способ экологической оценки хронической токсичности воды

Формула изобретения

1. Способ экологической оценки хронической токсичности воды, включающий внесение корма в контрольную (природная вода без поллютанта) и природную воду, содержащую поллютант, с последующим внесением по 10 двухсуточных самок Daphnia magna Straus в контрольную и природную воду, содержащую поллютант, экспонирование с ежесуточной подкормкой дафний, учет количества выживших исходных самок и потомства, оценку хронической токсичности воды на основании разности между показателями выживаемости или репродукции дафний в природной воде с поллютантом и контрольной, при этом если рассчитанная величина t_d (критерий достоверности разности двух сравниваемых величин - показателей выживаемости или репродукции дафний в природной воде с поллютантом и контрольной) больше или равна значению критерия Стьюдента t_St (t_d t_St) для уровня значимости Р = 0,05 и степени свободы n₁+n₂-2, то природную воду признают оказывающей хроническое токсическое действие на дафний, отличающийся тем, что биотестирование проводят неоднократно в течение весенне-летнего и осенне-зимнего сезона на природной воде, которую отбирают из одной и той же точки водоема, в качестве корма вносят живой концентрат планктона, полученный фильтрованием природной воды на месте ее отбора через сеть Апштейна с мельничным газом №76-77.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что объем природной воды, процеживаемой для получения концентрата планктона, определяют согласно зависимости V=v_cp·n_исх·t,

где V - искомый объем;

v_cp - средняя скорость фильтрации дафний, мл/экз·сут; в осенне-зимний период V_cp принимают за 100-120 мл/экз·сут, в остальное время - 60 мл/экз·сут;

n_исх - общее число исходных самок в вариантах с концентратом планктона;

t - количество суток опыта.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что объем ежедневной порции концентрата планктона, добавляемой в емкость с тест-объектом, определяют согласно зависимости

где V_П - искомый объем, мл·сут;

V - объем процеженной воды, мл;

v_к - объем полученного концентрата, мл;

v_cp - средняя суточная скорость фильтрации дафний, мл/экз·сут;

n - количество экземпляров дафний в опытной емкости.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что выживаемость тест-объекта определяют согласно зависимости

где KB - коэффициент выживаемости тест-объекта;

а_n - численность дафний за каждые сутки опыта (во всех повторностях), начиная с первых;

m - количество суток опыта;

n - количество повторностей варианта.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к исследованиям в области водной токсикологии, охраны окружающей среды и устойчивого развития, касается способов экологического контроля природных и сточных вод и может быть использовано для оценки качества вод, загрязненных различными токсикантами, при экологической экспертизе, способствующей сохранению водного населения различного уровня организации и токсикорезистентности, для экотоксикологической оценки новых химических веществ, внедряемых в хозяйственную деятельность.

Известно устройство биологической оценки токсичности воды (а.с. SU 1413525 А1, Устройство для биологической оценки токсичности воды, G 01 N 33/18, опубл. Бюл. №28 от 30.07.88) - [1], содержащее блок водоподготовки, камеру для размещения дафний, решетку, установленную в камере и служащую для предотвращения уноса дафний, систему подвода и отвода воды, усилитель, блоки регистрации и управления и связанные между собой компаратор и блок сигнализации.

Известен способ биотестирования пресных вод (а.с. RU 2082167 С1, Экспресс-способ биотестирования пресных вод «Поведенческие реакции моллюсков» («ПРМ-тест»), G 01 N 33/18, опубл. Бюл. №17 от 20.06.97) - [2], по которому оценивают возникающие в тестируемой воде изменения поведенческих реакций тест-организмов, включая их локомоторную и дыхательную активность, а также ряд других физиологических реакций, по результатам оценки определяют параметры, характеризующие функциональное состояние тест-организмов и являющиеся показателями степени токсичности тестируемой воды.

Данные устройство и способ предназначены для получения оперативной информации о токсичности водной среды, основанной на изменении поведенческих и ряда других реакций тест-объектов в исследуемой среде по сравнению с контролем.

