способ диагностики туберкулеза

Формула изобретения

Способ диагностики туберкулеза, включающий исследование биологической жидкости путем проведения иммуноферментного анализа, определения концентрации специфических антител, специфических к микобактериальным антигенам, выраженной в единицах оптической плотности (ОП), отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости исследуют слюну, которую в объеме 3-4 мл консервируют добавлением азида натрия в концентрации 0,002%, а в качестве антигена используют микобактериальный антиген, специфически связывающийся с секреторным иммуноглобулином А человека, в качестве конъюгата используют специфические моноклональные антитела, направленные против секреторного иммуноглобулина А человека, и при значении ОП равной или превышающей ОПкрит (0,946+0,2) диагностируют наличие туберкулезной инфекции.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно фтизиатрии, и может быть использовано при первичной диагностике туберкулеза путем определения специфических противотуберкулезных антител для корректировки тактики лечения больных туберкулезом, а также для изучения патогенетических механизмов развития данного заболевания.

Туберкулез остается тяжелейшим, смертельно опасным хроническим заболеванием. Ежегодно в мире умирает от туберкулеза 3 млн человек, а в развивающихся странах один из каждых пяти случаев смерти связан с туберкулезом [Barry R. Bloom, Tuberculosis. Pathogenesis, protection, and control. 2002, ASM Press, Washington DC]. Примерно треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями туберкулеза и подвержена опасности развития этого заболевания. В Российской Федерации заболеваемость туберкулезом увеличивается с каждым годом и в 2002 году достигла 95,2 случаев на 100 тыс. населения [Научные труды к 75-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы. Под редакцией академика РАМН В.И. Литвинова. Москва. 2002]. Своевременное выявление лиц, инфицированных М. tuberculosis, имеет важнейшее значение, поскольку у 10% из них на протяжении жизни развиваются активные контагиозные формы туберкулеза, при этом явные клинические признаки проявляются поздно [Stead, W.W. 1992. Genetics and resistance to tuberculosis. Ann. Int. Med. 116:937-94].

Известен способ диагностики туберкулеза на основе кожной реакции гиперчувствительности замедленного типа - так называемый туберкулиновый тест или реакция Манту [Palmer, C.E., and L.В. Ddwarsd, 1967. Tuberculin test in restospect. Arch. Environ. Health 15:792-808]. В организм пациента подкожно вводят антиген путем укола или царапины. В качестве антигена используют комплексные антигены (обычно туберкулин или PPD - protein purified derivate) [Koch, R. 1891]. Ответная кожная реакция развивается в течение 24-48 часов и может сохраняться несколько дней. Ее считают положительной при появлении гиперемии, инфильтрации или волдыря. Пациента направляют на дальнейшее обследование на наличие туберкулезного процесса.

Однако чувствительность и специфичность туберкулиновых проб весьма ограничена, так как среди больных туберкулезом положительная проба наблюдают только в 50% случаев, и из-за невозможности отличить больных с активными формами туберкулеза от ранее инфицированных, вакцинированных или инфицированных микобактериями других видов.

Недостатком данного способа является его неинформативность у значительного числа ВИЧ-инфицированных, когда важно выявить не только наличие заболевания, вызванного микобактериями, но и определить тип микобактерий, а также получить информацию для проведения эффективной тактики лечения. Также затруднена диагностика и при тяжелых течениях туберкулеза, когда система иммунологической защиты организма под действием микобактерий находится в угнетенном состоянии и не может эффективно функционировать. [Huebner, R.Е., М.F. Schein, and J.В. Bass, Jr. 1993 b. The tuberculin skin test. Clin. Infect. Dis. 17:968-975].

Тем не менее, несмотря на все описанные ограничения кожная туберкулиновая проба остается основным официально утвержденным тестом и по его результатам определяют группы риска на возникновение инфекции.

