способ лечения инсульта

Формула изобретения

Способ лечения инсульта, включающий интрацеребральную трансплантацию стволовых клеток костного мозга во время нейрохирургического вмешательства в область поражения, отличающийся тем, что трансплантацию проводят в раннем или позднем восстановительном периоде после перенесенного ишемического или геморрагического инсульта, при этом в качестве стволовых клеток вводят весь комплекс аутологичных мононуклеарных клеток, выделенных из аспирата костного мозга, которые используют без выделения отдельных фракций клеток и их культивирования.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в неврологии и нейрохирургии для лечения больных со стойким неврологическим дефицитом после перенесенного ишемического или геморрагического инсульта.

Известно, что восстановление нервной ткани после перенесенного острого нарушения мозгового кровообращения (инсульта) может быть обусловлено способностью стволовых клеток дифференцироваться в нейроны, а также продукцией ими растворимых факторов, стимулирующих пролиферацию нейрональных предшественников и защищающих клетки мозга от апоптоза.

У взрослого человека стволовые клетки локализованы, главным образом, в костном мозге. В культуре in vitro показана возможность дифференцировки костномозговых стволовых клеток в нейрональном направлении. Указанные клетки могут преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в ткани мозга, являясь источником регенерации нервной ткани. С учетом этого было предложено использовать трансплантацию стволовых клеток в качестве заместительной терапии повреждений и/или заболеваний головного мозга.

Обоснованность такого подхода была подтверждена в экспериментальных моделях повреждений головного мозга. Так, на модели ишемического инсульта у крыс внутривенное или интрацеребральное введение различных типов стволовых клеток сопровождалось восстановлением функции головного мозга и снижением выраженности неврологического дефицита уже через 2 недели после окклюзии средней мозговой артерии [1, 2, 3].

Другим источником стволовых клеток, в том числе нейрональных предшественников, используемых в заместительной терапии нейродегенеративных заболеваний и повреждений головного мозга, являются фетальные клетки, полученные из ткани мозга абортивных эмбрионов человека. Так, предложен способ лечения заболеваний и травм центральной нервной системы (ЦНС) на основе использования стволовых нервных клеток, полученных из ткани переднего мозга или перивентрикулярной области головного мозга абортивных эмбрионов человека первого триместра беременности. При этом из полученного материала селективно выделяют стволовые клетки, которые перед использованием разращивают в культуре до 10⁷-10 ⁹ плюрипотентных недифференцированных клеток (патент №2191388, RU, 2002).

Известен также способ лечения заболеваний ЦНС, согласно которому больным в ликворное пространство мозга вводят 1 мл суспензии эмбриональной ткани мозга человека вместе с белково-нуклеиновыми экстрактами этой ткани в количестве 0,01-0,05 мг сухого остатка смеси на 1 кг веса пациента (патент №2129427, RU, 1999).

Использование фетальных стволовых клеток имеет, однако, морально-этические ограничения, сложности в получении абортивных эмбрионов человека, связано с трудностями выделения и культивирования клеток, а также сопряжено с высоким риском контаминации материала бактериальной и/или вирусной микрофлорой. Кроме того, в литературе активно обсуждается возможность злокачественной трансформации эмбриональных клеток.

Другим источником нейрональных клеток являются иммортализованные клеточные линии [4]. Так, например, клетки линии NTera 2/cl/Dl (NT2), первоначально выделенные из опухоли карциномы яичка, в ответ на обработку ретиноидной кислотой способны дифференцироваться в нейрональные клетки (LBS-нейроны). В 2000 г была проведена I фаза клинических испытаний по оценке безопасности и переносимости интрацеребральной трансплантации таких клеток у 12 больных инсультом со стойким неврологическим дефицитом [5]. Трансплантацию проводили в среднем через 2,2 года после инсульта (от 7 мес до 6 лет), и клетки водили однократно в дозе 2 или 6×10⁶/больного. Авторы показали хорошую переносимость и безопасность трансплантации LBS-нейронов и достоверное уменьшение выраженности неврологического дефицита. При оценке по шкале Бартела отмечалось увеличение суммы баллов в среднем на 10%, но только при введении 6×10⁶ клеток/больного. Существенными недостатками использования иммортализованных клеточных линий является необходимость их культивирования и криоконсервации, риск возврата трансплантированных клеток к опухолевому фенотипу, а также необходимость длительного (за 1 неделю до и в течение 8 недель после трансплантации) применения иммуносупрессорной терапии циклоспорином А, с целью профилактики отторжения трансплантированных аллогенных клеток.

