производные калопорозида, способ их получения и их применение

Формула изобретения

1. Производные калопорозида формулы I

в которых

R₁, R₂ , R₃ независимо друг от друга означают Н или ацильные остатки с 1-10 С-атомами;

R₄ - Н или -С(O)(СН ₂)_nСООН, где n равно 1-7, при условии, что R ₁, R₂, R₃ и R₄ не все означают Н,

а также их физиологически приемлемые соли.

2. Соединение формулы I по п.1, в котором

R₁ , R₂ и R₃ означают независимо друг от друга Н или ацетил и R₄ - Н или малонил (n=1), а также их физиологически приемлемые соли.

3. Соединение формулы I по п.1 или 2, в котором R₁ - ацетил, и R₂ , R₃ и R₄ - Н, а также их физиологически приемлемые соли.

4. Соединение формулы I по п.1 или 2, в котором R₁ и R₃ - ацетил; R₂ - Н и R₄ - малонил, а также их физиологически приемлемые соли.

5. Соединение формулы I по п.1 или 2, в котором R ₁ и R₂ - Н; R₃ - ацетил и R₄ - малонил, а также их физиологически приемлемые соли.

6. Соединение формулы I по п.1 или 2, в котором R₁ и R₃ - Н; R₂ - ацетил и R₄ - малонил, а также их физиологически приемлемые соли.

7. Соединение формулы I по п.1 или 2, в котором R₁, R ₂ и R₄ - H и R₃ - ацетил,

а также их физиологически приемлемые соли.

8. Соединение формулы I или его физиологически приемлемая соль по одному или нескольким пп.1-7, полученные тем, что штамм Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784 ферментирован в аэробных условиях при температуре между 18 и 35°С и рН между 5 и 8, выделено одно или несколько производных калопорозида, которые при необходимости переведены в физиологически приемлемые соли.

9. Способ получения соединения формулы I или его физиологически приемлемой соли по одному или нескольким пп.1-7, отличающийся тем, что штамм Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784 ферментирован в аэробных условиях при температуре между 18 и 35°С и рН между 5 и 8, выделены одно или несколько производных калопорозида, которые при необходимости переведены в физиологически приемлемые соли.

10. Соединение формулы I или его физиологически приемлемая соль по одному или нескольким пп.1-8, пригодные для применения в качестве лекарственного средства, ингибирующего CDK, для лечения рака или других заболеваний с патологическим нарушением пролиферации клеток.

11. Соединение формулы I или его физиологически приемлемая соль по одному или нескольким пп.1-8, пригодные в качестве CDK-ингибитора.

12. Применение соединения формулы I или его физиологически приемлемой соли по одному или нескольким пп.1-8 в качестве CDK-ингибитора для получения лекарственного средства для лечения рака или других заболеваний с патологическим нарушением пролиферации клеток.

13. Лекарственное средство, ингибирующее CDK и содержащее по крайней мере одно соединение формулы I или его физиологически приемлемую соль по одному или нескольким пп.1-8.

14. Способ получения лекарственного средства по п.13, отличающийся тем, что по крайней мере одно соединение формулы I или его физиологически приемлемую соль по одному или нескольким пп.1-8 переводят в подходящую форму введения вместе с подходящими вспомогательными веществами или носителями.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новым биологически активным веществам (производным калопорозида), которые продуцируются микроорганизмом Gloeoporus dichrous Bres. ST001714, DSM 13784, при ферментации, к способу их получения, к их применению в качестве лекарственного средства, к лекарственному средству, содержащему производные калопорозида, а также к микроорганизму Gloeoporus dichrous Bres. ST001714, DSM 13784.

Впервые калопорозид был описан в 1994 как ингибитор фосфолипазы C (W. Weber et al. J. Antibiotics, 47, 1188-1194). В том же году были выделены два других похожих вторичных метаболита (R. Shan et al. Nat. Prod. Lett., 4, 171-178). Согласно изобретению соединения формулы I, описанные ниже, отличаются от описанных там веществ своей структурой.

Рак - протекающее преимущественно со смертельным исходом заболевание человека и животных, которое вызывается неконтролируемым ростом аутогенных клеток. Рак обозначает образование злокачественных опухолей (злокачественных образований), новообразований (опухолей или карцином) или злокачественных перерождений, а также нарушения созревания белых кровяных телец (лейкемия, рак крови). Раковые или опухолевые клетки возникают при превращении аутогенных клеток. Злокачественность раковой клетки выражается в автономности роста, то есть в ее способности, проникая, беспрепятственно расти, не вписываясь в строение органа и сопровождаясь разрушением ткани.

Явными симптомами злокачественности является образование вторичных видоизменений (метастаз) после гематогенного или лимфогенного распространения опухолевых клеток. Рак относится к числу самых частых причин смертности человека, в связи с чем возникает большая потребность в методах и средствах лечения или воздействия на злокачественные перерождения.

