новые полициклические ксантоны и их применение

Формула изобретения

1. Соединение общей формулы:

или

где каждый заместитель R¹ является одинаковым или различным и может представлять собой водород, ацил, алкил, алкенил, арил, бензил, щелочной металл и/или моносахарид, дисахарид, трисахарид или их производное, a R² и R ³ могут представлять собой водород или алкил.

2. Соединение IB-00208 по п.1 формулы:

3. Способ получения соединения IB-00208, который включает культивирование штамма микроорганизма, способного его продуцировать в водной питательной среде.

4. Способ по п.3, который дополнительно включает выделение и очистку соединения IB-00208 из культурального бульона.

5. Способ по п.4, где продуцирующий соединение IB-00208 микроорганизм представляет собой по существу чистый штамм культуры РO13-046, имеющийся в распоряжении под номером доступа СЕСТ 5318 в Coleccion Espanola de Cultivos Tipo Университета Валенсии, Испания.

6. По существу чистый штамм культуры РO13-046, который продуцирует соединение IB-00208, выделенный из морских беспозвоночных, принадлежащих к семейству Thermomonosporaceae и таксономически классифицированный как Actinomadura sp.

7. Противоопухолевая фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

8. Противоопухолевая фармацевтическая композиция, содержащая соединение IB-00208 по п.2 и фармацевтически приемлемый носитель.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к полициклическим ксантонам и их противоопухолевому применению.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цервиномицины (ЕР 00246091; ЕР 0054801; J. Antibiot., 1982, 35, 645-652; J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, 6088-6089, J. Antibiot., 1987, 40, 301-308; J. Antibiot., 1994, 47, 342-348; синтетические производные J. Antibiot., 1986, 39, 1636-1639 и ЕР 0259496) и цитреамицины (J. Antibiot., 1989, 42, 846-851; J. Antibiot., 1990, 43, 504-512; EP 0405151) принадлежат к семейству встречающихся в природе антибиотиков, каждый из которых содержит ксантоновую структурную единицу, включенную в более крупную полициклическую структуру.

Указанные соединения обладали сильной активностью в отношении аэробных и анаэробных бактерий и микоплазм, однако противоопухолевая активность была описана только для цервиномицинов (ЕР 0246091).

Недавно в международной заявке PCT/GB01/02148 авторами изобретения также была описана противоопухолевая активность цитреамицинов.

Для лечения многих опухолей человека до сих пор существует потребность в новых противоопухолевых лекарственных средствах. Соответственно, целью настоящего изобретения являлось создание новых противоопухолевых агентов, имеющих полициклическую ксантоновую структуру.

Другой целью настоящего изобретения являлось создание фармацевтических композиций для введения активного соединения нуждающимся в лечении пациентам.

Еще одна цель изобретения была направлена на производство полициклического ксантона путем контролируемой аэробной ферментации с применением биологически чистой культуры микроорганизма в подходящей питательной среде, а также на разработку способов его выделения и концентрирования из ферментационного бульона, и окончательной очистки активного соединения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому классу активных ксантоновых соединений, основанному на открытии нового выделенного из бактерий соединения IB-00208, полезного в качестве противоопухолевого лекарственного средства формулы:

Таким образом, настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы:

или

где каждый заместитель R¹ является одинаковым или различным и может представлять собой водород, ацил, алкил, алкенил, арил, бензил, щелочной металл и/или сахар, а R² и R³ могут представлять собой водород, алкил или образовывать вместе ненасыщенную связь.

Настоящее изобретение также относится к способам получения данных соединений, включая способ получения соединения IB-00208.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

IB-00208 и родственные соединения обладают противоопухолевой активностью в отношении опухолей млекопитающих, таких как карцинома легких человека, карцинома толстой кишки человека, меланома человека, и подобных. Таким образом, настоящее изобретение включает способ лечения любого млекопитающего, страдающего злокачественной опухолью, чувствительной к нему, который включает введение больному терапевтически эффективного количества соединения - или его фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также относится как к фармацевтическим препаратам, которые включают в качестве активного ингредиента соединение IB-00208 или любое его производное, или их фармацевтически приемлемую соль, а также к способам их получения. Используется фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтические композиции обычно получают из активного соединения и включают любые твердые формы (таблетки, пилюли, капсулы, гранулы, и подобные) или жидкие формы (растворы, суспензии иди эмульсии) в комбинации с любым носителем или другими фармакологически активными соединениями.

