культуральная среда и способ идентификации грамотрицательных микроорганизмов

Формула изобретения

1. Культуральная среда для идентификации грамотрицательных микроорганизмов, содержащая следующие количества компонентов на 1 л дистиллированной или деионизированной воды:

смесь соединений, которые обеспечивают проявление различных цветов и размеров гало, состоящая из кремнезема, обезжиренного молока, крахмала и микробиологического активированного угля, содержащееся в среде, количество которой составляет от 8 до 20 г/л, и, в частности, количество каждого компонента составляет: кремнезем от 2 до 10 г/л, обезжиренное молоко от 2 до 20 г/л, крахмал до 4 г/л, микробиологический активированный уголь до 4 г/л;

а также смесь питательных веществ в количестве от 10 до 38 г/л, которая состоит из пептона от 2 до 15 г/л, триптона от 2 до 15 г/л, дрожжевого экстракта от 2 до 8 г/л;

вещества, обеспечивающие проявление различных цветов колоний;

вещества, обеспечивающие ингибирование грамположительных организмов, и

вещества, обеспечивающие твердую матрицу в дистиллированной или деионизированной воде для роста и развития колоний.

2. Культуральная среда по п.1, где вещество, обеспечивающее проявление различных цветов колоний, выбрано из группы, включающей пропиленгликоль, который применяют в количестве от 5 до 15 мл/л;

нейтральный красный, который применяют в количестве до 0,05 г/л; фенол красный, который применяют в количестве до 0,05 г/л; фуксин-глюкуронид, который применяют в количестве от 0,05 до 0,25 г/л; X-gal, который применяют в количестве от 0,03 до 0,1 г/л и MUG, который применяют в количестве до 0,07 г/л.

3. Культуральная среда по п.1, где вещества, обеспечивающие ингибирование грам-положительных организмов, находятся в количестве от 0,1 до 1 г/л, предпочтительно является дезоксихлорат натрия.

4. Культуральная среда по п.1, где вещества, обеспечивающие твердую матрицу для роста и развития колоний, находятся в смеси с соединениями, которые обеспечивают проявление различных цветов и размеров гало, в частности кремнезема, обезжиренного молока, крахмала и микробиологического активированного угля, в соотношении от 0,75:1 до 2:1.

5. Способ идентификации грамотрицательных микроорганизмов, включающий инокулирование и инкубацию образцов микроорганизмов в культуральной среде по п.1, при этом идентификацию интересующих микроорганизмов проводят по меньшей мере по 10 характерным цветам колоний правильной и неправильной формы и по меньшей мере по 5 различающимся характерным цветам и размерам гало.

6. Способ по п.5, где идентификацию различных организмов осуществляют следующим образом:

E.coli по фиолетово-голубому цвету интересующих колоний и голубому гало и оранжевому цвету среды и, в определенных случаях, по флуоресценции голубого цвета;

E.coli 0157:H7 по синевато-фиолетовому или зеленоватому цвету колоний и розовому цвету среды;

Shigella sonnei по красновато-фиолетовому цвету колоний, очень неровным краям и желтому гало;

Shigella flexneri по окраске от оранжевой до желтой полупрозрачных колоний, наличию мукоидных колоний и по окраске от оранжевой до желтой среды;

Pseudomonas aeruginosa по оранжево-розовому цвету колоний, полупрозрачному гало и зеленоватой флуоресценции в течение 24 ч и зеленоватому цвету через 24 ч;

Klebsiella pneumoniae по красновато-фиолетовому цвету колоний, наличию мукоидных колоний с розово-бежевым гало, в ряде случаев;

Serratia odorifera и Serratia marcencens по зеленовато-фиолетовому цвету колоний и полупрозрачному очень небольшому гало;

Proteus mirabilis, Proteus vulgaris и Providence spp. по бесцветным маленьким колониям и оранжевому цвету среды;

Salmonella enteritidis по красному цвету колоний с ровными краями;

Salmonella cholerasuiss по красному цвету колоний с неровными краями;

Salmonella typhimurium по красному цвету колоний и гало различных оттенков оранжевого цвета;

Salmonella schotmuelleri по оранжевому цвету полупрозрачных колоний и по окраске от оранжевого до желтого среды;

Salmonella typhi по оранжевому цвету колоний и желтому цвету среды;

Enterobacter aerogenes и E.cloacae по светло-фиолетовому или зеленовато-фиолетовому цвету колоний с более интенсивным фиолетовым окрашиванием в центре;

Citrobacter freundii по темно-фиолетовым мелким колониям с интенсивным фиолетовым окрашиванием в центре;

Aeromonas hydrophilia по появлению колоний светло-зеленого цвета и широкого полупрозрачного гало.

7. Способ по п.5, где идентификацию различных организмов при использовании фенолового красного проводят следующим образом:

E.coli по синему цвету колоний и розовому цвету среды, а в случае использования MUG по флуоресценции голубого цвета;

Shigella sonnei по синему цвету колоний с неровными краями и землянично-розовой окраске;

Pseudomonas aeruginosa по зеленовато-бежевому цвету колоний и розовому цвету среды;

Salmonella typhimurium по бежевому или бесцветному цвету колоний и клубнично-розовому цвету среды.

8. Способ идентификации грамотрицательных микроорганизмов по п.5, где культуральную среду по п.1 получают путем смешивания 30-50 г сухих ингредиентов среды с 1 л дистиллированной или деионизированной воды, перемешивания, кипячения до полного расплавления агара, охлаждения до 45-50°С, с последующими добавлением пропиленгликоля в количествах от 5 до 15 мл, перемешиванием и распределением по чашкам Петри при постоянном перемешивании, после чего проводят инокулирование и инкубирование образцов микроорганизмов при температуре от 30 до 45°С до 18 ч и, наконец, проводят их идентификацию и дифференциацию по цвету колоний или центра колоний, гало, по виду краев и, в некоторых случаях, по цвету среды.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области микробиологической диагностики и более конкретно к идентификации или дифференциации грамотрицательных бактерий.