Наиболее привлекательным представляется использование стволовых клеток, выделенных из костного мозга или жировой ткани взрослого человека. Так, известен способ интрацеребральной трансплантации стволовых кроветворных клеток костного мозга в лечении нейродегенеративных заболеваний человека (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Крейцфельда-Якоба) (патент №2216336, GB, 2003). Известен также способ применения мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из жировой ткани человека, в моделях травматических и дегенеративных заболеваний ЦНС у экспериментальных животных (патент №793173, USA, 2001).

С целью лечения инсульта предложен способ (патент AU 5130000, А 61 К 35/00, 2000), по которому из мононуклеарных клеток костного мозга человека выделяют прилипающую к пластику фракцию МСК, которые в дальнейшем разращивают в культуре in vitro, после чего вводят различными путями (интрацеребрально, интракаротидно, внутривенно) лабораторным животным (крысам и мышам) через 24 ч после 2-часовой окклюзии средней церебральной артерии (экспериментальная модель острого нарушения мозгового кровообращения), и на 14-28 сутки наблюдают снижение выраженности неврологического дефицита. Для более эффективного разращивания МСК и усиления их дифференцировки в нейрональном направлении предлагается также длительное (в течение 1 мес) культивирование костномозговых стволовых клеток в присутствии комплекса ростовых факторов, включая фактор стволовых клеток (SCF, 100 нг/мл), фактор роста нервов (NGF, 200 нг/мл), нейротрофический фактор, выделенный из мозга (BDNF, 100 нг/мл) и эпидермальный ростовой фактор (EGF, 20 нг/мл). Авторы патента предлагают использовать данный подход в лечении последствий острого нарушения мозгового кровообращения у человека. Однако клинических исследований эффективности разработанного способа при лечении инсульта у человека не проведено. При этом следует отметить, что экспериментальная модель инсульта у животных принципиально отличается от реальной клинической ситуации, при которой продолжительность нарушения мозгового кровообращения может существенно превышать 2 часа и приводить к более выраженным повреждениям головного мозга. Трансплантация стволовых клеток через 24 ч после произошедшего инсульта представляется проблематичной в силу тяжести общего состояния больного и выраженности системной воспалительной реакции. Кроме того, введение стволовых клеток производится в зону ишемизированного мозга без учета локализации поражения функционально важных структур мозга. Другим недостатком предложенного способа является сложность технологии выделения и длительного культивирования мезенхимальных стволовых клеток и, как следствие, высокий риск их контаминации патогенной микрофлорой и высокая стоимость расходных материалов, включая ростовые факторы.

Технической задачей настоящего изобретения является создание способа лечения инсульта на основе аутологичной трансплантации костномозговых стволовых клеток, полученных по упрощенной и более экономичной технологии, который позволяет снизить выраженность неврологического дефицита у больных в раннем или отдаленном периоде после перенесенного ишемического или геморрагического инсульта, не вызывая при этом каких-либо побочных или токсических реакций.

Поставленная задача решается за счет использования фракции аутологичных мононуклеарных клеток, выделенных из аспирата костного мозга больного, которые после определения их количества и жизнеспособности, а также относительного содержания среди них CD34⁺ стволовых клеток, вводятся интрацеребрально стереотаксически под нейронавигационным контролем в область поражения функционально важных структур головного мозга (в зависимости от клинических проявлений), сочетая с наложением экстра-иптракраниального микроанастомоза при выявлении дефицита перфузии вещества головного мозга.

Способ осуществляется следующим образом. Все процедуры, связанные с получением аспирата костного мозга, выделения из него мононуклеарной фракции, содержащей стволовые клетки, проводятся в один день с нейрохирургическим вмешательством: стереотаксическим введением клеток под навигационным контролем в пораженные функционально важные структуры головного мозга (подкорковые ганглии, моторные зоны, зрительная кора, таламический бугор). При выявлении дефицита перфузии вещества головного мозга эта операция дополняется наложением экстра-интракраниального микроанастомоза. В утренние часы у больного в условиях операционной при анастезиологической поддержке специалистом-гематологом проводится процедура трепанобиопсии, во время которой из крыла подвздошной кости в стерильный флакон с раствором гепарина (10000 ЕД) забирается аспират костного мозга в объеме 200 мл. Флакон транспортируется в лабораторный блок, где инкубируется при 37°С в течение 40 мин. После гравитационного разделения цельного костного мозга в отдельный флакон собирается «верхняя» фракция, состоящая из клеток лейковзвеси, которые затем центрифугируются и осаждаются (1200 об/мин, 15 мин). Надосадок, содержащий аутоплазму собирают в отдельный стерильный флакон, а осадок клеток лейковзвеси ресуспендируют в 40 мл фосфат-забуференного физиологического раствора, содержащего 10 Ед/мл гепарина (ЗФР/гепарин). Затем клетки лейковзвеси наслаивают на градиент плотности фиколла-верографина (1,078 г/л) и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Собранные из интерфазы костномозговые мононуклеарные клетки (МНК КМ) троекратно отмывают в ЗФР/гепарине и ресуспендируют в 2 мл физиологического раствора, дополненного 20% (v/v) аутоплазмы. С целью лабораторной характеристики выделенных МНК КМ определяют их количество и жизнеспособность по окраске трипановым синим, а также относительное содержание среди них CD34⁺ стволовых клеток методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson). Соответствующим образом маркированный и укупоренный флакон с костномозговыми клетками транспортируют (в среднем через 2,5-3 ч после трепанобиопсии) в нейрохирургическое отделение, где в условиях операционной аутологичные стволовые клетки вводят интрацеребрально стереотакси чески под нейронавигационным контролем в область поражения функционально важных структур головного мозга.

