фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии

Формула изобретения

Кватернизованные фталоцианины общей формулы

МРс(СН ₂Х)_nCl_n,

где Рс - остаток фталоцианина С₃₂Н₁₆N₈,

M - Zn, AlY,

n=6÷8,

Y - Cl, ОН, OSO₃Н,

как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно - к фотосенсибилизаторам для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и ряда других патологических состояний.

Метод ФДТ основан на применении природных или синтетических фотосенсибилизаторов (ФС), которые обладают тропностью к опухолевой ткани. При облучении светом определенной длины волны ФС переходит в активированное состояние, которое инициирует образование цитотоксических агентов, в частности свободных радикалов и синглетного кислорода, вызывающих разрушение опухолевой ткани.

В настоящее время в клинической практике применяют ФС, относящиеся к классу гематопорфиринов, например фотофрин-2 и фотогем, которые используются для лечения опухолей различных поверхностных локализаций (Van Lier J.Phtalocyanines as sensitizers for PDT of cancer // Photodynamic Therapy of Neoplastic Disease, CRS Press, Boca Raton, FL, 1990, vol.1, pp.279-291). Недостатками ФС этого класса являются: поглощения при длине волны 620-640 нм, что позволяет поражать опухоль глубиной до 0.5 см; низкая интенсивность поглощения в максимуме (величина экстинкции =3000), невысокая селективность накопления в опухолевой ткани; медленное выведение из организма и, как следствие, повышенная кожная фоточувствительность.

Преимущества в некотором отношении имеют ФС на основе хлоринов, например радохлорин и фотодитазин. Препарат на основе хлорина е₆ фотодитазин с максимумом поглощения при 662 нм имеет более высокую селективность накопления в опухоли и проникающую способность в ткани (Романько Ю.С., Цыб А.Ф., Каплан М.А. и др. Влияние фотодинамической терапии с фотодитазином на морфо-функциональные характеристики саркомы M1 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. Т.138. №12. С.658-665).

Перспективными ФС являются производные фталоцианина, например фотосенс. Препарат фотосенс на основе сульфированных производных фталоцианина алюминия имеет максимум поглощения в более длинноволновой области спектра ( _max=675 нм), высокий коэффициент молярной экстинкции (свыше 100000), высокий квантовый выход флуоресценции (Патент РФ N 2220722. А 61 К 31/409, 2004). Это позволяет добиваться фотоиндуцированных некрозов на глубине до 1.0 см, а также проводить многократные курсы ФДТ с использованием одной инъекции фотосенса (Вакуловская Е.Г., Шенталь В.В. Фотодинамическая терапия и флуоресцентная диагностика у больных раком кожи головы и шеи // Материалы 6 Ежегодной Российской онкологической конференции. Москва. 2002. С.44-45).

Однако в ходе клинического изучения были выявлены недостатки фотосенса: недостаточно высокая селективность накопления в опухолевых клетках, длительное сохранение в тканях и, как следствие, увеличение фототоксичности кожи.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности лечения злокачественных новообразований с использованием ФДТ на основе ФС, характеризующихся высокой тропностью к опухолевой ткани, поглощением в более длинноволновой области спектра (675-700 нм), уменьшением побочных эффектов за счет сокращения времени циркуляции в организме и обладающих высокой фо-тоиндуцированной активностью.

Для решения этой задачи в качестве ФС для ФДТ предлагается использование положительно заряженных фталоцианинов - катионных кватернизованных хлорме-тилзамещенных фталоцианинов с различными боковыми заместителями и центральными атомами металла следующей общей формулы:

где Рс=остаток фталоцианина C₃₂H ₁₆N₈,

М=Zn, AlY,

n=6÷8,

Y=Cl, OH, OSO₃H, например:

ZnPcChol₈ - октакис(2-гидроксиэтилдиметиламмониометил)фталоцианин цинка октахлорид;

AlPcChol₈ - октакис(2-гидроксиэтилдиметиламмониометил)фталоцианин хлоралюминия октахлорид;

ZnPcPym₈ - октакис(пиридиниометил)фталоцианин цинка октахлорид;

AlPcPym₈ - октакис(пиридиниометил)фталоцианина хлоралюминия октахлорид;

ZnPcTmed₈ - октакис(N-(2-(диметиламино)этил)-N,N-диметиламмониометил)фталоцианин цинка октахлорид;

ZnPcThea₈ - октакис(N,N,N-три(2-гидроксиэтил)аммониометил)фталоцианин цинка октахлорид;

ZnPcPmed₈ - октакис(N,N-диметил-N-(2-триметиламмониоэтил)аммониометил)фталоцианин цинка октаиодид октахлорид.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