Предпосылки изобретения

Диагностика грамотрицательных бактерий играет решающую роль для здоровья человека и животных и для сохранения окружающей среды, поскольку многие из указанных бактерий, такие как E.coli, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, вызывают серьезные заболевания человека.

В течение более 100 лет проводилась разработка различных культуральных сред для идентификации и подсчета указанных бактерий.

Начиная с 1990 года, в течение последующих десяти лет были разработаны новые культуральные среды с использованием хромогенных и/или флуорогенных субстратов для лучшей идентификации некоторых из указанных патогенов.

В 1994 году Фергюсон (Ferguson)/(патент США № 5358854 от 1994 г.) получил патент на изобретение, относящееся к культуральной среде и хромогенным реагентам для идентификации и дифференциации E.coli и коли-форм. Сущность изобретения состояла в использовании субстрата фермента бета-галактозидазы, который образует нерастворимый осадок первого цвета, и субстрата бета-глюкуронидазы, который вызывает появление второго окрашивания. Указанная среда позволяет проводить дифференциацию коли-форм лишь в целом, но не дает возможности проводить дифференциацию внутри них.

Алан Рамбах (Alain Rambach) получил в 1993 году патент (патент США № 5194374) на среду для целей выделения Salmonella, которая основана на способности указанного микроорганизма метаболизировать полиолы. Однако указанная среда не позволяет проводить идентификацию большого числа родов и видов коли-форм, имеющих важное диагностическое значение.

В том же году Денис (Denis) с сотрудниками (F. Denis et al., Evaluation d'un nouveau milieu avec substrats chromogenes pour recherche of salmonellas dans them coprocultures: him milieu SMID, Revue francaise de laboratories, decembre 1994, No.271, pp. 19-22) опубликовали результаты оценки хромогенной среды для выделения и предварительной идентификации Salmonella. Среда состоит из двух хромогенных субстратов, один из которых окрашивает колонии в синий цвет на основе -галактозидазной активности, а другой окрашивает колонии Salmonella в красный цвет на основе разложения глюкуроната, который входит в состав цветного индикатора.

С помощью указанной среды могут быть дифференцированы Salmonella typhi. Salmonella paratyphi В и Salmonella typhimurium, Proteus, Citrobacter, E. coli и Enterobacter. Среда содержит мощные ингибиторы микроорганизмов, такие как кристаллический фиолетовый и соли желчных кислот, и требуется использование Трис-буфера, который делает среду более сложной и более мощной по ее ингибирующей способности даже для некоторых представляющих интерес микроорганизмов. С другой стороны, используется Политон (Polytone). Он представляет собой сложную смесь белковых гидролизатов. Однако указанная среда не позволяет проводить идентификацию представляющих большой интерес микроорганизмов, таких как, в числе других, Psendomonas и Е. coli О157:Н7.

Рамбах (Rambach) в 1997 году запатентовал культуральную среду и способ обнаружения штаммов Enterohemorrhagic Е. coli (заявка на патент № WO 97/39103). Указанное изобретение состоит из селективной среды для дифференциации Е. coli, особенно серотипов О157 и/или О11, которая включает хромогенный субстрат фермента -галактозидазы. С целью повышения дифференцирующей способности указанного метода были использованы другие хромогенные субстраты -галактозидазы, которые гидролизуются множеством коли-формных бактерий, и хромогенные субстраты -глюкуронидазы, которые гидролизуются серогруппами Е. coli, отличными от О157 и О11. Указанная культуральная среда не облегчает дифференциацию других грамотрицательных бактерий, а Валлас (Wallace) и Джонс (Jones) сообщили, что некоторые штаммы Е. coli и Citrobacter могут давать ложно-положительные результаты (Wallace and Jones, J. Appl. Bacteriol, 1996, 81:663-668).

Годом позже, в 1998 году, Рамбах (Rambach) запатентовал новую культуральную среду для обнаружения Е. coli (патент США № 5846761), основанную на использовании хромогенного субстрата, полученного из индолилглюкуроновой кислоты и ее солей. Указанная специфичная среда не позволяет проводить идентификацию штаммов Е. coli О157:Н7, а также других коли-форм.

В 1995 году Монже (Monget) с соавторами (патент США № 4277561) запатентовали способ бактериологического анализа и среду для обнаружения Salmonella. Указанный метод основан на способности Salmonella ферментировать глюкуроновую кислоту или ее соли и не продуцировать фермент -галактозидазу. Среда также содержит питательные вещества, флуорогенное или хромогенное соединение для фермента -галактозидазы, глюкуроновую кислоту или одну из ее солей и индикатор рН.

Указанная среда также содержит ингибиторы родов и видов, отличных от Salmonella, такие как бриллиантовый зеленый и дезоксихолат натрия, которые могут ингибировать другие грамотрицательные микроорганизмы. Указанная культуральная среда требует внесения после стерилизации глюкуроната натрия в качестве добавки. Согласно данным Дениса (Denis) с сотрудниками, специфичность указанной среды составляет менее 94% (93,3%) (Denis et al., Revue francaise des laboratories, decembre 1994, No.271).

С другой стороны, Туомпо (Tuompo) с соавторами запатентовали способ и среду для культивирования и идентификации Salmonella на основе использования мелибиозы, маннита и сорбита и субстратов бета-глюкуронидазы (патент США № 5786167). Ее коричневое, синее или зеленое окрашивание позволяло идентифицировать другие коли-формы в зависимости от используемого хромогенного субстрата. С помощью указанного метода авторы, однако, не смогли соответствующим образом дифференцировать друг от друга релевантные коли-формные микроорганизмы.

Миллер (Miller) с соавторами в 1999 году запатентовали (патент США №5871944 от 1999 г.) среду для дифференциации Salmonella с использованием лактозы и целлобиозы с целью подавления появления черного осадка в среде, что позволяло проводить обнаружение наличия или отсутствия Salmonella. Указанная среда требует использования Трис-буфера, пептонов и мясного экстракта, X-gal и других ингредиентов.