Известен способ диагностики туберкулеза по обнаружению возбудителя туберкулеза в биологическом материале, взятом от пациента. [Kent, В.D., and G.P. Kubica. 1985 Public health mycobacteriology a guide for the level III laboratory, 207 p. U.S. Department of Health and Human Services. Centers for Disease Control, Atlanta]. Стандартные процедуры начинаются с микроскопических исследований мазков мокроты и плеврального экссудата больных с предварительным окрашиванием (AFB-метод) на наличие кислотоустойчивых микобактерий с последующим посевом материала и биохимическим тестированием выращенных на селективных средах микроорганизмов с целью идентификации вида обнаруженных микобактерий. По наличию возбудителя туберкулеза ставят диагноз наличия туберкулезного процесса.

Недостатком этого способа является то, что все эти процедуры требуют значительного времени - от 4 до 6 недель с момента сбора материала, из-за медленного роста микобактерий. Кроме того, цитологическая идентификация недостаточно чувствительна, чревата ошибками и зависит от квалификации персонал. Использование теста в лабораториях развивающихся стран выявляется только 20-40% больных туберкулезом, в развитых странах ˜ 40-60%.

Известны и более современные методы диагностики туберкулеза, основанные на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР, или PCR). Принцип метода состоит в увеличении в 10 ⁶-10⁸ раз копий специфического участка ДНК микроорганизма, активизируемого ДНК-полимеразой в автоматическом режиме. Это высокоспецифичный и чрезвычайно чувствительный тест, с помощью которого принципиально возможно идентифицировать в анализируемой пробе наличие даже одной единственной молекулы ДНК возбудителя (чувствительность составляет порядка 10^-15 М) [Reischl U., Naumann L./ [Molecular biology methods in detection of mycobacteria. Improved and newly developed test systems for the diagnosis of mycobacteria] / Fortschr.Med. - 1996. - Vol.114. - P.237-241]. Ha метод ПЦР возлагают большие надежды, он постоянно совершенствуется и в настоящее время применяется в диагностике туберкулеза.

Недостатком данного способа является его высокая стоимость, сложность исполнения, дорогое инструментальное и приборное обеспечение. Результат зависит от уровня квалификации персонала и соблюдения особых требований к лабораторным помещениям, в которых проводится анализ. Минимальное загрязнение анализируемых образцов, инструментария и воздуха в помещении нуклеиновой кислотой микобактерий может дать ложноположительный результат. Кроме того, из-за сверхвысокой чувствительности этот тест часто определяет неактивную форму туберкулеза. В силу указанных причин применение данного метода в лабораторной диагностике пока довольно ограничено.

В качестве ближайшего аналога принят способ диагностики туберкулеза путем определения специфических противотуберкулезных антител методом иммуноферментного анализа (ELISA) [Engvall E., Perlmann Р. (1971). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Quntitive assay of immunoglobulin G. Immunochem., 8, 871-874]. Способ заключается в следующем. Производят забор крови у пациентов, приготовленные из нее образцы сыворотки крови исследуются. Проводят иммуноферментную реакцию, для чего вносят микобактериальный антиген в лунки планшета, отмывают их буфером, вносят в каждую лунку раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА). Образцы сыворотки разводят в растворе БСА и вносят их в лунки планшета. Кроме исследуемых проб в три лунки вносят контрольные образцы. Планшет инкубируют, отмывают. Затем в лунки вносят раствор специфических противотуберкулезных антител, меченных пероксидазой хрена в растворе БСА, инкубируют и отмывают. После этого проводят цветную реакцию путем внесения в лунки планшета субстрата цветной реакции. На спектрофотометре определяют степень окрашивания по спектру поглощения, по которому определяют концентрацию специфических противотуберкулезных антител, выраженных в единицах оптической плотности. Вычисляют критическое значение оптической плотности, сравнивают с ней величину оптической плотности исследуемых проб. При значении этой величины, равной или превышающей критическое значение оптической плотности, реакцию считают положительной и предварительно диагностируют наличие туберкулеза, а при меньшем значении - отрицательной.

