способ выделения мезенхимальных стволовых клеток

Формула изобретения

Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека, включающий измельчение и ферментативную обработку тканей раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, очистку от эритроцитов с помощью лизирующего раствора с последующей фильтрацией полученной суспензии, отличающийся тем, что в качестве тканей человека используют тимус, для ферментативной обработки используют коллагеназу типа II, а фильтрацию проводят последовательно через фильтры с размером пор 100 и 10 мкм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности, к выделению мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека, и может найти применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний.

В настоящее время в современной биомедицине формируется новый раздел - клеточная терапия, которая позволяет с помощью трансплантации клеток восполнить недостаточную функциональную активность тканей и регенерировать поврежденные органы. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют стволовые клетки, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов. В связи с этим применение стволовых клеток является наиболее перспективным направлением клеточной терапии и наибольшую актуальность приобретают работы по выделению стволовых клеток из различных тканей человека.

Стволовые клетки тканей взрослого организма служат клеточной основой для поддержания в нем гомеостаза и лежат в основе репаративных процессов в организме. В связи с этим, наибольшую актуальность приобретают работы по выделению стволовых клеток из различных тканей человека. В настоящее время выделены эмбриональные стволовые клетки, а также стволовые клетки тканей взрослого организма - гематопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной ткани), мезенхимальные (клетки, способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения, а также способны трансдифференцироваться в клетки тканей других зародышевых листков) и др.

Относительная простота выделения и культивирования, способность пролиферировать в течение долгого времени in vitro и широкий спектр дифференцировки делают данный тип клеток привлекательным для фундаментальных исследований и открывают возможность для клинического применения.

Впервые мезенхимальные стволовые клетки были получены из костного мозга по способности прикрепляться к поверхности культуральной посуды (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol. 1974. Vol.2. P.83-92).

Недостатком этого метода является длительность и трудоемкость анализа сыворотки в процессе поиска лота, подходящего для культивирования клеток, а также отсутствие воспроизводимости результатов.

Известен способ выделения МСК с помощью селекции на антитела к Stro-1, антигену с неизвестной функцией, временно экспрессирующимся на поверхности МСК (Grontos S., Simmons P.J. The growth factors requirements of Stro-1 positive human stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro // Blood. 1995. Vol.85. P.929-940).

Способ является очень трудоемким и требует длительного времени для предварительного выделения антител.

Известен способ выделения МСК, состоящий в получении мононуклеарных клеток, селекции на антитела к поверхностному антигену CD105, экспрессирующемуся на поверхности МСК, и культивировании клеток, прикрепляющихся к пластику. Доля отобранных CD105 ⁺ клеток составляет 2-3% от фракции моноядерных клеток. В результате была получена популяция клеток, обладающих морфологией и профилем экспрессии поверхностных антигенов, характерных для МСК, а также хондрогенным потенциалом (Majumdar M.K., Banks V., Peluso D.P., Morris E.A. Isolation, characterization, and chondregenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells // J. Cell. Physiol. 2000. Vol.185. P.98-106).

Способ приводит к выделению фракции клеток CD105⁺, обогащенной МСК, но это требует дополнительной стадии селекции с помощью антител, иммобилизованных на магнитных шариках, что ведет к потере части клеток и требует дополнительных затрат.

Известен способ выделения МСК из фетальной крови плода. Для их получения выделяют фракцию мононуклеарных клеток центрифугированием в градиенте фиколла и культивируют в условиях, поддерживающих рост МСК (Campagnoli С., Roberts I.A., Kumar S. et al. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver, and bone marrow // Blood. 2001. Vol.98. P.2396-2402).

Недостатком метода получения МСК из данного источника является труднодоступность фетальных тканей, а также этические проблемы, связанные с их использованием. Кроме того, изолированные популяции клеток были неоднородными: 76% проб содержали остеокластоподобные клетки, экспрессирующие характерные антигены CD45, CD51/CD61, отрицательные по CD64 (маркер макрофагов), SH2 (маркер МСК), CD31 (маркер эндотелиальных клеток). Лишь 26% образцов состояли из МСК-подобных клеток, экспрессирующих SH2, SH3, SH4, МАВ1470, CD 13, CD29, CD49e, CD54, CD90, ASMA, отрицательных по CD31 и vWF (маркеры эндотелиальных клеток).

Известен наиболее близкий к заявленному способ выделения МСК из липоаспирата человека, состоящий в том, что измельченную жировую ткань подвергают действию коллагеназы типа I, а после нейтрализации коллагеназы и промывки клеточной суспензии очищают с помощью фильтров с размером пор 100 мкм для удаления клеточных остатков. В результате получают популяцию МСК, обладающую характерной морфологией, иммунофенотипом, а также способностью к дифференцировке в костную, хрящевую, жировую, мышечную и нервную ткани (Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., deUgarte D.D., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraiser J.K., Benhaim P. and Hedrick M.H. Human adipose tissue is source of multipotent stem cells // Molecular Biology of the Cell. 2002. Vol.13. P.4279-4295). Недостатками данного способа является неоднородность клеточной суспензии и невысокий выход жизнеспособных клеток.

Изобретение решает задачу выделения мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека с высокой однородностью клеточной суспензии.