Указанная среда подходит лишь для некоторых грамотрицательных бактерий, таких как Salmonella и Shigella, при этом возможна дифференциация указанных микроорганизмов, как таковых, но не между ними.

Батчнер (Butchner) в 1996 году запатентовал среду и способ выделения и предварительной идентификации нескольких бактерий, в частности тех, которые вызывают сепсис мочевых путей или инфекции мочевых путей (патент США №5541082). Указанный способ основан в принципе на различении их по морфологии колоний и по цвету.

Указанная среда содержит протеиноподобный непрозрачный материал, два или более хромогенных субстрата арилсульфатаз, галактозидаз, глюкуронидаз, триптофаноксидаз и тираминооксидаз, но она также не является специфичной для грамотрицательных бактерий, которые служат показателями качества пищевых продуктов и воды.

С другой стороны, при использовании указанного метода микроорганизмы, имеющие большое клиническое и гигиеническое значение, не могут быть соответствующим образом идентифицированы, и среди них - Е. coli О157:H7, Serratia, Citrobacter, Aeromonas и другие. Кроме того, метод нуждается в дополнительных "тестах на мазок" для подтверждения некоторых микроорганизмов и всегда в качестве предварительной диагностики.

Кесада Мунис (Quesada Muciz) и Родригес Мартинес (Rodriguez Martinez) получили патент на изобретение (Авторское свидетельство на изобретение № 20000083) на композицию, которая включает смесь белковых гидролизатов, белков, спиртов и других элементов, которая позволяет, помимо идентификации представляющих интерес микроорганизмов, таких как Е. coli и Salmonella , проводить идентификацию Pseudomonas aeruginosa менее, чем за 24 часа. Однако указанная среда не облегчала идентификацию других представляющих интерес грамотрицательных микроорганизмов, которые растут в виде бесцветных колоний.

Рот (Roth) с соавторами в 1993 году получили патент на способ и хромогенную среду для идентификации и дифференциации всех коли-форм и Е. coli (патент США № 5393662). Указанная среда состоит из субстратов с разными хромофорными группами. Однако данная среда не облегчает идентификацию и подсчет E coli O157:H7, Salmonella и других не относящихся к коли-формам энтеробактерий. Shigella sonnei приводит к получению ложных положительных результатов, поскольку в указанной среде ее колонии растут с теми же самыми цветовыми характеристиками, что и Е. coli.

В 1997 году Хенгстлер (Hengstler) с соавторами (KAI A. Hengstler, Rainer Hammann and Anne Mane Fahr. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation Medium for Detection and Presumptive Identification of Urinary Tract Pathogens. Journal of Clinical Microbiology, Nov., 1997, p.2773-2777) провели оценку среды CHROMagar Orientation medium для обнаружения и предварительной идентификации патогенов в образцах мочи. Рассматриваемая среда позволяла осуществлять обнаружение нескольких видов представляющих интерес микроорганизмов по окрашиванию колоний и среди них: окрашенные в цвет от розового до красного (Е. coli), окрашенные в сине-фиолетовый цвет (Klebsiella spp.), окрашенные в сине-красный цвет (Enterobacter spp.), окрашенные в розовый цвет (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Proteus mirabilis), окрашенные в синий цвет (Serratia spp.), окрашенные в сине-фиолетовый цвет (Citrobacter freundii и koseri), с окраской от бесцветной до бежевой на коричневой среде (Morganella morganii, Proteus mirabilis и vulgaris), окрашенные в синий цвет на коричневой среде (Proteus vulgaris), бесцветные колонии на коричневой среде (Enterococcus spp.), окрашенные в блестящий синий цвет (Streptococcus agalactiae), окрашенные в сине-зеленый цвет (Enterococcus spp.) и окрашенные в светло-розовый цвет (Staphylococcus saprophyticus).

Как следует из достигнутого уровня техники, каждый микроорганизм не может быть корректно идентифицирован, поскольку ему не соответствует единственная цветовая окраска, в связи с чем можно утверждать, что идентификацию нельзя провести лишь по показателям вида колоний или среды - требуются другие тесты, такие как те, что проводятся в случае Proteus mirabilis, Enterobacter, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterococcus spp. В другом аспекте, среда не облегчает корректной идентификации, поскольку различные виды дают сходное окрашивание, как в случае Enterobacter spp., Citrobacter freundii и Proteus mirabilis, которые все приобретают розовую окраску.

В марте 1998 года Рот (Roth) с соавторами запатентовали изобретение (патент США № 5726031), в котором были раскрыты среда и количественный способ идентификации и дифференциации биологического материала в исследуемом образце. Указанная среда включает специфический хромогенный субстрат для одного из биологических материалов, который придает окраску указанному материалу, второй хромогенный субстрат, специфичный для второго типа биологического материала, который облегчает получение второй окраски, отличной от первой, которая характерна для колоний другого вида, и третий исследуемый биологический материал, который расщепляет один из двух субстратов. Первый и второй биологические материалы разлагают сахар, а третий биологический материал не разлагает указанный сахар.

В указанную среду включен индикатор рН, что позволяет изменять окрашивание среды в результате гидролиза сахара, имеющегося вокруг колоний, и колонии принимают характерную окраску расщепленных хромогенных субстратов. Основными компонентами являются: 6-хлор-3-индолилгалактозид, 5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронид, сорбит и феноловый красный. Кроме того, включаются соли желчных кислот, лаурилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, полигликолевый эфир и антибиотики, полученные из акрифлавина.

Указанная композиция также включает индуктор ферментативных реакций (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид), агары, пектины, каррагенины, альгинаты, ксантин и пептоны. Указанное изобретение может рассматриваться как ближайший аналог данного изобретения.

Недостатки указанного изобретения могут быть резюмированы следующим образом:

- Salmonella typhi не может быть дифференцирована от Salmonella, не относящимся к виду typhi, и подтверждение ее идентификации является сложным, а для некоторых штаммов даже невозможным, поскольку на данной среде она может образовывать белые колонии, как это имеет место в случае других грамотрицательных бактерий, таких как Proteus.

