способы лечения ревматических заболеваний с применением растворимого ctla4

Формула изобретения

1. Способ лечения ревматического заболевания, заключающийся во введении субъекту растворимого CTLA4, молекула которого содержит внеклеточный домен и представляет собой мутантную молекулу CTLA4, которая связывает молекулу В7, показанную на Фигуре 23, содержащую мутацию в положении +104 CTLA4, где лейцин в положении +104 замещен глутаминовой кислотой, и мутацию в положении +29 CTLA4, где аланин в положении +29, как изображено на Фигуре 23, замещен на тирозин, совместно или последовательно со вторым агентом, который выбирают из группы, состоящей из кортикостероида, нестероидного противовоспалительного препарата, азатиоприна, метотрексата, блокатора или антагониста TNF , гидроксихлорокина, сульфасалазина, соли золота, анакинры, циклофосфамида и лефлуномида.

2. Способ лечения ревматического заболевания, заключающийся во введении субъекту растворимого CTLA4, молекула которого представляет собой L104EA29YIg, начиная с метионина в положении +1 или с аланина в положении -1 и кончая лизином в положении +357, как показано на Фигуре 19, совместно или последовательно со вторым агентом, который выбирают из группы, состоящей из кортикостероида, нестероидного противовоспалительного препарата, азатиоприна, метотрексата, блокатора или антагониста TNF , гидроксихлорокина, сульфасалазина, соли золота, анакинры, циклофосфамида и лефлуномида.

3. Способ по п.1 или 2, при котором ревматическое заболевание выбирают из ревматоидного артрита, полимиозита, склеродермии, смешанной соединительнотканной болезни, воспалительного ревматизма, дегенеративного ревматизма, внесуставного ревматизма, коллагеноза, хронического полиартрита, артропатического псориаза, анкилозирующего спондилоартрита, ювенильного ревматоидного артрита, нодозного полиартрита, системной красной волчанки, прогрессирующего системного склероза, плече-лопаточного периартрита, подагры, хондрокальциноза, дерматомиозита, мышечного ревматизма, миозита и миогелеза.

4. Способ по п.1 или 2, при котором симптом, ассоциированный с ревматическим заболеванием, ослабляется, и этот симптом выбирают из группы, состоящей из опухания суставов, боли, слабости, утренней тугоподвижности, структурного нарушения, повышенного уровня сывороточного С-реактивного белка, повышенного уровня растворимого уровня IL-2r, повышенного уровня растворимого ICAM-1, повышенного уровня растворимого Е-селектина и повышенной скорости оседания эритроцитов.

5. Способ по п.4, при котором структурное поражение уменьшается или предупреждается.

6. Способ по п.1 или 2, при котором субъекту вводят растворимый CTLA4 в количестве 0,5-100 мг/кг веса субъекта.

7. Способ по п.1 или 2, при котором субъекту вводят растворимый CTLA4 в количестве 0,5 мг/кг веса субъекта.

8. Способ по п.1 или 2, при котором субъекту вводят растворимый CTLA4 в количестве 2 мг/кг веса субъекта.

9. Способ по п.1 или 2, при котором субъекту вводят растворимый CTLA4 в количестве 10 мг/кг веса субъекта.

10. Способ по п.1 или 2, при котором субъекту вводят растворимый CTLA4 в количестве 0,5-10 мг/кг веса субъекта.

11. Способ по п.1 или 2, при котором субъекту вводят растворимый CTLA4 в количестве 0,1-20 мг/кг веса субъекта.

12. Способ по п.1 или 2, при котором второй агент представляет собой метотрексат.

13. Способ по п.1 или 2, при котором растворимый CTLA4 вводят внутривенной инфузией (вливанием) в дни 1, 15, 29 и 57.

14. Способ по п.1 или 2, при котором блокатор или антагонист TNF представляет собой инфликсимаб или этанерцепт.

15. Способ по п.1 или 2, при котором внеклеточный домен молекулы CTLA4 соединен с не-CTLA4 молекулой.

16. Способ по п.15, при котором не-CTLA4 молекула содержит аминокислотную последовательность, изменяющую растворимость или родство молекулы CTLA4.

17. Способ по п.16, при котором аминокислотная последовательность, изменяющая растворимость или родство, представляет собой иммуноглобулин.

18. Способ по п.17, при котором иммуноглобулин представляет собой константную область иммуноглобулина или ее часть.

19. Способ по п.18, при котором константная область иммуноглобулина или его часть мутирует с ослаблением эффекторной функции.

20. Способ по п.17, при котором область иммуноглобулина имеет одну или более мутаций, ослабляющих эффекторную функцию.

21. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, выбранного из аутоиммунных заболеваний, иммунных расстройств, связанных с отторжением пересаженных тканей (трансплантата), псориаза, Т-клеточной лимфомы, Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, тестикулярной ангиоцентрической Т-клеточной лимфомы, доброкачественного лимфоцитарного васкулита, волчаночного нефрита, тиреоидита Хашимото (Hashimoto), первичной микседемы, болезни Грейвса, злокачественной анемии, аутоиммунного атрофического гастрита, болезни Аддисона, инсулинзависимого сахарного диабета, синдрома Гудпасчера, тяжелой псевдопаралитической миастении, пузырчатки, болезни Крона, симпатической офтальмии, аутоиммунного увеита, рассеянного склероза, аутоиммунной гемолитической анемии, идиопатической тромбоцитопении, первичного билиарного цирроза, хронического активного гепатита, язвенного колита, синдрома Сегрена, васкулита, ревматического заболевания, ревматоидного артрита, полимиозита, склеродермии, смешанной соединительнотканной болезни, воспалительного ревматизма, дегенеративного ревматизма, внесуставного ревматизма, коллагенозов, хронического полиартрита, артропатического псориаза, анкилозирующего спондилоартрита, ювенильного ревматоидного артрита, нодозного полиартрита, системной красной волчанки, прогрессирующего системного склероза, плече-лопаточного периартрита, подагры, хондрокальциноза, дерматомиозита, мышечного ревматизма, миозитов и миогелеза, содержащая растворимый CTLA4, молекула которого содержит внеклеточный домен и имеет последовательность, показанную на Фиг.19, начинающуюся с метионина в положении +1 или с аланина в положении -1 и заканчивающуюся аспарагиновой кислотой в положении +124, и фармацевтически приемлемый носитель.

22. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, выбранного из аутоиммунных заболеваний, иммунных расстройств, связанных с отторжением пересаженных тканей (трансплантата), псориаза, Т-клеточной лимфомы, Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, тестикулярной ангиоцентрической Т-клеточной лимфомы, доброкачественного лимфоцитарного васкулита, волчаночного нефрита, тиреоидита Хашимото (Hashimoto), первичной микседемы, болезни Грейвса, злокачественной анемии, аутоиммунного атрофического гастрита, болезни Аддисона, инсулинзависимого сахарного диабета, синдрома Гудпасчера, тяжелой псевдопаралитической миастении, пузырчатки, болезни Крона, симпатической офтальмии, аутоиммунного увеита, рассеянного склероза, аутоиммунной гемолитической анемии, идиопатической тромбоцитопении, первичного билиарного цирроза, хронического активного гепатита, язвенного колита, синдрома Сегрена, васкулита, ревматических заболеваний, ревматоидного артрита, полимиозита, склеродермии, смешанной соединительнотканной болезни, воспалительного ревматизма, дегенеративного ревматизма, внесуставного ревматизма, коллагенозов, хронического полиартрита, артропатического псориаза, анкилозирующего спондилоартрита, ювенильного ревматоидного артрита, нодозного полиартрита, системной красной волчанки, прогрессирующего системного склероза, плече-лопаточного периартрита, подагры, хондрокальциноза, дерматомиозита, мышечного ревматизма, миозитов и миогелеза, содержащая растворимый CTLA4, молекула которого представляет собой L104EA29YIg, содержащую последовательность, показанную на Фиг.19, начинающуюся с метионина в положении +1 или с аланина в положении -1 и заканчивающуюся лизином в положении +357, и фармацевтически приемлемый носитель.

23. Фармацевтическая композиция для лечения иммунных заболеваний, ассоциированных с отторжением трансплантата, содержащая растворимый CTLA4, молекула которого содержит внеклеточный домен и имеет последовательность, показанную на Фиг.19, начинающуюся с метионина в положении +1 или с аланина в положении -1 и заканчивающуюся аспарагиновой кислотой в положении +124, и фармацевтически приемлемый носитель.

24. Фармацевтическая композиция для лечения иммунных заболеваний, ассоциированных с отторжением трансплантата, содержащая растворимый CTLA4, молекула которого представляет собой L104EA29YIg, содержащую последовательность, показанную на Фиг.19, начинающуюся с метионина в положении +1 или с аланина в положении -1 и заканчивающуюся лизином в положении +357, и фармацевтически приемлемый носитель.

25. Фармацевтическая композиция по п.22 или 24, содержащая растворимый CTLA4, молекула которого кодируется последовательностью ДНК, депонированной под номером АТСС РТА-2104.

26. Фармацевтическая композиция по п.22 или 24, отличающаяся тем, что внеклеточный домен молекулы CTLA4 соединен с не-CTLA4 молекулой.

27. Фармацевтическая композиция по п.26, отличающаяся тем, что не-CTLA4 молекула содержит аминокислотную последовательность, изменяющую растворимость или родство молекулы CTLA4.

28. Фармацевтическая композиция по п.27, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность, изменяющая растворимость или родство, представляет собой иммуноглобулин.

29. Фармацевтическая композиция по п.28, отличающаяся тем, что иммуноглобулин представляет собой константную область иммуноглобулина или ее часть.

30. Фармацевтическая композиция по п.29, отличающаяся тем, что константная область иммуноглобулина или ее часть мутирует с ослаблением эффекторной функции.

31. Фармацевтическая композиция по п.28, отличающаяся тем, что область иммуноглобулина имеет одну или более мутаций, ослабляющих эффекторную функцию.

Описание изобретения к патенту

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в целом к области ревматических заболеваний. В частности, изобретение относится к методам терапии ревматических заболеваний и композициям, предназначенным для лечения ревматических заболеваний, таких как ревматоидный артрит, путем введения субъекту эффективного количества растворимого мутантного CTLA4.

Предпосылки создания изобретения

В настоящее время не существует методов лечения ревматических заболеваний. Терапевтические агенты применяются скорее для лечения симптомов. Как правило, терапевтические агенты принимают в течение длительного времени, и терапевтическое значение часто снижается из-за побочных эффектов.

Ревматические заболевания охватывают группу заболеваний, которые поражают скелетно-мышечные и соединительные ткани организма. Эти заболевания характеризуются хроническим воспалением, которое часто ведет к длительному поражению, деформации, атрофии тканей и к потери ими трудоспособности. Ревматические заболевания поражают связки, костные ткани, мягкие ткани или спинной мозг (Mathies, H. 1983, Rheuma) и делятся на ревматический артрит, дегенеративный ревматизм, суставной ревматизм или коллагеноз. Известно, что некоторые ревматические заболевания представляют собой аутоиммунные заболевания, вызываемые изменением иммунной реакции субъекта.

Ревматоидный артрит является прогрессирующим ревматическим заболеванием, поражающим 2% взрослого населения развитых стран (Utsinger, P.D., et al., 1985, Rheumatoid Arthritis, p.140). Это заболевание характеризуется стойким синовитом, который вызывает разрушение хряща и эрозию костей, ведущие к структурной деформации периферических суставов. Симптомы, обусловленные ревматоидным артритом, включают набухание суставов, хрупкость суставов, воспаление, утреннюю тугоподвижность суставов и боль, в особенности, при сгибании. Больные в стадии прогрессирующего артрита страдают структурными поражениями, включая разрушение суставов с эрозией костей (в "Principals of Internal Medicine", Harrison, 13^th edition, pages 1648-1655). Кроме того, больные могут иметь другие клинические симптомы различных органических патологических изменений, включая патологические изменения кожи, почек, сердца, легких, центральной нервной системы и глаз вследствие васкулита, вызванного аутоиммунным процессом.