Данный способ лечения инсульта был проверен в клинических условиях на базе нейрохирургического отделения Дорожной клинической больницы, г. Новосибирска. Предложенным способом было пролечено 10 пациентов в возрасте от 23 до 67 лет с выраженным стойким неврологическим дефицитом, обусловленным ишемическим (5 пациентов) или геморрагическим инсультом (5 пациентов). Трансплантация аутологичных костномозговых стволовых клеток проводилась в среднем через 15 месяцев от момента острого нарушения мозгового кровообращения. Количество выделенных мононуклеарных клеток костного мозга варьировало от 0,8 до 3,0×10⁹ клеток, при этом среднее содержание среди них CD34⁺ стволовых клеток составляло 100×10 ⁶ клеток. МНК КМ в 2 мл физиологического раствора вводили стереотаксически под нейронавигационным контролем. Интрацеребральная трансплантация МНК КМ не сопровождалась развитием каких-либо осложнений. У всех пациентов отмечалось существенное снижение спастичности в паретичных конечностях. У ряда пациентов положительная неврологическая динамика проявлялась в виде уменьшения степени пареза и афатических расстройств. При оценке по шкале Бартела отмечалось увеличение суммы баллов на 20%. Таким образом, предложенный способ лечения инсульта с использованием аутологичной трансплантации костномозговых стволовых клеток позволяет не только существенно упростить саму процедуру получения стволовых клеток (за счет исключения этапов выделения фракции прилипающих к пластику клеток, их разращивания в культуре и направленной дифференцировки в нейрональном направлении в присутствии комплекса растворимых факторов), но и позволяет добиться снижения неврологического дефицита у больных в раннем или отдаленном периоде после перенесенного ишемического или геморрагического инсульта. При этом лечение с использованием предложенного способа является хорошо переносимым и не вызывает развития каких-либо побочных или токсических реакций.

Ниже приведены клинические примеры, поясняющие данный способ лечения инсульта.

Пример 1. Больной С., 30 лет

Диагноз при поступлении: Поздний восстановительный период после острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) по геморрагическому типу в бассейне правой средней мозговой артерии. Левосторонний гемипарез. Эписиндром. Анамнез: в августе 2001 г на фоне высоких цифр артериального давления произошло ОНМК по геморрагическому типу. Был госпитализирован в неврологическое отделение г.Экибастуз. В последние 12 мес. отмечает отсутствие динамики в восстановлении силы в паретичных конечностях.

Дата поступления: 28.04.2003.

Дата операции: 20.05.2003 1) трепанобиопсия и получение аспирата костного мозга из крыла подвздошной кости; 2) аутологичная трансплантация костномозговых стволовых клеток в пораженные подкорковые ганглии правого полушария головного мозга под нейронавигационным контролем.

Неврологический статус до операции: Уровень сознания 15 баллов по шкале Глазго. Дизартрия. Брадилалия. Левосторонняя нижнелицевая асимметрия (парез по центральному типу VII ЧМН слева). Девиация языка влево (парез по центральному типу XII ЧМН слева). Грубый левосторонний гемипарез: сила в левой кисти 0-1 балла, сила сгибателей-разгибателей предплечья - 2 балла; сила сгибателей-разгибателей голени - 3 балла; сила в стопе - 3 балла. Левосторонняя гемигипостезия. Патологические симптомы: симптомы Бабинского, Россолимо слева положительные. Брюшные рефлексы D>S.

