способ оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза

Формула изобретения

Способ оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани, включающий исследование образца ткани папилломы, детекцию РНК вируса папилломы человека (ВПЧ), проведение обратнотранскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), отличающийся тем, что проводят детекцию РНК консервативной области основного белка капсида ВПЧ, полученную из образцов ткани папилломы, отобранных до лечения и спустя 24-72 ч после начала лечения, затем с помощью ОТ-ПЦР выделяют комплементарную ДНК, определяют количество геномных эквивалентов ВПЧ и при уменьшении их количества не менее чем в 10 раз лечение оценивают как эффективное.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к оториноларингологии и инфекционным заболеваниям, и может быть использовано для оценки эффективности проводимого лечения в ранние сроки.

Респираторный папилломатоз - одно из наиболее распространенных опухолевых заболеваний верхних дыхательных путей. Оно часто носит тяжелый характер из-за склонности к распространению в дыхательных путях и частым рецидивам, сопровождающимся клиникой стеноза гортани. Частые рецидивы заболевания нередко приводят к распространению процесса в дыхательных путях, длительному течению заболевания и сопутствующим осложнениям. Заболевание вызывается вирусом папилломы человека (ВПЧ) 6 и 11 типов (Elo J., Hidvegi J., Bajtai A. Papova viruses and recurrent laryngeal papillomatosis//Acta. Otolaryngol. Stockh, - 1995. - Vol.115. - #2. - P.322-325).

Известен способ определения эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани в зависимости от частоты его рецидивирования (Ст. Чирешкина Д.Г. "Папилломатоз как причина хронической обструкции гортани у детей". Журнал "Ушные, носовые и горловые болезни", 1993, №3, с.43-50).

Недостатком данного способа является то, что рецидивы заболевания определяются по клиническим проявлениям болезни, которые могут быть растянуты во времени от нескольких месяцев до нескольких лет. В соответствии с этим однозначно определить эффективность лечения во время такого длительного периода, в течение которого постоянно проводится противорецидивная терапия, практически невозможно.

Известен способ оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани, включающий исследование образца ткани папилломы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и определение маркера специфического для данных типов ВПЧ (Нурмухаметов Р.Х. "Применение препаратов интерферона при ювенильном респираторном папилломатозе". Афтореф. диссерт. Канд. мед наук, М., 1998, с.22).

Суть известного способа заключается в том, что во время операции образец удаленного материала папилломы исследуют путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), во время которой определяют наличие в клетках образца ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) ВПЧ.

Недостатками данного способа являются его ограниченные возможности, обусловленные отсутствием возможности определения количественного содержания ДНК, что не позволяет провести оценку результатов лечения.

Кроме того, использование в качестве маркера ДНК ВПЧ может привести к получению ложноположительных результатов, так как ДНК стабильна и сохраняться в клетках значительное время, даже при эффективно проводимой терапии.

Нами была поставлена задача разработать способ, позволяющий достоверно оценить эффективность проводимого лечения респираторного папилломатоза в ранние сроки от начала терапии, что позволит своевременно провести адекватную коррекцию лечения, в случае его малой эффективности.

Эта задача достигается тем, что в способе оценки эффективности лечения респираторного папилломатоза гортани, включающем исследование образца ткани папилломы с помощью полимеразной цепной реакции и определение маркера специфического для данных типов ВПЧ, предложено в качестве маркера специфического для данных типов ВПЧ использовать РНК (рибонуклеиновую кислоту) консервативной области основного белка капсида ВПЧ, которую получают из образцов ткани папилломы, отобранных до лечения и спустя 24-72 часа после начала лечения, затем для полученных РНК с помощью реакции обратной транскрипции выделяют комплиментарную ДНК, и определяют количество геномных эквивалентов вирусов ВПЧ и при уменьшении их последующего количества по сравнению с первоначальным не менее чем в 10 раз, определяют эффективность лечения.

