пробиотик

Формула изобретения

1. Применение штамма Lactobacillus fermentum ME-3 DSM 14241 в качестве пробиотика.

2. Применение по п.1 для приготовления функционального продукта питания.

3. Применение по п.1 для приготовления продукта для профилактики и лечения кишечных инфекций и уроинфекций.

4. Применение по п.1 для приготовления продукта против окислительного стресса.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к биотехнологии и будет использовано в качестве нового пробиотика, применяемого в получении функциональных пищевых продуктов (йогурта, сыра) и непищевых препаратов (таблеток, капсул) для предупреждения или лечения различных заболеваний.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пробиотики являются живыми микробными пищевыми добавками, которые оказывают полезное действие на микробиологический баланс кишечника и здоровье человека. Пробиотики используют в качестве функциональных пищевых продуктов. Функциональные пищевые продукты являются пищевыми продуктами, потребляемыми дополнительно к обычным пищевым продуктам и содержащими биопрепараты (в том числе пробиотики) или другие компоненты, благоприятно влияющие на здоровье человека или уменьшающие риск заболеваний.

Пробиотики потребляются в виде компонентов пищевых продуктов (пробиотического йогурта или сыра) или непищевых препаратов (лиофилизированных микробных культур).

Большинство пробиотиков являются молочно-кислыми бактериями, главным образом молочно-кислыми бактериями (лактобациллами). Лактобациллы являются непатогенными микроорганизмами, колонизирующими кишечник и мочеполовые пути с раннего детства до старого возраста. В настоящее время успешно используют несколько коммерческих пробиотических лактобацилл, среди которых Lactobacillus rhamnosus GG (Saxelin M. Lactobacillus GG - a human probiotic strain with thorough clinical documentation. Food Rev Int 1997; 13: 293-313) является наиболее известным. Недавно были описаны и запатентованы несколько новых штаммов лактобацилл, например L. reuterii (патент Кореи KR 211529, C 12 N 1/20, Korea Institute Sciences Technology, 1999), выделенный из организма животного и по этой причине непригодный для применения человеком.

Несколько штаммов Lactobacillus fermentum используют для коррекции и стабилизации кишечной микрофлоры в случае дисбактериоза и инфекций мочеполовых путей с различными этиологиями. Штамм микроорганизма Lactobacillus fermentum 39 используют для получения бактериального биологического препарата (PCT/SU 89/00264 (WO 91/05852), C 12 N 1/20, А 61 К 35/74, University of Tartu, 1991). Штамм Lactobacillus fermentum 90-TS-4 (RU 2133272, C 12 N 1/20, А 61 К 35/74, Akivo Lentsner et al., 1999) характеризуется по лектинотипированию как штамм, имеющий чувствительный к маннозе профиль клеточной стенки. Этот препарат предписывают для применения в гинекологии.

Существуют некоторые хорошо известные пробиотики, нацеленные против только одного патогена (например, Salmonella) (патент США 54785576 А 61 К 35/74, US Agriculture, 1995; патент США 5340577, А 61 К 35/74, US Army, 1994). До настоящего времени не был описан штамм лактобацилл с сильным антимикробным действием против многочисленных патогенов и условно-патогенных микроорганизмов.

Подобным образом еще не известен такой штамм микроорганизма, который мог бы иметь природную антибиотическую устойчивость против лекарственных средств, используемых наиболее часто в лечении инфекций. Это свойство позволило бы использовать такие штаммы в случае принимающих антибиотики пациентов. В ветеринарии используют ряд различных микроорганизмов, содержащих также один штамм L. fermentum, но этот штамм не имеет сопутствующего антимикробного и антиокислительного действия (патент России RU 2119796, А 61 К 35/66, Закрытое акционерное общество "BAKS", 1998).

Антиокислительные препараты, подобные витаминам Е и С, бета-каротину и др., получают в настоящее время большое внимание в связи со здоровым питанием. Избыточное образование химически активных (реакционноспособных) молекул кислорода (ROS) в дыхании ткани может вызывать повреждение клеток и, следовательно, тканей. Образование химически активного кислорода может зависеть от некоторых стресс-факторов, таких как алкоголь, пероксиды и некоторые лекарственные средства.

Обычно избыточное окисление тесно связано с обусловленными питанием заболеваниями, возрастом, нарушениями центральной нервной системы и желудочно-кишечного тракта, раком и другими патологическими состояниями. Организм имеет несколько систем защиты против токсикогенности кислорода. Для гарантии функционирования этих систем важным является прием антиоксилительных веществ.