Неврологический статус через 6 месяцев после операции: Уровень сознания 15 баллов по шкале Глазго. Адекватен, ориентирован. Зрачки обычной формы и размера, D=S, фотореакции живые. Легкая левосторонняя нижнелицевая асимметрия (парез по центральному типу VII ЧМН слева). Язык по средней линии. Умеренный левосторонний гемипарез: сила в левой кисти - 2 балла; сила сгибателей-разгибателей предплечья - 3 балла, сила сгибателей-разгибателей голени - 4 балла, сила разгибателей стопы - 3 балла, сгибателей стопы - 4 балла. Отмечается положительная динамика в виде уменьшения спастичности в левых конечностях. Симптомы Бабинского, Россолимо слева положительные. Левосторонняя гемигипостезия. Нарушений ФТО, менингеальной симптоматики - не выявлено.

Среди динамических изменений в неврологическом статусе следует отметить уменьшение спастичности в паретичных конечностях, а также нарастание силы в дистальных отделах паретичных конечностей.

Результаты нейровизуализационного исследования:

РКТ головного мозга с контрастным усилением от 30.04.03 (на момент поступления): В подкорковых структурах правой теменной доли визуализируется постгеморрагическая киста размерами 24×20×20 мм (9,6 см³).

РКТ головного мозга с контрастным усилением от 21.08.03 (через 3 мес. после аутологичной трансплантации костномозговых стволовых клеток): В подкорковых структурах правого полушария головного мозга сохраняется постгеморрагическая киста щелевидной формы размерами 20×7,7×20 мм (3,1 см ³, т.е. уменьшение полости кисты по сравнению с исходным объемом более чем в 3 раза, на 68%).

Результаты нейрофизиологического исследования (табл.1):

Таблица 1
Patient S.	До трансплантации МНК KM		Через 10 дней после трансплантации МНК KM		Через 2,5 мес после трансплантации МНК KM
	19.05.2003		30.05.2003		07.08.2003
Latencies	left	right	left	right	left	right
CORT	23,80	21,40	22,80	21,40	25,30	21,00
SUBCORT	16,30	16.50	17,10	15,30	14,30	14,70
P14N20	7,52	4,88	5,68	6,16	11,00	6,32
EP-N20	12.60	9,92	11,30	9,60	14.20	9,76
EP-P14	5,12	5,04	5,60	3,44	3,20	3,44
- Транскраниальная магнитная стимуляция (в динамике): положительная динамика в виде уменьшения времени центрального проведения по двигательным проводникам;

- Сомато-сенсорные вызванные потенциалы (в динамике): уменьшение времени центрального проведения по сенсорным проводникам в подкорковых отделах справа с признаками улучшения трофики этого участка.

Пример 2. Больной П., 67 лет

Диагноз при поступлении: Ранний восстановительный период после ОНМК по ишемическому типу в бассейне левой средней мозговой артерии. Двухсторонняя окклюзия ВСА, стеноз базилярной артерии. Правосторонний гемипарез. Грубая моторная, амнестическая афазия. Частые преходящие нарушения мозгового кровообращения в правом каротидном бассейне не контролируемые медикаментозно.

Сопутствующие заболевания: Гипертоническая болезнь III ст., риск IV, частая предсердная экстрасистолия, НК 0.

Дата ОНМК: 25.12.2002

Дата поступления: 16.01.2003

Дата операции (07.02.2003): 1) трепанобиопсия и получение аспирата костного мозга из крыла подвздошной кости; 2) наложение экстра-интракраниального микроанастомоза (ЭИКМА) слева; 3) аутологичная трансплантация костномозговых стволовых клеток в премоторную зону и область задней части нижней лобной извилины, пораженные ишемией (поля 6, 44, 45 по Бродману).

Неврологический статус до операции: Уровень сознания 14 баллов по шкале Глазго. Амнестическая, моторная афазия. Зрачки обычной формы и размера, D=S, фотореакции живые. Движения глазных яблок в полном объеме. Центральный парез правого лицевого нерва, язык по средней линии. Сухожильные рефлексы с рук, ног оживлены справа по пирамидному типу D>=S. Тонус в правых конечностях повышен по пирамидному типу. Легкий правосторонний гемипарез до 4-х баллов. Симптом Бабинского, Россолимо справа. Нарушений чувствительности, менингеальной симптоматики, нарушения ФТО не выявлено. Частые эпизоды углубления неврологического дефицита на протяжении суток.