Возможность лечения злокачественных опухолей включает, наряду с оперативным удалением опухоли (при возможности радикальным), радиологическую терапию рентгеновским излучением, -, -, -лучами, иммунотерапию и химиотерапию. Иммунотерапия в настоящее время применима только в ограниченной степени. Под химиотерапией опухолей понимают прием клеточных ядов (цитостатиков) для воздействия на опухоли и опухолевые клетки, оставшиеся после локального хирургического вмешательства или облучения. Эти вещества вмешиваются специфически в определенные процессы деления клеток, так что ткани с высоким содержанием в ней делящихся клеток, такие как быстрорастущая ткань опухоли, реагируют более ощутимо. Для применения используются алкилированные соединения, как, например, циклофосфамид (The Merck Index, изд.12, с.463), антиметаболиты, как метотрексат (The Merck Index, изд.12, с.1025), алкалоиды, как винкристин (The Merck Index, изд.12, с.1704), и антибиотики, как дауномицин (The Merck Index, изд.12, с.479), а также адриамицин (The Merck Index, изд.12, с.581-582). Однако все эти агенты имеют из-за многочисленных побочных действий большие недостатки, так как только отдаляют смерть больного, но не предотвращают ее. Кроме того, у перерожденных (раковых) клеток возникает сопротивляемость к применяемому средству. Известные медикаменты более не проявляют цитостатического действия, а становятся токсичными из-за побочных действий. Кроме того, показано, что комбинированное, или последовательное применение цитостатиков превосходит эффективность отдельного цитостатика (монотерапия), и, таким образом, возможно, чтобы значительные побочные эффекты при полихимиотерапии не суммировались. По всем этим причинам новые химиотерапевтические средства являются необходимыми и поэтому являются объектом поисков во всем мире.

Центральную роль при регулировании клеточных циклов играют циклин-зависимые киназы (cyclin-dependent kinases=CDKs). Они катализируют реакции фосфорилирования и приводят в действие каскад реакций, которые инициируют в клеточном цикле переход от фазы G1 (фаза роста 1) в S-фазу (синтезфазу). Поэтому циклин-зависимые киназы представляют собой хорошую терапевтическую мишень для лечения рака и других заболеваний с патологическим нарушением пролиферации клеток. Низкомолекулярные ингибиторы, которые регулируют клеточный цикл и подавляют неконтролируемое деление клеток, были бы вспомогательными лекарственными веществами при лечении больных раком.

К удивлению, было обнаружено, что штамм микроорганизма Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, может создать новые сильнодействующие цитостатики, которые в очень малых концентрациях ингибируют циклин-зависимые киназы.

Предметом изобретения являются поэтому действующие вещества, продуцируемые штаммом Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784 (производные калопорозида), а также их физиологически приемлемые соли, сложные эфиры и очевидные химические эквиваленты.

Изобретение относится, таким образом, к соединениям общей формулы I

где означают:

R₁, R₂ и R₃ независимо друг от друга Н или ацильный остаток с 1-10 С-атомами, предпочтительно с 2-6 атомами, особенно предпочтительно с 2 атомами; и

R₄ Н или -С(О)(СН₂ )_nСООН, где n равно от 1 до 7, предпочтительно от 1 до 3, особенно предпочтительно 1 или 2;

при условии, что не все R₁, R₂, R₃ и R ₄ означают Н;

а также их физиологически приемлемые соли.

Ацильный остаток соединения формулы I может быть линейным или разветвленным, насыщенным или одно- или двукратно ненасыщенным.

Под ацильным остатком с 2 С-атомами понимается, например, ацетильный остаток.

Примерами насыщенных, неразветвленных ацильных остатков являются остаток уксусной кислоты (С=2), остаток пропионовой кислоты (С=3), остаток масляной кислоты (С=4), остаток кислоты (C=3), остаток масляной кислоты (C=4), остаток валериановой кислоты (C=5), остаток капроновой кислоты (C=6), остаток энантовой кислоты (C=7), остаток каприловой кислоты (C=8), остаток пеларгоновой кислоты (C=9) и остаток каприновой кислоты (C=10).

Примерами однократно ненасыщенных, неразветвленных ацильных остатков являются остаток акриловой кислоты (C=3), остаток кротоновой кислоты (C=4) или остаток винилуксусной кислоты (C=4).

Примером дважды ненасыщенного неразветвленного ацильного остатка является остаток сорбиновой кислоты (C=6).

Калопорозиды являются слабодействующими антибиотиками, которые состоят из салициловой кислоты и дисахарида. Оба структурных элемента связаны через алкильную цепь. Сахаридная часть соединения формулы I может быть дисахаридом, состоящим соответственно из D-пиранозы альдогексозы (как, например, D-глюкопираноза или D-галактопираноза) и он-кислоты альдогексозы (например, D-глюконовая кислота). Предпочтительно сахаридная составляющая является D-маннопиранозил-D-манноновой кислотой, которая незамещена или замещена R₂, R ₃ и/или R₄, как определено выше.