Другие симптомы, которые коррелируют с ревматоидным артритом, включают повышенную скорость оседания эритроцитов и повышенные уровни сывороточного С-реактивного белка (CRP) и/или растворимого рецептора IL-2 (IL-2r). Скорость оседания эритроцитов повышена почти у всех больных активным ревматоидным артритом. Уровень сывороточного С-реактивного белка также повышен и коррелирует с активностью заболевания и вероятностью прогрессирующего поражения суставов. Кроме того, в сыворотке крови и синовиальной жидкости больных активным ревматоидным артритом повышается уровень растворимого IL-2r, продукта активированных Т-клеток (см. "Principals of Internal Medicine", Harrison, 13^th edition, pages 1650).

Полагают, что ревматоидный артрит является аутоиммунным заболеванием, опосредуемым Т-клетками, включая межмолекулярные взаимодействия между Т-лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками. Как правило, величина Т-клеточного ответа определяется костимулирующим ответом, выявляемым с помощью взаимодействия между молекулами Т-клеточной поверхности и их лигандами (Mueller, et al., 1989, Ann. Rev. Immunol. 7:445-480). Ключевые костимулирующие сигналы вызываются взаимодействием между рецепторами Т-клеточной поверхности, CD28 и CTLA4, и их лигандами, такими как молекулы, родственные В7, CD80 (т.е. В7-1) и CD86 (т.е. В7-2), на антигенпрезентирующих клетках (Linsley, P. and Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11:191-212). Активация Т-клеток в отсутствие костимуляции вызывает анергический Т-клеточный ответ (Schwartz, R.H., 1992, Cell, 71:1065-1068), при этом иммунная система становится толерантной к стимуляции.

Так как полагают, что ревматоидный артрит является опосредуемым Т-клетками заболеванием иммунной системы, единственной стратегией создания новых агентов для терапии ревматоидного артрита является идентификация молекул, которые блокируют костимулирующие сигналы между Т-лимфоцитами и антиген презентирующими клетками, блокируя взаимодействие между эндогенным CD28 или CTLA4 и В7. Потенциальные молекулы включают молекулы растворимого CTLA4, которые модифицированы так, чтобы связываться с В7 с более высокой авидностью, чем CTLA4 дикого типа (последовательность которого показана на Фигуре 23), или CD28, тем самым блокируя костимулирующие сигналы.

Растворимые формы CD28 и CTLA4 созданы путем слияния вариабельных (V) внеклеточных областей CD28 и CTLA4 с константными областями иммуноглобулина (Ig), при этом образуются CD28Ig и CTLA4Ig. Нуклеотидная аминокислотная последовательность CTLA4Ig показана на Фигуре 24, причем белок начинается с метионина в положении +1 или аланина в положении -1 и оканчивается лизином в положении +357. CTLA4Ig связывается с CD80-позитивными и CD86-позитивными клетками более прочно, чем CD28Ig (Linsley, P., et al., 1994, Immunity 1:793-800). Найдено, что многие Т-клеточные иммунные реакции блокируются CTLA4Ig как in vitro, так и in vivo. (Linsley, P., et al., 1991b, см. выше; Linsley, P., et al., 1992a, Science 257:792-795; Linsley, P., et al., 1992b, J. Exp. Med. 176:1595-1604; Lenschow, D.J., et al. 1992, Science 257:789-792; Tan, P., et al., 1992, J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L.A., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105).

С целью изменения аффинности связывания с природными лигандами, такими как В7, слитые молекулы растворимого CTLA4Ig модифицируют с помощью мутации аминокислот на участке CTLA4 молекулы. Области CTLA4, которые, мутируя, изменяют аффинность или авидность связывания с лигандами В7, включают гипервариабельный участок 1 (CDR-1, как описано в патентах США 6090914; 5773253; 5844095; в одновременно рассматриваемой патентной заявке США 60/214065; и в Peach et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2049-2058) и участки, подобные гипервариабельному участку 3 (CDR-3) (CDR-3 представляет собой консервативный участок внеклеточной области CTLA4, как описано в патентах США 6090914; 5773253; 5844095; в одновременно рассматриваемой патентной заявке США 60/214065; и в Peach et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2049-2058. CDR-3-подобный участок охватывает участок CDR-3 и продолжается, включая несколько аминокислот, в 3'-5' направлении и/или в 5'-3' направлении от мотива CDR-3). CDR-3- подобный участок включает гексапептидный мотив MYPPPY, являющийся высококонсервативным у всех представителей семейства CD28 и CTLA4. Мутагенез со сканированием аланина с помощью гексапептидного мотива в CTLA4 и в избранных остатках в CD28Ig уменьшает или сводит на нет связывание с CD80 (Peach, R.J., et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2049-2058).

Молекулы растворимого CTLA4Ig дополнительно модифицируют с помощью чередования гомологичных участков CTLA4 и CD28. Эти химерные CTLA4/CD28 гомологичные мутантные молекулы идентифицировали гексапептидный мотив MYPPPY, общий для CTLA4 и CD28, так же как некоторые неконсервативные аминокислотные остатки CDR-1- и CDR-3-подобных участков CTLA4, как участки, ответственные за увеличение авидности связывания CTLA4 с CD28 (Peach, R.J., et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2049-2058).

Молекулы растворимого CTLA4, так же как CTLA4Ig, молекулы мутантного CTLA4, или химерные CTLA4/CD28 гомологичные мутантные молекулы, описанные выше, вводят новую группу терапевтических лекарственных препаратов для лечения ревматических заболеваний.

Современная терапия ревматических заболеваний, таких как ревматоидный артрит, включает применение неспецифических цитотоксических иммунодепрессантов, таких как метотрексат, циклофосфамид, азатиоприн, циклоспорин А и блокаторы или антагонисты фактора альфа некроза опухолевых клеток (TNF ). Эти иммунодепрессанты подавляют общую иммунную систему субъекта, и продолжительное их применение повышает риск инфицирования. Кроме того, эти лекарственные препараты лишь замедляют развитие ревматоидного артрита, которое возобновляется с повышенной скоростью после прекращения лечения. Далее, продолжительное лечение этими неспецифическими препаратами вызывает вредные побочные эффекты, включая тенденцию к злокачественному развитию, почечной недостаточности, ослаблению костного мозга, пневмосклерозу, злокачественности, диабету и нарушению функции печени. Эти лекарственные препараты также постепенно теряют эффективность после 2-5 лет применения (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6^th Edition, pages 1001-1022).

Или же терапевтические агенты, которые являются неспецифическими иммунодепрессантами и противовоспалительными лекарственными средствами, применяли для ослабления симптомов. Эти лекарственные препараты зависят от дозы и не предотвращают развитие болезни. Эти препараты включают стероидные соединения, такие как преднизон и метилпреднизолон. Стероидные соединения также вызывают значительные побочные эффекты, связанные с длительностью их применения (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6^th Edition, pages 829-833).

Таким образом, современные методы лечения ревматоидного артрита имеют ограниченную эффективность, дают значительные побочные эффекты и не могут применяться непрерывно в течение длительного времени.

Следовательно, существует необходимость в эффективных и более мощных терапевтических средствах, лишенных недостатков обычных методов и агентов и нацеленных на патофизиологический механизм аутоиммунитета, для лечения ревматических заболеваний, таких как ревматоидный артрит.

Сущность изобретения

Данное изобретение включает композиции и способы лечения ревматических заболеваний путем введения субъекту молекул растворимого CTLA4, которые связываются с молекулами В7 на поверхности В7-позитивных клеток, тем самым ингибируя связывание эндогенных В7 молекул с CTLA4 и/или CD28 на поверхности Т-клеток. Молекулы растворимого CTLA4, используемого в способах и композициях по изобретению, включают:

а) молекулу CTLA4, которая содержит внеклеточный домен и имеет мутацию в положении +104 CTLA4, где лейцин в положении +104 замещен глутаминовой кислотой, и мутацию в положении +29 CTLA4, где аланин в положении +29 замещен на тирозин;

б) молекулу, которая представляет собой L104EA29YIg, начиная с метионина в положении +1 или с аланина в положении -1 и кончая лизином в положении +357, растворимый CTLA4 применяют совместно или последовательно со вторым агентом, который выбирают из группы, состоящей из кортикостероида, нестероидного противовоспалительного препарата, азатиоприна, метотрексата, блокатора или антагониста TNF , гидроксихлорокина, сульфасалазина, соли золота, анакинры, циклофосфамида и лефлуномида.

Ревматическое заболевание выбирают из ревматоидного артрита, полимиозита, склеродермии, смешанной соединительнотканной болезни, воспалительного ревматизма, дегенеративного ревматизма, внесуставного ревматизма, коллагеноза, хронического полиартрита, артропатического псориаза, анкилозирующего спондилоартрита, ювенильного ревматоидного артрита, нодозного полиартрита, системной красной волчанки, прогрессирующего системного склероза, плечелопаточного периартрита, подагры, хондрокальциноза, дерматомиозита, мышечного ревматизма, миозита и миогелеза.

При применении способов и фармацевтических композиций в соответствии с изобретением симптом, ассоциированный с ревматическим заболеванием, ослабляется, при этом симптом выбирают из группы, состоящей из опухания суставов, боли, слабости, утренней тугоподвижности, структурного нарушения, повышенного уровня сывороточного С-реактивного белка, повышенного уровня растворимого уровня IL-2r, повышенного уровня растворимого ICAM-1, повышенного уровня растворимого Е-селектина и повышенной скорости оседания эритроцитов.

Структурное поражение при использовании изобретения уменьшается или предупреждается.

Субъекту вводят растворимый CTLA4 в количестве 0,5-100 мг/кг веса субъекта, предпочтительно 0,5-10 мг/кг веса.

Предпочтительным является, когда второй агент представляет собой метотрексат.

Растворимый CTLA4 вводят внутривенной инфузией (вливанием) в дни 1, 15, 29 и 57.

Краткое описание фигур

Фигура 1А: Демографические данные контингента больных. Демографические данные, включающие пол, расу и длительность заболевания, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 1В: Демографические данные контингента больных. Демографические данные, включающие пол, возраст и интенсивность заболевания по оценке пациента и врача, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 1С: Демографические данные контингента больных, описанного ниже, в Примере 3. Демографические данные, включающие интенсивность заболевания, скорость оседания эритроцитов (ESR, СОЭ), физическую функцию (потеря трудоспособности, оцениваемая с помощью анкеты) и С-реактивный белок (CRP, ЦРБ).

Фигура 1D: Демографические данные контингента больных, описанного ниже, в Примере 3. Демографические данные, включающие опухание суставов, болезненность суставов, утреннюю тугоподвижность и боль.

Фигура 1Е: Демографические данные контингента больных, описанного ниже, в Примере 3. Демографические данные, включающие предыдущее лечение.

Фигура 2: Краткие сведения о случаях прекращения (лечения) на 85 день по причине, описанной ниже, в Примере 3.

Фигура 3А: Реакции ACR на 85 день, описанные ниже, в Примере 3: Реакции ACR-20, -50 и -70.

Фигура 3В: Реакции ACR-20 на 85 день, включая реакцию на плацебо, как описано ниже, в Примере 3: реакция ACR-20 с 95%-ным доверительным пределом.

Фигура 3С: Реакции ACR-20 на 85 день, как описано ниже, в Примере 3: расхождение реакций ACR-20 с 95%-ными доверительными интервалами.

Фигура 4А: Подсчет основных (20% улучшение) клинических реакций в опухшем и болезненном суставе в процентах пациентов на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: основная клиническая реакция, ACR-20.

Фигура 4В: Подсчет основных (20% улучшение) клинических реакций опухшего и болезненного сустава в процентах пациентов на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: изменение клинической реакции, улучшение в процентах.

Фигура 5А: Болезненная реакция (по шкале Ликерта (Likert), среднее отклонение от базовой линии) в процентах пациентов на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: величина изменения болевых ощущений по сравнению с базовой линией-фоном.

Фигура 5В: Изменение течения болезни в целом по оценке пациента (среднее отклонение от фона по шкале Ликерта) в процентах пациентов на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: общие изменения интенсивности заболевания у больного.

Фигура 5С: Изменение течения болезни в целом по оценке врача общие изменения интенсивности заболевания по оценке врача.

