способ дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака кожи и кератоакантомы

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака кожи и кератоакантомы, включающий иммуногистохимическое исследование с применением ядерного маркера Ki-67, отличающийся тем, что исследуют локализацию экспрессии ядерного маркера Ki-67 или Р-63 в слоях эпидермиса и дермы и при локализации маркера базально диагностируют кератоакантому, а при диффузной локализации маркера диагностируют плоскоклеточный рак кожи.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологии и дерматоонкологии.

Известен способ диагностики трансформации кератоакантомы в плоскоклеточный рак, включающий исследование венозной крови с добавлением антигена, с последующим определением радиометрическим методом уровня бласттрансформации лейкоцитов, по результатам которого определяют значение индекса стимуляции, характеризующий диагноз (Патент РФ №2050003, МПК G 01 N 33/53, публ. 1995 г.).

Недостатком этого способа является то, что первоначальный диагноз кератоакантомы поставлен на основе клинических данных, которые требуют длительного наблюдения, что недопустимо в случае плоскоклеточного рака.

Известен способ дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака кожи и кератоакантомы, включающий патоморфологические исследования биопсийного материала (Sanchez-Yus E., Simon P., Requena L., Ambrojo P., de-Eusebio E. Solitary keratoacanthma: a self-healing proliferation that frequently becomes malignant. Am. J. Dermatopathol. 2000, Aug; 22 (4). P.305-310).

Недостатком этого способа является невысокая точность диагноза, так как основой гистологических изменений при кератоакантоме (КА) является псевдоканцероматозная гиперплазия эпидермиса, при которой можно обнаружить многие признаки, характерные злокачественному процессу: большое количество патологических митозов, глубокая инвазия эпидермальных комплексов.

Наиболее близким является способ дифференциальной диагностики кератоакантомы и плоскоклеточного рака, включающий патоморфологические исследования с добавлением иммуногистохимических маркеров, в частности ядерного маркера Ki-67, определение индекса пролиферации (Mayumi Matsuta, Sadakatsu Kimura, Gen Kosegawa, Saiichi Kon and Morimasa Matsuta «Immunohistochemical Detection of Ki-67 in Epithelial Skin Tumors in Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Sections Using a New Monoclonal Antibody (MIB-1)». The Journal of Dermatology. Vol.23: 147-152, 1996).

Недостатком этого способа является невысокая точность, поскольку определение индекса пролиферации, т.е. исследование только количественных характеристик маркера в большинстве случаев является сопоставимым при обоих заболеваниях.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков за счет дополнительного, помимо количественного, исследования перераспределения маркера в слоях эпидермиса.

Для этого в способе дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака кожи и кератоакантомы, включающем иммуногистохимическое исследование с применением ядерного маркера Ki-67, предложено исследовать локализацию экспрессии ядерного маркера Ki-67 или р-63 в слоях эпидермиса и дермы, и при локализации маркера базально диагностировать кератоакантому, а при диффузной локализации маркера диагностировать плоскоклеточный рак кожи.

Предлагаемые исследования позволяют поставить точный диагноз поскольку экспрессия генного белкового продукта р-63 и белка ядер пролиферирующих клеток Ki-67 выявляется в клетках наружного базального слоя бородавчато-акантотических разрастаний эпидермиса в кератоакантоме. При плоскоклеточном раке зона экспрессии этого белка расширяется, ядра, специфически окрашенные на Ki-67 и р-63, выявляются и по периферии, и в центральных отделах эпидермальных опухолевых тяжей и комплексов.

На фиг.1 показана экспрессия в ядрах эпидермоцитов в кератоакантоме ядерного маркера р63; на фиг.2 - то же, маркер Ki-67, локализующегося по периферии опухолевых разрастаний в базальных отделах; на фиг.3 показана экспрессия в ядрах эпидермоцитов в плоскоклеточном раке ядерного маркера р63, которые беспорядочно разбросаны по акантотическим выростам и отшнурованным комплексам атипичного эпителия, т.е. экспрессия выявляется диффузно и зоны экспрессии расширяется за пределы базального слоя; на фиг.4 - то же, маркер Ki-67.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследование проводили в соответствии с методикой Taylor С.R., Cote R. и Sternberger L.A.

Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования биопсийный материал фиксировали в 10%-ном растворе формалина, забуфференном по Лилли (рН 7,2), затем проводили по батарее спиртов и ксилолов и заливали в парафин по стандартной методике. Использовали специальный парафин с температурой плавления 54°С.

Готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм, которые наносили на стекла с полилизиновым покрытием. Депарафинировали срезы по стандартной схеме.

Перед инкубацией с первичными антителами срезы обрабатывали в микроволновом режиме при мощности 750 Вт, в цитратном буфере (с рН 6,0) - 2 раза по 5 минут.

Затем срезы охлаждались при комнатной температуре не менее 15-20 минут.

Затем на срезы наносились соответствующие первичные антитела, инкубировали с первичными антителами: 30 минут при комнатной температуре, затем оставляли на ночь (14-18 часов) при 4°С.

Антитела	Клон	Фирма	Разведение
р63	4А4	Santa Crus	1:500
Ki-67	В56	BD Biosciences	1:10

Срезы тщательно промывались в фосфатном буфере при рН 7,4-7,6.