- В тех случаях, когда указанные несколько видов растут на одной чашке Петри, очень трудно идентифицировать желтые зоны, характерные для большинства Salmonella, поскольку данное явление происходит в связи с подкислением среды, и образование указанных желтых зон может происходить за счет наложения таких реакций в указанной среде.

- Идентификация и подсчет других грамотрицательных, не относящихся к коли-формам бактерий, в том числе, таких как Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, не представляется возможным, поскольку они требуют использования других тестов для их идентификации.

- Для идентификации представляющих интерес микроорганизмов, как и в случае традиционных сред, требуется, как минимум, от 24 до 48 часов.

- Компоненты, которые должны ускорять рост представляющих интерес микроорганизмов в указанной среде, недостаточны для быстрого развития (менее 24 часов) идентифицирующих реакций, и возникает необходимость использования индуктора фермента -галактозидазы (IPTG).

- Необходимость присутствия в указанной среде додецилсульфата натрия, акрифлавина и антибиотиков усложняет и делает дороже процесс ее получения. Стабильность указанной среды ограничена наличием антибиотиков, которые вводят в качестве добавок.

- Указанный процесс проводят путем инкубирования образца при 40°С, а не при температуре, рекомендованной для большинства микроорганизмов и для большинства организаций, которые регулируют микробиологические процедуры (44°С), и это может вызвать проблемы, поскольку указанные процедуры не стандартизованы, а также вызвать путаницу среди лабораторного персонала.

Раскрытие изобретения

Цель настоящего изобретения состоит в предоставлении новой культуральной среды для идентификации и/или дифференциации грамотрицательных микроорганизмов, представляющих интерес для проведения микробиологической диагностики в клинической и ветеринарной практике, при контроле качества пищевых продуктов и для мониторинга загрязнения окружающей среды, а также способа ее использования.

Новизна настоящего изобретения состоит в обеспечении лабораторной практики культуральной средой, с помощью которой можно осуществлять дифференциацию большого числа представляющих интерес грамотрицательных микроорганизмов при диагностике их в единственной емкости (при определении), на основании различий по меньшей мере 10 цветов окраски колоний разного размера и по меньшей мере 5 типов различных гало (кольцевых образований вокруг колоний) по их окраске и размерам.

Впервые предложенная среда позволяет оценивать одновременно Е. coli, E. coli О157:H7, Salmonella typhi и отличных от вида typhi и даже проводить дифференциацию между ними; Klebsiella, Shigella и проводить дифференциацию между ними; Serratia, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Citrobacter и Aeromonas.

Некоторые микроорганизмы в указанной среде приобретают характерное окрашивание, как например, Salmonella typhi и S. schotmuleri, которые демонстрируют оранжевую окраску, Aeromonas hydrophila со светло-зеленой окраской, Pseudomonas aeruginosa оранжево-розового цвета, Shigella sonnei с красновато-фиолетовой окраской, Shigella flexneri прозрачные с окраской от оранжевой до желтой, Serratia odorifera с фиолетово-зеленоватой окраской и Proteus и Providence в виде бесцветных колоний.

Неожиданностью стало наличие у некоторых микроорганизмов характерных гало, как в случае Pseudomonas aeruginosa, образующих широкое прозрачное гало, Shigella sonnei, образующих желтое гало, Klebsiella pneumoniae, образующих розово-бежевое гало, Serratia , образующих небольшое прозрачное гало, Aeromonas hydrophila , образующих прозрачное гало, и Salmonella typhimurium, образующих оранжевое гало.

Были получены некоторые неожиданные реакции детектируемых микроорганизмов, в случае использования в качестве индикатора фенолового красного, в частности, колонии Shigella sonnei синего цвета с неровными краями, а среда клубнично-розового цвета; колонии Pseudomonas aeruginosa зеленовато-бежевого цвета, а среда розового цвета; и колонии Salmonella typhimurium бежевого цвета или бесцветные, а среда клубнично-розового цвета.

С другой стороны, предлагаются новые сочетания элементов, которые позволяют получать хорошо дифференцируемые гало, не описанные ранее для данных микроорганизмов, такие как определенное количество кремнезема, сепарированного молока, крахмалов и активированного угля, которые добавляются к среде в заданных пропорциях.

Вещества, которые вместе с описанными в предыдущем абзаце ингредиентами смешиваются друг с другом, гарантируют появление различного окрашивания колоний и их гало и выбираются из пропиленгликоля (от 5 до 15 мл/л), нейтрального красного (до 0,05 г/л), фенолового красного (до 0,05 г/л), глюкуронида-фуксина (от 0,05 до 0,25 г/л), X-gal (от 0,03 до 0,1 г/л) и MUG (до 0,07 г/л), и также составляют новизну, поскольку в указанных комбинациях и сочетаниях гарантируют появление окрашивания колоний и гало, которые не были описаны ранее.

Количества трех питательных основ в среде по отношению к содержанию ингибиторов роста грамотрицательных микроорганизмов также представляют новое сочетание, которое способно усилить рост конкурентных микроорганизмов.

Преимущества предлагаемой среды и соответствующего метода, описанных в настоящем изобретении, более детально состоят в следующем.

- Указанная среда не только позволяет осуществлять дифференциацию коли-форм в целом, но и специфическую дифференциацию между большинством из них, что весьма важно для диагностики в клинической практике и при осуществлении контроля качества пищевых продуктов.

- При использовании указанной среды не описанное ранее большое множество родов и видов может быть одновременно идентифицировано в одной чашке Петри, что позволяет таким образом сохранить лабораторные ресурсы, снизить время получения материалов и достичь экономии с точки зрения занятого персонала.

- Среду не стерилизуют, и ее получение является достаточно простым.

- Указанный способ позволяет при его использовании проводить инкубацию образца в широком диапазоне температур, причем даже выше, чем 40°С, поскольку длительность указанной стадии составляет лишь 18 часов и среда не подвергается порче.