Фигура 5D: Боль (среднее отклонение от фона по шкале Ликерта) в процентах пациентов на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: изменение боли по сравнению с фоном (базовой линией).

Фигура 6А: Общая оценка больным изменения интенсивности заболевания по сравнению с фоном по 2-балльной системе на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: улучшение в ходе болезни.

Фигура 7А: Снижение уровней С-реактивного белка (CRP, ЦРБ) в процентах на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: уменьшение уровней ЦРБ по сравнению с фоном.

Фигура 7В: Расхождение величин уменьшения уровней С-реактивного белка (ЦРБ) на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: уменьшение расхождения уровней ЦРБ в процентах с 95%-ными доверительными интервалами.

Фигура 7С: Среднее понижение уровней С-реактивного белка (ЦРБ) на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3: среднее изменение по сравнению с фоном (базовой линией).

Фигура 8: Понижение уровней растворимого рецептора IL-2, среднее изменение по сравнению с базовой линией на 85-ый день, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 9А: Действие CTLA4Ig на болезненные суставы во времени, как описано ниже, в Примере 3: среднее отклонение (медиана) от базовой линии.

Фигура 9В: Действие CTLA4Ig на болезненные суставы во времени, как описано ниже, в Примере 3: среднее отклонение от базовой линии.

Фигура 10А: Действие CTLA4Ig на опухшие суставы во времени, как описано ниже, в Примере 3: среднее отклонение (медиана) от базовой линии.

Фигура 10В: Действие CTLA4Ig на опухшие суставы во времени, как описано ниже, в Примере 3: среднее отклонение от базовой линии.

Фигура 11: Влияние CTLA4Ig на среднее изменение во времени оценки боли по сравнению с базовой линией, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 12А: Влияние CTLA4Ig на оценку пациентом среднего изменения во времени интенсивности заболевания, по сравнению с базовой линией, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 12В: Влияние CTLA4Ig на оценку врачом среднего изменения во времени интенсивности заболевания, по сравнению с базовой линией, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 13А: Действие L104EA29YIg на болезненные суставы во времени, как описано ниже, в Примере 3: среднее отклонение (медиана) от базовой линии.

Фигура 13В: Действие L104EA29YIg на болезненные суставы во времени, как описано ниже, в Примере 3: среднее отклонение от базовой линии.

Фигура 14А: Действие L104EA29YIg на опухшие суставы во времени, как описано ниже, в Примере 3: среднее отклонение (медиана) от базовой линии.

Фигура 14В: Действие L104EA29YIg на опухшие суставы во времени, как описано ниже, в Примере 3: среднее отклонение от базовой линии.

Фигура 15: Влияние L104EA29YIg на среднее изменение во времени оценки боли по сравнению с базовой линией, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 16А: Влияние L104EA29YIg на оценку пациентом среднего изменения интенсивности заболевания во времени, по сравнению с базовой линией, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 16В: Влияние L104EA29YIg на оценку врачом среднего изменения интенсивности заболевания во времени, по сравнению с базовой линией, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 17: Улучшение в процентах состояния больного с нарушением трудоспособности по сравнению с базовой линией, по оценке Анкеты состояния здоровья (HAQ) на 85 день при лечении CTLA4Ig и L104EA29YIg, как описано ниже, в Примере 3.

Фигура 18: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность L104EIg, описанного ниже, в Примере 1.

Фигура 19: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность L104EA29YIg, описанного ниже, в Примере 1.

Фигура 20: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность L104EA29LIg, описанного ниже, в Примере 1.

Фигура 21: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность L104EA29TIg, описанного ниже, в Примере 1.

Фигура 22: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность L104EA29WIg, описанного ниже, в Примере 1.

Фигура 23: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность рецептора CTLA4.

Фигура 24: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность CTLA4Ig.

Фигура 25: CTLA4Ig (дорожка 1), L104EIg (дорожка 2) и L104EA29YIg (дорожка 3) на SDS геле (Фиг.25А); и хроматограммы CTLA4Ig (Фиг.25В) и L104EA29YIg (хроматография по размеру молекул).

Фигуры 26 (левый и правый рисунки): Ленточная диаграмма внеклеточной IgV-складки CTLA4, построенная при разрешении структуры, определенной методом ЯМР-спектроскопии.

На Фиг.26 (правый рисунок) дан (в увеличенном масштабе) вид участка CDR-1 (S25-R33) и участка MYPPPY, показывающий расположение и ориентацию боковой цепи мутаций, повышающих авидность, L104 и А29.

Фигуры 27А и 27В: анализы методом FACS, показывающие связывание L104EA29YIg, L104EIg и CTLA4Ig с человеческими CD80-или CD86-трансфецированными СНО-клетками, как описано ниже, в Примере 2.

Фигуры 28А и 28В: Диаграммы, показывающие ингибирование пролиферации CD80-позитивных и СD86-позитивных СНО-клеток, как описано ниже, в Примере 2.

Фигуры 29А и 29В: Диаграмма, показывающая, что L104EA29YIg более эффективно ингибирует пролиферацию первичных и вторичных аллостимулированных Т-клеток, чем CTLA4Ig, как описано ниже, в Примере 2.

Фигуры 30А-С: Диаграммы, иллюстрирующие, что L104EA29YIg более эффективно, чем CTLA4Ig, ингибирует продуцирование цитокинов - IL-2 (Фиг.30А), IL-4 (Фиг.30В) и гамма ( )-интерферона (Фиг.30С) - аллостимулированных человеческих Т-клеток, как описано ниже, в Примере 2.

Фигура 31: Диаграмма, показывающая, что L104EA29YIg более эффективно ингибирует пролиферацию фитогемагглютинин (РНА)-стимулированных Т-клеток, чем CTLA4Ig, как описано ниже, в Примере 2.

Фигура 32: Диаграмма, иллюстрирующая анализ равновесного связывания L104EA29YIg, L104EIg и CTLA4Ig дикого типа с CD86Ig.

Фигуры 33А и В: Уменьшение среднего изменения уровней растворимого ICAM-1 и растворимого Е-селектина по сравнению с базовой линией на 85 день, как описано ниже, в Примере 3.

Подробное описание изобретения

Определения

Все научные и технические термины, применяемые в данной заявке, имеют значение, обычно используемое в технике, если не указано иначе. Следующие слова и выражения, применяемые в данной заявке, имеют нижеуказанные значения.

Применяемый в данном описании термин "лиганд" относится к молекуле, которая специфически распознает другую молекулу и связывается с ней, например лигандом для CTLA4 является молекула В7.

Применяемый в данном описании "CTLA4 дикого типа", или "немутированный (немутантный) CTLA4" имеет природную аминокислотную последовательность, полноразмерный CTLA4, показанную на Фигуре 23 (а также описанную в патентах США 5434131, 5844095, 5851795), или ее любой фрагмент или производное, которые распознают В7 и связываются с ним, или влияют на В7 так, что блокируется связывание с CD28 и/или CTLA4 (например, эндогенный CD28 и/или CTLA4). В конкретных вариантах изобретения внеклеточная область CTLA4 дикого типа начинается с метионина в положении +1 и заканчивается аспарагиновой кислотой в положении +124, или внеклеточная область CTLA4 дикого типа начинается с аланина в положении -1 и заканчивается аспарагиновой кислотой в положении +124. CTLA4 дикого типа представляет собой белок клеточной поверхности, содержащий N-концевой внеклеточный домен, трансмембранный домен и С-концевой цитоплазматический домен. Внеклеточный домен связывается с молекулами-мишенями, такими как молекула В7. В клетке природный белок, CTLA4 дикого типа, транслируется в виде незрелого полипептида, который включает сигнальный пептид на N-концевом участке. Незрелый полипептид претерпевает посттрансляционное процессирование, которое включает отщепление и удаление сигнального пептида с образованием продукта расщепления CTLA4, имеющего вновь образованный N-концевой участок, который отличается от N-концевого участка незрелой формы. Специалист в данной области техники поймет, что может происходить дополнительное пост-трансляционное процессирование, при котором удаляется одна или более аминокислот из вновь образованного N-концевого участка продукта расщепления CTLA4. Или же сигнальный пептид может удаляться не полностью, при этом образуются молекулы, которые начинаются до обычной стартовой аминокислоты - метионина. Так, молекула зрелого белка CTLA4 включает внеклеточный домен или любой его участок, который связывается с В7.

Применяемое в данном описании выражение "молекула мутантного CTLA4", "мутантная молекула CTLA4" обозначает CTLA4 дикого типа, как показано на Фигуре 23, или любой ее участок или производное, которое содержит мутацию или ряд мутаций (предпочтительно, во внеклеточном домене CTLA4 дикого типа). Молекула мутантного CTLA4 имеет последовательность, аналогичную, но не идентичную, последовательности молекулы CTLA4 дикого типа, но все еще связывающуюся с В7. Мутации могут включать один или более аминокислотных остатков, замещенных аминокислотой, имеющей консервативную (например, замена лейцина на изолейцин) или неконсервативную (например, замена глицина на триптофан) структуру или химические свойства, аминокислотные делеции, добавления, сдвиги рамки считывания или усечения. Молекулы мутантного CTLA4 могут содержать в себе молекулу не-CTLA4 или могут быть с ней связаны. Мутантные молекулы могут быть растворимыми (т.е. циркулирующими) или связанными с клеточной поверхностью. Дополнительные молекулы мутантного CTLA4 включают такие молекулы, которые описаны в патентных заявках США №№09/865321; 60/214065 и 60/287576; и в патентах США 6090914; 5844095 и 5773253; и Peach, R.J., et al., в J. Exp. Med., 180:2049-2058 (1994). Молекулы мутантного CTLA4 можно получать синтетическим путем или методом рекомбинантной ДНК.

"CTLA4Ig" представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный домен CTLA4 дикого типа, соединенный с Ig-хвостом, или его частью, которая связывается с В7. Конкретный вариант изобретения содержит внеклеточный домен CTLA4 дикого типа (как показано на Фигуре 23), начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; или начиная с аланина в положении -1 и заканчивая аспарагиновой кислотой в положении +124; участок соединения - глутаминовый аминокислотный остаток в положении +125; и иммуноглобулиновый участок, охватывающий область от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 включительно (ДНК, кодирующая CTLA4Ig, депонирована 31 мая 1991 года в Американской коллекции типовых культур (культур клеток (АТСС), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, согласно условиям Будапештского соглашения, и ей присвоен номер АТСС 68629; Linsley, P., et al, 1994, Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, клеточная линия яичников китайского хомячка (СНО), экспрессирующая CTLA4Ig, депонирована 31 мая 1991 года, идентификационный номер в АТСС CRL-10762). Молекулы растворимого CTLA4Ig, применяемого в способах и/или наборах по изобретению, могут включать или могут не включать сигнальную (лидерную) пептидную последовательность. Как правило, в способах и/или наборах по изобретению молекулы не включают сигнальную пептидную последовательность.

"L104EA29YIg" обозначает слитый белок, который представляет собой растворимый мутантный CTLA4, молекула которого содержит внеклеточный домен CTLA4 дикого типа с аминокислотными заменами A29Y (аминокислотная замена остатка аланина на остаток тирозина в положении +124) и L104E (замена остатка лейцина на остаток глутаминовой кислоты в положении +104) или часть его, которая связывается с молекулой В7, соединенная с Ig-хвостом (включенная в Фигуру 19; ДНК, кодирующая L104EA29YIg, депонирована 20 июня 2000 года с номером АТСС РТА-2104; одновременно рассматривается в патентных заявках США 09/579927; 60/287576 и 60/214065, вводимых в данное описание в качестве ссылки). Молекулы растворимого L104EA29YIg, в способах и/или наборах по изобретению, могут включать или могут не включать сигнальную (лидерную) пептидную последовательность. Как правило, в способах и/или наборах по изобретению молекулы не включают сигнальную пептидную последовательность.

