способ прогнозирования течения кампилобактериоза у детей

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения кампилобактериоза путем выявления секреторных антител в реакции непрямой иммунофлюоресценции, отличающийся тем, что в копрофильтратах больных острой кишечной инфекцией определяют специфические секреторные антитела классов М и А к антигенам Campylobacter jejuni и Campylobacter coli, и при обнаружении SIgM прогнозируется затяжное, рецидивирующее течение заболевания, при одновременном обнаружении SIgM и SIgA судят о благоприятном исходе кампилобактериоза.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к инфекционным болезням и лабораторной диагностике, и может быть использовано в практике здравоохранения для прогнозирования течения инфекционного процесса при кампилобактериозе у детей.

Острая кишечная инфекция, этиологически обусловленная бактериями рода Campylobacter, приобретает высокую значимость в патологии детского возраста, поскольку чрезвычайно широко распространена во всех географических регионах. В развитых странах кампилобактериозу принадлежит одно из первых мест среди причин диарей. Так, в странах Европы и США уровень заболеваемости кампилобактериозом составляет 60-90 на 100 тысяч населения в год, что сопоставимо с уровнем сальмонеллеза и шигеллеза в различных возрастных группах. В России эта инфекция остается малоизученной, поэтому регистрация кампилобактериоза в нашей стране невысока (1,9-3,4 на 100 тысяч населения в год). По данным НИИ детских инфекций (Санкт-Петербург) с введением современных методов диагностики доля кампилобактериоза среди инвазивных диарей у детей в 2004 г. составила 19,1%.

Род Campylobacter насчитывает 18 видов, но наибольшее значение в патологии человека имеют виды C.jejuni и С.coli, обуславливающие 80-90% заболеваний.

Кампилобактериоз характеризуется полиморфной клиникой и протекает как в локализованной гастроинтестинальной, так и в генерализованной септической формах. Основное значение для детской инфекционной патологии имеет гастроинтестинальная форма, при которой в 9-15% случаев имеет место негладкое течение инфекционного процесса [Горелов А.В. Кампилобактериоз у детей. // Инфекционные болезни - 2004, т.2. №3, с.80-82].

Высокая частота затяжного, рецидивирующего течения и высокий уровень кампилобактериоза в структуре острых кишечных инфекций у детей обуславливает поиск критериев, позволяющих прогнозировать характер развития инфекционного процесса на ранних этапах заболевания.

В настоящее время известны различные способы оценки прогноза негладкого течения кампилобактериоза, основанные на клинико-анамнестических и лабораторных показателях. Однако попытки связать тяжелое течение заболевания со штаммовыми особенностями возбудителя не оказались эффективны, поскольку с помощью предлагаемого способа не выявляются различия в уровнях вирулентности штаммов, обуславливающих как гладкое, так и негладкое течение инфекции [Konkel ME, Monteville MR, Rivera-Amill V, Joens LA. The pathogenesis of Campylobacter jejuni-mediated enteritis. // Curr Issues In-test Microbiol. - 2001 Sep; 2(2) - P.55-71]. Наряду с вышеописанным, предложен способ оценки реактивности макроорганизма и ее определяющей роли в характере течения инфекционного процесса при кампилобактериозе у детей.

Существующие способы, основанные на оценке клинических и анамнестических данных, позволяют выделить группы риска детей по негладкому течению кампилобактериоза: новорожденные, дети с нутритивной недостаточностью, различными иммунодефицитными состояниями и с тяжелой сопутствующей патологией. Клинически прогноз осуществляется по выраженности отдельных симптомов, особое внимание при этом обращается на глубину местных изменений кишечника [The Increasing Incidence of Human Campylobacteriosis. Report and Proceedings of a WHO Consultation of Experts Copenhagen, Denmark, 21-25 November 2000; 135].

Вместе с тем, несмотря на высокую значимость клинических и анамнестических методов прогнозирования негладкого течения кампилобактериоза, основанных на оценке преморбидного фона, предложенные способы не отличается точностью, специфичностью, чувствительностью, являются субъективными и ориентировочными.