Из известных решений ближе всего к данному изобретению является патент, описывающий антиокислительные пищевые продукты, антиокислительный препарат и способ антиокисления (ЕР 0649603, A 23 L 3/3472, A 23 L 3/3571, Otsuka Pharma Co Ltd. 1995). Целью этого изобретения является препарат, который содержит природное вещество, включающее в себя марганец (листья растения чая) и микроорганизм Lactobacillus plantarum, который продуцирует систему каталазы и супероксиддисмутазы, увеличивая таким образом антиокислительную активность организма-хозяина. Авторы этого изобретения заявляют, что этот препарат предотвращает заболевания, развивающиеся вследствие действия химически активного кислорода. Однако они не описывают действия конкретного штамма Lactobacillus с уменьшающей реакционноспособный кислород антиокислительной активностью или улавливанием гидроксильных радикалов in vitro. Кроме того, этот штамм микроорганизма является также несовершенным, поскольку для получения предполагаемого антиокислительного действия в организме (in vivo) необходимо добавить некоторое количество Mn-содержащего материала (листья растения чая) к этому препарату, так как только в этом случае реализуется его SOD-(супероксиддисмутазная)-активность.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью данного изобретения является обеспечение штамма микроорганизма в качестве нового антимикробного и антиокислительного пробиотика для применения в фармацевтической и пищевой промышленности, а также в медицине в качестве устойчивого к антибиотикам препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных и урологических инфекций и против окислительного стресса.

Объект данного исследования - штамм микроорганизма Lactobacillus fermentum ME-3 - был выделен из фекальной пробы здорового ребенка во время сравнительного исследования микрофлоры детей Эстонии и Швеции с использованием среды MRS (Oxoid) и культивированием его в СО₂-содержащей окружающей среде (Sepp et al., Intestinal microflora of Estonian and Swedish infants, Acta Paediatricia, 1997, 86, 956-961).

Штамм микроорганизма Lactobacillus fermentum ME-3 выделяли посевом разведений фекалий здорового однолетнего эстонского ребенка (10^-2-10⁷ в фосфатном буфере с 0,04% тиогликолевой кислотой; рН 7,2). Эти разведения высевали на свежеприготовленную MRS-агаровую среду и культивировали при 37°С в среде с СО₂. Штамм, который является объектом данного изобретения, выделяли из разведения 10^-5 на основании характерной морфологии колоний и клеток. Затем следовала предварительная и более точная идентификация. С использованием дополнительных тестов этот штамм был отобран из других выделенных лактобацилл из того же самого ребенка на основании его особых свойств.

Тот факт, что микробный штамм Lactobacillus fermentum ME-3 происходит из кишечного тракта здорового ребенка, доказывает его GRAS - (обычно признаваемый как безопасный) - статус, т.е. этот штамм микроорганизма является безопасным для организма человека и пригодным для перорального введения.

Культурально-морфологические свойства определяли после культивирования этого штамма на средах MRS-агаре и MRS-бульоне (OXOID). Микробные клетки являются грамположительными палочками правильной формы, расположенными в параллельных цепях, не образующими спор, средней толщины и различной длины (2×3-5 мкм).

Физиолого-биохимические свойства: MRS-бульон был пригоден для культивирования этого микробного штамма в течение 24-48 часов в среде с 10% CO₂, после чего в бульоне происходил гомогенный мутный рост. Колонии микроорганизма на MRS-агаре являются белыми, округленными, имеющими правильные края.

Оптимальная температура роста равна 37°С, микроорганизм размножается также при 45°С, но не растет при 15°С. Оптимальная среда для роста имеет рН 6,5.

Основными свойствами являются отрицательный каталазный тест, продуцирование газа при ферментации глюкозы, продуцирование NH₃ из аргинина и продуцирование лизоцима. Во время репродукции в молоке он продуцирует 1,07% кислоты.

Штамм с вышеупомянутыми свойствами идентифицировали на основании биохимической активности с использованием набора API 50 CHL System (BioMerieux, France) как Lactobacillus fermentum (ID% 99,6, Т 0,87, только 1 тест был противоположным). Ферментировали следующие сахара и спирты: рибозу, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, эскулин, мальтозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, D-рафинозу, D-тагатозу и глюконат.