Применяемый в данном описании термин "растворимый" относится к любой молекуле, или к ее фрагментам, или к ее производным, не связанным с клеткой или не присоединенным к клетке, т.е. циркулирующим. Например, CTLA4, В7 или CD28 можно сделать растворимыми, присоединяя иммуноглобулиновый (Ig) фрагмент к внеклеточному домену CTLA4, В7 или CD28, соответственно. Или же такое соединение, как CTLA4, можно сделать растворимым, удаляя из его молекулы трансмембранный домен. Как правило, растворимые молекулы в способах по изобретению не включают сигнальную (или лидерную) последовательность.

Применяемое в данном описании выражение "молекулы растворимого CTLA4" обозначает не связанные с клеточной поверхностью (т.е. циркулирующие)молекулы CTLA4 или любой функциональный участок молекулы CTLA4, который связывается с В7, включая, но без ограничения: слитые белки CTLA4Ig (например, АТСС 68629), в которых внеклеточный домен CTLA4 слит с фрагментом иммуноглобулина (Ig), что делает слитую молекулу растворимой, или их фрагменты или производные; белки с внеклеточным доменом CTLA4, слитые или связанные с участком биологически активного или химически активного белка, такие как Е-7 генный продукт вируса папилломы (CTLA4-E7), ассоциированный с меланомой антиген р97 (CTLA4-p97), или белок ВИЧ env (CTLA4-env gp120), или их фрагменты или производные; гибридные (химерные) слитые белки, такие как CD28/CTLA4Ig, или их фрагменты или производные; молекулы CTLA4, у которых удален трансмембранный домен, чтобы сделать белок растворимым (Oaks, M.K., et а1., 2000, Cellular Immunology, 201:144-153), или их фрагменты или производные. "Молекулы растворимого CTLA4" также включают их фрагменты, участки или производные и молекулы растворимого мутантного CTLA4, обладающие СТLА4-связывающей активностью. Молекулы растворимого CTLA4, применяемые в способах по изобретению, могут включать или могут не включать сигнальную (лидерную) пептидную последовательность. Как правило, молекулы в способах по изобретению не включают сигнальную (или лидерную) последовательность.

Применяемое в данном описании выражение "внеклеточный домен CTLA4" обозначает участок CTLA4, который распознает лиганды CTLA4, такие как молекулы В7, и связывается с ними. Например, внеклеточный домен CTLA4 содержит область от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты +124 (Фигура 23). Или же внеклеточный домен CTLA4 содержит область от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (Фигура 23). Внеклеточный домен включает фрагменты или производные CTLA4, которые связываются с молекулой В7. Внеклеточный домен CTLA4, как показано на Фигуре 23, может также включать мутации, которые изменяют авидность связывания молекулы CTLA4 с молекулой В7.

Применяемый в данном описании термин "мутация" обозначает изменение в нуклеотидной или аминокислотной последовательности в молекуле дикого типа, например изменение в ДНК и/или аминокислотных последовательностях внеклеточного домена CTLA4 дикого типа. Мутация в ДНК может изменять кодон, приводящий к изменению аминокислотной последовательности. Изменение ДНК может включать замены, делеции, инсерции, альтернативный сплайсинг или усечения. Аминокислотное изменение может включать замены, делеции, инсерции, добавления, усечения или ошибки при процессинге (процессировании) или расщеплении белка. Или же мутации в нуклеотидной последовательности могут приводить к молчащей мутации в аминокислотной последовательности, что достаточно понятно из уровня техники. Следует обратить внимание, что определенные нуклеотидные кодоны кодируют одну и ту же аминокислоту.

Примеры включают нуклеотидные кодоны CGU, CGG, CGC и CGA, кодирующие аминокислоту аргинин (R); или кодоны GAU и GAC, кодирующие аминокислоту-аспарагиновую кислоту (D). Следовательно, белок может кодироваться молекулой одной или более аминокислот, которые отличаются своей специфической нуклеотидной последовательностью, но кодируют белковые молекулы, имеющие идентичные последовательности. Последовательности, кодирующие аминокислоты, суть следующие:

Мутантная молекула может содержать одну или более мутаций.

Применяемые в данном описании выражения "не-CTLA4 белковая последовательность" или "не-CTLA4 молекула" обозначают любую белковую молекулу, которая не связывается с В7 и не препятствует связыванию CTLA4 с этой мишенью. Пример включает, но без ограничения, константную область иммуноглобулина (Ig) или ее фрагмент. Предпочтительно, константная область иммуноглобулина представляет собой константную область Ig человека или обезьяны, например С(гамма)1, включая шарнирную, СН2 и СН3 области человеческого Ig. Константная область Ig может мутировать с ослаблением своих эффекторных функций (Патенты США 5637481; 5844095 и 5434131).

Применяемые в данном описании термины "фрагмент" или "участок" обозначают любую часть или сегмент молекулы CTLA4, предпочтительно, внеклеточный домен CTLA4 или его часть или сегмент, который распознает свою мишень, например, молекулу В7, и связывается с ней.

Применяемое в данном описании обозначение "В7" относится к семейству молекул В7, включая, но без ограничения, В7-1 (CD-80), B7-2 (CD-86) и В7-3, которые могут распознавать CTLA4 и/или CD28 и связываться с ними.

Применяемое в данном описании выражение "В7-позитивные клетки" обозначает любые клетки, экспрессирующие на клеточной поверхности молекулы В7 одного или более типов.

Применяемый в данном описании термин "производное" обозначает молекулу, которая имеет общую с молекулой-предшественником гомологию последовательности и активность. Например, производное CTLA4 включает молекулу растворимого CTLA4, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 70% сходную с внеклеточным доменом CTLA4 дикого типа, которая распознает В7 и связывается с ним, например CTLA4Ig или L104EA29YIg, молекула мутантного CTLA4.

Применяемый в данном описании термин "блокировать" или "ингибировать" рецептор, сигнал или молекулу обозначает препятствовать активации рецептора, сигнала или молекулы, что обнаруживается с помощью общепризнанного в технике теста. Например, блокаду опосредуемого клетками иммунного ответа можно обнаружить, определяя ослабление симптомов, связанных с ревматическим заболеванием. Блокада (или ингибирование) может быть частичной или общей (тотальной).

Употребляемое в данном описании выражение "блокировать взаимодействие с В7" означает препятствовать связыванию В7 с его лигандами, такими как CD28 и/или CTLA4, тем самым мешать взаимодействию Т-клеток и В-позитивных клеток. Примеры агентов, которые блокируют В7-взаимодействия, включают, но без ограничения, молекулы, такие как антитело (или его фрагмент или производное), которое распознает любые из молекул CTLA4, CD28 и/или В7 (например, В7-1, B7-2); молекулы растворимой формы (или их часть или производное), например растворимого CTLA4; пептидный фрагмент или другую малую молекулу, предназначенную для того, чтобы препятствовать клеточному сигналу с помощью взаимодействия, опосредуемого CTLA4/CD28/B7. В предпочтительном варианте изобретения блокирующим агентом является молекула растворимого CTLA4, например CTLA4Ig (ATCC 68629) или L104EA29YIg (ATCC PTA-2104), молекула растворимого CD28, например CD28Ig (ATCC 68628), молекула растворимого В7, например B7Ig (ATCC 68627), моноклональное антитело против В7 (например, НВ-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 и моноклональные антитела, описанные Anderson et al. в патенте США 6113898 или Yokochi et al., 1982. J. Immun., 128(2)823-827), моноклональное антитело против CTLA4 (например, ATCC HB-304 и моноклональные антитела, описанные в ссылках 82-83) и/или моноклональное антитело против CD28 (например, ATCC ИВ-11944 и моноклональное антитело, mAb 9.3, описанное Hansen (Hansen et al., 1980. Immunogenetics 10: 247-260) или Martin (Martin et al., 1984. J. Clin. Immun., 4(1): 18-22)).

Употребляемое в данном описании выражение "заболевание иммунной системы" обозначает любое заболевание, опосредуемое взаимодействием Т-клеток с В7-позитивными клетками, включая, но без ограничения, аутоиммунные заболевания, нарушения, связанные с трансплантацией, и иммунопролиферативные заболевания. Примеры заболеваний иммунной системы включают гомологическую болезнь (GVHD) (например, в результате пересадки костного мозга или при индукции толерантности), иммунные нарушения, вызванные отторжением трансплантата, хроническим отторжением и алло- и ксенотрансплантатов, включая плотные ткани (органы), кожу, островки, мышцы, гепатоциты, нейроны. Примеры иммунопролиферативных заболеваний включают, но без ограничения, псориаз, Т-клеточную лимфому, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, тестикулярную ангиоцентрическую Т-клеточную лимфому, доброкачественный лимфоцитарный васкулит, волчанку (например, красную волчанку, волчаночный нефрит), тиреоидит Хашимото (Hashimoto), первичную микседему, болезнь Грейвса (базедову болезнь), злокачественную анемию, аутоиммунный атрофический гастрит, болезнь Аддисона, диабет (например, инсулинзависимый сахарный диабет, сахарный диабет типа I, сахарный диабет типа II), синдром Гудпасчера, тяжелую псевдопаралитическую миастению, пузырчатку, болезнь Крона, симпатическую офтальмию, аутоиммунный увеит, рассеянный склероз, аутоиммунную гемолитическую анемию, идиопатическую тромбоцитопению, первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, язвенный колит, синдром Сегрена, ревматические заболевания (например, ревматоидный артрит), полимиозит, склеродерму и смешанную соединительнотканную болезнь.

Употребляемый в данном описании термин "ревматические заболевания" обозначает любое заболевание, которое действует на суставы, кости, мягкие ткани или спинной мозг (Mathies, H. 1983, Rheuma), и включает острый суставной ревматизм (ревматическую атаку), дегенеративный ревматизм, внесуставной ревматизм и коллагенозы. Помимо этого, ревматические заболевания включают, но без ограничения, хронический полиартрит, суставной псориаз, анкилозирующий спондилоартрит, ревматоидный артрит, нодозный полиартрит, системную красную волчанку, прогрессирующий системный склероз, плече-лопаточный периартрит, подагру, хондрокальциноз, дерматомиозит, фиброзит, миозиты и миогелез. Известно, что некоторые ревматические заболевания представляют собой аутоиммунные заболевания, вызываемые изменившейся иммунной реакцией субъекта.

Употребляемый в данном описании термин "генная терапия" обозначает процесс (способ) лечения заболевания с помощью такой генетической обработки, при которой нуклеотидная последовательность переносится в клетку, затем клетка экспрессирует какой-либо генетический продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой. Например, как хорошо известно специалистам в данной области техники, перенос нуклеиновой кислоты можно осуществлять с помощью инсерции вектора экспрессии, содержащего интересующую нуклеиновую кислоту, в клетку ex vivo или in vitro различными методами, включая, например, осаждение фосфатом кальция, диэтиламиноэтилдекстраном, полиэтиленгликолем (ПЭГ, PEG), электропорацию, непосредственную инъекцию, липофекцию или вирусную инфекцию (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Kriegler M. Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W.H.Freeman and Co, New York, N.Y., 1993) и Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993). Или же представляющую интерес нуклеотидную последовательность можно переносить в клетку in vivo при участии ряда векторов и различными методами, включая, например, непосредственное введение нуклеиновой кислоты субъекту (Williams et al., 1991, PNAS, 88:2726-2730) или инсерцию нуклеиновой кислоты в вирусный вектор и инфицирование субъекта вирусом (Battleman et al., 1993, J. Neurosci, 13:94-951; Carrol et al., J. Cell Biochem, 17E:241; Lebkowski et al., патент США 5354678; Davison and Elliot, Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)). Другие методы, применяемые для переноса in vivo, включают инкапсулирование нуклеиновой кислоты в липосомы и непосредственный перенос липосом, или липосом, объединенных с гемаглютинирующим вирусом Сендай (патент США 5824655. Трансфецированные или инфицированные клетки экспрессируют белковые продукты, кодируемые нуклеиновой кислотой, ослабляя заболевание или симптомы заболевания.

Для более глубокого понимания данного изобретения ниже представлено следующее описание.

Композиции и методы по изобретению

Данное изобретение включает композиции и методы лечения заболеваний иммунной системы, таких как ревматические заболевания, путем введения субъекту эффективного количества лиганда, который связывает В7, например, молекул растворимого CTLA4 (такого как CTLA4Ig и/или L104EA29YIg), и mAbs, которые распознают В7 и связываются с ним. Эффективное количество определяют как количество молекул растворимого CTLA4, которые, будучи связаны с молекулами В7 на В7-позитивных клетках, ингибируют связывание молекул В7 с эндогенными лигандами, такими как CTLA4 и CD28.