Правильная доза фармацевтической композиции соединения IB-00208 или его производных может изменяться в соответствии с конкретным соединением, препаративной формой, способом введения, и местом локализации у хозяина и типом подвергаемой лечению опухоли.

Другие факторы, такие как возраст, вес тела, пол, рацион питания, время введения, скорость выведения, состояние пациента, комбинация лекарственных средств, индивидуальная чувствительность и тяжесть заболевания, должны быть приняты во внимание. Введение может производиться постоянно или периодически в пределах максимально переносимой дозы.

Ацильные группы могут представлять собой алифатический ацил, ароматический ацил или смешанный алифатический/ароматический ацил. Так, например, они могут соответствовать формуле RCO-, где R представляет собой алкильную группу, алкенильную группу, арильную группу, арилалкильную группу или алкиларильную группу. Примеры включают бензоил.

Алкильные группы обычно содержат от 1 до 18 атомов углерода. Алкильные группы предпочтительно содержат от 1 до приблизительно 12 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до приблизительно 8 атомов углерода, еще более предпочтительно от 1 до приблизительно 6 атомов углерода, и наиболее предпочтительно 1, 2, 3 или 4 атома углерода. Особенно предпочтительными алкильными группами в соединениях по настоящему изобретению являются метильная, этильная и пропильная, включая изопропильную. Используемый здесь термин «алкильная», если не определено иначе, относится как к циклическим, так и к нециклическим группам, хотя циклические группы должны содержать в кольце по крайней мере три атома углерода. Алкильные группы могут быть с неразветвленной или с разветвленной цепью.

Алкенильные группы обычно содержат от 1 до 18 атомов углерода. Предпочтительные алкенильные группы в соединениях по настоящему изобретению содержат одну или несколько ненасыщенных связей и от 2 до приблизительно 12 атомов углерода, более предпочтительно от 2 до приблизительно 8 атомов углерода, еще более предпочтительно от 2 до приблизительно 6 атомов углерода, и еще более предпочтительно 2, 3 или 4 атома углерода. Используемый здесь термин «алкенильная» относится как к циклическим, так и к нециклическим группам, хотя неразветвленные или разветвленные нециклические группы являются в общем более предпочтительными.

Арильные группы могут быть карбоциклическими или гетероциклическими и могут содержать одно или несколько конденсированных колец. Карбоциклические арильные группы обычно содержат 6 или 10 атомов углерода, как в фенильной или нафтильной группах. Гетероциклические арильные группы обычно содержат от 5 до 12 атомов, более часто 4, 5, 6, 10, 11 или 12 атомов, из которых 1, 2, 3 или более представляют собой гетероатомы, обычно выбираемые из кислорода, серы или азота. Подходящие гетероциклические арильные группы в соединениях по настоящему изобретению включают кумаринил, включая 8-кумаринил, хинолинил, включая 8-хинолинил, пиридил, пиразинил, пиримидил, фурил, пирролил, тиенил, тиазолил, оксазолил, имидазолил, индолил, бензофуранил и бензотиазол.

Типичные щелочные металлы включают натрий и калий.

Применяемые в качестве заместителей сахара обычно представляют собой моно-, ди- или трисахариды, или сахаридные производные, предпочтительно моно- или дисахариды. Предпочтительными являются соединения пентозы или гексозы. Производные включают сахарные гликозиды, N-гликозиламины, O-ацильные производные, O-метильные производные, сахарные спирты, сахарные кислоты, дезоксисахара или родственные соединения. Примеры включают триметилдезоксипиранозу гексозу соединения IB-00208.

В настоящем изобретении описан новый полициклический ксантон IB-00208, выделенный из ферментационного бульона микроорганизма, предпочтительно штамма Actinomadura sp. PO13-046, культура которого была помещена в Colección Espanola de Cultivos Tipo Университета Валенсии, Испания под номером доступа СЕСТ 5318. Депозит данной культуры был совершен в соответствие с положениями Будапештского Договора, и все ограничения доступа к нему общественности будут сделаны до момента выдачи патента по настоящей заявке.