Изобретение включает далее

a) соединение формулы I, в котором R ₁=ацетил; R₂=R₃=R₄=H (=калопорозид B: суммарная формула: C₃₈H₆₂O₁₆ , молекулярный вес 774,9), а также их физиологически приемлемые соли;

b) соединение формулы I, в котором R₁=R ₃=ацетил; R₂=H; R₄=малонил (=калопорозид C: суммарная формула: C₄₃H₆₆О₂₀ , молекулярный вес 902,99), а также их физиологически приемлемые соли;

c) соединение формулы I, в котором R₁=R ₂=H; R₃=ацетил; R4=малонил (=калопорозид D: суммарная формула: C₄₁H₆₄О₁₉ , молекулярный вес 806,96), а также их физиологически приемлемые соли;

d) соединение формулы I, в котором R₁=R ₃=H; R₂=ацетил; R₄=малонил (=калопорозид E: суммарная формула: C₄₁H₆₄O₁₉ , молекулярный вес 806,96), а также их физиологически приемлемые соли;

e) соединение формулы I, в котором R₁=R ₂=R₄=H; R₃=ацетил (=калопорозид F: суммарная формула: C₃₈Н₆₂О₁₆ , молекулярный вес 774,9), а также их физиологически приемлемые соли.

Центры хиральности в соединениях формулы I могут, если не оговорено другое, быть в форме R- или S-конфигурации. Изобретение относится как к оптически чистым соединениям, так и стереоизомерным смесям, как смеси энантиомеров и диастереомеров.

Согласно изобретению соединения формулы I получают путем ферментации Gloeoporus dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784 или одного из его вариантов или мутантов в подходящих условиях в культуральной среде, пока в культуральной среде не накопится один или несколько производных калопорозида формулы I. Путем последующего выделения соединения и, при необходимости, превращения в химические эквиваленты, а также их физиологически приемлемые соли получают производные калопорозида.

Поэтому изобретение относится далее к способу получения соединения формулы I, отличающемуся тем, что микроорганизм Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784 или один из его вариантов или мутантов ферментируют при подходящих условиях в культуральной среде до тех пор, пока в культуральной среде не накопится одно или несколько целевых соединений, и затем выделяют из культуральной среды и при необходимости превращают в химические эквиваленты и/или физиологически приемлемые соли.

Предпочтительно штамм ST001714, DSM 13784, его мутанты и/или варианты ферментируют в питательном растворе или твердой среде (обозначаемой также культуральной средой) с источниками углерода и азота, а также обычными неорганическими солями, пока соединения согласно изобретению не накопятся в культуральной среде, затем соединения выделяют из культуральной среды и при необходимости разделяют на отдельные активные компоненты.

Способ согласно изобретению может применяться для ферментации в масштабе лаборатории (объем от миллилитра до литра) и в промышленном масштабе (масштаб кубических метров).

Штамм Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714 размножали в форкультуре. Изолят был внесен в реестр Deutschen Sammlung von Mikroorganismen и Zellkulturen GmbH (Немецкое собрание микроорганизмов и клеточных культур), Mascheroder Weg 1B, 3300 Брауншвейг, Германия, согласно правилам Будапештского договора, 14 декабря 1999 под следующим номером: DSM 13784.

Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, имеет белый мицелий и пурпурно окрашенные споры. Он встречается предпочтительно на Betula, но может нападать также на других хозяев, как, например, Alnus, Salix, Populus, Ulmus, Prunus.

Вместо штамма Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, могут также использоваться его мутанты и варианты, которые синтезируют одно или несколько соединений согласно изобретению. Такие мутанты могут производиться по известным способам физическими средствами, например облучением, как ультрафиолетовым или рентгеновским излучением, или химическими мутагенами, как, например, этилметансульфонатом (ЭМС), 2-гидрокси-4-метокси-бензофеноном (МОБ) или N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуадинином (МННГ).

Скрининг на мутанты и варианты, синтезирующие одно или несколько соединений согласно изобретению, происходит по следующей схеме:

- лиофилизация планшетной разводки;

- экстракция лиофилизата органическим растворителем;

- экстракция соединения из культурального фильтрата с помощью твердой фазы;

- анализ с помощью ВЭЖХ, DC или путем проверки биологической активности.

Описываемые далее условия ферментации подходят для Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, внесенного в список изолята DSM 13784, а также их мутантов и вариантов.

В питательном растворе, содержащем источник углерода и источник азота, а также обычные неорганические соли, Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, продуцирует производные калопорозида.

В качестве предпочтительных источников углерода для ферментации подходят ассимилируемые углеводы и спирты, дающие при окислении моносахарид, например глюкозу, лактозу, сахарозу или D-маннит, а также содержащие углеводы натуральные продукты, как, например, солодовый экстракт. В качестве азотсодержащих питательных веществ принимают во внимание аминокислоты, пептиды и белки, а также продукты их расщепления, как казеин, пептоны или триптоны, далее, мясные экстракты, экстракты дрожжей, размолотые семена, например, кукурузы, пшеницы, бобов, сои или хлопка, остатки перегонки при получении спирта, мясной муки или экстрактов дрожжей, но также и соли аммония и нитраты, в частности также получаемые синтетически или биосинтезом пептиды. В качестве неорганических солей питательный раствор может содержать, например, хлориды, карбонаты, сульфаты или фосфаты щелочных или щелочноземельных металлов, железа, цинка, кобальта и марганца.

Образование соединений согласно изобретению протекает особенно хорошо в питательном растворе, который содержит примерно от 0,05 до 5%, предпочтительно от 1 до 2%, солодового экстракта, от 0,05 до 3%, предпочтительно от 0,05 до 1%, экстракта дрожжей и от 0,2 до 5%, предпочтительно от 0,5 до 2%, глюкозы, от 0,5 до 3%, предпочтительно от 0,5 до 1%, порошка целлюлозы и следы сульфата аммония. Процентные величины рассчитаны соответственно на вес всего питательного раствора.