В предпочтительном варианте изобретения иммунное заболевание является ревматическим заболеванием. Ревматические заболевания представляют собой такие заболевания, которые характеризуются (i) воспалением или перерождением структуры скелетно-мышечных или соединительных тканей организма, в особенности суставов, и включающих мышцы, сухожилия, хрящи, синовиальные и волокнистые ткани, (ii) сопровождающимся опуханием суставов, болезненностью, хрупкостью суставов, воспалением, утренней тугоподвижностью суставов и/или болью или двигательной недостаточностью или недостаточностью функции этих структур и, в ряде случаев, (iii) часто сопровождающим серологическим доказательством ревматоидного фактора и других воспалительных суррогатных маркеров.

Ревматические заболевания включают, но без ограничения, ревматоидный артрит. Симптомы ревматоидного артрита включают опухание суставов, болезненность, хрупкость суставов, воспаление, утреннюю тугоподвижность суставов и боль, вызывающую потерю физической трудоспособности. Больные прогрессирующим артритом имеют симптомы структурного поражения и обессиливающей боли. Другие органы также могут быть ослаблены по аутоиммунному механизму.

Композиции

Настоящее изобретение включает композиции, содержащие растворимый CTLA4, для лечения иммунных заболеваний, таких как ревматические заболевания. Кроме того, данное изобретение включает композиции, содержащие биологический агент, который ингибирует Т-клеточную функцию, но не Т-клеточное истощение, у человека при контактировании В7-позитивных клеток человека с растворимым CTLA4. Примеры растворимого CTLA4 включают CTLA4Ig и мутантный растворимый CTLA4, например L104EA29YIg.

Молекулы CTLA4, имеющие мутантные последовательности или последовательности дикого типа, можно сделать растворимыми с помощью делеции трансмембранного сегмента CTLA4 (Oaks, М.К., et al., 2000, Cellular Immunology, 201:144-153).

Или же молекулы растворимого CTLA4, которые имеют мутантные последовательности или последовательности дикого типа, могут быть молекулами слитых белков, при этом молекулы CTLA4 слиты с не-CTLA4-фрагментами, такими как молекулы иммуноглобулина (Ig), которые делают растворимыми молекулы CTLA4. Например, слитый белок CTLA4 может включать внеклеточный домен CTLA4, слитый с константной областью иммуноглобулина, образуя в результате молекулу CTLA4Ig (Фигура 24) (Linsley, P.S., et al., 1994, Immunity, 1:793-80).

Для клинических протоколов предпочтительным является, чтобы иммуноглобулиновая область не вызывала вредной иммунной реакции у субъекта. Предпочтительным фрагментом является константная область иммуноглобулина, включая константные области иммуноглобулина человека или обезьяны. Одним из примеров подходящего иммуноглобулинового участка является человеческий С 1, включающий шарнирную область, области СН2 и СН3, которые могут опосредовать эффекторные функции, такие как связывание с рецепторами Fc, опосредующими зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC), или опосредовать зависимую от антитела цитотоксичность, опосредуемую клетками (ADCC). Иммуноглобулиновый фрагмент может содержать одну или более мутаций (например, в домене СН2, для ослабления эффекторных функций, таких как CDC или ADCC), если мутация модулирует способность иммуноглобулина связываться с лигандом, повышая или понижая способность иммуноглобулина связываться с рецепторами Fc. Например, мутации в иммуноглобулиновой области могут включать замены любого или всех цистеиновых остатков в шарнирной области, например, цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяют на серин (Фигура 24). Молекула иммуноглобулина может содержать замену пролина в положении +148 на серин, как показано на Фигуре 24. Кроме этого, мутации в иммуноглобулиновом фрагменте могут включать замену лейцина в положении +144 на фенилаланин, замену лейцина в положении +145 на глутаминовую кислоту или замену глицина в положении +147 на аланин.

Дополнительные не-СТLА4-фрагменты для применения в молекулах растворимого CTLA4 или в молекулах мутантного растворимого CTLA4 включают, но без ограничения, молекулу р97, молекулу env gp120, молекулу Е7 и молекулу ova (Dash, В. et al. 1994, J. Gen. Virol. 75 (Pt 6):1389-97; Ikeda, Т., et al. 1994, Gene 138(1-2):193-6; Falk, K, et al. 1993, Cell. Immunol. 150(2):447-52; Fujisaka, K. et al. 1994, Virology 204(2):789-93). Возможно также применение других молекул (Gerard, С. et al. 1994, Neuroscience 62(3): 721; Byrn, R. et al. 1989, 63(10):4370; Smith, D. et al. 1987, Science, 238:1704; Lasky, L. 1996, Science, 233:209).

Молекула растворимого CTLA4 по изобретению может включать последовательность сигнального пептида, связанную с N-концом внеклеточного домена СТLА4-участка молекулы. Сигнальный пептид может иметь любую последовательность, которая допускает секрецию молекулы, включая сигнальный пептид онкостатина М (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9:2847-2853) или CD5 (Jones, N.H. et al., (1986) Nature 323:346-349), или сигнальный пептид любого внеклеточного белка.

Молекула растворимого CTLA4 по изобретению может включать сигнальный пептид онкостатина М, связанный с N-концом внеклеточного домена CTLA4, и молекулу человеческого иммуноглобулина (например, шарнирную область, СН2 и СН3), связанную с С-концом внеклеточного домена (дикого типа или мутантного) CTLA4. Эта молекула включает сигнальный пептид онкостатина М, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении -26 до аланина в положении -1 включительно, участок CTLA4, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно, участок соединения - аминокислотный глутаминовый остаток в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий аминокислотную последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 включительно.

А именно, молекулы растворимого мутантного CTLA4, содержащие мутантные последовательности CTLA4, описанные ниже, представляют собой молекулы слитых белков, содержащих фрагменты человеческого IgC 1, слитые с фрагментами мутантного CTLA4.

В одном варианте изобретения молекулы растворимого мутантного CTLA4 содержат IgC 1, слитый с фрагментом CTLA4, содержащим моносайтовую мутацию во внеклеточном домене. Внеклеточный домен CTLA4 включает область от метионина в положении +1 по остаток аспарагиновой кислоты в положении +124 (например, Фигура 23). Внеклеточный участок CTLA4 может содержать область от аланина в положении -1 по остаток аспарагиновой кислоты в положении+124 (например. Фигура 23). Примеры моносайтовых мутаций включают следующие мутации, в результате которых лейцин в положении +104 заменяется на любую другую аминокислоту:

Моносайтовый мутант:	Замена кодона:
L104EIg	Глутаминовая кислота GAG
L104SIg	Серин AGT
L104TIg	Треонин ACG
L104AIg	Аланин GCG
L104WIg	Триптофан TGG
L104QIg	Глутамин CAG
L104KIg	Лизин AAG
L104RIg	Аргинин CGG
L104GIg	Глицин GGG

Кроме этого, данное изобретение включает мутантные молекулы, содержащие внеклеточный домен CTLA4 с двумя мутациями, слитый с фрагментом IgC 1. Примеры включают следующие мутации, в результате которых лейцин в положении +104 заменяется на другую аминокислоту (например, глутаминовую кислоту), а глицин в положении +105, серин в положении +25, треонин в положении +30 или аланин в положении +29 заменяются на любую другую аминокислоту:

Двухсайтовые мутанты:	Замена кодона:
L104EG105FIg	Фенилаланин ТТС
L104EG105WIg	Триптофан TGG
L104EG105LIg	Лейцин СТТ
L104ES25RIg	Аргинин CGG
L104ET30GIg	Глицин GGG
L104ET30NIg	Аспарагин ААТ
L104EA29YIg	Тирозин ТАТ
L104EA29LIg	Лейцин TTG
L104EA29TIg	Треонин ACT
Ll04EA29WIg	Триптофан TGG

Далее, данное изобретение включает мутантные молекулы, содержащие внеклеточный домен CTLA4 с тремя мутациями, слитый с фрагментом IgC 1. Примеры включают следующие мутации, в результате которых лейцин в положении +104 заменяется на другую аминокислоту (например, глутаминовую кислоту), аланин в положении +29 заменяется на другую аминокислоту (например, тирозин) и серин в положении +25 заменяется на другую аминокислоту:

Трехсайтовые мутанты:	Замены кодонов:
L104EA29YS25KIg	Лизин ААА
L104EA29YS25KIg	Лизин AAG
L104EA29YS25NIg	Аспарагин ААС
L104EA29YS25RIg	Аргинин CGG

Молекулы растворимого мутантного CTLA4 имеют участок соединения - аминокислотный остаток, который расположен между участком CTLA4 и участком Ig молекулы. Соединительная аминокислота может быть любой аминокислотой, включая глутамин. Соединительную аминокислоту можно вводить молекулярными или химическими синтетическими методами, известными из уровня техники.

Настоящее изобретение включает молекулы мутантного CTLA4, включая последовательность сигнального пептида, связанную с N-концом внеклеточного домена CTLA4-участка мутантной молекулы. Сигнальный пептид может иметь любую последовательность, которая допускает экспрессию мутантной молекулы, включая сигнальный пептид онкостатина М (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9:2847-2853) или CDS (Jones, N.H. et al., (1986) Nature, 323:346-349), или сигнальный пептид любого внеклеточного белка.

Настоящее изобретение включает молекулы мутантного CTLA4, содержащие моносайтовую мутацию во внеклеточном домене CTLA4, например, L104EIg (см. Фигуру 18) или L104SIg, причем L104EIg и L104SIg мутируют в своих CTLA4-последовательностях таким образом, что лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту или серин, соответственно. Кроме того, моносайтовые мутантные молекулы включают CTLA4-участки, охватывающие область от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (включительно), соединительный аминокислотный участок - глутамин - в положении +125 и иммуноглобулиновый участок от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 включительно. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы может также быть мутантным таким образом, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин и пролин в положении +148 заменяется на серин. Или же молекула моносайтового растворимого мутантного CTLA4 может иметь CTLA4-участок, охватывающий последовательность от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно.

Настоящее изобретение включает молекулы мутантного CTLA4, содержащие двухсайтовую мутацию во внеклеточном домене CTLA4, например L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg или L104EA29WIg, в которых лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту, а аланин в положении +29 заменяется на тирозин, лейцин, треонин и триптофан, соответственно. Последовательности для L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg и L104EA29WIg, начиная с метионина в положении +1 и кончая лизином в положении +357, плюс последовательность сигнального пептида (лидерная) включены в последовательности, показанные на Фигурах 19-22, соответственно. Двухбайтовые мутантные молекулы дополнительно содержат участки CTLA4, охватывающие метионин в положении +1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно, соединительный аминокислотный участок - глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 включительно. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы может также быть мутантным, так что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин и пролин в положении +148 заменяется на серин. Или же эти молекулы двухсайтового растворимого мутантного CTLA4 могут иметь CTLA4-участок, охватывающий последовательность от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно.

Настоящее изобретение включает молекулы мутантного CTLA4, содержащие двухсайтовую мутацию во внеклеточном домене CTLA4, например L104EG105FIg, L104EG105WIg и L104EG105LIg, в которых лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту, а глицин в положении +105 заменяется на фенилаланин, триптофан и лейцин, соответственно. Двухсайтовые мутантные молекулы, помимо этого, содержат участки CTLA4, охватывающие метионин в положении +1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно, соединительный аминокислотный участок - глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 включительно. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы может также быть мутантным, так что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин и пролин в положении +148 заменяется на серин. Или же эти мутантные молекулы могут иметь CTLA4-участок, охватывающий последовательность от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно.

Данное изобретение включает L104ES25RIg, который является двухсайтовой мутантной молекулой, включающей CTLA4-участок, охватывающий последовательность от метионина в положении +1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно, соединительный аминокислотный участок - глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 включительно. Участок, содержащий внеклеточный домен CTLA4, мутирует, таким образом серин в положении +25 заменяется на аргинин, а лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Или же L104ES25RIg может иметь CTLA4-участок, охватывающий последовательность от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно.