Штамм микроорганизмов был выделен из неидентифицированных морских многощетинковых червей, собранных в Бискайском заливе.

Хотя депозитированный микроорганизм несомненно является предпочтительным, настоящее изобретение не относится к или не ограничивается каким-либо конкретным штаммом или микроорганизмом. В объем настоящего изобретения включены другие продуцирующие соединение IB-00208 микроорганизмы, штаммы или мутанты.

Штамм Actinomadura sp. PO13-046, культивируемый в контролируемых условиях в подходящей среде, продуцирует антибиотик IB-00208. Указанный штамм предпочтительно растет в водной питательной среде в аэробных и мезофильных условиях.

Антибиотик IB-00208 может быть выделен из осадка мицелия экстракцией подходящей смесью растворителей, такой как CHCl₃:СН₃ОН:Н ₂O. Активность концентрируется в нижнем слое. Экстракты двух повторных экстракций могут быть объединены и упарены досуха в вакууме.

Выделение и очистка соединения IB-00208 из неочищенного активного экстракта может быть выполнена с применением подходящей комбинации традиционных хроматографических методик.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой ¹ Н-ЯМР-спектр очищенного соединения IB-00208;

Фигура 2 представляет собой ¹³С-ЯМР-спектр очищенного соединения IB-00208;

Фигура 3 представляет собой DEPT эксперимент очищенного соединения IB-00208;

Фигуры 4, 5, и 6 представляют собой COSY 45, HMQC и НМВС спектры очищенного соединения IB-00208, соответственно;

Фигура 7 представляет собой ИК-спектр очищенного соединения IB-00208;

Фигура 8 представляет собой ВЭЖХ/МС-хроматограмму и ESI-MS-спектр соединения IB-00208; и

Фигура 9 представляет собой ВЭЖХ/УФ-хроматограмму и УФ-спектр очищенного соединения IB-00208.

Разделение на фракции может проводиться по принципу противоопухолевой активности фракций, или методом ТСХ с проявлением ванилином в концентрированной H₂SO₄, или методом аналитической ВЭЖХ с фотодиодом и МС-детектором. ВЭЖХ-анализ проводят при комнатной температуре с применением аналитической колонки Symmetry C18 (5 мкм), используя в качестве подвижной фазы смесь метанол: Н₂О: уксусная кислота (99:1:1) со скоростью потока 0,3 мл/мин и регистрируя значения при 325 нм, причем в данных условиях время удерживания для соединения IB-00208 составляет 4,5 минуты, как показано на фиг.9.

На основании детального анализа его различных спектральных характеристик чистое соединение было идентифицировано как соединение IB-00208 (смотри данные, представленные на фигурах 1-9). Поэтому установленная структура соответствует представленной выше.

Данные соединения IB-00208 суммированы в Таблице 1.

Таблица 1

Максимумы поглощения УФ-спектра: 225, 255 нм и 325 нм, как представлено на фиг.9.

¹H-, ¹³С- и DEPT ЯМР-спектры представлены на фиг.1, фиг.2 и фиг.3, соответственно.

Результаты 2D ЯМР-экспериментов COSY, HMQC и НМВС представлены на фиг.4, фиг.5 и фиг.6, соответственно.

Инфракрасный спектр поглощения представлен на фиг.7.

ES-MC-спектр обнаруживает (М+Н) ^- пик при 691 и (M+Na) пик при 713, как показано на фиг.8.

Различные производные соединения IB-00208 могут также быть получены с применением известных в данной области техники методик. В качестве примера, данные изменения могут быть внесены с применением химических и биологических методов.

Данные изменения включают:

- получение агликоновой части;

- добавление к агликону различных известных и новых сахаров;

- модификацию агликона.

Могут быть получены соединения с различными ацильными, алкильными, алкенильными, арильными, бензильными группами и/или группами сахаров в R¹. Таким образом, например, ацилгалогениды и алкильные, алкенильные, арильные или бензильные ангидриды могут быть использованы в качестве электрофилов для реакций ацилирования IB-00208 в соответствующих основных или кислотных условиях в соответствующих растворителях. Альтернативно, для реакций алкилирования IB-00208 в подходящих условиях могут применяться алкил-, алкенил-, арил- или бензилгалогениды, мезилаты или тозилаты. Дополнительно, различные производные сахаров, известные и новые, могут использоваться в качестве реагентов для реакций гликозидирования в стандартных условиях для данного типа реакции.