В этом питательном растворе Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres ST001714, DSM 13784 образует смесь производных калопорозида. Составом питательного раствора можно варьировать количественную долю одного или нескольких производных калопорозида согласно изобретению. Кроме того, составом среды можно так управлять синтезом отдельных производных калопорозида, чтобы какое-либо производное калопорозида не образовывалось совсем или образовывалось в количестве ниже границы обнаружения микроорганизмом.

Культивирование микроорганизма происходит аэробно, так, например, с помощью встряхивания или перемешивания в колбе на качалке или с помощью ферментеров, при необходимости с подачей воздуха или кислорода, или на твердой среде. Оно может проводиться в температурном интервале от 18 до 35°C, предпочтительно от 20 до 30°C, особенно предпочтительно от 25 до 30°C. pH должно находиться в интервале между 5 и 8, предпочтительно между 5,5 и 6,5. Микроорганизм культивируют при этих условиях, как правило, в течение 24-720 часов, предпочтительно от 288 до 576 часов.

Целесообразно проводить культивирование в несколько этапов, т.е. сначала производят одну или несколько форкультур в жидкой питательной среде, которые затем пересевают непосредственно в продуцирующую среду (основную культуру), например, при объемном содержании 1:10. Форкультуру получают, например, тем, что мицелий пересевают в питательный раствор и оставляют расти в течение 36-120 часов, предпочтительно от 48 до 72 часов. Мицелий может быть получен, например, тем, что штамм оставляют расти на срок примерно от 3 до 40 дней, предпочтительно от 10 до 30 дней, на твердой или жидкой питательной среде, например смеси солод-дрожжи-агар или картофель-декстроза-агар.

Процесс ферментации можно отслеживать по значениям pH культур или по объему мицелия, а также хроматографическими методами, как, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), или проверкой биологической активности.

Процесс выделения, описываемый далее, служит для очистки производных калопорозида согласно изобретению.

Выделение или очистка производного калопорозида согласно изобретению из культуральной среды протекает по известным методам с учетом химических, физических и биологических свойств натуральных веществ. Для проверки концентрации соответствующих производных калопорозида в культуральной среде или на отдельных этапах выделения может применяться ВЭЖХ, причем количество образованного вещества сравнивают целесообразно с эталонным раствором.

Для выделения соединений согласно изобретению культуральный бульон или культуру вместе с твердой средой лиофилизируют, затем производные калопорозида экстрагируют от лиофилизата органическим растворителем, смешиваемым при необходимости с водой. Фаза органического растворителя содержит натуральные вещества согласно изобретению, их при необходимости концентрируют в вакууме и очищают далее.

Дальнейшая очистка одного или нескольких соединений согласно изобретению происходит с помощью хроматографии на подходящих материалах, предпочтительно, например, на молекулярных ситах, на силикагеле, окиси алюминия, ионообменниках или адсорбирующих смолах или на обращенных фазах (reversed phase, RP). С помощью этой хроматографии разделяют производные калопорозида. Хроматография производных калопорозида происходит с буферными водными растворами или смесями водных и органических растворов. Под смесями водных или органических растворов понимают все смешиваемые с водой органические растворители, предпочтительно метанол, пропанол и ацетонитрил, в концентрации растворителя от 5 до 80%, предпочтительно от 20 до 50%, или также все буферные водные растворы, которые смешивают с органическими растворителями. Используемые буферы те же, что и указанные выше.

Разделение производных калопорозида из-за их различных полярностей происходит с помощью хроматографии обращенной фазы, например, на MCI® (адсорбирующая смола производства Мицубиси, Япония) или Amberlite XAD® (TOSOHAAS), на других гидрофобных материалах, как, например, на фазах RP-8 или RP-18. Кроме того, разделение может проходить с помощью хроматографии нормальных фаз, например, на силикагеле, окиси алюминия и подобных.

Хроматография производных калопорозида происходит с помощью забуференных или подкисленных водных растворов или смесей водных растворов со спиртами или другими смешиваемыми с водой органическими растворителями. В качестве органических растворителей предпочтительно применяют пропанол и ацетонитрил.

Под забуференными или подкисленными водными растворами понимают, например, воду, фосфатный буфер, ацетат аммония, цитратный буфер в концентрации от 0 до 0,5 M, а также муравьиную кислоту, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту или все стандартные известные специалисту кислоты, предпочтительно в концентрации от 0 до 1%. В буферных водных растворах особенно предпочтителен 0,1%-ный ацетат аммония.

Хроматографию проводят с градиентом, начиная от 100% воды и оканчивая 100% растворителя, предпочтительно с линейным градиентом от 20 до 100% пропанола или ацетонитрила.

Альтернативно может проводиться также гель-хроматография или хроматография на гидрофобных фазах.

Гель-хроматографию проводят на полиакриламиде или смешанных полимерных гелях, как, например, Biogel-P 2® (производство Biorad) или Fractogel TSK HW 40® (производство Merck, Германия или Toso Haas, США).

