способ получения комбинированного бактериального удобрения для растений

Формула изобретения

Способ получения комбинированного бактериального удобрения для растений, включающий получение биогумуса путем вермикомпостирования органических отходов с использованием дождевых червей и внесение в биогумус микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве органических отходов используют навоз сельскохозяйственных животных, предварительно нейтрализованный до рН 7-8, а в качестве дождевых червей используют гибрид красного калифорнийского червя с дождевыми червями кубанской природной популяции в количестве 10⁴ на 1 м², при этом вермикомпостирование осуществляют в течение 2-3 месяцев при температуре 16-32°С в естественных условиях, причем после отделения червей из биогумуса виброситом с размером пор 0,5-1,0 см биогумус подсушивают до влажности 50-60%, фасуют в пакеты из полипропилена, в которых автоклавируют в течение 45-75 мин при 0,8-1,2 атм, вносят микроорганизмы, относящиеся к роду Rhizobium и роду Agrobacterium, при соотношении, %:

Род Rhizobium	30-70
Род Agrobacterium	30-70

и выдерживают до достижения титра 8·10 ¹².

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов, относящиеся к роду Rhizobium, используют Rh. japonicum, Rh. meliloti, Rh. vigna, Rh. leguminogarum.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов, относящихся к роду Agrobacterium, используют Ag. chroococcum, Ag. radiobacter.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к технологии приготовления почвоудобрительных препаратов для растениеводства.

В последние годы все большее применение в сельском хозяйстве находит биогумус - продукт вермикомпостирования различных органических отходов промышленного и сельскохозяйственного производства специально выведенной расой дождевых червей. Биогумус содержит гуминовые и фульвокислоты, макро- и микроэлементы, аминокислоты и гиббереллины и другие биологически активные вещества в доступной растениям форме. Поэтому само по себе применение биогумуса повышает урожайность сельскохозяйственных культур и увеличивает плодородие почв.

Известный способ утилизации органических отходов в биогумус включает приготовление субстрата путем смешивания компонентов, одним из которых являются отходы животного происхождения, внесение в него червей и/или их коконов, укладку субстрата в коробку или гряды и компостирование при влажности 65-80% и аэрации, отделение червей от полученного биогумуса. В качестве главного компонента в субстрат вводят скоп, являющийся отходом производства картона, в количестве 20-80% к общей массе субстрата. В качестве отходов животного происхождения применены навоз крупного рогатого скота и/или навоз свиней и помет птиц, применены черви вида Eisenia foetida в количестве 15-25 тыс. особей на 1 м². При низком содержании азота в субстрате после смешивания компонентов вводят добавки азота минеральных удобрений в виде мочевины в количестве не более 5% от общей массы субстрата с одновременной добавкой известняковой муки в количестве, обеспечивающем рН среды готового субстрата не более 8 (пат. РФ №2057743, кл. C 05 F 3/06. 10.04.1996).

Однако данный способ имеет некоторые недостатки. Введение скопа (отходов производства картона) не всегда возможно в связи с отсутствием сырья. Кроме того, широкий диапазон величины его ввода не позволяет стандартизировать процесс вермикомпостирования, так как доля скопа влияет на активность червей. Вызывает сомнение, что мочевина может обеспечивать заявляемый эффект. Кроме того, как и в вышеуказанном аналоге, маловероятно, чтобы полученный таким способом биогумус включал в себя необходимое количество полезных микроорганизмов, в том числе и способных к азотфиксации.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения биоудобрения, заключающийся в получении биогумуса путем вермикомпостирования сельскохозяйственных и промышленных отходов с использованием дождевых червей, отделения биогумуса от червей и его досушивания, причем из дождевых червей используют червей "Оболенский гибрид", полученных путем скрещивания "Красного калифорнийского гибрида" с российской популяцией дождевых червей Eisenia foetida, при этом вермикомпостирование осуществляют при температуре 16-24°С в течение 4-6 месяцев, в полученный биогумус вносят микроорганизмы, обладающие фунгицидными свойствами. В способе микроорганизмы, обладающие фунгицидной активностью, вносят после отделения червей или после дозревания биогумуса, кроме того, в качестве них используют штамм бактерий Bacillus subtilis ИПМ-215 в концентрациях 1·10⁹-1·10¹² спор на 1 кг биогумуса или культуру микофильного гриба Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 в концентрациях 1·10⁴ -1·10⁸ колониеобразующих единиц на 1 кг биогумуса (пат. РФ №2125549, кл. C 05 F 11/08, 1999 г., бюл. №3. - прототип).

Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, использование указанного гибрида не позволяет повсеместно получать качественный биогумус, так как климатические условия нашей страны очень разнообразны. Во-вторых, вызывает сомнение возможность использования данной технологии в южных регионах России, так как указанный диапазон температур не позволяет в теплые месяцы проводить культивирование данного гибрида, а время культивирование (4-6 месяцев) не позволяет получать достаточное количество биогумуса. Кроме того, дефицит азота во многих агроландшафтах требует дополнительного азотного питания, что не может обеспечить предлагаемый препарат. Кроме того, низкий титр препарата требует высоких доз внесения для борьбы с болезнями, что делает экономически не эффективным применение биопрепарата.

Известные способы не позволяют получать биопрепарат с высоким титром полезных микроорганизмов и обладающий комбинированной азотфиксирующей активностью.

Техническим решением задачи является расширение ассортимента биопрепаратов, повышение их биологической активности спектра действия за счет нескольких штаммов в составе препарата, улучшение агрохимических показателей почвы за счет питательных веществ, находящихся в биогумусе, наличия у препарата азотфиксирующей активности, как симбиотической, так и ассоциативной, и высокого титра полезных микроорганизмов за счет стимуляции друг друга.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения комбинированного бактериального удобрения для растений, включающем получение биогумуса путем вермикомпостирования органических отходов с использованием дождевых червей и внесение в биогумус микроорганизмов, в качестве органических отходов используют навоз сельскохозяйственных животных, предварительно нейтрализованный до рН 7-8, а в качестве дождевых червей используют гибрид красного калифорнийского червя с дождевыми червями кубанской природной популяции в количестве 10⁴ на м², при этом вермикомпостирование осуществляют в течение 2-3 месяцев при температуре 16-32°С в естественных условиях, причем после отделения червей из биогумуса виброситом с размером пор 0,5-1,0 см биогумус подсушивают до влажности 50-60%, фасуют в пакеты из полипропилена, в которых автоклавируют в течение 45-75 мин при 0,8-1,2 атм, вносят микроорганизмы, относящиеся к роду Rhizobium и роду Agrobacterium, при соотношении, %:

род Rhizobium	30-70
род Agrobacterium	30-70

и выдерживают до достижения титра 8·10¹². В качестве микроорганизмов, относящихся к роду Rhizobium, используют Rh. japonicum, Rh. meliloti, Rh. vigna, Rh. legummogarum, а из микроорганизмов, относящихся к роду Agrobacterium, используют Ag. chroococcum, Ag. radiobacter.

Заявленный способ получения комбинированного бактериального удобрения для растений отличается от прототипа режимами изготовления биогумуса и видами и комбинацией используемых микроорганизмов.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию "новизна".

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение поставленной задачи и не выявлены при изучении патентной и научно-технической литературы в данной и смежной областях науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию "изобретательский уровень".

Способ получения комбинированного бактериального удобрения для растений реализуется следующим образом.

Пример 1. Навоз крупного рогатого скота складируется в бурты размером 1х5х1,5 метров. Навоз перелопачивается до достижения им температуры окружающей среды. Для регуляции кислотности используется мел или гашеная известь. Защелачивание проводят послойно до достижения навозом рН 7-8. Если кислотность навоза будет менее 7 ед., то черви развиваться в нем не будут, а значит, биогумус не будет образовываться. Если кислотность навоза будет более 8 ед., то черви развиваться также в нем не будут, так как это значение рН для них также неоптимально, кроме того, будет перерасход защелачивающего агента, что приведет к дополнительным расходам на подготовку субстрата для червей. Таким образом, оптимальной кислотностью навоза для развития червей является рН 7,5.