Известен способ хронического биотестирования воды, описанный в кн. Методическое руководство по биотестированию воды РД 119-02-90. - М., 1990. - 72 с. - [3]. Способ предусматривает проведение длительного биотестирования на ракообразных - Daphnia magna Straus с целью определения хронической токсичности сточной воды на сбросе в водный объект, воды в контрольном и других створах водного объекта для проверки соответствия качества воды нормативным требованиям. Для контроля и разбавлений используют отстоянную водопроводную воду. В случаях, когда результаты биотестирования учитывают при установлении величин ПДС (предельно допустимых сбросов), в качестве контрольной и разбавляющей служит природная вода, отобранная вне зоны влияния источника загрязнения. Хроническое токсическое действие воды на дафний определяют по их выживаемости и плодовитости (репродукции). Ежедневно вносят корм - суспензию лабораторной культуры зеленой водоросли хлореллы плотностью 600 тыс. кл/мл среды. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок дафний, выживших в течение биотестирования, показателем репродукции - среднее количество молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

В предлагаемом способе, в отличие от вышеописанного способа-прототипа, условия эксперимента максимально приближены к природным. Задача авторов - учесть целый ряд факторов, свойственных естественной среде обитания, что позволило бы более точно оценить степень токсичности природной воды и вносимых поллютантов на популяцию гидробионтов, выбранную в качестве тест-объекта. Так, в способе-прототипе, описанном выше [3], не учитывается:

1) отличие состава и свойств природной воды, используемой в качестве среды обитания тест-объекта от таковых способа-прототипа;

2) зависимость токсикорезистентности тест-объекта от сезонных особенностей взаимодействия с био- и абиокомпонентами природной воды, в том числе с экзометаболическими продуктами жизнедеятельности биокомпонентов;

3) что хлорелла, используемая в качестве корма в концентрации (600 тыс. кл/мл), не свойственной природной воде, изменяет с сезонными особенностями устойчивость тест-объекта к действию поллютанта по выживаемости и репродукции. Этот эффект на репродуктивную активность тест-объекта в течение всего сезонного периода исследований значительно превышает таковой от влияния био- и абиотических компонентов природной воды (Ратушняк А.А. Эколого-физиологические аспекты регуляции гомеостаза водных биосистем разного уровня организации с участием фитогидроценоза. Автореф. дисс... д. биол. наук. Нижний Новгород, 2002. 58 с. [4]; Ратушняк А.А., Андреева М.Г., Ильясова М.А., Ратушняк А.Ю. Влияние хлореллы (Chlorella vulgaris), прижизненных выделений рогоза узколистного (Typha angustifolia) на токсикорезистентность Daphnia magna // Токсикологический вестник, 2003, №1, с.33-41 [5]).

Выявленные существенные сезонные различия по степени влияния на токсикорезистентность тест-объекта используемых в качестве пищевых добавок хлореллы в способе-прототипе и концентрата природного планктона (КП) в заявленном способе, свидетельствуют о том, что результаты общепринятого хронического биотестирования не отражают истинной токсичности природной воды (ПВ) на тест-объект, а следовательно, снижают точность оценки.

В действующих в настоящее время Методических указаниях МУ 2.1.5.720-98 к обоснованию гигиенических нормативов химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования, обеспечивающих безопасность вод для здоровья человека [6], принимаются во внимание новые данные о взаимодействии вещества и организма, вещества и водной среды, но не учитываются перечисленные выше факторы.

Технический результат, на достижение которого направлено заявленное изобретение, заключается в повышении точности экотоксикологической оценки потенциальной опасности существующих и вновь синтезируемых поллютантов, попадающих в водные объекты, для наиболее чувствительных к ним водных организмов.

Задача достигается тем, что в отличие от способа-прототипа, по которому проводят длительное биотестирование (без учета сезонных особенностей) на отстоянной водопроводной воде (ОВВ) с внесенными поллютантом и двухсуточной молодью Daphnia magna Straus, ежедневно добавляют хлореллу (Chlorella vulgaris, 600 тыс. кл/мл), а о токсичности поллютанта судят по достоверности отличия показателей выживаемости и репродукции тест-объекта Daphnia magna Straus в опытных вариантах от контрольных [3], в заявленном способе биотестирование осуществляют неоднократно в сезонной динамике на природной воде, которую отбирают из одного и того же створа водоема, ежесуточно добавляют корм - КП. Критерием хронического токсического действия является достоверность различия критерия Стьюдента (t_St) и критерия достоверности разности двух сравниваемых величин (t_d) показателей выживаемости или репродукции Daphnia magna Straus в ПВ без поллютанта (контроль) и ПВ с поллютантом.

В качестве показателя выживаемости нами введен коэффициент выживаемости (KB), который рассчитывается для каждого варианта как сумма долей от 100%-ной выживаемости Daphnia magna Straus, принимаемой за единицу, за каждые сутки с последующим делением на количество суток опыта. Коэффициент ввели для учета суммарных изменений выживаемости Daphnia magna Straus в суточной динамике (за время опыта).

