способ диагностики метастазов в лимфатических узлах корня легкого при раке легкого

Формула изобретения

Способ диагностики метастазов в лимфатических узлах корня легкого у больных раком легкого, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что определяют активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и активность НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) в лимфоцитах периферической крови, при этом сочетание активности ЛДГ выше или равной 12,50 мкЕ и активности НАДФГДГ равной или ниже 0,25 мкЕ свидетельствует об отсутствии метастазов, а сочетание активности ЛДГ ниже 12,50 мкЕ и активности НАДФГДГ выше 0,25 мкЕ свидетельствует о наличии метастазов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, точнее к онкологии. Способ предназначен для дооперационного планирования тактики лечения.

Известен лабораторный способ диагностики метастазов рака легкого, основанный на исследовании скорости оседания эритроцитов, цветного показателя, среднего объема эритроцитов, концентрации лимфоцитов, натрия, уровня альбуминов и мочевой кислоты [Патент 1184125 SU, МПК ⁷ А 61 В 10/00. Способ диагностики метастазов рака легкого / 1-й Московский медицинский институт им. И.М.Сеченова, SU / Вапник Т.Н., Шехтер А.И., Романычев Ю.А., Аблицов Ю.А.; заявлено 1983.08.05; заявка 3632209/14; опубл. 2002.11.20].

Известный способ основан на анализе показателей крови, определяемых различными методами и имеющих широкие вариации в норме и при различных патологических состояниях. Кроме того, за исключением концентрации лимфоцитов в крови, все указанные параметры не отражают состояния активности иммунной системы, недостаточный уровень реактивности которой и определяет появление метастазов.

Известный способ является недостаточно точным.

Задачей изобретения является повышение точности диагностики.

Задача решается тем, что в способе диагностики метастазов в лимфатических узлах корня легкого у больных раком легкого, включающем исследование биологического материала, согласно изобретению, определяют активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и активность НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) в лимфоцитах периферической крови, при этом сочетание активности ЛДГ выше или равной 12,50 мкЕ и активности НАДФГДГ равной или ниже 0,25 мкЕ свидетельствует об отсутствии метастазов, а сочетание активности ЛДГ ниже 12,50 мкЕ и активности НАДФГДГ выше 0,25 мкЕ свидетельствует о наличии метастазов в лимфатических узлах корня легкого.

Лимфоциты, снабженные рецепторами ко всем гуморальным регуляторным веществам, отвечают на поступающие импульсы изменением активности ферментов. Ответ клетки зависит от интенсивности поступающих сигналов, которая определяется не только количеством циркулирующих в крови регуляторных веществ, но и чувствительностью к ним иммунокомпетентных клеток - лимфоцитов. При опухолевом росте на лимфоциты воздействует комплекс регуляторных факторов. С одной стороны, активационные сигналы стимулируют функциональную активность иммунокомпетентных клеток, с другой - сама опухоль синтезирует ряд иммуносупрессорных веществ, ингибирующих реактивность иммунокомпетентных клеток. Наиболее высокой информативностью для исследования метаболизма активированных лимфоцитов обладают окислительно-восстановительные ферменты. Это связано с тем, что, являясь основными переносчиками электронов в клетке, они осуществляют ключевые реакции клеточного метаболизма и координируют сопряженные метаболические пути. ЛДГ (КФ 1.1.1.27) является основным регулятором цитоплазматического уровня НАДН/НАД. В случае избытка НАДН в цитоплазме ЛДГ восстанавливает пируват до лактата, который затем удаляется из клетки (анаэробная реакция ЛДГ). В то же время при активации аэробных процессов ЛДГ окисляет лактат до пирувата с образованием НАДН (аэробная реакция ЛДГ). НАДФГДГ (КФ 1.4.1.4) осуществляет НАДФ-зависимое окислительное дезаминирование L-глутаминовой кислоты. Глутаматдегидрогеназы являются ключевыми в системе внутриклеточного обмена азота.