- Высокое содержание в среде твердых веществ, природа таких компонентов и значения их рН гарантируют сохранение их в течение периодов времени, достаточных для поддержания в лаборатории нужных запасов в виде, готовом для использования.

- Вплоть до настоящего момента не поступало сообщений о ложных положительных или ложных отрицательных реакциях исследуемых микроорганизмов в ответ на идентификационные модели, которые были предложены для данной среды, что означает, что цвета колоний, их центров, гало вокруг них и их размеры и формы краев являются характерными и не изменяются.

- В указанной среде отсутствуют какие-либо вещества, которые могут вызывать быструю порчу в связи со способностью к окислению, и наоборот, она содержит вещества, которые помогают сохранить жизнеспособность микроорганизмов мишеней и даже защищают клетки от повреждений, вызываемых химическими веществами, как в случае древесного угля, молока, крахмала и кремнезема.

- При использовании описанных среды и способа достигается дифференциация не только Salmonella, не относящихся к виду typhi , от вида typhi, но и некоторых из них друг от друга.

- При проведении идентификации микроорганизмов в основном по зоне роста, т.е. по окрашиванию колоний и их центров, по их гало и их морфологии, процедура идентификации в меньшей степени зависит от изменения реакции окрашивания в указанной среде, которое может приводить к неверной идентификации в случае перекрывания реакций, например, при использовании для исследования загрязненных образцов с наличием широкого перечня организмов различных видов и родов, как в случае сильно загрязненной или гниющей воды.

- Нет необходимости проводить дополнительные тесты для идентификации микроорганизмов гигиенического значения, таких как Pseudomonas, Aeromonas и Klebsiella.

- Питательные основы, используемые в заданных количествах, в сочетании с наличием защитных агентов и при подборе концентрации ингибиторов способствуют быстрому росту и восстановлению менее чем за 24 часа представляющих интерес микроорганизмов.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к культуральной среде для идентификации грамотрицательных микроорганизмов, которая включает смесь соединений, обеспечивающих появление гало различных расцветок и размеров, включающую кремнезем, сепарированное молоко, крахмалы и бактериологический древесный уголь. Указанная среда также включает смесь основных питательных компонентов, веществ, которые приводят к развитию различной окраски колоний, веществ, которые обеспечивают ингибирование грамположительных микроорганизмов, и веществ, которые создают твердую матрицу для роста и развития колоний.

В культуральной среде согласно настоящему изобретению соединения, которые приводят к развитию гало различной окраски и различных размеров, присутствуют в количествах от 8 до 20 г/л и представлены следующими количествами:

кремнезем - от 2 до 10 г/л;

сепарированное молоко - от 2 до 20 г/л;

крахмал - до 4 г/л;

бактериологический древесный уголь - до 4 г/л.

Указанная смесь основных питательных компонентов, содержащихся в среде, присутствует в количествах от 10 до 38 г/л и состоит из

пептонов - от 2 до 15 г/л;

триптонов - от 2 до 15 г/л;

дрожжевого экстракта - от 2 до 8 г/л.

В среде согласно настоящему изобретению вещества, которые приводят к развитию различного окрашивания колоний, выбирают из группы, состоящей из пропиленгликоля, который используют в количествах от 5 до 15 мл/л, нейтрального красного, который используют в количествах до 0,05 г/л, фенолового красного, который используют в количествах до 0,05 г/л, фуксин-глюкуронида, который используют в количествах от 0,05 до 0,25 г/л, X-gal, который используют в количествах от 0,03 до 0,1 г/л, и MUG, который используют в количествах до 0,07 г/л.

С другой стороны, вещества, которые гарантируют ингибирование грамположительных микроорганизмов, присутствуют в количествах от 0,1 до 1 г/л, и предпочтительно используется дезоксихолат натрия.

Дополнительно, указанная среда содержит вещества, которые образуют твердый матрикс для роста и развития колоний, которые составлены из комбинации смеси веществ, которые обеспечивают развитие гало различных цветов и размеров, в частности кремнезема, сепарированного молока, крахмалов и бактериологического угля, с агаром в соотношениях от 0,75:1 до 2:1.

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации грамотрицательных микроорганизмов, где дифференциацию представляющих интерес микроорганизмов проводят на основании развития по меньшей мере 10 характерных вариантов окраски правильных и неправильных колоний и на основе гало по меньшей мере 5 различных характерных цветов и размеров.

В рассматриваемом способе идентификацию различных микроорганизмов проводят следующим образом:

- Е. coli по появлению колоний интенсивной синевато-фиолетовой окраски, синего гало и среды оранжевого цвета и, в некоторых случаях, с наличием флуоресценции голубого цвета;

- Е. coli О157:Н7 по появлению колоний синевато-фиолетовой или зеленоватой окраски и среды розового цвета;

- Shigella sonnei по появлению колоний красновато-фиолетовой окраски с очень нестандартными краями и желтого гало;

- Shigella flexneri по появлению прозрачных колоний от оранжевой до желтой окраски, мукоидов и среды от оранжевого до желтого цвета;

- Pseudomonas aeruginosa по появлению колоний оранжево-розовой окраски, прозрачного гало и зеленоватой флуоресценции до истечения 24 часов и зеленоватой окраски после 24 часов;

- Klebsiella pneumoniae по появлению колоний красновато-фиолетовой окраски, мукоидов с розово-бежевым гало в ряде случаев;

- Serratia odorifera и Serratia marcencens по появлению колоний зеленовато-фиолетового цвета и прозрачного очень маленького гало;

- Proteus mirabilis, Proteus vulgaris и Providence spp. по появлению мелких бесцветных колоний и среды оранжевого цвета;

- Salmonella enteritidis по появлению колоний красного цвета со стандартными краями;

- Salmonella cholerasuiss по появлению колоний красного цвета с нестандартными краями;

- Salmonella typhimurium по появлению колоний красного цвета и гало различных оттенков оранжевого цвета;

- Salmonella schotmuelleri по появлению колоний оранжевого цвета, прозрачных, и среды от оранжевого до желтого цвета;

- Salmonella typhi по появлению колоний оранжевого цвета и желтой среды;

- Enterobacter aerogenes и Е. cloacae по появлению колоний светло-фиолетового или зеленовато-фиолетового цвета с центром более интенсивного фиолетового цвета;

- Citrobacter freundii по появлению мелких колоний темно-фиолетового цвета с центром более интенсивного фиолетового цвета;

- Aeromonas hydrophilia по появлению колоний светло-зеленого цвета и широкого прозрачного гало.