Известный способ обладает высокой чувствительностью (определяет до 0,05 нг/мл вещества) и экспрессивностью, что способствовало широкому внедрению ИФА в лабораторную практику для диагностики многих инфекционных заболеваний.

Однако чувствительность метода не всегда удовлетворяет практических врачей. Это обусловлено тем, что антитела к микобактериям в том или ином количестве присутствуют в крови не только больных, но и здоровых «контактных» людей. В сыворотке крови больных антитела могут иногда достигать очень больших величин, что не всегда связано с давностью инфицирования или тяжестью заболевания. В большей степени это определяется особенностями течения болезни и состоянием иммунной системы пациента. Содержание антител у людей с неактивным туберкулезом обычно все-таки существенно ниже, чем у больных, и это дает возможность при соблюдении определенных правил вывести некий дискриминационный уровень, при преодолении которого можно говорить о высокой вероятности наличия активного туберкулеза.

Кроме того, способ является инвазивным, для его проведения необходим забор крови подготовленным для этого медицинским персоналом в специально оборудованным для этих целей помещении. В связи с этим данный способ не может быть использован для проведения широкомасштабных исследований, а также в полевых условиях.

Задачей изобретения является создание высокоэффективного, более быстрого, простого, точного и неинвазивного способа диагностики туберкулеза.

Сущность изобретения состоит в том, что предложен способ диагностики туберкулеза, включающий исследование биологической жидкости путем проведения иммуноферментного анализа, для чего вносят микобактериальный антиген в лунки планшета, отмывают их буфером, вносят в каждую лунку раствор бычьего сывороточного альбумина, разводят исследуемые образцы в растворе сывороточного альбумина, вносят их и контрольные образцы в лунки планшета, инкубируют, отмывают, затем в лунки вносят раствор специфических противотуберкулезных антител, меченных пероксидазой хрена в растворе сывороточного бычьего альбумина, инкубируют и отмывают, после чего проводят цветную реакцию и на спектрофотометре определяют концентрацию специфических противотуберкулезных антител, выраженных в единицах оптической плотности, вычисляют критическое значение оптической плотности, и при значении величины оптической плотности исследуемых проб, равном или превышающем критическое значение оптической плотности, реакцию считают положительной и диагностируют наличие туберкулезной инфекции, а при меньшем значении - отрицательной, в качестве биологической жидкости исследуют слюну, которую в объеме 3-4 мл консервируют путем добавления 30 мкл раствора азида натрия в концентрации 0,002%, при этом для проведения иммуноферментного анализа используют микобактериальный антиген, связывающийся с секреторным IgA с высокой степенью специфичности, и специфические моноклональные антитела, направленные против секреторного IgA человека.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Впервые разработан способ определения противотуберкулезных секреторных антител против IgA в слюне пациентов методом иммуноферментного анализа для диагностики туберкулеза.

Способ обладает рядом преимуществ по сравнению с известными, наиболее важным из которых является его неинвазивность, что особенно важно у детей младшего возраста при массовых исследованиях в детских учреждениях и в полевых условиях. При проведении широких исследований у взрослых также гораздо проще, быстрее и экономичней собирать диагностические образцы слюны, а не крови. При этом не требуется наличие специального медицинского персонала, инструментария для забора крови и специально оборудованных помещений.

Способ прост в исполнении. Весь процесс диагностики, включая забор биологического материала, занимает не более 3-х часов.

Способ обладает высокой информативностью, специфичностью и чувствительностью по отношению к туберкулезу. Он может использоваться в любой клинико-диагностической лаборатории, где применяется метод иммуноферментного анализа.

Способ может быть рекомендован для широкомасштабных диагностических исследований в любых условиях, для любого контингента населения. Это позволит проводить раннюю диагностику туберкулеза в короткие сроки, назначить своевременное и адекватное лечение, сократить его сроки и материальные затраты и приостановить, таким образом, рост заболевания, обусловленного передачей инфекции от больных с открытым процессом здоровым лицам.