Использование в качестве маркера РНК ВПЧ позволяет установить изменение количества геномных эквивалентов во времени, то есть осуществить мониторинг в клиническом материале, полученном от больных, что позволит оценить эффективность лечебных мероприятий на самых ранних стадиях и в случае необходимости вовремя провести адекватную коррекцию лечения.

Способ осуществляют следующим образом.

До начала лечения у больного берут образец ткани папилломы и помещают его в лизирующий раствор для сохранения (поскольку РНК быстро разрушается). Далее отобранный материал в количестве строго 50-100 мг ресуспендируют в 1 мл раствора, который в итоге дальнейших манипуляций переводят в 50 мкл. В реакцию обратной транскрипции берут 10 мкл. В ходе реакции исходные 10 мкл разводят в 30 мкл буферной смеси. В ПЦР берут 10 мкл из пробирки четвертого этапа работы и выделяют комплиментарную ДНК (кДНК).

Количество кДНК определяют визуальным сравнением исследуемой пробы с известными пробирками внутреннего стандарта от №1 до №6, которые содержат №1-10, №2-10² №3-10 ³ №4-10⁴ №5-10⁵, №6-10⁶ количества копий вирусов положительного внутреннего контроля.

Затем по формуле ГЭ=1×10^{№пробирки}×100×N, где N=9 (разведение исходной РНК) определяют эквимолярное количество копий вируса исследуемого образца. Затем после начала лечения в течение 24-72 часов дополнительно отбирают образец ткани папилломы и определяют эквимолярное количество копий ВПЧ данного образца. Сравнивают первоначальное и последующее количества копий ВПЧ и при уменьшении его не менее чем в 10 раз определяют эффективность лечения.

Необходимым условием для определения эквимолярного количество копий РНК ВПЧ является ее транскрипция в комплиментарную ДНК, поскольку для реакции обратной транскрипции методом конкурентной ПЦР матрицей служит только ДНК, в частности комплиментарная ДНК (кДНК). Поэтому первым этапом является выделение РНК ВПЧ с помощью ПЦР. Затем проводят реакцию обратной транскрипции методом конкурентной ПЦР. Метод конкурентной ПЦР позволяет провести амплификацию ДНК с раститрованным внутренним контролем (конкурентом), имеющим аналогичные сайты отжига для используемых специфических праймеров. ПЦР продукты от специфической матрицы и внутреннего контроля отличаются приблизительно на 50-200 пар нуклеотидов. Реакцию одновременной амплификации специфической матрицы и внутреннего контроля проводят в серии из 6 пробирок с раститрованным от 10 ¹ до 10⁶ копий матрицы внутреннего контроля и одинаковым количеством (объемом) ДНК из анализируемой пробы. Детекцию ПЦР продукта проводят электрофорезом в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, под УФ светом с длиной волны 310 нм. В конкурентных условиях реакции амплификации количество матрицы в анализируемой пробе определяют относительно известного количества копий внутреннего контроля в каждой пробирке из серии (Chomczynski P., Sacchi N. Anal. Biochem., #162, Р.156-157, 1987).

Пересчет количества геномных эквивалентов вирусов ВПЧ (ГЭ/мл) основан на соблюдении строгих пропорций и объемов на всех этапах работы, результатом которых явилась формула пересчета ГЭ/мл, которая является унифицированной единицей измерения количества кДНК, РНК в ПЦР диагностике (Chomczynski Р. BioTechniques, #15, Р.532-537, 1993).

Конкретные примеры выполнения способа.