При проведении идентификации различных организмов с использованием фенолового красного наблюдаются следующие результаты:

- Е. coli идентифицируют по появлению колоний синего цвета и среды розового цвета, а в случае использования MUG, по флуоресценции голубого цвета;

- Shigella sonnei идентифицируют по появлению колоний синего цвета с нестандартными краями и среды клубнично-розовой окраски;

- Pseudomonas aeruginosa идентифицируют по появлению колоний зеленовато-бежевого цвета и среды розового цвета;

- Salmonella typhimurium идентифицируют по появлению колоний бежевого цвета или бесцветных и среды клубнично-розовой окраски.

Указанную культуральную среду готовят путем смешивания от 30 до 50 граммов среды с 1 литром дистиллированной или деионизированной воды, перемешивания, кипячения до полного расплавления агара, охлаждения до 45-50°С, добавления пропиленгликоля в количествах от 5 до 15 мл, перемешивания и разливания по чашкам при постоянном перемешивании. Затем образцы или микроорганизмы инокулируют и инкубируют при температуре от 30 до 45°С вплоть до 18 часов, с последующей окончательной идентификацией или дифференциацией микроорганизмов в основном по характерному цвету колоний, их центров, гало, по виду границ колоний и, в случае, когда это необходимо, по окрашиванию среды.

В промышленных масштабах указанную среду начинают готовить из смеси обезвоженных ингредиентов, предварительно измельченных и просеянных. Смешивание осуществляют в гомогенизаторах в течение времени от 0,5 до 6 часов. Затем отбирают образец и проверяют его рН. Значение рН доводят до 6,6-7,4 с помощью карбоната натрия и снова перемешивают в течение времени от 0,5 до 6 часов. После повторного определения рН среду подвергают физико-химическому и функциональному контролю и в случае получения удовлетворительных результатов разливают по колбам разного объема.

В лабораторных условиях при наличии среды, готовой для использования, проводят следующие процедуры.

Вначале в колбу Эрленмейера помещают небольшой объем дистиллированной или деионизированной воды, взяв ее из общего объема в 1 литр, необходимого для получения среды. Указанное количество воды смешивают с 10 мл пропиленгликоля. После этого отвешивают и добавляют обезвоженные ингредиенты, начиная с тех компонентов, которые могут быстрее смачиваться, таких как основные питательные компоненты, в количестве от 10 до 30 г, конкретно, пептоны в количестве от 2 до 15 г/л, триптоны в количестве от 2 до 15 г/л и дрожжевые экстракты в количестве от 2 до 8 г/л. Далее добавляют ингредиенты, которые обеспечивают появление гало, в количествах от 8 до 20 г/л, конкретно, сепарированное молоко в количестве от 2 до 20 г/л, крахмал в количестве до 4 г/л, активированный древесный уголь в количестве до 4 г/л и, наконец, кремнезем в количестве от 2 до 10 г/л.

После этого добавляют большую часть ингредиентов, которые гарантируют появление окрашивания, таких как нейтральный красный, в количествах до 0,05 г/л или феноловый красный в количествах до 0,05 г/л, фуксин-глюкуронид в количествах от 0,005 до 0,02 г/л, X-gal в количествах от 0,003 до 0,005 г/л и MUG в количестве до 0,002 г/л.

Затем добавляют ингибиторы грамположительных микроорганизмов, предпочтительно дезоксихолат натрия в количестве от 0,1 до 1 г/л.

В заключение добавляют агар в соотношении от 0,5:1 до 1,5:1 относительно суммарного количества молока, крахмала, древесного угля и кремнезема.

Все ингредиенты, в конечном итоге, должны быть добавлены в количестве от 30 до 50 г.

Указанную смесь оставляют в покое в течение нескольких минут, после чего добавляют оставшееся количество воды до 1 литра, хорошо перемешивают компоненты и оставляют в покое в течение времени до 15 минут, так чтобы агар успел набухнуть.

Затем смесь нагревают, при постоянном перемешивании, до кипения и до полного расплавления агара.

Смесь охлаждают до 45-50°С, добавляют пропиленгликоль в количествах от 5 до 15 мл, среду выдерживают при постоянном перемешивании и разливают по чашкам Петри при постоянном перемешивании.

Чашки Петри инокулируют исследуемыми образцами с помощью любого установленного способа, предпочтительно по методу выливания на чашку или посредством штриховки.

Ниже представлены несколько примеров.

Пример 1

Получают 1000 г порошкообразной обезвоженной культуральной среды, которая имеет следующий состав:

г/1000 г среды
Пептон из мышцы быка	118,5
Казеиновый триптон	118,5
Дрожжевой экстракт	94,8
Порошок сепарированного молока	237,0

Указанные компоненты предварительно были просеяны.

В данную композицию включали дезоксихолат натрия как ингибитор (23,7 г). Получали вначале предварительную смесь 47,4 г кремнезема с 1,2 г X-gal, 0,7 г нейтрального красного и 3,0 г фуксин-глюкуронида. После этого все ингредиенты смешивали с агаром в качестве желирующего средства в количестве 355 г и с карбонатом натрия в количестве 1 г. После достижения равномерности композиции и доведения значения рН до 7,0 указанную композицию в количестве 21 г запечатывали в плотно закрытую колбу.

В то же самое время помещали в колбы по 5 мл пропиленгликоля.

Содержимое колбы с композицией помещали в колбу Эрленмейера, которая содержала смесь деионизированной воды и содержимого колбы с пропиленгликолем; полученную смесь перемешивали, оставляли для набухания в течение 10 минут и затем кипятили в течение 3 минут, после чего охлаждали до 45°С и разливали по чашкам Петри. После желирования композиции полученную среду осматривали с точки зрения внешнего вида и других характеристик.