Технический результат достигается за счет того, что авторами впервые предложено проводить исследование слюны человека для диагностики туберкулеза. Разработан информативный бескровный способ, который основан на выявлении противотуберкулезных секреторных IgA у больных туберкулезом.

Впервые показано, что по уровню противотуберкулезных секреторных IgA в слюне в сравнении с неизмененными показателями у здоровых доноров можно оценивать наличие инфекционного процесса при этом заболевании.

За основу метода авторами принят тот факт, что в слюне человека содержится IgA, а в слюне больных туберкулезом присутствуют противотуберкулезные IgA-антитела, реагирующие со специфическим антигеном микобактерий туберкулеза. Основной задачей авторов явилось получение микобактериального антигена, связывающегося с секреторным IgA с высокой степенью специфичности. Для этих целей был использован стандартный хроматографический метод, с помощью которого путем разделения и очистки получен высокоочищенный микобактериальный антиген, состоящий из фрагментов клеточной стенки бактерий, лишенных липидных компонентов. Для этого получали различные фракции микобактерий, исследовали их, определяли специфичность бактериальных антигенов по отношению к секреторному IgA и отбирали, таким образом, наиболее эффективные для дальнейшей работы. Другой составляющей научного поиска явилось получение высокоспецифичных моноклональных антител МАТ-4Е7, направленных против IgA слюны человека, которые были получены с использованием стандартного периодатного метода.

Существенным признаком способа является также консервирование слюны, т.к. оно позволяет сохранить ее нативные свойства для получения достоверных результатов. В других условиях в слюне при наличии в ней микобактерий последние могут быстро размножаться, и в этом случае результат диагностики не будет отражать первичного состояния исследуемых проб.

Способ осуществляется следующим образом.

У пациента производят забор слюны, за 20 минут до которого он прополаскивает ротовую полость минеральной щелочной бикарбонатной водой типа «Нарзан» или «Боржоми». Слюна отбирается в пластиковый контейнер в объеме 3-4 мл и консервируется добавлением 30 мкл раствора азида натрия в концентрации 0,002%. Пробы хранят в холодильнике при 4-6°С. При необходимости длительного хранения, более суток, пробы замораживают при -20°C. Полученные образцы слюны исследуют методом иммуноферментного анализа.

Для проведения иммуноферментной реакции используют 96-луночные полистироловые планшеты с высокой связывающей способностью, тип 1 (Costar, США, кат. №9018). В каждую лунку планшета вносят по 50 мкл натрий-фосфатного буфера(PBS, рН 7,2) содержащий специфический микобактериальный антиген в концентрации 1 мкг/мл, и оставляют на ночь в холодильнике при -4-6°C. Микобактериальный антиген получают стандартными хроматографическими методами (Авдиенко В.Г., Космиади Г.А., Баенский А.В. и др. Иммунодоминантные антигены. Ж. Проблемы туберкулеза, 2002, №2, с.30-33).

Затем лунки планшета промывают 4 раза, внося в каждую лунку по 200 мкл натрий-фосфатного буфера (рН 7,2), содержащего 0,1% Твин-20 (детергент), после чего остатки промывочного буфера полностью удаляют из лунок планшета, постукивая планшетом по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаги, помещенной в лоток. Затем в каждую лунку вносят по 100 мкл 1% раствора БСА в среде натрий-фосфатного буфера

Образцы слюны разводят в 1% растворе БСА (в соотношении 1:1) и по 50 мкл вносят в лунки планшета. Кроме исследуемых проб в три лунки планшета вносят по 50 мкл контрольных образцов, которые представляют из себя пул (смесь), собранных от 200 здоровых людей. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение часа при 37°C. Затем планшет трижды отмывают натрий-фосфатным буфером (рН 7,2).