С другой стороны, соединения, содержащие гидрохиноновое кольцо, могут быть получены из соединения IB-00208 восстановлением хинона подходящим восстанавливающим агентом [например: NaBH₄ (Т.Ross Kelly et al., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 4522-4524), Na₂S₂ 0₄ (A.V.Rama Rao et al., Tetrahedron Lett., 1991, 32, 5199-5202)] в подходящем растворителе, с последующим (когда R1 Н) проведением взаимодействия гидрохинона с ацилирующим или алкилирующим или подходящим агентом в подходящем растворителе. Как описано выше, различные ацильные, алкильные, алкенильные, арильные, бензильные и/или группы сахаров могут быть введены также в R¹. Также различные алкильные группы могут быть введены в R² и R³. Кроме того, R ² и R³ могут быть связаны посредством ненасыщенной связи, например, посредством реакции метатеза с внутримолекулярным замыканием цикла между двумя концевыми двойными связями.

Настоящее изобретение со ссылкой на предпочтительные воплощения ниже дополнительно проиллюстрировано примерами, которые имеют целью помочь в понимании настоящего изобретения и только проиллюстрировать его, и не должны истолковываться как ограничивающие его.

ПРИМЕРЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все указанные здесь проценты, если не определено иначе, представлены по весу. Все указанные температуры выражены в градусах Цельсия. Все инкубации проводили при 28°, если не оговорено иначе, и колбы встряхивали на круговом шейкере со скоростью 250 об/мин. Все среды и реципиенты являлись стерильными, а все операции с культурами асептическими.

Примеры 1-3 относятся к получению соединения IB-00208 указанной выше формулы. Примеры 4-9 относятся к получению соединений 1-6 по изобретению. Пример 10 касается определения биологической активности соединения IB-00208.

ПРИМЕР 1

Продуцирующий микроорганизм.

Применяемые здесь таксономические методы представляют собой методы, обычно применяемые в классической таксономии Actinomycete, и описаны в литературе.

Все культуры были изучены после инкубации, и все записи результатов делались еженедельно вплоть до 21 суток. В случае необходимости добавлялся NaCl.

Описание микроорганизма представляет собой следующее.

Через 21 сутки наблюдался хороший рост в колониях ISP 2, ISP 6, Bennet и 172 АТСС с ASW. Колонии имели светло-коричневый цвет. В колониях ISP 3, ISP 5, Czapek и ISP 7 с ASW наблюдался худший рост и растворимый пигмент обнаружен не был. Воздушный мицелий не образовывался. Субстратный мицелий был разветвленным. На субстратном мицелии могли образовываться изолированные споры. Споры были удлиненными и редкими. Никаких других образований не наблюдалось.

В колонии ISP-1, как и в других твердых средах, образовывались способные к диффузии коричневые пигменты. Устойчивость к NaCl превышала 5%. Оптимальный для роста диапазон температур составлял от 25° до 35°С. Микроорганизм мог расти на глюкозе, галактозе, рамнозе и ксилозе в качестве единственного источника углерода, однако, рост на фруктозе, рафинозе, м-инозитоле, сахарозе и -мелибиозе не наблюдался, а на манните и мелезитозе был колеблющимся.

Исследования химического состава микроорганизма показали, что в гидролизате цельных клеток штамма РO13-046 содержится мезо-2,6-диаминопимелиновая кислота.

Сравнение метиловых эфиров жирных кислот штамма РO13-046 с другими подобными штаммами описаны в Таблице 2.

Основываясь на предшествующих характеристиках, культура была определена как вид рода Actinomadura, с 94% идентичностью штамму A. vinacea.

ПРИМЕР 2

Ферментация IB-00208:

Этапами, необходимыми для продуцирования соединения IB-00208 предпочтительным микроорганизмом, являются:

Исходная культура: Полный бульон штамма Р013-046 чистой культуры Actinomadura sp.хранился замороженным в 20% глицерине.

Посевная культура: Замороженную культуру или хорошо растущую культуру на скошенном агаре применяли для засева 100 мл описанной ранее посевной среды в 250 мл встряхиваемой колбе. Колбу инкубировали в течение 48 часов и использовали в качестве посевной культуры первого этапа. 500 мл той же самой среды в двухлитровой колбе Эрленмейера засевали 10% указанной посевной культуры первого этапа. Колбу инкубировали в течение 48 часов.