В качестве кольчатых червей используется гибрид красного калифорнийского червя с дождевыми червями кубанской природной популяции, полученный при совместном культивировании гибрида красного калифорнийского червя с кубанской популяцией кольчатых навозных червей. Это связано с тем, что гибрид красного калифорнийского червя очень чувствителен к условиям внешней среды и требует оптимальной температуры, определенных качеств субстрата, что делает его нетехнологичным в наших условиях. В то же время кольчатые навозные черви, обитающие в почве, хотя и всеядны, но низкопродуктивны и сохраняют инстинкт к миграции, что делает их неудобным объектом для вермикомпостирования. Поэтому использование адаптированной породы обеспечивает достаточно высокую степень продуктивности червей и одновременно низкую восприимчивость к внешним условиям среды.

Готовый к использованию навоз заселяют червями из расчета 10 тыс. червей на 1 м², предварительно проверив тестом "50 червей", который позволяет оценить качество субстрата. Заселение производится вечером или в пасмурный день, так как черви не выносят прямых солнечных лучей. Навалы с заселенным червями субстратом сверху накрывают травой для защиты от солнца и снижения испарения воды. Навалы периодически поливают, рыхлят верхний слой субстрата. Вермикомпостирование осуществляют в течение 2-3 месяцев. Если время культивирования составляет менее 2 месяцев, то гибрид красного калифорнийского червя и кольчатого червя кубанской популяции не переработает субстрат, а значит, выход биогумуса будет незначительный. Если время культивирования составляет более 3 месяцев, то гибрид красного калифорнийского червя и кольчатого червя кубанской популяции, переработав весь субстрат, начтет угнетаться и терять продуктивность, а кроме того, это увеличивает время процесса приготовления биопрепарата, что увеличивает его себестоимость. Поэтому оптимальным временем культивирование червей в субстрате составляет 2,5 месяцев. Оптимальное культивирование червей в субстрате осуществляют при температуре 24°С. Если температура культивирования составляет менее 16°С, то метаболизм и рост гибридных червей замедляется, а значит, и эффективность конверсии субстрата в биогумус будет низкая. Если температура культивирования составляет более 32°С, то рост вермикультуры также будет низким.

В результате роста и размножения червей происходит переработка навоза в биогумус. Отделение червей осуществляют на механических виброситах, причем остающиеся на сите черви используются для последующего получения биогумуса из следующей партии навоза. При этом оптимальным является размер пор сита 0,75 см, что позволяет получать чистый биогумус, свободный от частиц непереработанного субстрата и остатков мусора. Если величина пор сита будет менее 0,5 см, то скорость просеивания будет низка, что увеличит время технологической операции. Если величина пор сита будет более 1,0 см, то вместе с частицами биогумуса в емкость с готовым продуктом будут попадать и частицы непереработанного субстрата, что будет негативно сказываться на качестве готового продукта.

Полученный биогумус подсушивается в потоке горячего воздуха до влажности 55% и складируется в крафт-мешки. Если влажность готового биогумуса будет менее 50%, то будет происходит перерасход теплоносителя при сушке продукта и это потребует дополнительного ввода воды для комфортного развития вносимых в биогумус азотфиксирующих микроорганизмов. Если влажность готового биогумуса будет более 60%, то качество готового продукта ухудшится, так как получаемое удобрение потеряет сыпучесть, а кроме того, аэрация субстрата будет низкая, что приведет к замедленному развитию микроорганизмов.