Данное изобретение предлагает молекулы мутантного CTLA4, содержащие двухсайтовую мутацию во внеклеточном домене CTLA4, например, такую как L104ET30GIg и L104ET30NIg, в которых лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту, а треонин в положении +30 заменяется на глицин и аспарагин, соответственно. Двухсайтовые мутантные молекулы, кроме того, содержат участки CTLA4, охватывающие метионин в положении +1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно, соединительный аминокислотный участок - глутамин - в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 включительно. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы может также быть мутантным, так что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин и пролин в положении +148 заменяется на серин. Или же эти мутантные молекулы могут иметь CTLA4-участок, охватывающий последовательность от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно.

Данное изобретение предлагает молекулы мутантного CTLA4, содержащие трехсайтовую мутацию во внеклеточном домене CTLA4, такую как L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg и L104EA29YS25RIg, в которых лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту, аланин в положении +29 заменяется на тирозин и серин в положении +25 заменяется на лизин, аспарагин и аргинин, соответственно. Трехсайтовые мутантные молекулы, кроме того, содержат участки CTLA4, охватывающие метионин в положении +1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно, соединительный аминокислотный участок - глутамин - в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 включительно. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы может также быть мутантным, так что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин и пролин в положении +148 заменяется на серин. Или же эти мутантные молекулы могут иметь CTLA4-участок, охватывающий последовательность от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 включительно.

Дополнительные варианты молекул растворимого мутантного CTLA4 включают химерные CTLA4/CD28 гомологичные мутантные молекулы, которые связывают В7 (Peach, R.J., et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2049-2058). Примеры таких химерных CTLA4/CD28 мутантных молекул включают HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 и HS14 (патент США 5773253).

Предпочтительным вариантом молекул растворимого CTLA4 по изобретению, такого как CTLA4Ig (показанный на Фигуре 24 начиная с метионина в положении +1 и кончая лизином в положении +357), является растворимый мутантный CTLA4 L104EA29YIg (показанный на Фигуре 19 начиная с метионина в положении +1 и кончая лизином в положении +357). Кроме того, изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, соответствующие молекулам растворимого CTLA4 по изобретению. В одном варианте изобретения нуклеотидная молекула представляет собой ДНК (например, кДНК) или ее гибрид. ДНК, кодирующая CTLA4Ig (Фигура 24), депонирована 31 мая 1991 года Американской коллекцией типовых культур (культур клеток, тканевых культур, АТСС), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, и ей в каталоге АТСС присвоен номер АТСС 68629. ДНК, кодирующая L104EA29YIg (последовательность, включенная в Фигуру 19), депонирована АТСС 19 июня 2000 и ей присвоен номер в каталоге АТСС РТА-2104. Или же нуклеотидные молекулы представляют собой РНК или ее гибрид.

Помимо этого, данное изобретение включает вектор, который содержит нуклеотидные последовательности по изобретению. Примеры векторов экспрессии включают, но без ограничения, векторы для клеток-хозяев млекопитающих (например, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); векторы pVPakc; векторы pCMV, векторы pSG5 (Stratagene)), ретровирусные векторы (например, векторы pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogene) или его модифицированные формы, аденовирусные векторы; векторы аденоассоциированных вирусов; векторы бакуловирусов, дрожжевые векторы (например, векторы pESC (Stratagene)).

Также предлагается векторная система-хозяин. Векторная система-хозяин включает вектор по изобретению в соответствующей клетке-хозяине. Примеры подходящих клеток-хозяев включают, но без ограничения, прокариотные и эукариотные клетки. В соответствии с практическим применением изобретения эукариотные клетки также являются подходящими клетками-хозяевами. Примеры эукариотных клеток включают любую животную клетку, первичную или иммортализованную, клетки дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomvces pombe и Pichia pastoris) и растительные клетки. Клетки миеломы, COS и СНО являются примерами животных клеток, которые можно использовать в качестве клеток-хозяев. Конкретные СНО клетки включают, но без ограничения, DG44 (Chasin, et al., 1986, Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar, 1997, Biochemistry, 36:10901-10909), СНО-К1 (ATCC № CCL-61), клеточную линию СНО-К1 Tet-On (Clontech), клетки СНО, обозначенные ЕСАСС 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), СНО клон 13 (GEIMG, Genova, IT), СНО клон В (GEIMG, Geneva, IT), клетки СНО-K1/SF, обозначенные ЕСАСС 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), и клетки RR-CHOK1, обозначенные ЕСАСС 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Примеры растительных клеток включают клетки табака (целое растение, культуру клеток или каллюс), пшеницы, сои культурной и риса. Также можно использовать семена пшеницы, сои и риса.

Молекулы мутантного CTLA4 по изобретению можно выделять в виде природных полипептидов или из других источников, природных, синтетических, полусинтетических или рекомбинантных. Соответственно, молекулы полипептидов мутантного CTLA4 можно выделять в виде природных белков из любых видов, в частности, млекопитающих, включая бычий, овечий, свиной, мышиный, лошадиный и, предпочтительно, человеческий белок. Или же молекулы полипептидов мутантного CTLA4 можно выделять в виде рекомбинантных полипептидов, которые экспрессируют в прокариотных или эукариотных клетках-хозяевах, или в виде химически синтезированных полипептидов.

Опытные специалисты в данной области техники могут легко применить стандартные способы выделения для получения выделенного мутантного CTLA4. Характер и степень выделения зависит от источника и предполагаемого применения выделенных молекул.

Молекулы мутантного CTLA4 и их фрагменты или производные можно получать методами рекомбинантной ДНК. Соответственно, выделенной нуклеотидной последовательностью, кодирующей молекулы CTLA4 дикого типа, можно манипулировать, вводя мутации, приводящие в результате к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют молекулы мутантного CTLA4. Например, нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулы мутантного CTLA4, можно получать методами сайт-направленного мутагенеза, используя праймеры и PCR (ПЦР) амплификацию. Праймеры могут включать специфические последовательности, предназначенные для введения заданных мутаций. Или же праймеры могут предназначаться для включения рандомизированных или полурандомизированных последовательностей с целью введения случайных мутаций. Стандартные методы рекомбинантной ДНК (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2^nd edition, Sambrook, Fritch, and Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor Press) и PCR-технологию (патент США 4603102) можно применять для получения и выделения CTLA4-мутантных полинуклеотидов, кодирующих CTLA4-мутантные полипептиды.

Данное изобретение включает фармацевтические композиции для применения при терапии заболеваний иммунной системы, содержащие фармацевтически эффективные количества растворимого CTLA4. В некоторых вариантах изобретения заболевания иммунной системы опосредуются взаимодействиями CD28/CTLA4/B7. Молекулы растворимого CTLA4, предпочтительно, представляют собой молекулы растворимого CTLA4 с последовательностью дикого типа и/или молекулы растворимого CTLA4, имеющие одну или более мутаций во внеклеточном домене CTLA4. Фармацевтическая композиция может включать молекулы растворимого белка CTLA4 и/или нуклеотидные молекулы и/или векторы, кодирующие молекулы. В предпочтительных вариантах изобретения молекулы растворимого CTLA4 имеют аминокислотную последовательность внеклеточного домена CTLA4, показанную на Фигуре 24 или 19 (CTLA4Ig или L104EA29YIg, соответственно). Еще более предпочтительным является, когда молекулы растворимого CTLA4 представляют собой L104EA29YIg, раскрываемые в данном описании. Кроме того, композиции могут включать другие терапевтические агенты, включая, но без ограничения, лекарственные токсины, ферменты, антитела или конъюгаты.

В обычной практике в данной области техники предлагаются фармацевтические композиции, содержащие молекулы по изобретению, смешанные с приемлемьм носителем или адъювантом. Предпочтительно, фармацевтические композиции содержат подходящие носители и адъюванты, включающие любое вещество (материал), которое при смешении с молекулой по изобретению (например, с молекулой растворимого CTLA4, такой как CTLA4Ig или L104EA29YIg) сохраняет активность молекулы и не является реакционноспособным в отношении иммунной системы субъекта. Эти носители и адъюванты включают, но без ограничения, ионообменные вещества, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси частичных глицеридов растительных насыщенных кислот, физиологический раствор с фосфатньм буфером, воду, эмульсии (например, водомасляную эмульсию), соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидроортофосфат натрия, дигидроортофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы и полиэтиленгликоль. Другие носители могут также включать стерильные растворы; таблетки, включая покрытые таблетки и капсулы. Как правило, такие носители содержат эксципиенты, такие как крахмал, молоко, сахар (например, сахарозу, глюкозу, мальтозу), некоторые виды глины, желатин, стеариновую кислоту или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры или масла, смолы, гликоли или другие известные эксципиенты. Такие носители могут также включать вкусовые добавки и красители или другие ингредиенты. Композиции, содержащие такие носители, готовят хорошо известными общепринятыми методами. Такие композиции можно также помещать в различные липидные композиции, такие, например, как липосомы, а также в различные полимерные композиции, такие, как полимерные микросферы.

Способы

Данное изобретение охватывает способы регулирования функциональных CTLA4-и CD28-позитивных клеточных взаимодействий с В7-позитивными клетками. Способы представляют собой контактирование В7-позитивных клеток с молекулой растворимого CTLA4 по изобретению таким образом, что образуются растворимые комплексы CTLA4/B7, причем эти комплексы препятствуют реакции молекулы эндогенного CTLA4 и/или CD28 с молекулой В7.

Данное изобретение также включает способы ингибирования функции Т-клеток, но не истощения популяции Т-клеток у человека путем контактирования В7-позитивных клеток человека с растворимым CTLA4. Примеры растворимого CTLA4 включают CTLA4Ig и мутантный растворимый CTLA4, например L104EA29YIg.

Далее, настоящее изобретение включает способы лечения заболеваний иммунной системы, таких как ревматические заболевания. Способы заключаются во введении субъекту терапевтической композиции, содержащей молекулы CTLA4 по изобретению, в количестве, эффективном для того, чтобы облегчить, по меньшей мере, один из симптомов, обусловленных заболеваниями иммунной системы. Помимо этого, данное изобретение может предложить способ долговременного терапевтического лечения заболеваний иммунной системы путем блокады взаимодействий Т-клеток с В7-позитивными клетками, тем самым блокируется стимуляция Т-клеток с помощью костимулирующих сигналов, таких как связывание В7 с CD28, что индуцирует анергию или толерантность Т-клеток. Заболевания иммунной системы включают, но без ограничения, аутоиммунные заболевания, иммунопролиферативные заболевания и нарушения, обусловленные трансплантацией. Примеры заболеваний, вызванных трансплантацией, включают гомологичную болезнь (трансплантат против хозяина, GVHD) (например, такую, которая может возникнуть в результате трансплантации костного мозга или при индукции толерантности), иммунные расстройства, связанные с отторжением трансплантата, хроническое отторжение и алло- или ксенотрансплантаты тканей или клеток, включая однородные органы, кожу, островки, мышцы, гепатоциты, нейроны. Примеры иммунопролиферативных заболеваний включают, но без ограничения, псориаз; Т-клеточную лимфому; Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, тестикулярную ангиоцентрическую Т-клеточную лимфому; и аутоиммунные заболевания, такие как доброкачественный лимфоцитарный васкулит, волчанка (например, красная волчанка, волчаночный нефрит), тиреоидит Хашимото (Hashimoto); и аутоиммунные заболевания, такие как первичная микседема, болезнь Грейвса (базедова болезнь), злокачественная анемия, аутоиммунный атрофический гастрит, болезнь Аддисона, диабет (например, инсулинзависимый сахарный диабет, сахарный диабет типа I, сахарный диабет типа II), синдром Гудпасчера, тяжелая псевдопаралитическая миастения, пузырчатка, болезнь Крона, симпатическая офтальмия, аутоиммунный увеит, рассеянный склероз, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, язвенный колит, синдром Сегрена, ревматические заболевания (например, ревматоидный артрит), полимиозит, склеродерма и смешанная соединительнотканная болезнь.