Для решения поставленной задачи в способе выделения мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека, включающем измельчение и ферментативную обработку тканей раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, очистку от эритроцитов с помощью лизирующего буфера с последующей фильтрацией полученной суспензии, в качестве тканей человека используют тимус, для ферментативной обработки используют коллагеназу типа II, а фильтрацию проводят последовательно через фильтры с размером пор 100 и 10 мкм.

Способ осуществляют следующим образом.

Тимус предварительно трижды промывают физиологическим раствором, забуференным фосфатами (ФСБ, РВЗ, phosphate buffered saline), pH 7,2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, содержащим антибиотики и антимикотик. Обрабатываемую ткань освобождают от пленок, промывают физиологическим раствором ФСБ и измельчают ножницами. К измельченной ткани добавляют среду Игла в модификации Дюльбекко (DMEM, Dulbecco-modified Eagle Medium), содержащую антибиотики и антимикотик при объемном соотношении ткани и среды от 1:5 до 1:10. В полученную суспензию вводят раствор коллагеназы типа II до конечной концентрации 0,1% для ферментативной обработки. Суспензию инкубируют 30 минут при 37°С при медленном покачивании. Полученную смесь перемешивают до получения однородной суспензии, затем для нейтрализации коллагеназы добавляют, в зависимости от вязкости полученной суспензии, среду DMEM, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS - сыворотка плода коровы) до исчезновения вязкости с последующим центрифугированием. Осадок промывают средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик, повторно центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость. Осадок суспендируют в среде DMEM с антибиотиками и антимикотиком и полученную клеточную суспензию пропускают через фильтр с размером пор 100 мкм.

Фильтрат центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость и осадок лизируют в 5 объемах холодного буфера, лизирующего эритроциты. Полученную суспензию разбавляют эквивалентным объемом среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик и осаждают центрифугированием. Удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в среде DMEM, дополненной 20% СПК, однократным раствором незаменимых аминокислот и однократным раствором антибиотиков и антимикотика. Суспензию клеток фильтруют через фильтр с размером пор 10 мкм.

Количество полученных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева, сеют в культуральные флаконы. Тимус человека получают при пункции или стернотомии.

Изобретение иллюстрирует пример.

Пример.

Тимус весом 10 гр. промывают трехкратно в физиологическом растворе, забуференным фосфатами (ФСБ), без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, содержащим антибиотики и антимикотик (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В).

Затем тимус освобождают от пленок, промывают в физиологическом растворе, забуференным фосфатами (ФСБ), рН 7,2, без ионов Са ²⁺ и Mg²⁺ и измельчают медицинскими ножницами в чашках Петри диаметром 10 см. К измельченному тимусу добавляют среду DMEM, содержащую антибиотики и антимикотик (как указано выше) в соотношении 1:5 и переносят суспензию в пробирку на 50 мл.

К полученной суспензии добавляют раствор коллагеназы типа II до конечной концентрации 0,1%. Инкубируют 30 минут на шейкере при 37°С.

Смесь тщательно пипетируют. Добавляют, в зависимости от вязкости суспензии, среду DMEM, содержащую 10% СПК (сыворотка плода коровы), для нейтрализации коллагеназы, до исчезновения вязкости. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Удаляют надосадочную жидкость, промывают в соотношении 1:5 средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик, как указано выше, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Удаляют надосадочную жидкость. Осадок суспендируют в соотношении 1:10 в среде DMEM с антибиотиками и антимикотиком (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В).

Полученную клеточную суспензию пропускают через фильтр с размером пор 100 мкм.

Фильтрат центрифугируют 10 минут 1000 g, удаляют надосадочную жидкость.

Осадок лизируют в 5 объемах холодного буфера, лизирующего эритроциты, содержащего 155 mM NH₄Cl, 10 mM КНСО ₃, 0,1 mM Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 5 минут при комнатной температуре. Полученную суспензию разбавляют в соотношении 1:2 средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик, как указано выше, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в среде DMEM, дополненной 20% СПК, однократным раствором незаменимых аминокислот и однократным раствором антибиотиков и антимикотика (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В).

Полученную суспензию клеток фильтруют через фильтр с размером пор 10 мкм.

Количество полученных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева, высевают во флаконы площадью 75 см², из расчета 3 млн. клеток на 1 см^2, из них 4-5×10⁴ являются мезенхимальными стволовыми клетками.

По истечении суток в флаконах меняют среду на среду DMEM, дополненную 15% СПК, однократным раствором незаменимых аминокислот и однократным раствором антибиотиков (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина).

По достижении монослоя клетки пересевают, оценивают визуально по морфологии с помощью фазово-контрастного микроскопа, подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации.

Полученные клетки имунофенотипируют по поверхностным маркерам с помощью проточного цитофлуориметра. Фенотип полученных клеток соответствует фенотипу мезенхимальных стволовых клеток. Клетки были протипированы по следующим антителам: CD13, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105.

Полученные клетки являются положительными по экспрессии следующих антигенов: CD13 - 96,4%, CD44 - 98,7%, CD90 - 97,1%, CD 105 - 99,2%, - и отрицательны по экспрессии CD45 - 1,8%. Присутствие в популяции небольшого количества клеток, положительных по экспрессии CD34, можно объяснить тем, что тимус является кроветворным органом.