Последовательность вышеуказанных хроматографий обратимая.

Соединения согласно изобретению стабильны в твердом состоянии и в растворах в области pH от 3 до 8, в частности от 5 до 7, и позволяют тем самым переработку в обычные фармацевтические готовые формы.

Благодаря своим ценным фармакологическим свойствам одно или несколько соединений согласно изобретению подходят для применения в медицине человека или животных в качестве лекарственного средства.

Настоящее изобретение относится тем самым к применению соединения формулы I или его физиологически приемлемой соли для получения цитостатического средства для лечения опухолевых заболеваний.

Далее, настоящее изобретение относится ко всем очевидным химическим эквивалентам соединений формулы I согласно изобретению. Такими эквивалентами являются соединения, которые имеют незначительное химическое различие, но имеющие равное действие или превращающиеся при мягких условиях в соединения согласно изобретению. К указанным эквивалентам относятся, например, также соли, продукты восстановления, сложные и простые эфиры, ацетали или амиды соединений согласно изобретению, а также эквиваленты, которые специалист может получить стандартными методами, кроме того, все оптические антиподы, диастереомеры и все стереомерные формы.

Под физиологически приемлемыми солями соединений формулы I понимают как их органические, так и неорганические соли, как они описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (изд.17, с.1418 (1985)). Благодаря физической и химической стабильности и растворимости для кислых групп предпочтительны соли натрия, калия, кальция и аммония; для основных групп предпочтительны соли соляной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты или карбоновых или сульфоновых кислот, как, например, уксусной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты и п-толуолсульфокислоты.

Сложный эфир, простой эфир и ацетали могут быть получены методами, описанными в литературе, например, в Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J. March, John Wiley&Sons, 1992 или Protective Groups in Organic Synthesis 3^rd Edition, T. W. Greene & P.G. M.Wuts, John Wiley&Sons, 1999.

Карбоксильная группа может, например, быть восстановлена LiAlH₄ до спирта.

Сначала из соединений формулы I посредством щелочного гидролиза может отщепляться гликозидная часть (W. Weber et al. J. Antibiotics, 47, 1188-1194). Затем гликозилированием (например, реакцией Конига-Кнорра) могут вводиться желаемые остатки сахаров. Соответствующие методы описаны в литературе, например в Carbohydrate Chemistry, J. F. Kennedy, Oxford University Press, 1988.

Механизм действия производных калопорозида неизвестен, однако может быть подтвержден значительный эффект.

Для доказательства ингибиторов CDKs пользуются тестом, при котором скорость фосфорилирования субстрата специфического пептида измеряется с помощью циклин-зависимых киназ. Циклин-зависимые киназы активируются связыванием с соответствующим циклином. [ -P]-фосфат переносят от [ -P]-ATP через энзим на субстрат пептида. Тест проводится на 96-луночном микротитровальном планшете: измеряется радиоактивность нанесенного на субстрат [ -P]-фосфата.

Величины IC₅₀ для производных калопорозида приведены в Таблице 1; это концентрация, которая деактивирует CDK-4 до 50%.

Таблица 1
калопорозид B	1,5 мкМ
калопорозид C	3,1 мкМ
калопорозид D	1,8 мкМ
калопорозид E	1,8 мкМ
калопорозид F	1,5 мкМ

Далее, настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему по крайней мере одно соединение согласно изобретению.

Одно или несколько соединений производных калопорозида согласно изобретению могут в принципе применяться индивидуально, в виде однокомпонентного вещества. Предпочтительно применение в смеси с подходящими вспомогательными веществами или наполнителями. В качестве наполнителей в лекарственных средствах могут применяться обычные фармакологически приемлемые наполнители и/или вспомогательные вещества.

Согласно изобретению лекарственные средства применяются обычно орально или парентерально, но принципиально возможно также и ректальное применение. Подходящими твердыми или жидкими фармацевтическими готовыми формами являются например, грануляты, порошки, таблетки, драже, (микро)капсулы, свечи, сиропы, эмульсии, суспензии, аэрозоли, капли или растворы для инъекций в ампулах, а также препараты с пролонгированным выделением активного вещества, при их получении обычно находят применение такие наполнители и добавки и/или вспомогательные средства, как репелленты, связующие, обволакивающие средства, агенты набухания, мягчители или смазывающие средства, вкусовые наполнители, подсластители или агенты растворения. В качестве часто применяемых наполнителей или вспомогательных веществ могут быть названы, например, карбонат магния, двуокись титана, лактоза, маннит и другие сахара, тальк, молочный белок, желатин, крахмал, витамины, целлюлоза и их производные, животные или растительные масла, полиэтиленгликоль и растворители, как, например, стерильная вода, спирты, глицерин и многозначные спирты.

При необходимости отдельные дозировочные единицы для орального применения могут помещаться в микрокапсулы, чтобы замедлить поступление или продлить его на большее время, как, например, покрытием или обволакиванием действующего вещества, находящегося в форме частиц, подходящими полимерами, восками и т.п.