К 2.5 г (2.58 ммоль) октакис(хлорметил)фталоцианина цинка (найдено, %: Cl 29.05; вычислено, %: Cl 29.36), полученного аналогично описанному в патенте №844338, 1953, добавляют 5 мл диметилформамида и 5 мл N,N-диметиламиноэтанола. Смесь перемешивают 2 ч при 100°С, выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном, сушат и получают 3.4 г (78.3%) октакис(N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметиламмониометил)фталоцианина цинка октахлорида (ZnPcChol₈). Электронный спектр поглощения, _max, нм (Н₂O): 679-680. Найдено, %: С 51.41; Н 6.84; N 13.07; Cl 15.88. Вычислено для C₇₂ H₁₁₂AlCl₈N₁₆O₈Zn, %: С 51.50; Н 6.72; N 13.35; Cl 16.89.

Пример 2

Аналогично примеру 1 из гексахлорметилзамещенного фталоцианина цинка (найдено, %: Cl 24.98; вычислено для ZnPc(CH₂Cl)₆ , %: Cl 24.48) получают гексакис(N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметиламмониометил)фталоцианин цинка гексахлорид (ZnPcChol₆). Электронный спектр поглощения, _max, нм (H₂O): 677-679.

Пример 3

Нагревают при кипении смесь 0.150 мг октакис(хлорметил)фталоцианина цинка и 2 мл пиридина в течение 1 ч, затем смесь фильтруют, промывают ацетоном, сушат и получают 0.228 г (87.6%) октакис(пиридиниометил)фталоцианина цинка октахлорида (ZnPcPym₈). Электронный спектр поглощения, _max, нм (Н₂О): 679-680.

Пример 4

Аналогично примеру 3 из октакис(хлорметил)фталоцианина хлоралюминия получают октакис(пиридиниометил)фталоцианин хлоралюминия октахлорид (AlPcPym₈). Электронный спектр поглощения, _max, нм (Н₂О): 680. Найдено, %: С 59.09; Н 4.36; N 13.49; Cl 18.41. Вычислено для C₈₀ H₆₄AlCl₉N₁₆, %: С 60.22; Н 4.04; N 14.04; Cl 19.99.

Пример 5

К 0.50 г (0.51 ммоль) октакис(хлорметил)фталоцианина цинка добавляют 2 мл диметилформамида и 3 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. После растворения исходного фталоцианина смесь перемешивают 1 ч при 100°С, выпавший осадок отделяют, промывают диметилформамидом, ацетоном, сушат и получают 0.71 г (73%) октакис(N-(2-(диметиламино)этил)-N,N-диметиламмониометил)фталоцианина цинка октахлорида (ZnPcTmed₈). Электронный спектр поглощения, _max, нм (Н₂О): 679. Найдено, %: С 55.45; Н 7.68; N 17.09; Cl 15.05. Вычислено для C₈₈ H₁₅₂Cl₈N₂₄Zn, %: С 55.70; Н 8.08; N 17.70; Cl 14.92.

Пример 6

Смесь 0.1 г комплекса, полученного в примере 5, 5 мл метанола и 3 мл метилиодида перемешивают при 40°С в течение 3 ч. Осадок отделяют, промывают метанолом, сушат и получают 0.12 г (75%) октакис(N,N-диметил-N-(2-(триметиламмонио)этил)аммониометил)фталоцианина цинка октаиодида октахлорида (ZnPcPmed₈). Электронный спектр поглощения, _max, нм (Н₂O): 680. Найдено, %: С 38.20; Н 5.65; N 10.75; Cl 9.05. Вычислено для С₉₆ Н₁₇₆Cl₈I₈N₂₄Zn, %: С 38.04; Н 5.85; N 11.08; Cl 9.35.

Пример 7

Аналогично примеру 3 из гексахлорметилзамещенного фталоцианина алюминия со степенью замещения, примерно равной шести, (найдено, %: Cl 23.27; вычислено для НО₃SOAlPc(СН₂Cl) ₆, %: Cl 22.93) получают гексакис(пиридиниометил)-фталоцианин гидросульфатоалюминия гексахлорид (AlPcPym₆). Электронный спектр поглощения, _max, нм (Н₂O): 680-682.

Пример 8

Аналогично примеру 1 из гексахлорметилзамещенного фталоцианина алюминия (найдено, %: Cl 23.27; вычислено для НО₃SOAlPc(СН ₂Cl)₆, %: Cl 22.93) получают гексакис(N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметиламмониометил)фталоцианин гидро-сульфатоалюминия гексахлорид (AlPcChol₆). Электронный спектр поглощения, _max, нм (Н₂O): 680-682.