1. Больной С., 9 лет, находился в ЛОР отделении МОНИКИ с 29 мая по 5 июня 2002 года, история болезни №9349 с диагнозом: Ювенильный респираторный папилломатоз гортани, стеноз гортани 4 степени, трахеальное канюленосительство. Поступил с жалобами на затрудненное дыхание через естественные дыхательные пути, афонию, наличие трахеостомы. Болен около 6 месяцев, когда появились затруднения дыхания, противовоспалительная терапия эффекта не принесла, дважды производилось удаление папиллом без улучшения, в связи с нарастанием явлений стеноза гортани трахеотомирован, рекомендовано лечение в ЛОР клинике МОНИКИ. При поступлении общее состояние удовлетворительное. Ребенку произведена прямая ларингоскопия с удалением папиллом, интраоперационно: в области черпалов, черпалонадгортанных складок, вестибулярных и голосовых складок, передней комиссуры. 70 мг удаленного материала в консервирующем растворе сразу же (во время операции) направлена в лабораторию, и определеноэквималярное количество РНК ВПЧ, составившее 3×10⁹ ГЭ/мл.

На 2 сутки (через 48 часов) после начала противорецидивной терапии (анцикловир по 0,2 по 5р/д) отобран образец ткани попиломы.

Проведено исследование, в результате которого установлено, что количество РНК ВПЧ составило - 3·10⁸ ГЭ/мл, то есть уменьшилась в 10 раз, что свидетельствует об эффективности лечения.

2. Больной Н., 34 лет, находился в ЛОР отделении МОНИКИ с 10.11.02 по 26.11.02, история болезни №19452, с диагнозом: рецидивирующий папилломатоз гортани. Жалобы на охриплость. При поступлении состояние удовлетворительное, дыхание через естественные пути свободное, при осмотре ротоглотки - uvula отсутствует, в этом месте папилломы розового цвета небольшого размера, при непрямой ларингоскопии: конгломераты папиллом, суживающие голосовую щель в области голосовых, вестибулярных, черпалонадгортанных складок, черпалов, гортанной поверхности надгортанника (верхушки его). Произведена прямая ларингоскопия с лазерным фотодинамическим воздействием на папилломы и частичным их удалением. 100 мг удаленного материала в консервирующем растворе направлено в лабораторию, где определено эквимолярное соотношение количества копий исследуемого образца от пациента и внутреннего стандарта, которое соответствует пробирке №5 с количеством внутреннего стандарта 1·10 ⁵. Следуя по формуле пересчета количество копий ВПЧ составило 1·10⁵×100×9=9×10⁷ ГЭ/мл.

После 1,5 суток (36 часов) от начала проведения лечения дополнительно отобран образец ткани папилломы и определено количество РНК ВПЧ, которое составило 9×10⁶ ГЭ/мл, что в 10 раз меньше первоначального. Проведенное лечение эффективно.

Использование данного способа позволит на самых ранних этапах в течение 24-72 часов от начала лечения определить его эффективность и во время провести коррекцию в случае необходимости, что существенно сократит сроки лечения.

Больной С., 45 лет, ист. болезни №18552, диагноз: рецидивирующий папилломатоз гортани. Жалобы на частые боли в горле, охриплость. При поступлении состояние удовлетворительное, дыхание через естественные пути свободное, при осмотре ротоглотки - uvula отсутствует, в этом месте папилломы розового цвета небольшого размера, при непрямой ларингоскопии: конгломераты папиллом, суживающие голосовую щель в области голосовых, вестибулярных, черпалонадгортанных складок, черпалов, гортанной поверхности надгортанника (верхушки его). Произведена прямая ларингоскопия с лазерным фотодинамическим воздействием на папилломы и частичным их удалением. 100 мг удаленного материала в консервирующем растворе направлено в лабораторию, где определено эквимолярное соотношение количества копий исследуемого образца от пациента и внутреннего стандарта, которое соответствует пробирке №6 с количеством внутреннего стандарта 1·10 ⁶. По формуле пересчета количество копий ВПЧ составило 1·10⁶×100×9=9×10⁸ ГЭ/мл.

На 3 сутки (после 60 часов) от начала проведения лечения дополнительно отобран образец ткани папилломы и определено количество РНК ВПЧ, которое составило 9×10⁷ ГЭ/мл, что в 10 раз меньше первоначального. Проведенное лечение эффективно.