способ генетического прогнозирования туберкулеза органов дыхания

Формула изобретения

Способ генетического прогнозирования туберкулеза органов дыхания, включающий молекулярное типирование генов семейства HLA при помощи полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что при выявлении аллеля HLA-DRB1*01, прогнозируют резистентность к туберкулезу.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно фтизиатрии, и может быть использовано с целью прогноза заболевания туберкулезом органов дыхания.

В последние 10 лет благодаря результатам выполнения международной и национальных программ «Геном человека» появилась возможность изучения наследственной компоненты подверженности различным заболеваниям, в том числе хроническим инфекциям. Изучение генетических детерминант такой грозной инфекции, как туберкулез, позволяет не только проникнуть в фундаментальные механизмы иммунитета и патологии при туберкулезе, но и использовать методы генетического типирования с целью совершенствования диагностики и терапии туберкулеза органов дыхания.

По современным представлениям, главную роль в регуляции иммунного ответа и, в конечном итоге, выживания человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной инфекционной агрессии обеспечивает главный комплекс гистосовместимости - система HLA. Гены HLA активно изучают, чтобы выяснить механизм включения данных генов в структуру наследственной предрасположенности и оценить силу их влияния на те или иные клинические проявления болезни.

Представления о строении системы HLA развиваются в течение всего периода ее изучения, однако информация о генах человека, участвующих в контроле туберкулезной инфекции, все еще очень скудна. Наибольший интерес для фтизиатрии в настоящее время представляют гены класса II комплекса HLA, в том числе аллели локуса HLA-DRB. Рядом авторов изучалась роль системы HLA в развитии туберкулеза у детей (Довгалюк И.Ф. 1985; 1993) и взрослых (Л.Е.Поспелов, В.Ю.Мишин с соавт., 2003; Л.Е.Поспелов, А.Г.Матракшин с соавт., 2003) серологическими методами. Следует констатировать, что определение генетических детерминант туберкулеза представляется трудной задачей, а первоначальные выводы, основанные главным образом на результатах лимфоцитотоксического теста, нуждаются в верификации и в поисках еще более эффективных подходов в исследовании данной проблемы.

Прототипом предлагаемого изобретения явилась работа Довгалюк И.Ф., где решалась задача генетического прогноза заболевания и течения туберкулеза органов дыхания у детей на основании изучения фенотипических характеристик HLA серологическим методом (Довгалюк И.Ф. Роль иммуногенетических факторов в развитии и течении туберкулезной инфекции у детей: Дис... д-ра м. н. - СПб., 1993). В данной работе автор рассматривала различную частоту встречаемости фенотипов локусов HLA А, В, С (I класс) и DR у детей с различными проявлениями туберкулеза. Материалом исследования послужили результаты наблюдения детей, находившихся на излечении в клиниках СПбНИИФ в 1988-1991 гг., то есть в период эпидемиологического благополучия по туберкулезу.

Несовершенство данного способа объясняется тем, что лимфоцитотоксический тест имеет пределы возможности метода и количество специфичностей, определяемых данной методикой, меньше, чем при определении методом полимеразной цепной реакции. Метод полимеразной цепной реакции позволил расширить представления о полиморфизме комплекса HLA, при этом были открыты многие новые аллели классов I, II и III, и общее количество известных специфичностей увеличилось более чем в 6 раз. Кроме того, в настоящее время установлено, что гены I класса отвечают за реализацию иммунологических реакций гиперчувствительности немедленного типа, в то время как при туберкулезе главную роль играет гиперчувствительность замедленного типа (гены II класса).

Материалы предлагаемого способа основаны на результатах наблюдения подростков с деструктивными процессами и бактериовыделением, туберкулез органов дыхания которых выявлен в условиях повсеместного роста заболеваемости и смертности от туберкулеза.

Задачей данного способа является повышение эффективности генетического прогнозирования туберкулеза органов дыхания.

Задача реализуется за счет того, что проводится молекулярное типирование гена HLA-DRB1* и при наличии аллеля HLA-DRB1*01 прогнозируют резистентность к туберкулезу.

Преимущества способа: за счет использования современных методов генетического типирования повышается точность генетического прогноза туберкулеза органов дыхания.

Для выполнения поставленной задачи проводится молекулярное типирование HLA-генов DRB1* локуса методом полимеразной цепной реакции (PCR-SSP) с использованием панели отечественных праймеров фирмы «ДПК-технология» (Москва, Институт Иммунологии).

