способ количественного определения альбикара в биологических объектах

Формула изобретения

Способ количественного определения альбикара - 2,6-диметил-4,8-диэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7- в биологических жидкостях, характеризующийся тем, что анализируемую пробу плазмы крови или мочи обрабатывают органическим экстрагентом, к сухому остатку после упаривания растворителя добавляют раствор 2, 4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7 в соотношении масс. альбикар - внутренний стандарт 1:3; 2:3; 3:3; 3:2; 3:1, анализируют методом газожидкостной хроматографии при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С, количественное содержание альбикара определяют по предварительно найденному относительному калибровочному коэффициенту K_i/s , который рассчитывают по формуле

где W_s и W_i - площади пиков внутреннего стандарта и альбикара;

Q_i и Q_s - массовые количества альбикара и внутреннего стандарта в смеси.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах.

Альбикар (2,6-диметил-4,8-диэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандион-3,7) по своей структуре является представителем бициклических бисмочевин; биологические испытания выявили у него выраженную психофармакологическую активность [Зимакова И.Е. Экспериментальное обоснование возможности применения в медицине нового биологически активного класса химических веществ - производных бициклических бисмочевин: Автореф. дис....д-ра фарм. наук. /Казан, гос. мед. ин-т. - 1978. - 46 с.]. До настоящего времени не описано специфичного, чувствительного способа количественного определения данного вещества в субстанции, лекарственных формах, биологическом материале, известен лишь способ определения мочевины в крови (SU № 1774262 А1, 07.11.1992).

Задачей изобретения является обеспечение возможности количественного определения альбикара в сложном многокомпонентном биологическом материале.

Это достигается тем, что анализируемую пробу биожидкости обрабатывают органическим экстрагентом, к сухому остатку после упаривания растворителя добавляют раствор 2,4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7, анализируют методом газожидкостной хроматографии при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С, количественное содержание альбикара определяют по предварительно найденному относительному калибровочному коэффициенту K_i/s.

Анализируемую пробу биожидкости (кровь, моча) обрабатывают органическим экстрагентом с целью извлечения альбикара. 2,4,6,8-Тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандион-3,7 добавляют к остатку после упаривания экстрагента, поскольку именно это вещество используется в качестве внутреннего стандарта. Предлагаемый температурный режим газожидкостного хроматографирования аналита необходим потому, что именно в этих условиях происходит удовлетворительное разделение пиков альбикара и эндогенных соединений.

Способ осуществляют следующим образом.

Из крови или мочи исследуемых животных (крысы-самцы) альбикар экстрагируют хлороформом, к сухому остатку после упаривания растворителя добавляют хроматографически чистый внутренний стандарт, представляющий собой раствор 2,4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7, например, в хлороформе с концентрацией 0,1%. В испаритель детектора сразу же вводят 1-3 мкл пробы и определяют количественное содержание альбикара по предварительно найденному относительному калибровочному коэффициенту K_i/s.

Пробу анализируют при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С, концентрацию альбикара определяют по калибровочному графику, в этих условиях время удерживания внутреннего стандарта и альбикара составляет соответственно 20, 50 и 24, 25 мин.

Получение количественных данных.

В качестве параметра расчета хроматограмм используют площадь пиков. Для нахождения значений относительного калибровочного коэффициента K_i/s альбикара по внутреннему стандарту готовят калибровочные смеси альбикар - внутренний стандарт в соотношениях масс 1:3; 2:3; 3:3; 3:2; 3:1 и хроматографируют при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С.

Значения K_i/s рассчитывают по формуле

где W_s и W_i - площади пиков внутреннего стандарта и альбикара,

Q_i и Q_s - массовые количества альбикара и внутреннего стандарта в смеси.

Разработанный способ может быть использован для количественного определения альбикара в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата, а также при выполнении клинических или фармакокинетических исследований препарата, а также при изучении его метаболизма.

Пример. Количественное определение альбикара в плазме крови и моче крыс (модельные растворы). К 1 мл интактных плазмы крови или мочи с известной концентрацией альбикара добавляют 20 мл хлороформа и производят экстракцию встряхиванием на шейкере в течение 15 мин. Водную фазу отделяют от хлороформной вымораживанием в морозильной камере при температуре -15°С в течение 15 ч. Хлороформный экстракт упаривают до объема 2-3 мл на роторном испарителе, переносят в пробирку с дном, оттянутым в капилляр и упаривают досуха в токе азота. К полученному сухому остатку добавляют внутренний стандарт. В испаритель хроматографа вводят 1-3 мкл пробы и хроматографируют при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С. В таблице приведены результаты определения концентрации альбикара в биологических жидкостях. Как видно из данных, приведенных в таблице, относительная ошибка определения концентрации альбикара при его различных концентрациях в моче не превышает 3,8%, а в плазме крови - 4,2%. Низкие значения коэффициента вариации - 3,4% - указывают на хорошую воспроизводимость методики.

Результаты количественного определения альбикара в биологических жидкостях (модельные растворы).
Добавлено альбикарамкг/мл		Найдено альбикара		Метрологическая характеристика (р=0,95)
		мкг/мл		S				Аотн. %
Плазма крови
		199,6
		195,3
200		201,4	201,2	4,10	2,04	1,83	5,09	2,53
		203,8
		206,0
		20,65
		20,06
20		19,10	19,97	0,574	2,87	0,257	0,714	3,58
		20,14
		19,72
		1,92
		1,95
2		1,90	1,97	0,067	3,40	0,030	0,083	4,21
		2,07
		1,99
Моча
	196,8
	202,6
200	196,0		199,0	2,84	1,43	1,27	3,53	1,77
	198,5
	201,3
	20,42
	19,72
20	19,59		20,01	0,352	1,76	1,157	0,436	2,18
	20,08
	20,26
	1,97
	2,04
2	1,97		1,99	0,60	3,02	0,027	0,075	3,77
	1,91
	2,06