способ количественного определения бикарэта в биологических объектах

Формула изобретения

Способ количественного определения бикарэта - 2,4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло [3.3.0]октандиона-3,7 в биологических жидкостях, характеризующийся тем, что анализируемую пробу плазмы крови или мочи обрабатывают органическим экстрагентом, к сухому остатку после упаривания экстракта добавляют раствор альбикара-2,6-диметил-4,8-диэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло [3.3.0]октандиона-3,7 в соотношении от 3:1 до 1:3, анализируют методом газожидкостной хроматографии при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 280°С, температура детектора 220°С, концентрацию бикарэта определяют по относительному калибровочному коэффициенту бикарэта по внутреннему стандарту.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах.

Бикарэт (2,4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандион-3,7)

- биологически активное вещество, которое проявляет антидепрессивные свойства активирующего действия наряду с транквилизирующим эффектом [Зимакова И.Е. Экспериментальное обоснование возможности применения в медицине нового биологически активного класса химических веществ - производных бициклических бисмочевин: Автореф. дис....д-ра фарм.наук. /Каз. гос. мед. ин-т. - 1978. - 46 с.].

До настоящего времени не описан специфичный, чувствительный способ количественного определения бикарэта в субстанции, лекарственных формах, биологическом материале, лишь способ определения мочевины в крови (SU № 1774262 А1, 07.11.1992).

Задачей изобретения является обеспечение возможности количественного определения бикарэта в сложном многокомпонентном биологическом материале.

Это достигается тем, что анализируемую пробу биожидкости обрабатывают органическим экстрагентом, к сухому остатку после упаривания экстракта добавляют раствор альбикара (2,6-диметил-4,8-диэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7), анализируют методом газожидкостной хроматографии при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 280°С, температура детектора 220°С, концентрацию бикарэта определяют по относительному калибровочному коэффициенту бикарэта по внутреннему стандарту.

Анализируемую пробу биожидкости (кровь, моча) обрабатывают органическим экстрагентом с целью извлечения бикарэта. Альбикар (2,6-диметил-4,8-диэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандион-3,7) добавляют к остатку после упаривания экстрагента, поскольку именно это вещество используется в качестве внутреннего стандарта. Предлагаемый температурный режим газожидкостного хроматографирования аналита необходим потому, что именно в этих условиях происходит удовлетворительное разделение пиков бикарэта, его метаболитов, внутреннего стандарта и эндогенных соединений.

Способ осуществляют следующим образом.

Из крови или мочи исследуемых животных (крысы-самцы) бикарэт экстрагируют хлороформом, к сухому остатку после упаривания растворителя добавляют хроматографически чистый внутренний стандарт, представляющий собой раствор альбикара, например в хлороформе с концентрацией 0,1%, в количестве, соответствующем соотношению бикарэт - альбикар от 3: 1 до 1: 3. В испаритель детектора вводят 1-3 мкл пробы. Результаты хроматографии используют для нахождения относительных калибровочных коэффициентов бикарэта по внутреннему стандарту, которые в данном интервале массовых соотношений составляют 0,81±0,01.

Хроматографируют пробу в следующем изотермическом режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 280°С, температура детектора 220°С. Газ-носитель - азот особой чистоты, объемная скорость на выходе из колонки - 2 мл/мин, коэффициент деления потока 1/20. Вспомогательные газы - водород (30 мл/мин), воздух (300 мл/мин).

Время удерживания бикарэта и внутреннего стандарта составляет соответственно 20,30 и 24,15 мин. В найденных условиях наблюдается удовлетворительное разделение пиков бикарэта и внутреннего стандарта с пиками эндогенных соединений и его метаболитов.

Получение количественных данных.

В качестве параметра расчета хроматограмм используют площади пиков.

Для количественного определения бикарэта в биопробе используют значение относительного калибровочного коэффициента бикарэта по внутреннему стандарту.

Разработанный способ может быть использован для количественного определения бикарэта в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата.

Пример. Количественное определение бикарэта в плазме крови и моче крыс (модельные растворы). К 1 мл интактных плазмы крови или мочи с известной концентрацией бикарэта добавляют 20 мл хлороформа и экстрагируют бикарэт встряхиванием на шейкере в течение 15 мин. Водную фазу отделяют от хлороформной вымораживанием в морозильной камере при температуре -15°С. Хлороформный экстракт упаривают до объема 2-3 мл на роторном испарителе, переносят в пробирку с дном, оттянутым в капилляр, и упаривают досуха в токе азота. К полученному сухому остатку добавляют внутренний стандарт. В испаритель хроматографа вводят 1-3 мкл пробы и хроматографируют в следующем изотермическом режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 280°С, температура детектора 220°С. В таблице приведены результаты определения концентрации бикарэта в биологических жидкостях для модельных растворов с концентрацией препарата 10 мкг/мл. Как видно из данных, приведенных в таблице, относительная ошибка определения концентрации бикарэта в моче составляет 2,7%, а в плазме крови - 3,2%. Низкие значения относительного стандартного отклонения S_r (0,02 для мочи и 0,03 для плазмы крови) указывают на хорошую воспроизводимость методики. Истинные значения концентрации бикарэта в моче и плазме крови крыс 10 мкг/мл лежат внутри доверительного интервала среднего, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки и достоверности результатов.

Таблица Достоверность результатов количественного определения бикарэта в биологических жидкостях
Биожидкость	Взято на анализ, мкг/мл	Найдено, мкг/мл	Метрологические характеристики (n=5, р=0,95)
Моча	10,00	10,25
	10,00	9,87
	10,00	9,78
	10,00	10,14
	10,00	9,77
Плазма крови	10,00	9,73
	10,00	10,29
	10,00	10,19
	10,00	9,75
	10,00	9,94