектицидной активности против представителей отряда Coleoptera проводили на личинках колорадского жука Leptinotarsa decemlineata.

Личинок младшего возраста (2 и начало 3 возраста) подсаживали в чашки Петри с листьями картофеля, обработанными путем погружения в растворы препаратов. Результаты гибели личинок колорадского жука учитывали на 5-е сутки.

Таблица 4
Штамм	Смертность
	(%)
	2-3 возраст
ВКПМ В-8831	55,1
ВКПМ В-1226	10
ВКПМ В-5081	25,1

Из результатов, приведенных в таблице 4, следует, что заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8831 значительно превосходит по своей инсектицидной активности против личинок колорадского жука контрольные штаммы. Статистическая обработка результатов, проведенная с помощью компьютерной программы пробит-анализа, позволила нам вычислить ЛК₅₀ заявляемого штамма ВКПМ В-8715 на 4 сутки эксперимента. Величина ЛК₅₀ составила 0,08% КЖ, что значительно превосходит этот показатель у других известных штаммов Bacillus thuringiensis [5, 9].

Сравнительную оценку инсектицидной активности против представителей отряда Homoptera проводили на личинках белокрылки.

В лабораторных условиях при использовании в качестве тест-объекта личинок белокрылки применяли метод погружения растений-хозяев в растворы культуральной жидкости со спорами и кристаллами исследуемых штаммов Bacillus thuringiensis, полученных после окончания споруляции.

Срезанные двухлистковые растения фасоли за сутки до опыта заселяли личинками первого возраста. Растения погружали в растворы препаратов на 6 секунд и устанавливали в сосуды с водой.

Учет гибели в опытах проводили после перехода личинок в 4-й возраст.

Таблица 5
Штамм	Смертность (%)
ВКПМ В-8831	9,4
ВКПМ В-1226	5,3
ВКПМВ-5081	4,9

Из результатов, приведенных в таблице 5, следует, что заявляемый штамм ВКПМ В-8831 по своей активности против личинок белокрылки значительно превосходит контрольные штаммы Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-1226 и Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis ВКПМ В-5081. Известные штаммы Bacillus thuringiensis [4, 5, 8, 9] не обладают инсектицидной активностью против личинок белокрылки. Таким образом, впервые получен рекомбинантный штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8831, проявляющий инсектицидную активность в отношении представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Homoptera, приносящих вред сельскохозяйственньм культурам.

Источники информации

1. National Research Council. 1986. Pesticide reistance: strategies and tactics for management. National Academy of Sciences, Washington, D.C.

2. Crickmore, N., Zeigler, D.R., Feitelson J., Schenepf, E., van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J. and Dean, D.H. 1998. Revision of the nomenclature for Bacillus thuringienis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813.

3. McConnell, E. and Richards, A.G. 1959. The production by Bacilllus thuringiensis Berliner of a heat-stable exotoxin toxic to insects. Can. J. Microbiol. 5: 161-168.

4. USA patent 6156308.

5. Патент РФ №2125091.

6. Sambrook, J., E.F.Fritsch, and T.Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

7. Kalman, S., К.L.Kiehne, N.Cooper, M.S.Reynoso, and T.Yamamoto. 1995. Enhanced production of insecticidal proteins in Bacillus thuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes. Appl. Environ. Microbiol. 61:3063-3068.

8. Патент РФ №2080065.

9. Патент РФ №2204598.

10. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. Наука, 1983, с.81-124.