Профиль метаболитов Lactobacillus fermentum ME-3 был характерным для гетероферментативного метаболизма, как определено способом газовой хроматографии (Hewlett-Packard model 6890). Профиль ферментации зависел от среды инкубирования: кроме молочной и уксусной кислот в среде с CO₂ продуцировалась в большом количестве янтарная кислота, но в анаэробной среде продуцировался в большом количестве этанол наряду с вышеупомянутыми веществами (таблица 1). Как янтарная кислота, так и этанол могут усиливать свойства стабильности этого микробного штамма в молоке, ферментируемом данным штаммом.

Таблица 1.

Концентрация уксусной кислоты, молочной кислоты, янтарной кислоты и этанола (мг/мл) в среде MRS при культивировании Lactobacillus fermentum ME-3 в микроаэрофильной и анаэробной среде в течение 24 и 48 часов

Молекулярная идентификация

Молекулярная идентификация при помощи ИТС-ПЦР (внутреннего транскрибируемого спейсера - полимеразной цепной реакции) с использованием Lactobacillus fermentum АТСС 14931 в качестве ссылочного штамма подтвердила более раннюю идентификацию с использованием API 50 CHL.

Микроорганизм с вышеупомянутыми свойствами был депонирован в Немецкой Коллекции для Микроорганизмов и Клеточных культур GmbH-s, регистрационный номер депозита DSM 14241 (19.04.2001).

Антимикробная активность

Lactobacillus fermentum ME-3 проявляет высокое антимикробное действие на штаммах Escherichia coli, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium 1 и 2 и Helicobacter pylori in vitro (таблица 2).

Таблица 2. Антимикробная активность штамма Lactobacillus fermentum ME-3 на модифицированном MRS-агаре, в MRS-бульоне и молоке
Lactobacillus fermentum ME-3	Escherichia coli	Shigella sonnei	Staphylococcus aureus	Salmonella typhimurium 1 и 2		Helicobacter pylori
MRS-агар	Зона ингибирования (мм)
CO 2/анаэробная среда	24/22	26/21	20/19	25.8/ 24.7	23.8/19.7	13.2/13.1
MRS-бульон	Уменьшение общего счета (log10) в сравнении с первоначальным счетом
	log 6.0	log 6.7	log 0.8	log 6.3	log 3.8	не определено
Молоко	Супрессия после различных интервалов времени (24-48 часов)
	24 t	32 t	24 t	32 t	48 t	не определено

С использованием ферментации молока удалось показать, что патогены, инокулированные в молоко, убивались в течение 24-48 часов, если молоко ферментировали с Lactobacillus fermentum ME-3. Такое свойство этого штамма может способствовать предупреждению размножения патогенов в продуктах (йогурте, сыре), ферментированных этим штаммом, и предупреждать связанные с питанием инфекции.

Органические кислоты и этанол, продуцируемые Lactobacillus fermentum ME-3, могли бы обеспечивать высокое антимикробное действие этого микроорганизма.

Устойчивость к антибиотикам

Согласно диск-диффузионному тесту (BBL Sensi disks) и Е-тесту (АВ Biodisk, Solna), Lactobacillus fermentum ME-3 был устойчивым к метронидазолу, офлоксацину, азтреонаму, цефокситину и TMP-SMX. Это позволяет использовать штамм Lactobacillus fermentum ME-3 в качестве препарата, сопровождающего лечение антибиотиками, в случае кишечных инфекций и уроинфекций.

Поверхностные структуры микробной клетки

Профиль углеводов поверхностной структуры микробных клеток Lactobacillus fermentum ME-3 определяли с использованием лектинотипирования. Этот штамм лактобацилл агглютинировал с пектином Griffonia simplifolia I, который является специфическим в отношении лигандов Gal и GalNAc в клеточной стенке.

Штамм Lactobacillus fermentum ME-3 не реагировал со следующими другими пектинами: Concanavalin ensiformis (Con А), Griffonia simplicifolia II, Arachis hypogaea (PNA), Vicia sativa (VSA) и Triticum vulgaris (WSA).

Таким образом, особый состав гликокаликса клеточной стенки Lactobacillus fermentum ME-3 становился ясным на основе лектинотипирования, он содержал остатки галактозы и N-ацетилгалактозамина. Эти соединения действуют в качестве адгезинов для сцепления с рецепторами слизистой оболочки эпителиальных клеток верхних мочевых путей.