Способ выполняют следующим образом. Из гепаринизированной венозной крови (25 ЕД/мл) обследуемого больного раком легкого, направленного на хирургическое лечение, выделяют лимфоциты. Для этого гепаринизированную кровь наслаивают на фиколл-урографин ( =1,077) в соотношении 1,5:5. Центрифугирование осуществляют при 400 g в течение 30 мин. Клетки, расположенные на границе раздела плазмы и градиента фиколл-урографина, собирают и трижды отмывают в среде 199. Подсчитывают количество выделенных лимфоцитов в камере Горяева и доводят концентрацию лимфоцитов до концентрации 10⁶ клеток/мл. Затем суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, после однократного замораживания-размораживания дополнительно разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему). Определяют активность ЛДГ и НАДФГДГ одним из известных способов, например, биолюминесцентным. Инкубационная смесь для определения активности ЛДГ содержит следующие реактивы: 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов, 50 мкл 2,0 мМ лактата в 0,1 М Трис-HCl буфере рН 9,0, 100 мкл 0,5 мМ НАД⁺ в 0,1 М Трис-HCl буфере рН 9,0. Инкубационная смесь для определения активности НАДФГДГ содержит следующие реактивы: 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов, 50 мкл 0,5 мМ глутамат в 0,1 М Трис-HCl буфере рН 9,8, 100 мкл 1,65 мМ НАДФ⁺ в 0,1 М Трис-HCl буфере рН 9,8. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производят в тех же условиях, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. После инкубации проб при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5 M, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М К⁺,Na⁺-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра, например "БЛМ-8803", производят измерение свечения. Получают относительные значения активности, исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10^-9 -10^-4 М вносят в кювету биолюминометра, содержащую биолюминесцентные реактивы в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции.

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывают по формуле:

,

где:

А - активность дегидрогеназы, мкЕ (1 мкЕ=10^-6 Е, 1 Е=1 мкмоль/мин);

[С] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента";

0,31 - объем пробы, миллилитры;

30 - время инкубации, мин.

Активности ЛДГ ниже 12,50 мкЕ и НАДФГДГ выше 0,25 мкЕ свидетельствует о наличии метастазов в лимфатических узлах корня легкого. Активность ЛДГ выше или равна 12,50 мкЕ, а активность НАДФГДГ, равная или ниже 0,25 мкЕ, свидетельствует об отсутствии метастазов.

Исходя из наличия или отсутствия метастазов, планируют тактику комбинированного лечения.

Пример 1. Больной Г., 75 лет. История болезни №2259/189. Находился на стационарном лечении в отделении торакальной хирургии Красноярского краевого онкологического диспансера с 8.04.2003 по 28.04.2003 с диагнозом: рак правого легкого IA стадии, T₁N₀M₀.

При исследовании уровней активности дегидрогеназ в лимфоцитах крови обнаружено, что активность ЛДГ составляет 26,89 мкЕ, а активность НАДФГДГ равна 0,12 мкЕ.

Диагноз - в лимфатических узлах корня легкого отсутствуют метастазы. На основании установленного диагноза не рекомендована дооперационная лучевая или химиотерапия.

Операция 17.04.03., проведена торакотомия справа. Расширенная нижняя лобэктомия. Проведено контрольное гистологическое исследование №16200-201: в препарате определен плоскоклеточный ороговевающий рак. В лимфатических узлах картина реактивной гиперплазии, что подтверждает результат, полученный по предлагаемому способу диагностики.

Пример 2. Больной Б., 62 лет. История болезни №7374/662. Находился на стационарном лечении в отделении торакальной хирургии Красноярского краевого онкологического диспансера с 24.11.2003 по 21.12.2003 с диагнозом: рак левого легкого III стадии, T₃N ₁M₀.

При исследовании уровней активности дегидрогеназ в лимфоцитах крови обнаружено, что активность ЛДГ составляет 7,45 мкЕ, а активность НАДФГДГ равна 1,14 мкЕ.

Диагноз - в лимфатических узлах корня легкого присутствуют метастазы. На основании установленного диагноза может быть рекомендована дооперационная лучевая или химиотерапия.

Операция 04.12.03., проведена торакотомия слева. Расширенная пульмонэктомия. Проведено контрольное гистологическое исследование №50154-71: в препарате определен плоскоклеточный рак, в бифуркационных лимфатических узлах обнаружены метастазы, что подтверждает результат, полученный по предлагаемому способу диагностики.

Предлагаемым способом обследовано 175 человек. Достоверность различий определялась по критерию Манна-Уитни.

Диагностика метастазов в лимфатических узлах корня легкого позволяет до операции более точно определить стадию заболевания и эффективность предоперационной лучевой или химиотерапии.