Описан способ прогнозирования характера течения кампилобактериоза, основанный на оценке выраженности микроэкологических нарушений просвета толстой кишки. Метод является более объективным, так как характер и степень микроэкологических нарушений прямо коррелирует с тяжестью заболевания, обусловленное повышением колонизационной активности кампилобактерий [Чайка Н.А., Хазенсон Л.Б., Бутцлер Ж.П. и др. Кампилобактериоз. М.: Медицина, 1988, с.128-148]. Однако и этот метод не лишен недостатков, так как не отражает состояние местного иммунитета и является интегральным показателем уровня неспецифической резистентности организма. Следовательно, используемые методы оценки микроструктуры слизистой толстой кишки, так же как и методы определения общего иммунного и нутритивного статуса ребенка, являются косвенными и неспецифическими прогностическими критериями. Таким образом, объективных специфичных лабораторных способов прогнозирования течения кампилобактериоза в настоящее время не предложено.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ прогнозирования течения различных форм дифтерийной инфекции, заключающийся в определении колонизационной резистентности эпителиоцитов слизистой ротоглотки с определением SIgA в реакции непрямой иммунофлюоресценции [Иванова В.В. и соавт. / Принципы прогнозирования течения дифтерийной инфекции. / Пособие для врачей. - СПб, 1998]. В данном способе материалом для исследования являются браш-биоптаты слизистой миндалин, а определение наличия или отсутствия SIgA служит критерием прогнозирования транзиторного бактерионосительства или формирования затяжного бактериовыделения. Вместе с тем, метод исключает определение фазы инфекционного процесса, поскольку не предусматривает выявление SIgM.

Авторы впервые предлагают способ прогнозирования течения кампилобактериоза, позволяющий согласно изобретению определять наличие в копрофильтрате специфических секреторных иммуноглобулинов классов М и А к антигенам Campylobacter jejuni и Campylobacter coli в реакции непрямой иммунофлюоресценции. При обнаружении только IgM прогнозируется затяжное, рецидивирующее течение заболевания, при одновременном обнаружении специфических секреторных IgM и IgA судят о благоприятном исходе кампилобактериоза.

Технический результат изобретения - в повышении точности и экспрессности.

Авторами впервые предложен объективный лабораторный способ прогнозирования течения кампилобактериоза в раннем периоде заболевания уже через 2 часа после взятия материала (копрофильтрата) от больного ОКИ. Метод имеет ряд отличий и преимуществ. Как было показано выше, на начальном этапе инфекционного процесса при кампилобактериозе определяющими являются характеристики функционального состояния кишечного эпителия, в том числе, способность адекватно секретировать специфический SIgA, блокирующий адгезию возбудителя к эпителиоцитам и колоноцитам.

Согласно изобретению специфический SIgA в копрофильтрате впервые предложен как прогностический критерий характера течения кампилобактериоза: отсутствие SIgA является маркером затяжного или рецидивирующего течения инфекции, а своевременная и адекватная его продукция способствует благоприятному исходу кампилобактериоза. Кроме того, показана возможность определять острую фазу инфекционного процесса по наличию специфического SIgM. Отсутствие специфического SIgM в копрофильтрате используется как критерий диагностики кампилобактериозного бактерионосительства.

В отличие от вышеуказанных способов прогнозирования авторами впервые предлагается осуществлять постановку реакции непрямой иммунофлюоресценции в копрофильтрате больного кампилобактериозом с целью выявления специфических секреторных иммуноглобулинов М и А одновременно на одном предметном стекле к двум наиболее актуальным возбудителям заболевания - Campylobacter jejuni и Campylobacter coli. Способ отличается простотой и доступностью, может быть использован в практике любой бактериологической лаборатории, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования.