Это является возможностью блокирования устойчивых к маннозе волосков (пилусов) Escherichia coli, что делает штамм авторов данного изобретения применимым в профилактике инфекций мочевых путей.

Антиокислительные свойства

Лактобацилл инкубируют в MRS-бульоне (Oxoid Ltd.) в течение 24 часов и центрифугируют при 4°С (1500 об/мин) в течение 10 минут с получением осадка, промывают изотонической солью (4°С) и суспендируют до плотности 1,15% KCl (Sigma, USA). Плотность суспензии была при OD₆₀₀ 1/1·10⁹ бактериальных клеток в мл^-1 ).

Для получения лизатов эти клетки разрушали обработкой звуком (В-12 Branson Sonic Power Company, Danbury, Connecticut) в 35 вибрациях с^-1 в течение 10 минут на бане со льдом и затем в течение 10 минут при -18°С. Эту суспензию центрифугировали при 4°С при 10000 g/r в течение 10 минут и супернатант фильтровали (мембраны MILLEY-GS, стерильные, 0,22 мкм; Millipore S.A., 67 Molsheim, France) с получением бесклеточного экстракта. Клетки Lactobacillus fermentum ME-3 и лизат продуцировали Н₂ О₂ в значительном количестве (таблица 3).

Таблица 3. Общая антиокислительная способность штаммов Lactobacillus fermentum МЕ-3 и Е-338-1-1 (согласно тестам LA и TAS), содержание пероксида водорода, отношение восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону и активность супероксиддисмутазы
Свойства	Lactobacillus fermentum МЕ-3	Lactobacillus fermentum Е-338-1-1
	Интактные клетки	Интактные клетки
ТАА в LA-тесте (%)	29±0.7 (n=5)	0
TAS (ммоль/л)	0.16±0.03 (n=5)	0
H 2O2 (мкг/мл)	31±26 (n=3)	49±20 (n=3)
	Лизат клеток	Лизат клеток
LA-тест (%)	59±3.8 (n=5)	0
H2O 2 (мкг/мл)	229±37 (n=4)	137±25 (n=3)
TGSH	12.5±4.1	5.5±3.0
GSSG (мкг/мл)	2.59±2.01	5.5±2.4
GSH (мкг/мл)	9.95±3.30	Marks
GSSG/GSH	0.28±0.17	0е
30D (Е/мг белка)	0.859±0.309 (n=3)	не определено
Пояснения: LA-тест - тест линоленовой кислоты; ТАА - общая антиокислительная активность; TAS - общий антиокислительный статус; GSSG - окисленный глутатион; GSH - восстановленный глутатион; GSSG/GSH - отношение глутатиона восстановленного к глутатиону оксиленному; SOD - супероксиддисмутаза.

Lactobacillus fermentum МЕ-3 имеет Mn-SOD-активность, определяемую электрофорезом. Для определения L. fermentum МЕ-3 SOD-типа бесклеточный экстракт (30 мкг белка) разделяли на 10% неденатурирующем полиакриламидном геле. Изофермент SOD определяли воздействием на этот гель 15 мМ H₂O₂, после чего сохранялась SOD-активность. Пояснение: H₂O ₂ ингибирует Fe-SOD, но не ингибирует Mn-SOD. Это доказывает, что Lactobacillus fermentum МЕ-3 имеет Mn-SOD-активность.

Штамм Lactobacillus fermentum МЕ-3 обнаруживает высокую величину ТАА (общей антиокислительной активности) в липидной среде на основе теста линоленовой кислоты, также высокую величину TAS (общего антиокислительного статуса) в водной среде (набор Randox, UK). В таблице 3 данные по антиокислительному штамму Lactobacillus fermentum E-338-1 добавлены для сравнения (таблица 3).

Клетки и лизаты штамма Lactobacillus fermentum МЕ-3 улавливают гидроксильные радикалы, что было доказано способом с терефталевой кислотой (27%±5%). 15 мМ восстановленный глутатион использовали для сравнения в качестве хорошо известного акцептора гидроксильных радикалов (84±4,6%). Lactobacillus fermentum МЕ-3 выживал в высокоокислительной среде Н₂O₂.