Предпочтительно фармацевтические препараты производятся и применяются в отдельных дозировках, причем каждая единица содержит в качестве активной составной части определенную дозу одного или нескольких соединений согласно изобретению производных калопорозида. В твердых дозировочных единицах, как таблетки, капсулы и суппозитории, эта доза составляет в день примерно до 500 мг, предпочтительно, однако, от 0,1 до 200 мг, а в растворах для инъекций в ампулах - примерно до 200 мг, но предпочтительно от 0,5 до 100 мг.

Дневная доза для приема зависит от веса тела, возраста, пола и состояния млекопитающего. При определенных обстоятельствах могут быть уместны, однако, и более высокие или низкие дневные дозировки. Применение дневной дозы может происходить как однократным приемом в форме отдельной дозировочной единицы или также в нескольких меньших дозировочных единицах, а также неоднократным приемом разделенной дозы через определенные интервалы.

Лекарственные средства согласно изобретению получают тем, что одно или несколько соединений согласно изобретению вместе с обычными наполнителями, а при необходимости также и добавками и/или вспомогательными веществами переводят в подходящую для применения форму.

В последующих примерах изобретение поясняется далее. Процентные соотношения представлены в виде процентных весовых соотношений. Соотношение смесей в жидкостях представлено в виде объемных соотношений, если не указано иное.

Примеры

Пример 1

Получение культуры глицерина из Gloeoporus dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784

100 мл питательного раствора (солодовый экстракт 2,0%, экстракт дрожжей 0,2%, глюкоза 1,0% (NH₄)₂HPO ₄ 0,05%, pH 6,0) в стерильной 300-миллилитровой колбе Эрленмейера засевали штаммом Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784 и инкубировали в течение 7 дней при 25°C и 140 об/мин на вращающейся вибрационной машине. 1,5 мл этой культуры затем разбавляли 2,5 мл 80%-ного глицерина и хранили при -135°C.

Пример 2

Получение форкультуры в колбе Эрленмейера из Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784

30 мл питательного раствора (солодовый экстракт 2,0%, экстракт дрожжей 0,2%, глюкоза 1,0% (NH₄)₂HPO ₄ 0,05%, pH 6,0) засевали в стерильной 100-миллилитровой колбе Эрленмейера штаммом Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, и инкубировали 4 дня при 25°C и 140 об/мин на вращающейся вибрационной машине. Затем при получении основной культуры для планшета засевали 2 мл этой форкультуры.

Пример 3

Получение основной культуры Gloeoporus dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784 на планшетах с твердой средой

Стерильные планшеты 25Ч25 см (производство Nunc) поливали 200 мл следующего питательного раствора: 20 г/л солодового экстракта, 2 г/л экстракта дрожжей, 10 г/л глюкозы и 0,5 г/л (NH₄ )₂HP0₄, pH 6,0. Эти планшеты засевали 2 мл форкультуры каждый. Максимальный выход одного или нескольких соединений согласно изобретению достигался приблизительно через 480 часов.

Пример 4

Получение производных калопорозида

Получали 50 штук планшетов 25Ч25 см и засеивали форкультурой:

Питательная среда:

20 г/л солодовый экстракт

2 г/л экстракт дрожжей

10 г/л глюкоза

0,5 г/л (NH ₄)₂HPO₄

pH 6 (перед стерилизацией)

время инкубирования: 480 ч

температура инкубирования: 25°C

Пример 5

Выделение смеси калопорозида из культуры, находящейся в лунках планшета, микроорганизмом Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784

По окончании ферментации Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, луночные культуры, полученные по примеру 3, лиофилизировали и лиофилизат экстрагировали 5 литрами метанола. Содержащий активное вещество метанольный раствор отделяли от остатка путем фильтрации и концентрировали в вакууме. Концентрат разбавляли водой и наносили на подготовленную заранее 1,0-литровую колонку MCI GEL, CHP20P. Элюировали с градиентом от воды до 100% ацетонитрила. Поток через колонку (25 мл в минуту) отбирали по фракциям (по 25 мл) и фракции, содержащие производные калопорозида (от 40% до 100% ацетонитрила), соединяли. Концентрирование в вакууме и последующая лиофилизация дают 8,5 г желто-коричневого порошка.

Пример 6

Предварительное разделение производных калопорозида путем хроматографии на RP18

0,5 г продукта, полученного по примеру 4, наносили на колонку Nucleosil® 100-7 C18 HD (размер 40 мм Ч 250 мм). Элюировали с градиентом от 20% ацетонитрила (+ вода с добавкой 0,1% ацетата аммония) до 100% ацетонитрила при скорости потока 35 мл в минуту. Выход из колонки отбирали по фракциям (35 мл). В основном во фракциях 39-68 содержались производные калопорозида. Их соединяли, освобождали в вакууме от растворителя и затем лиофилизировали. При этом чистота калопорозида B (22,4 мг) и F (10,5 мг) уже была >95%. Чистота калопорозида C (фракция 41; 43,4 мг), D (фракции 43-45; 76,2 мг) и E (фракции 43-45; 76,2 мг) составляла примерно 70%, и поэтому далее они еще очищались с помощью хроматографии.

Пример 7

Очистка калопорозида C, D и E.