Биотестирование проводят одновременно в сезонной динамике заявленным способом и способом-прототипом с целью выявления различий в оценке ими токсичности исследуемых сред (ОВВ и ПВ).

Пример реализации заявленного способа. В качестве поллютанта используют пиретроидный инсектицид 3-го поколения - децис (действующее начало - дельтаметрин) в действующей концентрации 1 мкг/л; в качестве тест-объекта - стандартизированную лабораторную культуру Daphnia magna Straus. Их выбор основан на анализе «химическая структура поллютанта - функции гидробионтов». Водные членистоногие, в том числе Daphnia magna Straus - звено водной биоты, наиболее чувствительное к особенностям химической структуры инсектицидов. Хроническое биотестирование с децисом на Daphnia magna Straus осуществляют неоднократно в сезонной динамике одновременно по общепринятой методике [3] на ОВВ и ПВ с ежедневным кормлением, соответственно, хлореллой (600 тыс. кл/мл) и КП. Последний получают фильтрованием природной воды на месте ее отбора через сеть Апштейна с мельничным газом №76-77 (Руководство по гидробиологическому мониторингу пресноводных экосистем под редакцией проф. В. А. Абакумова. СПб.: Гидрометеоиздат. 1992 [7]), с учетом ее объема, процеживаемого Daphnia magna Straus за сутки. Объем воды (V), который нужно процедить для получения КП, рассчитывают по формуле (1):

V= _ср·n_исх·t, где

_ср - средняя скорость фильтрации Daphnia magna Straus, мл/экз.·сут;

n_исх - общее число исходных самок Daphnia magna Straus в вариантах с ПВ;

t - количество суток опыта.

Значения v_ср в осенне-зимний период принимают за 100-120 мл/экз.·сут, в остальное время - 60 мл/экз.·сут (Гутельмахер Б.Л. Относительное значение фито- и бактериопланктона в питании планктонных ракообразных // Гидробиол.журн. - 1973. - Т.9. №4. С. 20-24. - [8]; Крючкова Н.М. Трофические взаимоотношения зоо- и фитопланктона. М., Наука. - 1989. - 124 с. - [9]; Bums C.W., Gilbert J.J. Direct observations of the mechanisms of interference between Dapnnia and Keratella cochlearis // Limnol. and Oceanogr. 1986. Vol.31. №4. P.859-866 -[10]).

Двухсуточную молодь дафний, полученную от стандартизированной лабораторной культуры Daphnia magna Straus, сажают в 400 мл стаканы, затем добавляют по 200 мл исследуемых сред (ПВ и ОВВ). Каждый вариант опыта ставят не менее чем в 3-х повторностях. Длительность каждого эксперимента - 14 суток.

Варианты на ОВВ + хлорелла и на ПВ + концентрат планктона следующие:

1) без токсиканта (контроль);

2) с децисом 1 мкг/л.

Затем по формуле (2) рассчитывают объем ежедневной порции концентрата - V _П, которую добавляют в каждый стакан пипеткой:

где V- объем процеженной воды, мл;

V _к - объем полученного концентрата, мл;

_ср - средняя суточная скорость фильтрации дафний, мл/экз.·сут;

n - количество дафний в стакане, экз.

Концентрат хранят в холодильнике в течение 3-5 дней, а затем обновляют.

Ежедневно подсчитывают число выживших самок Daphnia magna Straus, количество выметанной молоди, которую после каждого подсчета удаляют. По окончании эксперимента для каждого варианта опыта подсчитывают коэффициент выживаемости Daphnia magna Straus (KB) и количество молоди на 1 живую исходную самку, выметавшую молодь (X) по формулам (3), (4):

где а_n - численность Daphnia magna Straus за каждые сутки опыта (во всех повторностях), начиная с первых, экз.;

m - количество суток опыта;

n - количество повторностей варианта:

где Х - количество молоди на 1 исходную самку, определенное как отношение суммарного количества молоди, полученного за время биотестирования к количеству живых исходных самок, выметавших молодь (формула аналогична таковой в [3] - стр.23, п.3.3);

M_i - количество молоди в каждом помете, экз.;

N_i - количество живых исходных самок, выметавших молодь.

На основании проведенных расчетов строят графические зависимости показателей выживаемости и репродукции Daphnia magna Straus от сезона, полученных на ОВВ и ПВ.

Для пояснения сущности представлены фигуры 1-3.

Фиг.1. - Сезонная динамика показателя выживаемости (KB) Daphnia magna Straus на исследуемых ПВ и ОВВ.

Фиг.2. - Сезонная динамика показателя репродукции Daphnia magna Straus (X экз./жив.самку) в течение сезона на ОВВ.