Результаты физико-химической и органолептической оценок приведены в таблице 1.

Таблица 1 Оценка физико-химических и органолептических свойств
Параметры обследования	Результаты
Цвет порошка	Розово-бежевый
Внешний вид порошка	Хороший, текучий, гомогенный
Цвет полученной среды после расплавления	Красный
Прозрачность приготовленной среды после расплавления	Опалесцирующая
Потери при сушке	6,65
рН полученной среды перед расплавлением	6,97
РН полученной среды после расплавления	6,96

Сравнительные данные по дифференциации колоний и усилению роста на основной среде и дифференциальной среде для представляющих интерес микроорганизмов были получены с использованием сертифицированных штаммов на следующих средах:

Красно-фиолетовый желчный агар: готовили в концентрации 38,5 г/л в воде, смешивали и нагревали до кипения, охлаждали до 45-50°С и разливали по чашкам Петри.

S.S.Агар: готовили в концентрации 60 г/л в деионизированной воде, смешивали и нагревали до кипения, охлаждали до 45-50°С и разливали по чашкам.

В таблице 2 можно видеть приведенные в ней характеристики роста различных микроорганизмов, а также их количество при разведениях 10^-5 и 10^-6 .

Указанные результаты были удовлетворительными как с целевой средой согласно настоящему изобретению, так и со стандартными средами, не демонстрируя какого-либо ингибирования видов Salmonella и Shigella. Более сильный рост Shigella sonnei был показан для исследуемой среды в сравнении со средой S.S.Arap, что было доказано также на основании количества и размера колоний. Что касается достижения целей дифференциации различных видов, следует отметить, что во всех случаях были получены характерные ответы для каждого вида.

Аналогичные исследования были проведены с видами группы коли-форм с использованием стандартной среды красно-фиолетовый желчный агар, как показано в таблице 3.

Таблица 2 Дифференциация и усиление роста на культуральной среде, разработанной согласно настоящему изобретению (Salmonella и Shigella) изобретению (Salmonella и Shigella)
Микроорганизм	Среда	Среднее значение (КОЕ/мл)		Цвет среды	Цвет колоний	Морфология колоний
		10 -5	10-6
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Экспериментальная	н/с	325	Розовый	Красный	Стандартные края, 2 мм
	S.S. Агар	н/с	210	Оранжевый	Бесцветный	Стандартные края, центр черный, 2 мм
Salmonella enteritidis АТСС 13076	Экспериментальная	195	20	Розовый	Красный	Стандартные края, 2 мм
	S.S.Агар	235	20	Оранжевый	Бесцветный	Стандартные края, 1-2 мм
Shigella flexneri ATCC 12022	Экспериментальная	н/с	75	Желтовато- оранжевый	Желтый, Просвечивающий	Стандартные края, 2 мм
	S.S. Агар	н/с	30	Оранжевый	Бесцветный	Стандартные края, 2 мм
Shigella Sonnei ATCC 25931	Экспериментальная	155	20	Розово- оранжевый	Красновато-фиолетовый	Очень нестандартные края, 2 мм
	S.S. Агар	НР	НР	НР	НР	НР
н/с - несчетное количество; НР - нет роста КОЕ/мл - колониеобразующие единицы на каждый миллилитр разбавления.

Таблица 3 Дифференциация и усиление роста (коли-формы)
Микроорганизм	Среда	Среднее значение (КОЕ/мл			Цвет среды	Цвет колоний	Морфология колоний
		10 -5	10-6
Escherichia coli ATCC 25922	Эксперимен- тальная	н/с	235		Розовый	Интенсивный голубовато- фиолетовый с голубым гало	Стандартные края, 2 мм
	Фиолетово- красный желчный агар	н/с	155		Розово- фиолетовый	Красно- фиолетовый с желчным осадком	Стандартные края, 3 мм
Enterobacter aerogenes ATCC 13048	Эксперимен- тальная	н/с	245	Розовый		Светло- фиолетовый с темным центром	Стандартные края, 2-3 мм
	Фиолетово- красный желчный агар	н/с	205	Розово- фиолетовый		Фиолетовый	Стандартные края, 2 мм
н/с - несчетное количество; НР - нет роста; КОЕ/мл - колониеобразующие единицы на каждый мл разбавления.

Количество указанных двух микроорганизмов в целевой среде согласно настоящему изобретению и в среде, используемой в качестве стандарта, было одинаково. В обоих случаях дифференциация микроорганизмов достигалась по их окрашиванию и морфологическим характеристикам.

Инокулировали группу штаммов посредством штрихования до получения изолированных колоний на поверхности среды, что позволило провести дифференциацию других 5 видов, приведенных в таблице 4.

Таблица 4 Дифференциация других грамотрицательных видов в среде
Микроорганизм	Цвет среды	Цвет колоний	Морфология изолированных колоний
Salmonella Schotmuleri ATCC 10719	Оранжевый	Оранжевый	Стандартные края (2-3 мм)
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883	Розовый	Красновато- Фиолетовый	Мукоиды (2 мм)
Citrobacter freundii ATCC 8090	Розовый	Интенсивный фиолетовый	Стандартные края (1 мм)
Enterobacter cloacae ATCC 23355	Розовый	Светло-фиолетовый с темным центром	Стандартные края (2-3 мм)
Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150	Розовый	Интенсивный голубовато-фиолетовый без гало вокруг	Стандартные края (2 мм)

В среде наблюдалась очень хорошая дифференциация всех микроорганизмов, при этом проявлялось различие между штаммом Е.coli O157:H7 и типичным E.coli , других коли-форм, таких как Klebsiella и Enterobacter , которые демонстрировали характерное окрашивание.