В каждую лунку вносят по 50 мкл раствора специфических моноклональных антител, направленных против секреторного IgA человека, меченных пероксидазой хрена, в 1% растворе БСА в концентрации 1 мкг/мл. Эти моноклинальные антитела против IgA человека получают стандартньм периодатным способом (Авдиенко В.Г., Кондрашев С.Ю., Куликовская Н.В. и др. Ж. Клин. лаб.диаг.2000, №6, с.22-35).

Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение часа при 37°С. Затем планшет 5-кратно отмывают натрий-фосфатным буфером (рН 7,2)

После этого проводят цветную реакцию, для чего в каждую лунку вносят по 50 мкл субстрата цветной реакции, содержащего 0,04% о-phenylenediamin (Sigma, США) и 0,012% перекиси водорода в цитратно-фосфатном буфере, содержащем 0,05 М лимоннокислого натрия-НООСС(ОН)(СН₂ COONa)₂ и 0,1 М фосфорнокислого калия К₂НРО (рН 5,0). Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют 30 мин при 37°С. После инкубации реакцию путем внесения в каждую лунку планшета по 10 мкл 1 М серной кислоты.

Учет результатов анализа проводят в течение 10-15 минут после остановки реакции. Результаты реакции регистрируют с помощью автоматического спектрофотометра ELx800 (Bioline, США) или приборов аналогичного типа. Определяют степень окрашивания, регистрируя спектр поглощения, получают значения оптической плотности, по которым определяют концентрацию специфических противотуберкулезных антител. В зависимости от концентрации специфических противотуберкулезных антител происходит окрашивание исследуемых и контрольных проб, которое регистрируется прибором и выражается в единицах оптической плотности (ОП) при длине волны 492 нм.

Для оценки результатов реакции вычисляют критическое значение оптической плотности (ОПкрит) по формуле:

ОПкрит=ОП(К)+0,2,

Где ОП(К) - среднее арифметическое из значений ОП, полученных при постановке контрольных проб в 3-х лунках.

Сравнивают значение оптической плотности исследуемых проб с критическим значением оптической плотности. При значении этой величины, равном или превышающем критическое значение оптической плотности, реакцию считают положительной и предварительно диагностируют наличие туберкулезного процесса, а при меньшем значении - отрицательной.

Способ испытан на базе ООО «ДТС-БИО» и ГУ ЦНИИ туберкулеза РАМН на 56 больных туберкулезом легких (23 женщины и 33 мужчины) в возрасте 12-65 лет и 56 здоровых доноров плазмы в возрасте 25-53 лет (табл.1 и 2). У всех больных туберкулезом был рентгенологически и микробиологически подтвержденный диагноз с длительностью процесса не менее 3 месяцев.

Пример 1. Больная X, диагноз - инфильтративный туберкулез S1-S2, страдает заболеванием приблизительно полгода. Под контролем врача провела полоскание ротовой полости минеральной водой «Нарзан», а спустя 20 минут от нее был произведен забор слюны в объеме 3,5 мл в специальный контейнер. Произведено консервирование образцов путем добавления 35 мкл азида натрия с концентрацией 0,002%. Образец был заморожен при -20°С и хранился в течение 2-х недель.

Для проведения анализа предварительно размороженный образец слюны больной Х разводили в растворе БСА в разведении 1:10. Далее полученное разведение вносили по 50 мкл в 96-луночный планшет в дубликатах, который заранее отмывали буфером. После часовой инкубации при 37°С, планшет трижды отмывали буфером и добавляли по 50 мкл «вторых» антител, меченных пероксидазой хрена, направленных против IgA человека. Планшет инкубировали в течение часа при 37°С. После пятикратной отмывки буфером в планшет вносили по 50 мкл субстрата и через 30 минут реакцию останавливали добавлением 10 мкл 1 М серной кислоты. Уровень реакции измеряли при длине волны 492 нм на автоматическом спектрофотометре с вертикальным лучом/ридере ELx800 (Bioline, США). Для исследуемого образца искомое значение составило 2,036±0,018 ед. опт. плотности. Путем сравнения полученного значения оптической плотности исследуемой пробы с ОП крит (0,946+0,2) определили, что данный образец слюны принадлежит больной туберкулезом и требуется вмешательство фтизиатра.