20 мг выделенного по примеру 5 и очищенного калопорозида C наносили на колонку LUNA® 5 мкм C18(2) (размер 10 мм Ч 250 мм) и хроматографировали с градиентом ацетонитрила от 25 до 35% в смеси 0,1%-ный ацетат аммония/вода. Поток элюента составляет 6,5 мл в минуту, размер фракции 6,5 мл. Во фракциях 35-42 находится калопорозид C. Лиофилизацией названных фракций получали калопорозид C (7,5 мг) с чистотой >95%.

25 мг выделенной по примеру 5 и очищенной смеси калопорозида D и E наносили на колонну LUNA ^® 5 мкм C18(2) (размер 10 мм Ч 250 мм) и хроматографировали с градиентом ацетонитрила от 30 до 40% в смеси 0,1%-ный ацетат аммония/вода. Поток элюента составляет 6,5 мл в минуту, размер фракции 6,5 мл. Во фракциях 18 и 19 находится калопорозид D, во фракциях 20 и 21 - калопорозид E. Лиофилизацией указанных фракций получали калопорозид D (7,0 мг) и калопорозид E (6,0 мг) с чистотой >95%.

Физико-химические, а также спектроскопические свойства веществ согласно изобретению могут быть кратко описаны следующим образом:

Калопорозид B:.

Суммарная формула: C₃₈H₆₂О₁₆

Молекулярный вес: 774,9

УФ-максимумы: 208, 244, 310

¹ H и ¹³C-ЯМР: см. Таблицу 2

FAB масс-спектр высокого разрешения обнаруживает интенсивный M+H⁺ при m/z 775,4120 Da, в хорошем соответствии с рассчитанной массой (для C₃₈ H₆₃O₁₆, моноизотопического) 775,4116 Da.

Калопорозид C:

Суммарная формула: C₄₃H ₆₆O₂₀

Молекулярный вес: 902,99

УФ-максимумы: 208, 244, 310

¹H и ¹³C-ЯМР: см. Таблицу 3

FAB-масс-спектр высокого разрешения обнаруживает интенсивный M+H⁺ при m/z 903,4264 Da, в хорошем соответствии с рассчитанной массой (для C₃₆H₇₁О₂₅ , моноизотопического) 903,4284 Da.

Калопорозид D:

Суммарная формула: С₄₁H₆₄O₁₉

Молекулярный вес: 860,96

УФ-максимумы: 208, 244, 310

¹H и ¹³C-ЯМР: см. Таблицу 4

FAB-масс-спектр высокого разрешения обнаруживает интенсивный M+Na⁺ при m/z 883,3942 Da, в хорошем соответствии с рассчитанной массой (для С₄₁H₆₄O ₁₉Na, моноизотопического) 883,3939 Da.

Калопорозид E:

Суммарная формула: С₄₁H₆₄O ₁₉

Молекулярный вес: 860,96

УФ-максимумы: 208, 244, 310

¹H и ¹³C-ЯМР: см. Таблицу 4

FAB-масс-спектр высокого разрешения обнаруживает интенсивный M+H⁺ при m/z 883,3942 Da, в хорошем соответствии с рассчитанной массой (для С₄₁H₆₄O₁₉ Na, моноизотопического) 883,3939 Da.

Калопорозид F:

Суммарная формула: C₃₈H₆₂О₁₆

Молекулярный вес: 774,9

УФ-максимумы: 208, 244, 310

¹H и ¹³C-ЯМР: см. Таблицу 5

FAB-масс-спектр высокого разрешения обнаруживает интенсивный M+H⁺ при m/z 775,4128 Da, в хорошем соответствии с рассчитанной массой (для C₃₈H₆₃О₁₆ , моноизотопического) 775,4116 Da.

Таблица 2 1H и 13C химические сдвиги калопорозида B в метаноле-d4 и ДМСО-d 6 при 300K
	ДМСО	MeOD	ДМСО	MeOD
1	-	-	171,24	a)
2	-	-	а)	а)
3	-	-	162,22	163,57
4	6,68	6,77	115,28	116,81
5	7,17	7,25	˜131,6	b
6	6,57	6,67	121,02	˜123,0
7	-	-	137,90	139,57
8	а)	а)	а)	а)
9	а)	а)	а)	а)
10-20	1,30-1,20	1,32-1,27	29,01-28,69	30,76-30,47
21	1,30	1,38/1,32	24,81	26,52
22	1,54/1,45	1,65/1,52	35,31	37,00
23	4,81	4,95	70,04	73,09
24	1,15	1,24	19,69	20,22
1'	-	-	173,43	175,35
2'	3,95	4,13	70,89	72,97
3'	3,95	4,17	70,04	71,59
4'	3,54	3,82	67,96	69,80
5'	3,65	3,86	78,94	80,12
6'	3,74/3,44	3,90/3,69	62,11	63,25
1"	4,53	4,71	100,27	101,34
2"	3,74	3,95	70,37	72,46
3"	3,22	3,44	73,67	75,30
4"	3,21	3,49	67,54	69,00
5"	3,04	3,22	77,15	78,23
6"	3,72/3,31	3,88/3,63	61,80	63,25
Ac-C'	-	a)	-	a)
Ac-Me	a)	a)	a)	a)
a) Для этих протонов/атомов углерода в MeOD, соответственно ДМСО, никаких сигналов не наблюдалось (агрегация).