Пример 2

Получали композицию, взвешивая ингредиенты отдельно друг от друга в колбе Эрленмейера в количествах, необходимых для получения 100 мл среды, при этом использовали ингредиенты в концентрациях согласно примеру 1, за исключением кремнезема, который использовали в концентрации 2 г/л. Добавляли 100 мл деионизированной воды, которая была предварительно смешана с 1 мл пропиленгликоля. Значение рН доводили до 6,94 и последующее получение проводили по процедуре, описанной в примере 1.

Исследуемые штаммы микроорганизмов, которые образуют просвечивающие гало вокруг колоний, инокулировали штрихованием до получения изолированных колоний. Их далее инкубировали в течение 24 часов при 37°С. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5 Результаты составления композиций с использованием 2 г/л кремнезема
Микроорганизм	Цвет среды	Цвет колоний	Морфология изолированных колоний
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	Оранжевый	Розовый флюоресцирующий с просвечивающим гало размером 3 мм	Мукоиды, несколько нестандартные, 2-3 мм
Aeromonas hydrophila sp.	Оранжевый	Светло-зеленый с просвечивающим гало размером 3	Стандартные края, мукоиды, 2 мм
Serratia marcencens ATCC 8100	Желто- оранжевый	Зеленовато- фиолетовый с маленьким гало размером 1 мм	Стандартные края, 1-2 мм

Хорошая дифференциация микроорганизмов наблюдалась по цвету и морфологии, при этом был очень хорошо различимым просвечивающийся гало вокруг колоний.

Пример 3

Готовили среду, взвешивая ингредиенты отдельно в колбе Эрленмейера в концентрациях согласно примеру 1, за исключением субстрата фуксин-глюкуронида, который использовали в концентрации 1,5 мкг/мл, и последующую процедуру проводили в соответствии с процедурой примера 2, после чего наблюдали реакцию группы энтеробактерий в данной композиции, результаты такого исследования показаны в таблице 6.

Таблица 6 Ростовые характеристики энтеробактерий в среде
Микроорганизм	Цвет среды	Цвет колоний	Морфология изолированных колоний
Shigella flexneri АТСС 12022	Желтый	Желтый, просвечивающий	Мукоиды, несколько нестандартные края, 2-3 мм
Shigella sonnei ATCC 25931	Оранжевый	Красновато- фиолетовый	Мукоиды, нестандартные края, 4-5 мм
Proteus mirabilis ATCC 12453	Оранжевый	Оранжевый с темным центром	Слегка нестандартные края, 2 мм
Providence sp .	Оранжевый	Оранжевый	Нестандартные края, 1-3 мм
Proteus vulgaris ATCC 13315	Оранжевый	Оранжевый	Нестандартные края, 3-5 мм
Escherichia coli ATCC 25922	Красновато- оранжевый	Фиолетовый с голубым гало	Стандартные края, центр 2 мм, гало 1 мм
Escherichia coli О157:Н7 ATCC 35150	Красновато- оранжевый	Зеленовато- фиолетовый	Стандартные края, 1-2 мм
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Оранжевый	Красный с темным центром	Слегка нестандартные края, 1-2 мм
Salmonella typhi АТСС 2280	Оранжевый	Оранжевый	Слегка нестандартные края, 1-2 мм
Salmonella choleraesuiss ATCC 10708	Красновато- оранжевый	Красный	Нестандартные края, мукоиды, 2-3 мм
Salmonella schotmuleri ATCC 10719	Желтый	Светло-оранжевый	Нестандартные края, 3 мм
Enterobacter cloacae ATCC 8100	Оранжевый	Зеленый с фиолетовым центром	Стандартные края, 2-3 мм
Enterobacter aerogenes ATCC 13048	Оранжевый	Зеленый с фиолетовым центром	Стандартные края, 3 мм

Как можно видеть по результатам приведенного примера, указанная композиция является функциональной для большой группы сертифицированных штаммов семейства Enterobacteriaceae. Достаточно легко наблюдались типичные реакции среды на инокулированные виды микроорганизмов, представляющие интерес.

Пример 4

Готовили среду, взвешивая ингредиенты отдельно в колбе Эрленмейера в концентрациях согласно примеру 1, за исключением замены субстрата фуксин-глюкуронида флуорогенным субстратом MUG, который использовали в концентрации 0,05 г/л, и последующее получение осуществляют в соответствии с процедурой примера 2.

Группу микроорганизмов инокулировали штрихованием до получения изолированных колоний, как указано в таблице 7.

Таблица 7 Оценка композиции с MUG
Микроорганизм	Цвет среды	Цвет колоний	Морфология изолированных колоний
Escherichia coli ATCC 25922	Красновато- оранжевый	Фиолетовый с голубым флуоресцирующим гало	Стандартные края
Escherichia coli О157:Н7 АТСС 35150	Красновато- оранжевый	Темно-фиолетовый без гало	Стандартные края
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Красный	Красный	Слегка нестандартные края

Пример 5

Готовили среду, которая имеет следующий состав:

Ингредиент	Г/л
Пептон	5
Триптон	5
Дрожжевой экстракт	4
Х-gal	0,05
Фуксин-глюкуронид	0,1
Дезоксихолат	1
Нерастворимый крахмал	4
Феноловый красный	0,018
Агар	15

Ингредиенты взвешивали в колбе Эрленмейера, добавляли 1 л деионизированной воды, перемешивали с 10 мл пропиленгликоля, доводили значение рН до 7,0, нагревали при постоянном перемешивании до кипения и затем оставляли на 15 минут в автоклаве без давления. Далее среду охлаждали до 45-50°С и разливали по чашкам Петри.

Штаммы энтеробактерий инокулировали штрихованием до получения изолированных колоний. Результаты приведены в таблице 8.

Таблица 8 Оценка композиции с крахмалом и феноловым красным
Микроорганизм	Цвет среды	Цвет колоний	Морфология изолированных колоний
Escherichia coli ATCC 25922	Розовый	Голубой	Стандартные края
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	Розовый	Зеленовато-бежевый	Слегка нестандартные края
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Розовый	Бежевый	Стандартные края
Shigella sonnei ATCC 25931	Розовый	Голубой	Нестандартные края