Затем на срезы наносили комплекс EnVision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO) и инкубировали 30-40 минут при комнатной температуре.

Срезы тщательно промывали в фосфатном буфере при рН 7,4-7,6. Далее на срезы наносили красящий визуализирующий реакцию раствор. В качестве системы визуализации использовали раствор диаминобензидина (ДАВ) - DAB + фирмы DAKO, затем срезы отмывались в дистиллированной воде и докрашивались гематоксилином Майера.

Далее провели микроскопические исследования. В биоптате в зависимости от нозологии наблюдается различная локализация экспрессии (окрашивание в коричневый цвет ядер под воздействием маркера) маркеров Ki-67 или р-63.

По нашим данным экспрессия в ядрах эпидермоцитов КА генного белкового продукта р-63 выявляется по периферии опухолевых разрастаний в базальных отделах. В ПКР ядра, экспрессирующие р-63, беспорядочно разбросаны по акантотическим выростам и отшнурованным комплексам атипичного эпителия, т.е. зона экспрессии этого маркера расширяется.

Белок ядер пролиферирующих клеток Ki-67 экспрессируется в клетках наружного (базального) слоя бородавчатоакантотических разрастаний эпидермиса в КА. При ПКР зона экспрессии этого белка расширяется, ядра, специфически окрашенные на Ki-67, выявляются и по периферии, и в центральных отделах эпидермальных опухолевых тяжей и комплексов.

При выявлении белка ядер пролиферирующих клеток в реакции с AT к другому белку - PCNA выявлена такая же топография расположения экспрессирующих Ki-67 ядер, но количество их возрастает, что объясняется экспрессией PCNA во все фазы клеточного цикла в отличие от Ki-67, который экспрессируется только в поздней G1, S, G2, и М фазах.

Различие экспрессии антиапоптотических белковых продуктов р-53 и ВАХ между КА и ПКР не отмечено.

Пример 1.

Больной Д, 65 лет, поступил в отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии с предположительным диагнозом нодулярная базалиома плеча. Из анамнеза: образование появилось 6-7 месяцев назад, на видимо неизмененной коже, до последнего времени субъективно не беспокоило, последние 2-3 недели стал отмечать болезненность при пальпации. При осмотре: образование полусферической формы, розового цвета с изъязвлением в центре закрытым роговыми массами, размер образования 4 см в диаметре, высота образования 3,5 см. При патоморфологическом исследовании структура напоминает кератоакантому, но по количеству патологических митозов и глубине инвазии гистологические изменения более соответствуют не высоко, а низкодифференцированному раку кожи. Пациент был направлен в областной онкологический диспансер для хирургического удаления опухоли с захватом здоровой кожи по периферии образования 1,5-2 см, и пересадкой кожного лоскута с донорской области. При иммуногистохимическом исследовании с применением маркера р-63 и дополнительным контролем с маркером Ki-67 обнаружилось базальное распределение обоих маркеров, пациенту была назначена терапия Реафероном в дозе 1 млн МЕ №10 еж. как при лечении атипичных кератоакантом, и к 4-й инъекции препарата появилась тенденция к регрессу. Спустя 3 недели от начала заболевания опухоль разрешилась. На месте образования небольшой очаг депигментации.

Пример 2.

Больной Г., 57 лет, болен около 2-х лет, когда впервые заметил узелок с булавочную головку в области левого ската носа, который медленно увеличивался, и через полтора года от начала заболевания достиг диаметра 0,6 см. Затем в течение последних трех месяцев больной отметил быстрый рост образования, которое к моменту обращения достигло диаметра 1,8 см. При осмотре: на коже левого ската носа узел, диаметром 1,8 см с изъявлением в центре. Периферический ободок опухоли состоит из бледно-розовых узелков, а центральная часть представлена опухолевым валом с изъязвлением в центре.

Быстрый рост образования был расценен как озлокачествление процесса, но после проведения предлагаемого иммуногистохимического исследования с маркером р-63 диффузная локализация маркера не была обнаружена. Был поставлен диагноз: кератоакантома, развившаяся на базалиоме и проведено соответствующее лечение. Отдаленные результаты подтвердили поставленный диагноз.

Пример 3.

Больная А., 73 лет, поступила с предположительным диагнозом кератоакантома нижней губы. Согласно вышеописанной методике, проведено исследование с ядерным маркером р-63.

Результаты иммуногистохимического исследования с ядерным маркером р-63, который экспрессируется и по периферии и в центральных отделах эпидермальных опухолевых комплексов, т.е. показали диффузную локализацию маркера. Был поставлен диагноз - плоскоклеточный рак, проведено соответствующее лечение.

По предлагаемой методике проведены исследования у 24 больных, у 13 пациентов диагностирован плоскоклеточный рак, у 11 - кератоакантома. Проведено лечение. Отдаленные результаты показали верность поставленного диагноза в 100% случаев.

Предлагаемый способ позволяет исключить возможность многоэтапного оперативного вмешательства при неправильной диагностике плоскоклеточного рака при имеющейся в действительности кератоакантоме. В случаях кератоакантомы, точная постановка диагноза позволяет своевременно осуществить адекватную терапию.