Пример 2. Больная П, 17 лет, в течение 2 месяцев имеет субфебрильную температуру, Манту 12 мм, кашель, затруднение при вдохе. Сбор слюны проводили по вышеуказанной методике. Образец был сразу исследован в ИФА по приведенной выше методике. Для исследуемого образца искомое значение составило 1,547±0,005 ед. опт. плотности. Сравнивая полученное значение с контрольным образцом, средняя оптическая плотность которого составляла 1,020, мы определили, что данный образец слюны содержит количество секреторных противотуберкулезных IgA антител. Больная была исследована фтизиатром, и после дополнительных методов исследования, включающих рентгеновское исследование, микроскопическое исследование мазков мокроты, ПЦР была госпитализирована с диагнозом инфильтративный туберкулез.

Пример 3. Образец слюны был получен от больного С., страдающего в течение месяца от кашля и фебрильной температуры. При проведении исследований на наличие противотуберкулезных секреторных IgA, был получен результат 0,359±0,013 ед. опт. плотности. Сравнивая полученное значение с контрольным образцом, средняя оптическая плотность которого составляла 0,947, мы определили, что данный образец слюны содержит количество секреторных противотуберкулезных IgA антител значительно ниже контрольного образца. Дополнительные исследования: проба Манту, микроскопия и ПЦР, также не выявили наличие возбудителя туберкулеза у больного С. Рентгеноскопия обнаружила наличие затемнений в средней доле легкого. Больному был поставлен диагноз пневмония. После усиленного курса антибиотикотерапии у больного С. исчезли все симптомы недомогания.

Таблица 2. Уровень противотуберкулезных секреторных IgA-антител слюны в группе здоровых доноров.
№№	ОП обр./ОП Контр, обр.	Результат
1	0,07	Отрицательный
2	0,80	Отрицательный
3	0,63	Отрицательный
4	0,20	Отрицательный
5	0,92	Отрицательный
6	0,37	Отрицательный
7	0,24	Отрицательный
8	0,15	Отрицательный
9	0,37	Отрицательный
10	0,85	Отрицательный
11	0,49	Отрицательный
12	0,63	Отрицательный
13	0,20	Отрицательный
14	0,03	Отрицательный
15	0,44	Отрицательный
16	0,29	Отрицательный
17	0,10	Отрицательный
18	0,60	Отрицательный
19	0,23	Отрицательный
20	0,21	Отрицательный
21	0,16	Отрицательный
22	0,03	Отрицательный
23	0,08	Отрицательный
24	0,27	Отрицательный
25	0,29	Отрицательный
26	0,07	Отрицательный
27	0,23	Отрицательный
28	0,09	Отрицательный
29	0,02	Отрицательный
30	0,12	Отрицательный
31	0,37	Отрицательный
32	0,01	Отрицательный
33	0,22	Отрицательный
34	0,39	Отрицательный
35	0,16	Отрицательный
36	0,24	Отрицательный
37	0,47	Отрицательный
38	0,07	Отрицательный
39	0,40	Отрицательный
40	0,14	Отрицательный
41	0,44	Отрицательный
42	0,51	Отрицательный
43	0,84	Отрицательный
44	0,19	Отрицательный
45	0,27	Отрицательный
46	0,30	Отрицательный
47	0,28	Отрицательный
48	0,91	Отрицательный
49	0,73	Отрицательный
50	0,64	Отрицательный
51	0,12	Отрицательный
52	0,56	Отрицательный
53	0,80	Отрицательный
54	0,54	Отрицательный
55	0,43	Отрицательный
56	0,20	Отрицательный