Ферментация: В 75-литровой емкости для брожения 50 литров уже описанной продукционной среды засевали 2,5 литрами посевной культуры второго этапа. Ферментацию проводили в течение 96 часов при перемешивании со скоростью 400 об/мин при токе воздуха 0,5 об./об.мин.

Таблица 3
Посевная среда
Глюкоза	5 г
Крахмал	20 г
Мясной экстракт	3 г
Дрожжевой экстракт	5 г
Триптон	5 г
СаСО3	4 г
NaCl	5 г
KCl	0,5 г
MgCl2	2 г
Доведение водой	до 1 литра
Продукционная среда
Глюкоза	5 г
Крахмал	20 г
Соевая мука	15 г
Дрожжевой экстракт	5 г
Триптон	2 г
СаСО3	4 г
NaCl	5 г
KCl	0,5 г
MgCl2	2 г
Доведение водой	до 1 литра

Выход соединения IB-00208 оценивали путем определения активности в отношении лейкоза мышей Р-388 в полном бульоне или методом ВЭЖХ.

ПРИМЕР 3

Выделение соединения IB-00208.

4,5 литра полного культивируемого бульона фильтровали для отделения биомассы и других твердых веществ. Осадок мицелия дважды экстрагировали 1,5 л смеси растворителей CHCl₃:СН₃ОН:Н₂O (2:1:1), причем активность концентрировалась в нижнем слое. Органический растворитель концентрировали и упаривали досуха в вакууме с получением 1,2 г неочищенного экстракта.

Экстракт разделяли хроматографически на силикагеле, элюируя смесями н-гексана/этилацетата и этилацетата/метанола. 110 мг фракции, содержащей обладающее противоопухолевой активностью соединение IB-00208, элюировали этилацетатом/метанолом (1:1).

Дальнейшую очистку содержащей соединение IB-00208 фракции проводили методом колоночной хроматографии на силикагеле и элюировали хлороформом/метанолом (95:5) 18 мг чистого соединения IB-00208.

Пример 4

Получение Соединения 1:

Раствор IB-00208 (150 мг, 0,22 ммоль) в толуоле (15 мл) обрабатывают Ag₂O (183 мг, 0,79 ммоль) и аллилбромидом (0,76 мл) при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную смесь перемешивают в течение 5 часов при 70°С. После охлаждения до комнатной температуры смесь фильтруют через целит® и промывают дихлорметаном. Растворитель выпаривают при пониженном давлении и остаток очищают флэш-хроматографией (CHCl₃ :МеОН 10:0,4) с получением соответствующего чистого продукта (выход 34%).

Пример 5.

Получение Соединения 2:

Раствор Соединения 1 (10 мг, 0,014 ммоль) в смеси метанол/дихлорметан 9:1 (3 мл) обрабатывают водным раствором 10 М Н₂SO₄ (0,5 мл). После охлаждения до комнатной температуры смесь разбавляют СН₂Cl₂ и добавляют насыщенный водный раствор NaCl. Водную фазу экстрагируют дихлорметаном и сушат над безводным сульфатом натрия. После выпаривания растворителя при пониженном давлении и флэш-хроматографии (CHCl ₃:МеОН 10:0,4) получают чистое Соединение 2 (выход 30%).

Пример 6.

Получение Соединения 3:

Раствор IB-00208 (50 мг, 0,072 ммоль) в дихлорметане (0,7 мл) обрабатывают палладием на угле (10 мг Pd/C) и перемешивают при комнатной температуре в атмосфере водорода в течение 4 часов. Смесь отфильтровывают и растворитель выпаривают при пониженном давлении. Соответствующий восстановленный продукт с гидрохиноновым фрагментом получают с количественным выходом (100%).

Пример 7.