Полученный вышеуказанным способом биогумус используется одновременно в качестве и носителя, и субстрата для развития и размножения азотфиксирующим микроорганизмов. По мере необходимости биогумус из крафт-мешков расфасовывается по полипропиленовым пакетам в зависимости от объемов использования от 1 кг до 5 кг в пакет. Пакеты закрываются ватно-марлевыми пробками и стерилизуются в автоклаве при режиме 1 атм в течение одного часа, что является оптимальным режимом стерилизации. Если время стерилизации будет менее 45 мин, а давление в автоклаве менее 0,8 атм, то полной стерилизации субстрата не произойдет и в нем останутся микроорганизмы, которые будут мешать росту и развитию азотфиксирующих микроорганизмов, а значит, их нужного титра микроорганизмы не достигнут, что снизит качество препарата. Если время стерилизации будет более 75 мин, а давление в автоклаве более 1,2 атм, то за счет жесткого режима автоклавировния в субстрате (биогумусе) образуются вещества, токсичные для азотфиксирующих микроорганизмов, и качество препарата снизится, кроме того, себестоимость бактериального препарата будет высокая за счет перерасхода теплоносителей.

Для засева биогумуса клубеньковыми микроорганизмами используют посевной материал из коллекции чистых культур. Пробирку с лиофилизированной чистой культурой Rhizobium japonicum B-2437 оживляют с помощью питательного раствора. Производят засев оживленной культуры в колбы на 750 мл по 200-250 мл питательной среды, представляющей собой гороховый отвар, который дополнительно содержит сахарозу и минеральные соли. Затем полученный маточный раствор засевают в бутыли объемом 5 литров, содержащих по 2,0-2,5 литра питательной среды, включающую в себя кукурузный экстракт, мелассу и минеральные соли. Аналогичным образом производят оживление, засев и наработку жидкой культуры Agrobacterium chroococcum 204.

Полученный таким образом рабочие растворы штаммов Rhizobium japonicum B-2437 и Agrobacterium chroococcum штамм 204 засевают стерильно в биогумус из расчета конечного общего титра микроорганизмов 5·10 ⁹. Если микроорганизмов рода Rhizobium будет менее 30%, то эффективного симбиотического процесса азотфиксации с бобовыми растениями не произойдет. Если микроорганизмов рода Rhizobium будет более 70%, то соотношение симбиотических и ассоциативным штаммов будет неоптимальным и эффективного взаимодействия с растениями этих штаммов не произойдет и качество препарата будет низким. Таким образом, оптимальным содержанием в препарате представителей рода Rhizobium будет 50%. Если микроорганизмов рода Agrobacterium будет менее 30%, то эффективного ассоциативного процесса азотфиксации с растениями не произойдет. Если микроорганизмов рода Agrobacterium будет более 70%, то соотношении симбиотических и ассоциативным штаммов будет неоптимальным и эффективного взаимодействия с растениями этих штаммов не произойдет и качество препарата будет низким. Таким образом, оптимальным содержанием в препарате представителей рода Agrobacterium будет 50%.

Перемешивание биогумуса и засеянных микроорганизмов производят механически таким образом, чтобы не повредить полипропиленовые пакеты. Затем засеянные пакеты помещают в термостатируемое помещение с комнатной температурой.

По истечении 7-10 дней проверяют титр посеянных микроорганизмов, который должен увеличиться на 2-3 порядка за счет совместного роста бактерий на биогумусе и достигать 8·10¹² .

Дальнейшее хранение препаратов в неповрежденных пакетах в течение 3-х месяцев не снижало титра азотфиксирующих микроорганизмов препарата ниже 9·10¹⁰, что связано с оптимальным содержанием в биогумусе необходимых для азотфиксирующих микроорганизмов питательных веществ и стимуляцией микроорганизмами друг друга за счет синтеза веществ.

Пример 2. Согласно технологии получения комбинированного бактериального удобрения для растений по примеру 1, в качестве сырья для культивирования червей используют куриный помет с добавлением измельченной соломы.

Пример 3. Согласно технологии получения комбинированного бактериального удобрения для растений по примеру 1, в качестве сырья для культивирования червей используют конский навоз.

Пример 4. Согласно технологии получения комбинированного бактериального удобрения для растений по примеру 1, в качестве сырья для культивирования червей используют навоз телят на откорме с добавлением измельченной соломы.