Предлагаемый способ прогнозирования течения кампилобактериоза осуществляется следующим способом. В качестве исследуемого материала используют копрофильтрат больного, исследование проводят на предметном стекле с предварительно приготовленным слайд-препаратом антигенов. Для приготовления слайд-препарата на предметное стекло наносят культуру кампилобактерий видов Campylobacter jejuni и Campylobacter coli в виде капель диаметром 0,5 мм в два ряда. Каждый ряд антигенов предназначен для выявления двух классов иммуноглобулинов (М и А соответственно). Полученные мазки подсушивают на воздухе, фиксируют 10-20 мин в ацетоне при +4°С, вновь высушивают на воздухе. После этого слайд-препарат готов и может храниться при комнатной температуре. В дальнейшем на готовый слайд-препарат наносят копрофильтраты, в которых предполагается наличие специфических секреторных иммуноглобулинов А и М. Для прикрепления антител к антигену комплекс слайд-препарат + исследуемый биосубстрат выдерживают в термостате при 37°С во влажной камере 40 минут. Затем препараты трижды отмывают в дистиллированной воде по 10 мин, наносят овечьи моноспецифические сыворотки против SIg человека классов М и А, инкубируют во влажной камере 20 минут, отмывают трижды в дистиллированной воде, высушивают, затем окрашивают смесью с антивидовой люминесцирующей сывороткой (бычий альбумин, меченный родамином, в соотношении 1:1), снова инкубируют в термостате при 37°С во влажной камере 20 мин, отмывают трижды в дистиллированной воде и высушивают на воздухе. Учет результатов реакции проводится в падающем свете в режиме люминесцентной микроскопии. При работе на люминесцентном микроскопе МЛ-2 используют систему светофильтров БС, ФС-4, С3С7-2, иммерсионные объективы, обозначенные буквой «Л», аппертура 1,25; окуляр 7° или 10°, сила тока на пульте микроскопа 4,5 А. О наличии специфических секреторных противокампилобактериозных иммуноглобулинов соответствующего класса в исследуемых образцах копрофильтратов (положительный результат) судят по яркой четкой зеленой флюоресценции по периферии (в области оболочки бактерии), контрастирующей с хорошо различимым темным телом микробной клетки. Морфология вида, как правило, сохраняется.

Оценка интенсивности свечения производится по четырехплюсовой системе:

++++ - очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастируемая с телом клетки;

+++ - яркая люминесцирующая периферия клетки;

++ или + - слабое свечение периферии клетки.

- (минус) - люминисценция клеток отсутствует.

Оценка препарата должна проводиться комплексно с учетом таких показателей, как яркость и цвет специфической флюоресценции, локализация и структура свечения (свечение оболочки). При обнаружении яркого специфического свечения в первом и втором ряду капель судят об остром периоде инфекции с благоприятным исходом (наличие специфического секреторного IgM и IgA). При отсутствии специфического свечения в каплях второго ряда прогнозируется затяжное, рецидивирующее течение заболевания (отсутствие специфического секреторного IgA).

Анализ известных способов на дату подачи заявки показывает, что не существует подобных способов, позволяющих выявить наличие классов специфических местных антител к возбудителям кампилобактериоза непосредственно в копрофильтратах с проведением лабораторного прогнозирования течения кампилобактериозной инфекции, что позволяет нам сделать вывод о существенном преимуществе заявляемого способа. Предлагаемый способ позволяет получить прогноз уже через 2 часа после взятия материала. Кроме того, забор материала исключает перентеральное вмешательство. Постановка реакции и учет результатов позволяют использовать стандартное недорогостоящее оборудование любой баклаборатории, обеспечивает точность.

Предложенный способ апробирован на материале от 72 больных кампилобактериозом в возрасте от 10 месяцев до 14 лет, госпитализированных в клинику НИИ детских инфекций (г.Санкт-Петербург) за период 2001-2004 годы.