Получение Соединения 4:

К раствору Соединения 3 (169 мг, 0,24 ммоль) в дихлорметане в атмосфере аргона при 0°С добавляют 0,02 мл пиридина (0,24 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 1 часа и добавляют 0,2 экв пиридина и 0,2 экв уксусного ангидрида до общего количества, равного 1 экв. Протекание реакции сопровождают ТСХ и далее реакционную смесь выливают в лед. рН регулируют до 1-2 с помощью 1М HCl и реакционную смесь экстрагируют дихлорметаном. Органическую фазу промывают насыщенным водным раствором NaCl и сушат над безводным сульфатом натрия. После выпаривания растворителя при пониженном давлении и флэш-хроматографии получают чистое моноацетилированное соединение Соединение 4 (выход 87%).

Пример 8

Получение Соединения 5:

К раствору Соединения 3 (92 мг, 0,133 ммоль) в пиридине в атмосфере аргона при комнатной температуре добавляют 0,4 мл Et₃N (2,9 мл) и 0,64 мл уксусного ангидрида (6,78 ммоль).

Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 минуты и далее добавляют дробленый лед. Смесь выливают в раствор 1 М HCl при 0°С и экстрагируют дихлорметаном. Органическую фазу промывают насыщенным водным раствором NaCl и сушат над безводным сульфатом натрия. После выпаривания растворителя при пониженном давлении и флэш-хроматографии получают чистое триацетилированное Соединение 5 (выход 74%).

Пример 9.

Получение Соединения 6:

Используют такую же методику, что и описанная выше для Соединения 5. В данном случае реакционную смесь перемешивают в течение 5 минут перед обработкой для получения диацетилированного продукта Соединения 6 в качестве основного соединения.

ПРИМЕР 10

Получение соединения 15 и соединения 16

Раствор IB-00208 (18 мг, 0,027 ммол) в ТГФ (1 мл) NaH 60% (1,16 мг, 0,029 ммол) при 0°С в атмосфере аргона. Реакционную смесь перемешивают в течение 5 минут при этой температуре. Раствор становится зеленым, и образуется твердое вещество (натриевая соль, соединение 15).

Затем при 0°С добавляют бензилбромид (3,5 мкл, 0,029 ммол) и йодид тетрабутиламмония (1,1 мг, 0,003 ммол). Охлаждающую баню удаляют и реакционную смесь перемешивают в течение 4 часов. Гашение реакции осуществляют добавлением 0,1 н HCl. Затем смесь экстрагируют дихлорметаном (дважды). Объединенные органические экстракты сушат над безв. Na₂SO₄ , фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении. Соединение 16 наблюдают в следовых количествах с помощью ¹H-ЯМР сырого продукта.

Получение соединения 16:

Раствор IB-00208 (18,5 мг, 0,012 ммол) в толуоле (15 мл) обрабатывают Ag₂O (12 мг, 0,05 ммол) и бензилбромидом (6 мкл, 0,05 ммол) при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при 70°С. После охлаждения до компнатной температуры, смесь фильтруют через целит® и промывают дихлорметаном. Растворитель выпаривают при пониженном давлении и остаток очищают флэш-хроматографией (СН₂Cl₂:МеОН 100:1) с получением чистого соединения 15 (5 мг, выход 52%) в виде оранжевого твердого вещества.

ПРИМЕР 11

Биологическая активность.

Противоопухолевую активность соединения IB-00208 определяли in vitro в культурах клеток лейкоза мышей Р-388, карциномы легких человека А-549, карциномы толстой кишки человека НТ-29 и меланомы человека MEL-28. Процедуру выполняли по методике, описанной в Bergeron et al. Было показано, что значение IC50 для всех 4 клеточных линий клеток составляло 0,001, 0,001, 0,001 и 0,001 мкг/мл, соответственно. Аналогичные результаты были получены по той же методике для соединений 1-6.

ССЫЛКИ

В описание настоящего изобретения включены следующие ссылки:

АТСС Catalog 1996;

Bergeron et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 121: 848, 1984;

Guerrant and Moss, Anal. Chem., 56: 633, 1984;

Hasegawa et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 29: 319, 1983;

Shirling and Gotlieb, Int. J. Syst. Bacterial., 16: 313, 1966;

Van der Auwera et al., J. Microbiol. Methods, 4: 265, 1986;

Waksman, The Actinomycetes, vol.II: 331, 1961.

Настоящее изобретение было описано подробно, включая его предпочтительные воплощения. Однако понятно, что специалист в данной области на основании описания настоящего изобретения может вносить изменения и/или усовершенствования, не выходящие за рамки настоящего изобретения.