Таблица 3 1H и 13C химические сдвиги калопорозида C в метаноле-d4 при 300K
	1H	13C
1	-	175,90
2	-	116,73
3	-	163,67
3-Ac-Me	a)	a)
3-Ac-C'	-	a)
4	6,73	116,73
5	7,16	˜132,6b)
6	6,55	123,53
7	-	139,51
8	2,49	43,06
9	1,53	24,75
10-20	1,36-1,26	30,78-30,62
21	1,38/1,33	26,54
22	1,65/1,52	37,02
23	4,95	73,04
24	1,24	20,22
1'	-	175,17
2'	4,17	72,82
3'	4,08	71,60
4'	3,71	69,79
5'	4,07	76,38
6'	4,60/4,14	66,43
7'	-	170,55
8'	3,27c)	˜44,8
9'	-	173,12
1"	4,93	99,40
2"	5,33	73,40
3"	3,72	73,40
4"	3,42	69,34
5"	3,34	78,19
6"	3,89/3,62	63,11
2"-Ac-Me	2,11	21,17
2"-Ac-C'	-	172,56
а) Для этих ядер сигналов не наблюдалось (сильное расширение сигнала). b) Расширение сигнала c) Сигнал от протонов в положении 8' наблюдается только для свежеприготовленного раствора (быстрый обмен на дейтерий).

Таблица 4 1 H и 13C химические сдвиги калопорозида D и E в метаноле-d4 при 300K
	1H калопорозид D	13 C калопорозид D	1H калопорозид E	13С калопорозид E
1	-	-	176,28	176,28
2	-	-	120,37	120,37
3	-	-	162,12	162,12
4	6,61	6,61	114,91	114,91
5	7,06	7,06	131,53	131,53
6	6,58	6,58	122,23	122,23
7	-	-	147,22	147,22
8	3,04	3,04	36,31	36,31
9	1,55	1,55	33,35	33,35
10-20	1,36-1,25	1,36-1,25	31,07-30,61	31,07-30,61
21	1,38/1,32	1,38/1,32	26,53	26,53
22	1,65/1,53	1,65/1,53	37,01	37,01
23	4,95	4,95	73,13a)	73,07a)
24	1,24	1,24	20,23	20,23
1'	-	-	175,18	175,40
2'	4,17	4,15	72,80	72,80
3'	4,08	4,15	71,61	71,53
4'	3,71	3,85	69,78	69,27
5'	4,07	4,08	76,40	77,07
6'	4,58/4,14	4,59/4,24	66,35	65,43
7'	-	-	˜170,4	˜170,4
8'	3,28	3,28	˜45,0	˜45,0
9'	-	-	˜173,0	˜173,0
1"	4,93	4,84	99,40	100,20
2"	5,33	4,03	73,41	70,27
3"	3,72	4,78	73,39	77,44
4"	3,42	3,71	69,32	66,35
5"	3,34	3,38	78,35	78,00
6"	3,91/3,62	3,89/3,65	63,09	62,96
2"/3"-Ac-Me	2,11	2,00	21,18	20,98
2"/3"-Ac-C'	-	-	172,59	172,36
а) Эти сигналы не могут быть отнесены однозначно.

Таблица 5 1H и 13C химические сдвиги калопорозида F в метаноле-d4 при 300K
	1H	13С
1	-	174,95
2	-	117,32
3	-	162,18
4	6,68	115,42
5	7,17	133,17
6	6,67	122,65
7	-	146,91
8	2,93	36,57
9	1,56	33,27
10-20	1,36-1,25	30,93-30,62
21	1,35	26,53
22	1,65/1,53	37,02
23	4,95	73,05
24	1,24	20,23
1'	-	175,15
2'	4,17	72,98
3'	4,09	71,73
4'	3,71	69,88
5'	3,85	79,59
6'	3,90/3,61	63,57
1"	4,88	99,76
2"	5,37	73,52
3"	3,63	73,56
4"	3,46	69,27
5"	3,28	78,33
6"	3,91/3,63	63,06
Ac-C'	-	173,03
Ac-Me	2,13	21,21

Пример 8

Биоанализ на ингибиторы CDK-4

Для определения величины IC₅₀ натуральных веществ согласно изобретению готовили концентрированные растворы в концентрации 10 мМ. 384-луночные Flash-планшеты покрывали 50 мкл слоем (50 мкг/лунка) биотинилированного субстрата пептида при комнатной температуре в течение 2 часов и затем трижды промывали буфером PBS. Для реакции на планшеты прикапывали 30 мкл разбавленного буфером раствора производного калопорозида и 20 мкл предварительно смешанного раствора ATP/циклинD1/CDK4 (конечная концентрация: 1 Ci 33P- -ATP, 2 мкМ ATP и 1 мкг смеси энзимов). Через 2 часа протекания реакции при 37°C планшеты трижды промывали, каждый по 80 мкл 3%-ной фосфорной кислоты, после чего в течение 30 секунд проводили измерения микробета-счетчиком. Определение процентного ингибирования происходит с помощью математических уравнений. Для определения величин IC₅₀ тестировали 10 концентраций свежеразбавленного раствора ДМСО веществ согласно изобретению.