Неврологический статус через 12 месяцев после операции: Уровень сознания 15 баллов по шкале Глазго. Элементы амнестической, моторной афазии. Зрачки обычной формы и размера, D=S, фотореакции живые. Движения глазных яблок в полном объеме. Лицо симметрично, язык по средней линии. Сухожильные рефлексы с рук, ног оживлены справа D>=S. Тонус в конечностях нормальный. Силовых парезов, патологических знаков, нарушения чувствительности, менингеальной симптоматики, нарушения ФТО не выявлено.

Среди динамических изменений в неврологическом статусе следует отметить уменьшение выраженности афатических расстройств, исчезновение патологического пирамидного тонуса в правых конечностях, а так же полное восстановление силы в правых конечностях.

Результаты нейровизуализационного исследования:

Дооперационная МРТ головного мозга от 25.01.03 (через 1 мес после ОНМК):

Слева в лобной доле (в области средних и нижней извилин) визуализируется обширный ишемический очаг (гиперинтенсивный на Т2 взвешенных и гипоинтенсивный на Т1 взвешенных) с нечеткими неровными контурами размерами 2,9×5,2×4,3 см, неправильной формы, неоднородный по структуре. В белом веществе левых лобной и теменной долей (локализованы на уровне тел боковых желудочков) выявлены очаги (с тенденцией к слиянию), размерами до 1,6 см, общие размеры очагов 1,7×4,2×2,5 см, очаги расположены паравентрикулярно (гиперинтенсивные на Т2 взвешанных и гипоинтенсивные на Т1 взвешанных).

МРТ головного мозга от 26.02.2004 (через 12 мес после аутологичной трансплантации костномозговых стволовых клеток): визуализируется постишемическая киста левой лобно-теменной области с четкими неровными контурами, размерами 3,3×3,2×4,2 см.

Примечание: за время после аутотрансплантации костномозговых стволовых клеток не отмечается положительная динамика в виде уменьшения очага поражения головного мозга на 32%.

Транскраниальное допплеровское сканирование церебральных сосудов (от 21.02.2004, через 12 мес после аутологичной трансплантации костномозговых стволовых клеток): в сравнении с транскраниальным допплеровским сканированием церебральных сосудов от 24.01.2003 отмечается значительная положительная динамика в виде увеличения линейной скорости кровотока в средней мозговой артерии и передней мозговой артерии обеих гемисфер. Сохраняется компенсаторная гиперперфузия кровотока обеих задних мозговых артерий с тенденцией к нормализации скоростных параметров кровотока. Определяется диффузное снижение сосудистого сопротивления в мозговых артериях. На глубине 33-38 мм слева, методом цветного картирования визуализируется участок ЭИКМА с линейной скоростью кровотока до 34 см/сек.

Результаты нейрофизиологического исследования (табл.2):

Таблица 2
Patient P.	До трансплантации МНК КМ		Через 14 дней после трансплантации МНК KM		Через 13 мес после трансплантации МНК KM
	06.02.2003		21.02.2003		04.03.2004
Latencies	left	right	left	right	left	right
CORT	20,60	20,50	20,60	20,50	20,10	19,50
SUBCORT	15,40	14,60	15,40	15,20	15,00	14,60
P14N20	5,20	5,92	5,28	5,28	5,04	4,88

- Транскраниальная магнитная стимуляция (в динамике): положительная динамика в виде уменьшения времени центрального проведения по двигательным проводникам;

Таким образом, проверка предложенного подхода в клинических условиях позволяет сделать вывод, что данный способ лечения инсульта за счет использования аутологичной трансплантации костномозговых стволовых клеток позволяет добиться значимого снижения неврологического дефицита у больных в раннем или отдаленном периоде после перенесенного ишемического или геморрагического инсульта. При этом лечение с использованием предложенного способа является хорошо переносимым и не вызывает развития каких-либо побочных или токсических реакций.

Литература

1. Chen J., Li Y., Wang L, Zhang Z., Lu D., Lu M., Chopp M. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats // Stroke. - 2001. - Vol.32. - P.1005-1011.

2. Li Y., Chen J., Wang L, Lu M., Chopp M. Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells // Neurology. - 2001. - Vol.56. - P.1666-1672.

3. Chen J., Zhang Z., Li Y., Wang L, Xu Y.X., Gautam S.C., Lu M., Zhu Z., Chopp M. Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats // Circulation research. - 2003. - Vol.92. - P.692-698.

4. Wechsler L.R. Stem cell transplantation for stroke // Cleveland Clinical Journal of Medicine. - 2004. - Vol.71. - Suppl. 1. - S40 - S41.

5. Kondziolka D., Wechsler L., Goldstein S. et al. transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke // Neurology. - 2000. - Vol.55. - P.565-569.