Исследование фотоиндуцированной активности in vitro проводили на 2-х клеточных линиях: эпидермоидной карциноме гортаноглотки человека (Нер2) и аденокарциноме легкого человека (А 549). Для культивирования клеток использовали среду Игла-МЕМ (Нер2, А 549) с добавлением 2 mM L-глугамина и 8-10% эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование проводили при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием СО₂. Клетки рассеивали в лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета ("Costar", США) по 100 мкл суспензии клеток в концентрации 0.5×10⁵ кл/мл. Через 24 часа вносили в лунку по 50 мкл тестируемых соединений в серийных разведениях и инкубировали в течение 2 часов в стандартных условиях и далее облучали галогеновой лампой мощностью 500 Вт через водный фильтр толщиной 5 см и широкополосный фильтр КС-13 ( 640 нм). Плотность мощности составляла 14±2 мВт/см ², время облучения 13-15 мин, расчетная световая доза - 10 Дж/см².

После облучения клетки инкубировали в стандартных условиях в течение 24 часов. Для оценки цитотоксической активности клетки помещали в затемненные условия на 24 часа. Выживаемость клеток определяли визуально, оценивая с помощью световой микроскопии морфологические изменения клеток, и колориметрическим методом с использованием МТТ-теста.

Уровень ингибирования роста клеток вычисляли по формуле (1):

где ИР - уровень ингибирования роста клеток в культуре,

OD_o - оптическая плотность в опыте,

OD_к - оптическая плотность в контроле.

Биологически значимым эффектом считали ингибирование роста клеток в культуре более чем на 50%. Величины ИК₅₀ и ИК₉₀, соответствующие концентрации тестируемого соединения, при которой наблюдается 50 и 90% торможение роста культуры, рассчитывали как среднюю величину по результатам трех независимых тестов.

Субстанция ZnPcChol₈ обладает фотоактивностью в отношении двух исследованных культур клеток, причем величины ИК₅₀ и ИК₉₀ близки по своим значениям. При облучении в присутствии тестируемого соединения в среде инкубации (время инкубации 2 часа) концентрация ИК₅₀ составляет 0.24±0.08 мкМ (культура НЕр 2) и 0.29±0.09 мкМ (культура А 549), а ИК₉₀ - 1.31±0.08 мкМ и 1.30±0.08 мкМ соответственно.

Производные фталоцианина цинка ZnPcTmed ₈, ZnPcThea₈ и ZnPcPmed₈ обладают высокой фотоиндуцированной активностью в отношении культуры клеток Нер2: величина ИК₅₀ данных соединений составила 0.3±0.1 мкМ, 0.69±0.4 мкМ и 0.18±0.2 мкМ соответственно. Темновая токсичность ФС на культуре клеток в исследованном диапазоне концентраций не выявлена.

Специфическую активность in vivo положительно заряженных ФС изучали на животных с перевивными опухолями. Исследовали флуоресцентные свойства по способности ФС накапливаться в опухоли, оценивая уровень нормированной флуоресценции (Фн) в тканях мышей, а также противоопухолевую фотоиндуцированную активность красителей. Все ФС накапливались в опухолевой ткани и разрушали ее при облучении.

Нормированную флуоресценцию определяли в тканях мышей с привитым подкожно на бедро лимфолейкозом Р-388. Содержание ZnPcChol ₈ оценивали флуоресцентным методом на лазерной диагностической установке "ЛЭСА" (ТОО "Биоспек", Москва) на основе He-Ne лазера с длиной волны генерации 633 нм контактным способом ех vivo на различные сроки наблюдения от 5 секунд до 72 часов. Интегральную интенсивность флуоресценции в диапазоне 641-724 нм нормировали на интегральную интенсивность сигнала обратного диффузного рассеяния возбуждающего лазерного излучения, таким образом определяли нормированную флуоресценцию (Фн) в ткани.

ZnPcChol₈ вводили внутривенно в дозе 1.0 мг/кг. В ходе исследования оценивали Фн красителя и рассчитывали отношение Фн в опухоли к Фн в коже и мышце, определяя таким образом показатель селективности (Кс) накопления ФС в опухоли по сравнению с окружающими тканями.

Исследования показали, что ZnPcChol₈ имеет максимум флуоресценции в тканях мышей при 696 нм. В мышце препарат накапливается в течение 5 минут, а в опухолевой ткани Р-388 и коже максимальное значение Фн достигается через 30 минут. В тканях организма препарат задерживается в течение 1 часа, а затем быстро выводится (см. чертеж).

Чертеж. Нормированная флуоресценция (Фн) ZnPcChol₈ в тканях мышей с опухолью Р-388.