Повторное культивирование лиофилизированной культуры, поддерживаемой при комнатной температуре в течение продолжительного времени, доказало жизнеспособность этого штамма и стойкость его свойств. Это гарантирует, что лиофилизированный штамм Lactobacillus fermentum МЕ-3 мог бы быть использован в качестве непищевого продукта в схеме функционального питания.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример получения йогурта с высокоантиокислительными свойствами на основе штамма Lactobacillus fermentum МЕ-3 и испытание потребления этого йогурта здоровыми добровольцами.

Чистую культуру Lactobacillus fermentum ME-3 в 0,15% MRS-агаре используют для получения йогурта, дополнительно чистые культуры Lactobacillus plantarum и Lactobacillus buchneri высевают в свежее козье молоко, автоклавированное в течение 20 минут при 110°С. Три культуры этих штаммов лактобацилл смешивают в равных долях вместе с 2% Streptococcus thermophilus и добавляют при 0,2% содержании в автоклавированное козье молоко.

Lactobacillus fermentum ME-3 со штаммами лактобацилл и стрептококков будет гарантировать получение вкусного и высокоантиокислительного йогурта (таблица 4).

Таблица 4. Антиокислительная активность чистой культуры Lactobacillus fermentum ME-3 и пробиотического йогурта
Штамм	Общая антиокислительная активность (ТАА %)
	Клетки	Йогурт
Lactobacillus fermentum ME-3	29	70

В таблицах 5 и 6 показаны изменения кишечной микрофлоры и показателей окислительного стресса сывороток крови здоровых добровольцев до и после приема пробиотического йогурта из козьего молока в течение 3 недель. Эти изменения доказывают антиокислительное (в том числе антиатерогенное) действие на организм человека.

Еще более высокая общая антиокислительная активность йогурта из козьего молока в сравнении с общей антиокислительной активностью интактных микробных клеток Lactobacillus fermentum ME-3 показана в таблице 5.

Микробные штаммы-добавки гарантируют стандартную кислотность и консистенцию йогурта.

Таблица 5. Изменения кишечной микрофлоры здоровых добровольцев (n=16) до и после потребления пробиотического йогурта из козьего молока в течение 3 недель
	До		После
	Колонизированные лица	Отношение лактофлоры (%)	Колонизированные лица	Отношение лактофлоры (%)
Потребление йогурта из козьего молока (16 человек)
L. fermentum	4*	0,7-5,77	16*	0,5-49,9#
Потребление козьего молока (4 человека)
L.	0	0	1	0-32,9
Статистически значимое увеличение:
* Критерий Фишера показал различие количеств микроорганизмов в лицах, колонизированных Lactobacillus fermentum ME-3, р<0,015;
# Критерий суммы рангов Манна-Уитни показал различие относительной доли Lactobacillus fermentum ME-3 в лактофлоре.

Таким образом, после потребления йогурта в течение 3 недель этот микроб присутствовал в кишечном тракте всех добровольцев и количество Lactobacillus sp. заметно увеличивалось.

Таблица 6. Показатели окислительного стресса сывороток крови добровольцев (n=16) до и после потребления пробиотического йогурта из козьего молока в течение 3 недель
Свойства	Уровень стандарта	Сыворотки крови до испытания	Испытание крови после испытания	Увеличение
ТАА (LA-тест, (%)	36±4.5	38±3.5	45±3.4	16%
TAS, ммоль/л	1.2±0.2	0.82±0.14	1.14±0.08	29%
Отношение Восстановленный/окисленный глутатион (GSSG/GSH)	0.17±0.08	0.15±0.01	0.11±0.035	-32%
Лаг-фаза LDL (время устойчивости)	>30 мин	41±7.9	46±8.6	11%
Базовая величина диеновых конъюгатов (величина экстинкции)	<0.3	0.27±0.06	0.23±0.06	-15%
Окисл.LDL (Е/л)	>127	98±12	81±19	-18%
Пояснения: LA-тест - тест линоленовой кислоты; ТАА - общая антиокислительная активность; TAS - общий антиокислительный статус; GSSG - окисленный глутатион; GSH - восстановленный глутатион; GSSG/GSH - отношение глутатиона восстановленного к глутатиону оксиленному; окисл. LDL - окисленные липопротеины низкой плотности.

Таким образом, все параметры, определенные в сыворотках крови здоровых добровольцев, изменялись благоприятным образом в течение 3-недельного испытания с йогуртом.

Применения данного изобретения не ограничиваются вышеописанным показавшим преимущество примером. В рамках формулы данного изобретения возможны некоторые другие варианты, например получение пробиотического сыра и других молочных продуктов.