Фиг.3. - Сезонная динамика показателя репродукции Daphnia magna Straus (X экз./жив.самку) в течение сезона на ПВ.

Вывод о наличии хронического токсического действия делают на основании достоверности различий между показателями выживаемости (KB) и репродукции Daphnia magna Straus (количество молоди на одну живую исходную самку, выметавшую молодь - X) на ПВ или ОВВ без поллютанта (контроль) и ПВ или ОВВ с поллютантом - децисом (1 мкг/л). Для этого в соответствии с [3] вычисляют критерий достоверности разности двух сравниваемых величин (стр.24, п.3.6), который сопоставляют со значениями критерия Стьюдента для уровня значимости Р = 0,05 и степенью свободы n₁+n₂ -2. Если значение критерия достоверности разности двух сравниваемых величин больше или равно значению критерия Стьюдента, то различие между этими величинами достоверно. В этом случае считают, что исследуемые ПВ или ОВВ с внесенным поллютантом оказывают хроническое токсическое действие на Daphnia magna Straus, если же это значение меньше, то отличие опытного варианта от контрольного недостоверно и хроническое токсическое действие отсутствует.

В нашем случае количество повторностей равнялось 3, следовательно, число степеней свободы равно 4, а соответствующее значение критерия Стьюдента равно 2,78.

Таблица 1 Достоверность оценки хронической токсичности (по коэффициенту выживаемости KB) исследуемых ОВВ (способ-прототип) и ПВ (заявленный способ) с децисом (1 мкг/л) по критерию Стьюдента
Сезоны (месяцы)	td OBB	Способ-прототип	td ПВ	Заявленный способ
февраль (II)	26,38	достоверно	18,39	достоверно
апрель (III)	4,87	достоверно	0,73	не достоверно
июнь (VI)	10,71	достоверно	0,17	не достоверно
июль (VII)	8,06	достоверно	0	не достоверно
август (VIII)	2,69	не достоверно	13,38	достоверно
октябрь (X)	46,42	достоверно	1,11	не достоверно
ноябрь (XI)	0,39	не достоверно	266,74	достоверно

Таблица 2 Достоверность оценки хронической токсичности (по репродукции - X) исследуемых ОВВ (способ-прототип) и ПВ (заявленный спсособ) с децисом (1 мкг/л) по критерию Стьюдента
Сезоны (месяцы)	td OBB	Способ-прототип	td ПВ	Заявленный способ
февраль (II)	18,53	достоверно	-*
апрель (III)	1,30	не достоверно	18,00	достоверно
июнь (VI)	-3,18	не достоверно	101,37	достоверно
июль (VII)	-0,24	не достоверно	519,62	достоверно
август (VIII)	1,14	не достоверно	36,13	достоверно
октябрь (X)	10,30	достоверно	7,78	достоверно
ноябрь(XI)	4,84	достоверно	112,10	достоверно
*- молодь отсутствовала

Основываясь на данных таблиц 1, 2 и приоритетности репродуктивного параметра при оценке хронической токсичности исследуемых сред, можно сделать вывод, что природная вода с децисом 1 мкг/л токсична для Daphnia magna Straus на протяжении всего периода исследования (заявленный способ), в то время как ОВВ (способ-прототип) - только в зимний и позднее-осенний период.

Поскольку хроническое биотестирование способом-прототипом проводят без учета сезона и влияния био- и абиокомпонентов природной воды, оценка токсичности исследуемых сред с поллютантами по этому способу может быть прямо противоположна (на 100%) заявленному.

Таким образом, за счет создания экспериментальных условий, наиболее приближенных к природным, учета влияния естественных компонентов среды обитания на тест-объект, предлагаемый способ экологической оценки хронической токсичности воды позволяет с более высокой точностью дать экотоксикологическую оценку потенциальной опасности поллютантов, попадающих в водоемы, для гидробионтов, наиболее чувствительных к их действию. Его можно использовать для:

1) внесения в периодически пересматриваемые Методические указания МУ 2.1.5.720-98 к обоснованию гигиенических нормативов химических веществ, особенно вновь синтезируемых, в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования, обеспечивающих безопасность вод для здоровья человека;

2) разрабатываемых методических указаний к обоснованию экологических нормативов химических веществ в воде водных объектов, обеспечивающих сохранение водного населения разного уровня организации и токсикорезистентности;

3) оценки качества вод, загрязненных различными токсикантами, в том числе природных, при экологической экспертизе;

4) для экотоксикологической оценки новых потенциально опасных для водных организмов химических веществ, внедряемых в хозяйственную деятельность.