ZnPcChol₈ обладает тропностью к опухолевой ткани Р-388. Максимальное значение показателей селективности, которое регистрируется через 30 минут после введения препарата, составляет 3.3±0.6 (Фн опухоль/Фн кожа) и 3.9±0.7 (Фн опухоль/Фн мышца).

Изучение специфической противоопухолевой активности субстанций in vivo проводилось на мышах гибридах BDF ₁ самках с лимфолейкозом Р-388 на 6-й-7-й день роста с использованием различных доз красителя и режимов облучения. Опухоль Р-388 прививали подкожно на бедро по 0.7×10⁶ клеток/мышь. ФС вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг, интервал между введением ФС и облучением составлял 5, 15, 30 и 60 минут. В качестве источника излучения применяли аппарат АТО-1 на основе галогеновой лампы мощностью 150 Вт с оптоволоконным жгутом и фильтрами КС-10 и СЗС-26 (длина волны - 600-800 нм). Плотность мощности (100-300 мВт/см²) контролировали с помощью измерителя мощности ИМПО (НПО "Плюс"), световая доза 90-270 Дж/см². Перед облучением шерсть над опухолью удаляли. В качестве анестезии применяли 5% раствор ketamini в дозе 2.5 мг/мышь внутрибрюшинно. Продолжительность наблюдения за животными продолжалась до их гибели. В качестве контроля использовали мышей-опухоленосителей, не подвергавшихся какому-либо воздействию.

Эффективность ФДТ с ZnPcChol₈ оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ), которые рассчитывали по формулам (2) и (3):

где V_оп - объем опухоли, равный d ₁×d₂×d₃, где d₁ , d₂ и d₃ - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли, СПЖ - средняя продолжительность жизни в опытной и контрольной группе.

ФДТ с ZnPcChol₈ приводило к развитию отека с последующим формированием некротического струпа в зоне облучения, который исчезал через 8-10 суток после облучения. На эффективность ФДТ оказывает влияние световая доза. Так, увеличение дозы света от 90 до 270 Дж/см² приводит к возрастанию значений ТРО с ZnPcChol₈ от 47.1÷75.2% до 93.6÷97.1%.

Увеличение дозы ZnPcChol₈ от 0.5 до 1.0 мг/кг также приводит к увеличению ТРО от 55.9÷68.6% до 93.6÷97.1% на все сроки наблюдения (15 суток). При дальнейшем увеличении дозы до 2 мг/кг ТРО сохраняется на высоком уровне (85.3-91.2%). Продолжительность жизни животных увеличивается на 38.8% при дозе 1 мг/кг и 23.1% при дозе 2 мг/кг.

При облучении через различные интервалы времени t 5, 15, 30 и 60 минут после введения красителя в дозе 1 мг/кг и световой дозе, равной 270 Дж/см², лечебный эффект оказался выше при t 15 и 30 минут: ТРО составляет 87.8-100% и 95.2-100%, а УПЖ - 31.4% и 38.8% соответственно. Увеличение интервала t до 60 минут приводит к некоторому снижению ТРО - 73.7-91.2%.

Изучение фотоиндуцированной активности in vivo на мышах с опухолью Colo 26 проводили на мышах линии Balb/c самках на 6-й-7-й день роста опухоли. Аденокарциному толстой кишки мыши Colo 26 прививали подкожно на бедро по 0.05×10⁶ клеток/мышь. Субстанцию ZnPcChol₈ вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг. Интервал между внутривенным введением Фс и облучением составлял 30 минут. В качестве источника излучения использовали светодиодный источник красного света с максимумом поглощения при 685 нм с регулятором плотности световой мощности (25-100 мВт/см²); световая доза 90 Дж/см². Перед облучением шерсть над опухолью удаляли. Для анестезии применяли 5% раствор ketamini в дозе 2.5 мг/мышь внутрибрюшинно. В качестве контроля использовали мыши-опухоленосители, не подвергавшиеся какому-либо воздействию. Эффективность ФДТ с ZnPcChol₈ оценивали по критерию излеченности (Ки), который рассчитывали по формуле (4).

где N_и - количество излеченных животных,

N_o - общее количество животных в опытной группе.

ФДТ с ZnPcChol₈ (доза 1.0 мг/кг) приводит к полной резорбции опухоли Colo 26 (К_и=100%) независимо от условий облучения - 100, 50 и 25 мВт/см², 90 Дж/см ², t 30 минут.

Предлагаемые в настоящем изобретении соединения - положительно заряженные фталоцианины с различными боковыми заместителями и центральными атомами металла - имеют высокую опухолетропность, обладают высокой фотоиндуцированной активностью in vitro и in vivo и представляют собой новый класс эффективных фотосенсибилизаторов, которые могут быть использованы для лечения методом ФДТ опухолей различных локализаций.