Молекулы растворимого CTLA4 по изобретению проявляют ингибирующие свойства in vivo. В условиях, когда взаимодействие Т-клетки/В7-позитивные клетки, например взаимодействие Т-клетки/В-клетки, происходит в результате контакта между Т-клетками и В7-позитивными клетками, что препятствует реакции CTLA4 с В7-позитивными клетками, например В-клетки могут мешать (т.е. ингибировать) взаимодействию Т-клетки/В7-позитивные клетки, что приводит в результате к регуляции иммунного ответа.

Данное изобретение охватывает способы негативной модуляции (супрессии) иммунного ответа. Негативная модуляция иммунного ответа молекулами растворимого CTLA4 по изобретению может происходить путем ингибирования или блокирования иммунного ответа уже в процессе его или может включать предотвращение индукции иммунного ответа. Молекулы растворимого CTLA4 по изобретению могут ингибировать функции активированных Т-клеток, такие как пролиферация Т-лимфоцитов и секреция цитокинов, подавляя реакцию Т-клеток или индуцируя специфическую толерантность в Т-клетках, или делая и то и другое. Далее, молекулы растворимого CTLA4 по данному изобретению, препятствуя пути обмена CTLA4/CD28/B7, могут ингибировать Т-клеточную пролиферацию и/или секрецию цитокинов и тем самым в результате вызывать пониженную деструкцию тканей и индукцию иммунологической неотвечаемости или анергии Т-клеток.

Предпочтительный вариант изобретения включает применение растворимого мутантного CTLA4, L104EA29YIg, для регуляции функциональных взаимодействий CTLA4- и СD28-позитивных клеток с В7-позитивными клетками, для лечения заболеваний, таких как ревматические заболевания, и/или для негативной модуляции иммунных реакций. L104EA29YIg по изобретению представляет собой молекулу растворимого мутантного CTLA4, содержащую, по меньшей мере, две аминокислотные замены, замену лейцина (L) на глутаминовую кислоту (Е) в положении +104 и замену аланина (А) на тирозин (Y) в положении +29. Молекула L104EA29YIg может содержать дополнительные мутации помимо двух, указанных в данном описании.

Предпочтительный вариант изобретения включает способы лечения ревматических заболеваний, таких как ревматоидный артрит, путем введения субъекту эффективного количества молекул растворимого CTLA4. Введение эффективного количества терапевтической композиции ослабляет у субъекта, по меньшей мере, один из симптомов, связанных с заболеванием, включая уменьшение: опухания суставов, хрупкости суставов, воспаления, утренней тугоподвижности суставов и боли, и структурного поражения, и последующего уменьшения физической нетрудоспособности (повышения трудоспособности). Способы по изобретению можно использовать для ослабления, по меньшей мере, одного симптома, связанного с ревматоидным артритом, включая снижение скорости оседания эритроцитов, уровней С-реактивного белка, растворимого ICAM-1, растворимого Е-селектина и/или растворимого IL-2r в сыворотке.

Количественно ослабление симптомов, вызываемое применением данного изобретения, можно определять, используя любые принятые критерии, установленные для измерения и документации ослабления симптомов в клинических условиях. Приемлемые критерии измерения ослабления симптомов (облегчения) могут включать показатели на основе критериев, установленных Американской коллегией ревматологии (например, ACR20), на основе четырех степеней ослабления симптомов (в "CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory and Antirheumatic Drugs-PDA, 1988) и анкеты для оценки состояния здоровья (HAQ) (Fries, J.F., et al., 1982, J. of Rheumatology, 9:789-793). Описание этих критериев в целом см. в "Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA)", February, 1999.

Субъекты, которые получают лечение по данному изобретению, включают млекопитающих, включая человека, обезьян, собак, кошек, лошадей, кроликов, мышей и крыс.

Настоящее изобретение включает различные способы, местные или системные, введения молекул растворимого CTLA4. Способы включают внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный (интраперитонеальный), пероральный, ингаляционный и подкожный методы, а также введение с помощью имплантируемого насоса, непрерывного вливания, генной терапии, липосом, суппозиториев, местного контакта, везикул, капсул и инъекционных методов. Терапевтический агент, приготовленный в виде состава с носителем, обычно лиофилизируют для хранения и восстанавливают, добавляя воду или буферный раствор с нейтральным рН (рН около 7-8, например рН 7,5) перед применением.

В обычной практике в данной области техники композиции по изобретению можно вводить субъекту в любой фармацевтически приемлемой форме.

В соответствии с практикой по данному изобретению способы включают введение субъекту молекул растворимого CTLA4 по изобретению для регуляции взаимодействия CD28-и/или СТLА4-позитивных клеток с В7-позитивными клетками. В7-позитивные клетки контактируют с эффективным количеством молекул растворимого CTLA4 по изобретению или их фрагментами или производными с образованием растворимых комплексов CTLA4/B7. Комплексы мешают взаимодействию молекул эндогенных CTLA4 и CD28 с молекулами семейства В7.

Молекулы растворимого CTLA4 можно вводить субъекту в количестве и во времени (например, продолжительность и/или количество раз), достаточном для блокады связывания молекул эндогенного В7 с соответствующими лигандами в организме субъекта. Блокада связывания эндогенный В7/лиганд, таким образом, ингибирует взаимодействие между В7-позитивными клетками и CD28-и/или СТLА4-позитивными клетками.

Дозировка терапевтического агента зависит от множества факторов, включая, но без ограничения, вид пораженной ткани, характер подвергаемого лечению аутоиммунного заболевания, тяжесть заболевания, здоровье субъекта и реакцию на лечение агентами. Соответственно, дозировки агентов могут варьироваться в зависимости от конкретного субъекта и способа применения. Молекулы растворимого CTLA4 можно вводить в количестве 0,1-20,0 мг/кг веса тела больного/день, предпочтительно 0,5-10,0 мг/кг/день.

Данное изобретение также охватывает применение композиций по изобретению вместе с другими фармацевтическими агентами для лечения заболеваний иммунной системы. Например, иммунные заболевания можно лечить соединениями по изобретению в сочетании, но без ограничения, с такими веществами как иммунодепрессанты, такие как кортикостероиды, циклоспорин (Mathiesen, 1989, Cancer Lett. 44(2): 151-156), преднизон, азатиоприн, метотрексат (R.Handschumacher, in: "Drugs Used for Immunosuppression" pages 1264-1276), блокаторы и антагонисты TNFa (New England Journal of Medicine, vol.340:253-259, 1999; The Lancet vol.354: 1932-39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol.130:478-486), или с другими биологическими агентами, нацеленными на любой воспалительный цитокин, нестероидными противовоспалительными средствами/ингибиторами Сох-2, такими соединениями как гидроксихлорохин, сульфасалазаприн, соли золота, этанерцепт, инфликсимаб, раламицин, микофенолят мофетил, азатиоприн, такролизмус, базиликсимаб, цитоксан, интерферон-бета-1a, интерферон бета 1-b, глатирамера ацетат, митоксантрон гидрохлорид, анакинра и/или другие биологические препараты.

Молекулы растворимого CTLA4 (предпочтительно, L104EA29YIg) можно вводить также в комбинации с одним или более следующих агентов для регуляции иммунного ответа: растворимый gp39 (также известный как лиганд CD40 (CD40L), CD154, Т-ВАМ, TRAP), растворимый CD29, растворимый CD40, растворимый CD80 (например, АТСС 68627), растворимый CD86, растворимый CD28 (например, 68628), растворимый CD56, растворимый Thy-1, растворимый CD3, растворимый TCR, растворимый VLA-4, растворимый VCAM-1, растворимый LECAM-1, растворимый ELAM-1, растворимый CD44; антитела, реактивные в отношении gp39 (например, АТСС НВ-10916, АТСС НВ-12055 и АТСС НВ-12056), антитела, реактивное в отношении CD40 (например, АТСС НВ-9110), антитела, реактивные в отношении В7 (например, АТСС НВ-253, АТСС CRL-2223, АТСС CRL-2226, АТСС НВ-301, АТСС НВ-11341 и т.д.), антитела, реактивные в отношении CD28 (например, АТСС НВ-11944 или mAb 9.3, описанные Martin et al. J. Clin. Immun. 4(1): 18-22, 1980), антитела, реактивные в отношении LFA-1 (например, АТСС НВ-9579 и АТСС TIB-213), антитела, реактивные в отношении LFA-2, антитела, реактивные в отношении IL-2, антитела, реактивные в отношении IL-12, антитела, реактивные в отношении IFN-гамма, антитела, реактивные в отношении CD2, антитела, реактивные в отношении CD48, антитела, реактивные в отношении любых ICAM (например, ICAM-1 (АТСС CRL-2252), ICAM-2 и ICAM-3), антитела, реактивные в отношении CTLA4 (например, АТСС НВ-304), антитела, реактивные в отношении Thy, антитела, реактивные в отношении CD56, антитела, реактивные в отношении CD3, антитела, реактивные в отношении CD29, антитела, реактивные в отношении TCR, антитела, реактивные в отношении VCAM-1, антитела, реактивные в отношении LECAM-1, антитела, реактивные в отношении ELAM-1, антитела, реактивные в отношении CD44. В некоторых вариантах изобретения предпочтительными являются моноклональные антитела. В других вариантах изобретения предпочтительными являются фрагменты антител. Как легко поймут опытные специалисты в данной области техники, комбинация может включать молекулы растворимого CTLA4 по изобретению и еще один иммунодепрессант, молекулы растворимого CTLA4 и два других иммунодепрессанта, молекулы растворимого CTLA4 и три других иммунодепрессанта и т.д. Определение оптимальной комбинации и дозировок может быть проведено и оптимизировано с применением методов, хорошо известных из уровня техники.

Некоторые конкретные комбинации включают следующие соединения: L104EA29YIg и моноклональные антитела (mAbs) к CD80; L104EA29YIg и mAbs к CD86; L104EA29YIg, mAbs к CD80 и mAbs к CD86; L104EA29YIg и mAbs к gp39; L104EA29YIg и mAbs к CD40; L104EA29YIg и mAbs к CD28; L104EA29YIg, mAbs к CD80 и к CD86 и mAbs к gp39; L104EA29YIg, mAbs к CD80 и к CD86 и mAbs к CD40; и L104EA29YIg, анти-LFA1 mAb и анти-gp39 mAb. Конкретным примером mAb к gp39 является MR1. Специалисты в данной области техники легко примут и поймут другие комбинации.

Молекулы растворимого CTLA4 по изобретению, например L104EA29YIg, можно вводить в виде единственного активного ингредиента или вместе с другими лекарственными веществами по схеме иммуномодулирования, или с другими противовоспалительными веществами, например, для лечения или предупреждения острого или хронического отторжения алло- или ксенотрансплантата или для лечения или предупреждения воспалительных или аутоиммунных заболеваний, или для индукции толерантности. Например, они могут применяться в комбинации с ингибитором кальцийнейрина, например, циклоспорином А или FK506; с иммунодепрессивными макролидами, например, рапамицином или его производным; например, таким как 40-0-(2-гидрокси)этилрапамицин; с агентом хоминга лимфоцитов, например, FTY720 или его аналогом; с кортикостероидами: циклофосфамидами; азатиопреном; метотрексатом; лефлюномидом или его аналогом; мизорибином; микофенольной кислотой; микофенолят мофетилом; 15-дезоксиспергвалином или его аналогом; иммуносупрессивными моноклональными антителами, например с моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например, МНС, CD2, CD3, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD27, В7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), 0Х40,4-1ВВ, или их лигандами; или с другими иммуномодуляторами, например, CTLA4/CD28-Ig, или другими ингибиторами адгезии, например, mAbs или низкомолекулярные ингибиторы, включая антагонисты LFA-1, антагонисты селектина и антагонисты VLA-4. В особенности, соединение применимо в комбинации с соединением, которое служит помехой CD40 и его лиганду, например антителам к CD40 и антителам к CD40-L.

Если молекулы растворимого мутантного CTLA4 по изобретению вводят в сочетании с другой иммуносупрессивной/иммуномодуляторной или противовоспалительной терапией, например, такой, которая охарактеризована выше в данном описании, дозировки одновременно вводимого иммунодепрессанта, иммуномодулятора или противовоспалительного соединения, несомненно, варьируются в зависимости от типа одновременно применяемого лекарственного вещества, например, является ли оно стероидом или циклоспорином, от конкретного применяемого лекарственного вещества, от состояния, подвергаемого лечению и т.п.