Способ осуществляется следующим образом.

1. Выделение ДНК

Геномная ДНК выделяется из мононуклеарных клеток периферической крови (свежей или замороженной при -20°С), стабилизированной ЭДТА или цитратом натрия (конечная концентрация антикоагулянта 0,5%), с помощью набора реагентов для выделения ДНК "НПФ ДНК-технология" (Москва). Периферическую кровь центрифугируют в пластиковой пробирке типа "Eppendorf" при 13000 g в течение 1 минуты. Затем надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл лизирующего буфера и центрифугируют при 13000 g в течение 1 минуты. Процедура лизиса повторяется до тех пор, пока надосадочная жидкость не становится прозрачной.

После окончательного удаления надосадочной жидкости к осадку мононуклеаров добавляют 60 мкл буфера для протеиназы К, 1 мкл протеиназы К (концентрация 10 мг/мл) и ресуспендируют. Инкубация с ферментом проводится не менее чем в течение 60 минут при +55°С. Инактивация протеиназы К после инкубации проводится путем нагревания пробирки на водяной бане при 95°С в течение 10 минут. После охлаждения пробирку центрифугируют при 13000 g в течение 10-15 секунд. Раствор ДНК хранится при +4°С до использования.

2. HLA-DRB1-типирование

Молекулярное типирование гена DRB1 проводится с использованием панели праймеров, позволяющей выявлять 13 групп его аллелей. Используемый метод включает в себя целую серию амплификации различных участков гена HLA-DRB1 и называется PCR-MSSP-методом (polimerase-chain reaction sequence specific primers mixed) (Алексеев Л.П. и соавт., 1997). Амплификация проводится на амплификаторе "ТЕРЦИК" ("ДНК-Технология", Москва) в два этапа:

I этап - амплификация II экзона DRB1 - гена проводится по следующему температурному режиму:

1. 94°С-1 мин	1 цикл
2. 94°С - 0 мин 20 с	7 циклов
58°С - 0 мин 5 с
3. 92°С - 0 мин 5 с	28 циклов
56°С - 0 мин 2 с

В результате этой амплификации получается продукт длиной 247 или 243 п.н., который затем разводится в 10 раз и используется во втором этапе амплификации. В качестве отрицательного контроля в реакции вместо ДНК используют дистиллированную воду.

II этап - серия амплификации со специфическими парами праймеров по следующему температурно-временному режиму:

93°С - 0 мин 1 с	15 циклов
62°С - 0 мин 2 с

Примечание: температурно-временной режим как I, так и II этапов амплификации всегда приводится в прилагаемой к набору реактивов инструкции. Он может несколько варьировать в зависимости от незначительных изменений в технологии изготовления реактивов.

Продукты амплификации оцениваются методом гель-электрофореза в 3,2% агарозном геле. Аллельная идентификация проводится путем сравнения длины полученных продуктов с маркером длин PUC19. Определенный аллель имеет амплификационный продукт определенной длины.

Материалом для выполнения задачи исследования послужили результаты динамического наблюдения 50 подростков, больных туберкулезом органов дыхания. Первичные формы туберкулеза органов дыхания диагностировались у 19 (38%) пациентов, вторичный туберкулез - у 31 (62%) подростка. Двусторонняя локализация изменений в легких определялась более чем у половины пациентов - 27 (54%). По протяженности поражения легочной ткани превалировали полисегментарные процессы - 29 (58%), поражение 1-2 сегментов отмечено в 18% случаев, изменения в пределах доли - 24% (12 чел.).

Деструкция легочной ткани зарегистрирована у 42 (84%)больных: в 78,6% (33 чел) определялись сформированные полости распада. Множественные каверны выявлены почти у половины пациентов - 46% (15 чел.). Преобладали полости с размерами до 4 см - у 60,6% (20 чел.).

Бактериовыделение зарегистрировано у 33 (66%).

Сопоставление проведено с группой здоровых лиц - жителей Северо-Запада России (346 человек) методом непараметрической статистики с вычислением ².

В результате установлено, что в группе больных туберкулезом органов дыхания по сравнению с контрольной группой достоверно снижена частота встречаемости аллеля HLA-DRB1*01 ( ²=4.95, p<0,05; чертеж), что свидетельствует о протективной роли данной специфичности в отношении развития туберкулезной инфекции. Полученные нами данные позволяют расценивать наличие в генотипе HLA-DRB1*01 как протективный генетический фактор, определяющий резистентность к туберкулезу органов дыхания.