Приводим следующие клинические примеры:

1. К.Алеша, 6 лет, ИБ №490, Д-з: кампилобактериоз еюни, гастроинтестинальный вариант, среднетяжелая форма. Заболел остро 26/01 с появления многократных рвот, выраженных болей в животе, жидкий стул со слизью до 3-х раз в сутки, температура субфебрильная. Диагноз установлен в ПЦР и культуральным методом. Получал комплексную терапию, стул нормализовался к 4-му дню стационарного лечения, выписан с улучшением под расписку на 7 день болезни, при этом мать ребенка отказалась от проведения дальнейшей терапии. Рецидив заболевания 4/02 (9 день болезни), протекал с фебрильной лихорадкой, многократными рвотами, частым жидким стулом со слизью, кровью.

Проведено исследование согласно предложенному способу прогнозирования на 3 и 11 день болезни, выявлено наличие специфического IgM и отсутствие специфического IgA в 1-ом и 2-ом анализе. Таким образом, был определен неблагоприятный прогноз течения кампилобактериоза, реализовавшийся в появлении рецидива заболевания, чему способствовало раннее прекращение этиопатогенетической терапии.

2. М.Эля, 2 года 8 месяцев, ИБ №708. Д-з: кампилобактериоз еюни, гастроинтестинальный вариант, среднетяжелая форма.

Ребенок поступил на 2-е сутки заболевания, заболевание протекало на фоне нормальной температуры, с многократными рвотами и жидким стулом со слизью до 6 раз в сутки. Предложенным способом проведено прогнозирование негладкого течения инфекции, т.к. на 3-й день заболевания в копрофильтрате больной отсутствовал специфический секреторный IgA, IgM присутствовал в достаточном количестве. Несмотря на нормализацию стула и самочувствия к 4-му дню болезни и выписку с улучшением на 6 день болезни, было рекомендовано продолжить комплексную терапию амбулаторно. Наблюдение в катамнезе и в течение двух месяцев показало хорошую динамику и гладкое течение реконвалесцентного периода.

3. Ш.Иван, 2 года 6 месяцев, ИБ №140. Д-з: кампилобактериоз еюни, гастроинтестинальный вариант, среднетяжелая форма. Заболевание имело острое начало с фебрильной лихорадки, появления жидкого стула до 5 раз в сутки со слизью и кровью. Ребенок поступил в стационар на третий день болезни, в копрофильтрате обнаружено достаточное количество специфических IgM и IgA. Ребенок получил комплексную терапию, к 5-му дню болезни нормализовался стул и ребенок был выписан под расписку. Катамнестическое наблюдение в течение месяца показало гладкое течение реконвалесцентного периода.

Результаты прогнозирования затяжного, рецидивирующего течения кампилобактериоза представлены в таблице.

Таблица Сравнительная оценка способов прогнозирования течения кампилобактериоза у детей.
Метод прогнозирования (n=72)	Прогнозируемое количество случаев с негладким течением		Установленное (окончательно) количество случаев с негладким течением
	Абс.	%	Абс.	%
Клинико-анамнестический	3	4,2	10	13,8
Лабораторный с определением уровня микроэкологических нарушений толстого кишечника	6	8,3
Лабораторный с выявлением специфических SIgA и SIgM	11	15,3

В отличие субъективного клинического и анамнестического метода и от неспецифического косвенного метода изучения микроэкологических нарушений толстого кишечника предложенный способ делает возможным эффективно прогнозировать негладкое течение кампилобактериоза путем выявления сниженного количества секреторных иммуноглобулинов класса А. Кроме того, выявление IgM определяет острую стадию заболевания, что позволяет проводить этиологическую верификацию диагноза и дифференцировать острую кампилобактериозную инфекцию от бактерионосительства.

Таким образом, авторами впервые предложен способ прогнозирования течения кампилобактериоза, позволяющий в ранние сроки определить негладкое течение заболевания (затяжное или рецидивирующее). Метод является неинвазивным и высоко специфичным. Преимуществом метода является его простота и точность, доступность, быстрота выполнения и возможность использования как у детей групп риска, так и при массовых обследованиях детей с кампилобактериозом.