способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции

Формула изобретения

Способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции, включающий смешивание исследуемого образца с реагентами и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой, отличающийся тем, что в качестве исследуемого образца используют экстракт пшеничных зародышей, для получения которого пшеничные зародыши измельчают до размера частиц 0,01-1,00 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 30 мин, после чего отделяют фильтрат, представляющий собой экстракт пшеничных зародышей, центрифугированием при частоте вращения ротора 5000 мин^-1 в течение 20 мин и анализируют, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в продукте.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу оценки качества пшеничных зародышей, применяемых в медицинской, косметической, кондитерской отраслях промышленности, продуктах детского и диетического питания.

Известным способом оценки качества пшеничных зародышей (ТУ 9295-027-00932169-2000 "Хлопья зародыша пшеничного") является метод определения кислотного числа (ГОСТ Р 52110-2003. Масла растительные. Методы определения кислотного числа. М.: Изд-во стандартов, 2003), который характеризует количество продуктов, образованных при реакции окисления.

Недостатками данного способа оценки качества зародышевого продукта являются невозможность определения главных инициаторов реакции цепного окисления липидов - свободных радикалов, которые обычными методами химического анализа не могут быть определены из-за их неустойчивости в биохимических системах, а также длительность проведения испытаний и высокий расход дорогостоящих реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигнутому эффекту является способ определения интенсивности процесса перекисного окисления липидов методом индуцированной хемилюминесценции ["Определение интенсивности свободнорадикальных процессов у здоровых и больных людей" (Биохемилюминесценция // Сб. под ред. Журавлева А.И. - М.: Наука. - 1983. - С.3-30)], предусматривающий смешивание исследуемого образца с фосфатным буфером с рН 7,5, сульфатом железа (II) и перекисью водорода и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой. Метод индуцирования хемилюминесценции перекисью водорода с сульфатом железа (II), применяющийся в клинической биохимической лаборатории для выявления нарушений перекисного окисления липидов в организме при оценке патологического состояния больных в медицине, основан на том, что в представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси с ионами металла с переходной валентностью - двухвалентным железом по реакции Фентона; образующиеся при этом свободные радикалы (R , ОН , RO , RO₂ , O₂ ) вступают в процесс инициации свободнорадикального окисления в исследуемом биологическом субстрате (моче, слюне, крови), рекомбинация радикалов RO₂ приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света.

Недостатком этого способа является то, что его невозможно использовать для анализа качества растительных тканей, в частности пшеничных зародышей.

Технической задачей изобретения является разработка способа количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции для определения качества пшеничных зародышей.

Техническая задача достигается тем, что в способе количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции, включающем смешивание исследуемого образца с реагентами и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой, новым является то, что в качестве исследуемого образца используют экстракт пшеничных зародышей, для получения которого пшеничные зародыши измельчают до размера частиц 0,01-1,00 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН 7,5 в соотношении 1:10 в течение 30 минут, после чего отделяют фильтрат, представляющий собой экстракт пшеничных зародышей, центрифугированием при частоте вращения ротора 5000 мин^-1 в течение 20 минут и анализируют, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН 7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II).

Технический результат заключается в том, что разработанный способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции применяют для определения качества пшеничных зародышей.

Способ осуществляют следующим образом. При приготовлении исследуемого образца пшеничные зародыши измельчают до размера частиц 0,01-1,00 мм, затем измельченные пшеничные зародыши смешивают с фосфатным буфером (рН 7,5) в соотношении 1:10 и встряхивают в течение 30 минут. Затем центрифугируют в течение 20 минут при частоте вращения ротора 5000 мин^-1 . Фильтрат, представляющий собой экстракт пшеничных зародышей, анализируют на биохемилюминометре БХЛ-06. Для этого в измерительную кювету вносят 0,1 мл исследуемого образца, 0,4 мл фосфатного буфера (рН 7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Затем быстро вносят 0,2 мл Н₂О₂ и переводят кювету в измерительное положение. В течение 40 секунд регистрируют показания хемилюминесценции. На информационной карте высвечивается максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, светосумма и тангенс угла наклона кинетической кривой.

На чертеже представлена типичная кинетическая кривая развития хемилюминесценции, сопровождающей процесс свободнорадикального перекисного окисления липидов мембран.

Она включает следующие стадии: "быструю вспышку" хемилюминесценции (I) и латентный период (II). Параметр I _max - максимальное значение интенсивности хемилюминесценции характеризует перекисные процессы в продукте. Чем выше показатель I_max, тем больше свободных радикалов в продукте и интенсивнее перекисное окисление липидов. Параметр tg - тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта. Чем больше этот показатель, тем выше ингибирующая способность продукта. Параметр S - светосумма - площадь под кинетической кривой развития хемилюминесценции коррелирует с показателями I_max и tg .

Пример. Продукт с влажностью 8,2% и содержанием липидов 10,2% заложили на опытное хранение при температуре 15°С и относительной влажности воздуха 75%. Каждые 15 дней проверяли показатель кислотное число продукта по стандартной методике и показатели хемилюминесценции. Каждый опыт проводили в 4-5 кратной повторности. Результаты исследований представлены в таблице.

Время хранения, сут	Показатели качества
	Кислотное число, мг КОН/г	Imax	tg	S
Начало	5,55	3,292	2,346	37,16
15	13,90	3,788	2,086	44,45
30	21,85	4,685	1,662	52,35
45	29,80	5,428	1,196	62,12
60	40,05	6,534	0,894	75,16
75	44,25	6,986	0,786	80,03
90	47,05	7,524	0,577	85,22

При изучении изменения традиционного показателя качества пшеничных зародышей установлено, что кислотное число постоянно росло и к концу третьего месяца его значение увеличилось на 41,5 мг КОН/г. Причем в течение первых двух месяцев наблюдался интенсивный рост кислотного числа, т.е. за первые 30 суток значение кислотного числа увеличилось на 16,3 мг КОН/г, за вторые 30 суток - на 18,2 мг КОН/г, а за последние - только на 7 мг КОН/г.

Заложенный на хранение продукт исследовали на приборе БХЛ-06 для определения интенсивности перекисного окисления в пшеничных зародышах и их ингибирующей способности. При хранении пшеничных зародышей интенсивность перекисного окисления (I_max ) на начало составила 3,292, за три месяца хранения она увеличилась до 7,594. Ингибирующая способность продукта (tg ) за тот же период хранения снизилась с 2,346 до 0,577. Значение S увеличилось с 37,16 до 85,22. За первые 30 суток хранения значение I_max увеличилось на 1,393, в то время как ингибирующая способность tg снизилась на 0,684, а значение S выросло на 15,19; в период с 30 суток по 60 сутки интенсивность перекисного окисления выросла на 1,849, значение S - на 22,84, а tg уменьшился на 0,768; за последние 30 суток разница I_max между 90 и 60 сутками составила 0,99, S - 10,06, а значение tg снизилось на 0,317.

Таким образом, предложенный способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции позволяет адекватно оценить качество пшеничных зародышей.