Результаты определений количества бактерий Rhizobium japonicum В-2437 и Agrobacterium chroococcum 204 в биогумусе разного происхождения представлены в таблице 1.

Таблица 1 Общий титр микроорганизмов Rhizobium japonicum В-2437 и Agrobacterium chroococcum 204 при использовании в биогумусе разного качества
№	Вариант	Титр культуры Rhizobium japonicum В-2437 и Agrobacterium chroococcum 204
1	вариант 1	1,2·1011
2	вариант 2	7,5·1010
3	вариант 3	8,7·10 10
4	вариант 4	8,2·1010

Результаты лабораторных испытаний по примерам 1, 2, 3, 4 показали, что независимо от происхождения отходов животноводства биогумусом, полученным на его основе, обеспечивается высокий титр азотфиксирующих бактерий, необходимый для получения качественного комбинированного бактериального препарата для растений.

Нами получены комбинированные бактериальные удобрения с использованием разных видов рода Rhizobium и рода Agrobacterium. Результаты общего титра этих бактерий при получении препарата по указанному способу представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, использование различных видов клубеньковых бактерий совместно с ассоциативными по указанному способу позволяет вне зависимости от вида микроорганизмов получить значительный титр, а значит, и высокое качество препарата.

Кроме того, следует отметить, что технология получение биогумуса - это простой процесс, а сырье (органические отходы сельского хозяйства) общедоступно. Одновременно с получением биогумуса решается и проблема защиты окружающей среды, что актуально особенно в аграрных регионах с развитым животноводством.

Таблица 2 Общий титр микроорганизмов рода Rhizobium и Agrobacterium при использовании биогумуса по предлагаемому способу
Виды микроорганизмов	Agrobacterium chroococcum 204	Agrobacterium radiobacter 10
Rhizobium japonicum B-2437	9,2·10 10	1,4·1011
Rhizobium meliloti В-1730	3,8·1011	4,9·10 11
Rhizobium vigna B-0806	1,6·1011	2,7·1011
Rhizobium leguminogarum B-2616	9,6·10 10	4,2·1011

Результаты анализа химического состава биогумуса и перегноя, полученных из навоза крупного рогатого скота, представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, использование биогумуса позволяет не только обеспечить высокие показатели концентрации азотфиксирующих бактерий, но и использовать биогумус как высокоэффективный источник питательных веществ для роста растений (данные химического состава биогумуса приводятся в сравнении с составом перегноя).

Не следует забывать и о том, что использование биогумуса в качестве наполнителя для препарата, получаемого предлагаемым способом, не только обеспечивает растения полезными микроорганизмами, но и само по себе является источником питательных веществ за счет биогумуса. Следует отметить, что препараты на основе биогумуса при использовании для обработки семян бобовых практически не требуют прилипателя и позволяют равномерно распределить бактерии по поверхности семян, что в целом повышает биологическую активность предлагаемого препарата.

Таблица 3 Химическая характеристика биогумуса и перегноя (%)
Наименование	Биогумус	Перегной
Кислотность среды	6,7	7,8
Органические вещества	44,9	23,6
Гуминовые кислоты	3,4	2,3
Фульвокислоты	2,2	0,6
Органический углерод	3,31	1,7
Азот	3,22	1,54
Фосфор	0,49	0,35
C:N	1,04	1,10
Электрическая проводимость мера относительной солености почвы или количества растворимых солей	12,1	3,60

Таким образом, способ получения комбинированного бактериального удобрения для растений на основе биогумуса не только позволяет получить высокий титр азотфиксирующих микроорганизмов за счет наличия в нем питательных веществ, а также этот эффект обеспечивается одновременным культивированием двух родов микроорганизмов, которые способны стимулировать рост и развития друг друга. Кроме того, предлагаемый препарат способен активизировать бобовые растения и их семена за счет наличия питательных и ускоряющих веществ самого биогумуса, обеспечивая тем самым расширение ассортимента биопрепаратов, и наконец, частично решить проблемы утилизации отходов животноводства за счет возможности размещение малотоннажных производств непосредственно в регионах.