В соответствии с вышесказанным настоящее изобретение включает в дополнительном аспекте способы по определению выше, заключающиеся в совместном введении, например, одновременно (сопутствующее) или последовательно, терапевтически эффективного количества молекул растворимого CTLA4 по изобретению, например, CTLA4Ig или L104EA29YIg, в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли, и второго лекарственного вещества, при этом второе лекарственное вещество является иммунодепрессантом, иммуномодулятором или противовоспалительным лекарственным средством, например, указанным выше. Кроме того, предлагаются терапевтические комбинации, например набор, например, для применения по любому способу, указанному выше, содержащий растворимый CTLA4, в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли, для применения, одновременного или последовательного, с, по меньшей мере, одной фармацевтической композицией, содержащей иммунодепрессант, иммуномодулятор или противовоспалительное средство. Набор может содержать инструкцию по применению.

Настоящее изобретение также включает способы продуцирования молекул растворимого мутантного CTLA4 по изобретению. Экспрессия молекул растворимого мутантного CTLA4 может происходить в прокариотных клетках или эукариотных клетках.

Прокариоты в основном представляют собой различные штаммы бактерий. Бактерии могут быть грамположительными или грамотрицательными. Как правило, предпочтительными являются грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli. Также можно использовать другие микробные штаммы. Последовательности, кодирующие молекулы растворимого мутантного CTLA4, можно встраивать в вектор, предназначенный для экспрессии чужеродных последовательностей в прокариотных клетках, таких как E. coli. Эти векторы могут включать обычно используемые прокариотные контролирующие последовательности, которые, как определено в данном описании, включают промоторы инициации транскрипции, при необходимости, с оператором, наряду с последовательностями сайта связывания рибосомы, включая такие обычно применяемые промоторы, как промоторные системы бета-лактамазы (пенициллазы) и лактозы (lac) (Chang, et al., (1977) Nature, 198:1056), промоторная система триптофана (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) и промотор фага лямбда Р_L и сайт связывания рибосомы N-гена (Shimtake, et al., (1981) Nature, 292:128).

Такие векторы экспрессии также включают ориджин репликации и селективный маркер, такой как ген бета-лактамазы или неомицинфосфотрансферазы, придающий устойчивость к антибиотикам, так что векторы могут реплицировать в бактериях и могут отбираться клетки, несущие плазмиды, выращенные в присутствии антибиотиков, таких как ампициллин и канамицин.

Плазмиду экспрессии можно вводить в прокариотные клетки различными стандартными методами, включая, но без ограничения, CaCl ₂ - шок (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, и Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)) и электропорацию.

В соответствии с практикой применения изобретения клетки эукариот также являются подходящими клетками-хозяевами. Примеры эукариотных клеток включают любую животную клетку, первичную или иммортализованную, клетки дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Pichia pastoris) и растительные клетки. Клетки миеломы, COS и СНО являются примерами животных клеток, которые можно использовать в качестве клеток-хозяев. Конкретные СНО клетки включают, но без ограничения, DG44 (Chasm, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar, 1997, Biochemistry, 36:10901-10909), СНО-К1 (АТСС № CCL-61), клеточную линию СНО-К1 Tet-On (Clontech), клетки СНО, обозначенные ЕСАСС 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), СНО клон 13 (GEIMG, Genova, IT), СНО клон В (GEIMG, Genova, IT), клетки CHO-K1/SF, обозначенные ЕСАСС 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), и клетки RR-CHOK1, обозначенные ЕСАСС 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Примеры растительных клеток включают клетки табака (целое растение, культуру клеток или каллюс), пшеницы, сои культурной и риса. Также можно использовать семена пшеницы, сои и риса.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулы мутантного CTLA4, можно также вводить в вектор, предназначенный для экспрессии чужеродных последовательностей в эукариотном хозяине. Регуляторные элементы вектора могут варьироваться в зависимости от конкретного эукариотного хозяина.

Обычно применяемые контролирующие последовательности эукариот для использования в векторах экспрессии включают промоторы и контролирующие последовательности, совместимые с клетками млекопитающих, например, такие как промотор CMV (вектор CD8) и вектор вируса саркомы птиц (ASV) (вектор LN). Другие обычно применяемые промоторы включают ранний и поздний промоторы вируса зеленой мартышки 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature, 273:113) или другие вирусные промоторы, такие как промоторы вирусов полиомы, Аденовируса 2 и вируса папилломы крупного рогатого скота. Индуцибельный промотор, такой как hMTII (Karin, et al., (1982) Nature, 299:797-802), также можно использовать.

Векторы экспрессии молекул мутантного CTLA4 в клетках эукариот могут также нести последовательности, называемые энхансерными областями (энхансерами). Энхансеры важны для оптимизации экспрессии генов и находятся либо "выше" (в 3'-5' направлении), либо "ниже" (в 5'-3' направлении) от промоторного участка.

Примеры векторов экспрессии для эукариотных клеток-хозяев включают, но без ограничения, векторы клеток-хозяев млекопитающих (например, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, рТК2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); векторы pVPakc; векторы pCMV, векторы pSG5 (Stratagene)), ретровирусные векторы (например, векторы pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogene) или его модифицированные формы, аденовирусные векторы; векторы аденоассоциированных вирусов; векторы бакуловирусов, дрожжевые векторы (например, векторы pESC (Stratagene)).

Нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулы мутантного CTLA4, можно интегрировать в геном эукариотной клетки-хозяина и реплицировать в виде реплик генома-хозяина. Или же векторы, несущие молекулы мутантного CTLA4, могут содержать ориджин репликации, позволяющий внехромосомную репликацию.

Для экспрессии нуклеотидных последовательностей в Saccharomyces cerevisiae можно использовать ориджин репликации эндогенной дрожжевой плазмиды, кольцо размером 2 мк.(Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Или же можно использовать последовательности дрожжевого генома, способные промотировать автономную репликацию (см., например, Stinchcomb et al., Nature, 282:39); Tschemper et al., (1980) Gene, 10:157; and Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300).

Последовательности транскрипционного контроля для дрожжевых векторов включают промоторы синтеза гликолитических ферментов. (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry, 17:4900). Дополнительные промоторы, известные из уровня техники, включают промотор CMV в векторе CDM8 (Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); промотор для 3-фосфоглицерат киназы (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) и промоторы для других гликолитических ферментов.

Другие промоторы являются индуцибельными, так как их можно регулировать с помощью внешних стимулов или с помощью среды для культивирования клеток. Индуцибельные промоторы включают промоторы генов, кодирующих белки теплового шока, алкоголь-дегидрогеназу 2, изоцитохром С, кислую фосфатазу, ферменты, ассоциируемые с азотным катаболизмом, и ферменты, ответственные за утилизацию мальтозы и галактозы.

Регуляторные последовательности могут также располагаться на 3' конце кодирующих последовательностей. Эти последовательности могут проявлять себя, стабилизируя матричную РНК. Такие терминаторы обнаружены в 3' нетранслируемой области после кодирующих последовательностей некоторых дрожжевых генов и генов млекопитающих.

Примеры векторов для растений и растительных клеток включают, но без ограничения, плазмиды агробактерий Т_i, векторы вируса мозаики цветной капусты (CaMV), векторы вируса золотой мозаики томатов (TGMV).

Общие аспекты трансформаций системы клетки-хозяина млекопитающего описаны Axel (патент США 4399216). Клетки млекопитающих можно трансформировать следующими способами, включая, но без ограничения, трансфекцию в присутствии фосфата кальция, микроинъекцию, электропорацию или трансдукцию при использовании вирусных векторов.

Способы введения последовательностей чужеродных ДНК в геномы растений и дрожжей включают (1) механические методы, такие как микроинъекция ДНК в единичные клетки или протопласты при интенсивном перемешивании клеток со стеклянными шариками в присутствии ДНК или при "выстреливании" оловянными или золотыми гранулами (сферами) в клетки или протопласты; (2) введение ДНК с помощью превращения клеточных мембран в проницаемые для макромолекул при обработке полиэтиленгликолем или при выдерживании в пульсовом режиме при высоком напряжении (электропорация); или (3) применение липосом (содержащих кДНК), которые сливаются с клеточными мембранами.

После экспрессии (молекул) мутантного CTLA4 по изобретению его можно собирать методами, хорошо известными из уровня техники, такими как клеточный лизис (например, ультразвук, лизоцим и/или детергенты) и очистка белка, осуществляемая стандартными методами очистки белков, например аффинной хроматографией или ионообменной хроматографией, получая практически чистый продукт (R. Scopes in: "Protein Purification, Principles and Practice", Third Edition, Springer-Verlag (1994); Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)). Экспрессию молекул мутантного CTLA4 можно обнаруживать методами, хорошо известными в технике. Например, мутантные молекулы можно обнаруживать по окрашиванию гелей SDS-PAGE с помощью кумасси голубого и иммуноблоттингом с применением антител, которые связывают CTLA4.

Следующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и для того, чтобы помочь рядовому специалисту в его осуществлении и применении. Примеры не претендуют никоим образом на какое-либо ограничение объема изобретения.

Пример 1

Ниже приводится описание методов, применяемых для получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих молекулы CTLA4 по изобретению.

Сначала конструируют плазмиду, кодирующую CTLA4Ig, и демонстрируют ее применение для экспрессии молекул CTLA4Ig, как описано в патентах США 5434131, 5885579 и 5851795. Затем при использовании последовательности, кодирующей CTLA4Ig, получают моносайтовые мутантные молекулы (например, L104EIg), экспрессируют и исследуют кинетику связывания с молекулами различных В7. Нуклеотидную последовательность L104EIg (включенную в последовательность, показанную на Фигуре 18) используют в качестве матрицы для получения двухсайтовых мутантных последовательностей CTLA4 (включенных в последовательности, показанные на Фигурах 19-22), которые экспрессируют в виде белков, и проверяют их кинетику связывания. Двухсайтовые мутантные последовательности CTLA4 включают: L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg и L104EA29WIg. Так же получают трехсайтовые мутанты.

Конструкция CTLA4Ig

Генетическую конструкцию, кодирующую CTLA4Ig, содержащий внеклеточный домен CTLA4 и домен IgCгамма1, создают, как описано в патентах США 5434131, 5844095 и 5851795, содержание которых вводится в данное описание ссылкой. Внеклеточный домен гена CTLA4 клонируют методом PCR, используя синтетические олигонуклеотиды, соответствующие опубликованной последовательности (Dariavach et al., Eur. Joum. Immunol. 18:1901-1905 (1988)).

Так как сигнальный пептид для CTLA4 не был идентифицирован в гене CTLA4, N-конец прогнозированной последовательности CTLA4 соединяют (сливают) с сигнальным пептидом онкостатина М (Malic et al., Mol. and Cell. Biol. 9:2847 (1989)) в две стадии с применением перекрывающих олигонуклеотидов. Для первой стадии в качестве "прямого" праймера используют олигонуклеотид CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGT GGCCCAGCC (который кодирует 25 С-концевых аминокислот сигнального пептида онкостатина, слитых с 7 N-концевыми аминокислотами CTLA4), а в качестве "обратного" праймера используют олигонуклеотид TTTGGGCTCCTGATCAGAATCGGGCACGGTTTG (кодирующий аминокислотные остатки 119-125 аминокислотной последовательности CTLA4 рецептора и содержащий сайт рестрикции Вс1 I). Матрицей на этой стадии является кДНК, синтезированная с применением 1 микрограмма тотальной РНК клеток Н38 (лейкемическая клеточная линия HTLV II инфицированных Т-клеток, предоставленная Drs. Salahudin and Gallo, NCI, Bethesda, MD). Часть PCR-продукта первой стадии снова амплифицируют с применением перекрывающего "прямого" праймера, кодирующего N-концевой участок сигнального пептида онкостатина М и содержащего сайт рестрикции эндонуклеазой Hind III, CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAG TCTGGTCCTTGCACTC и того же самого "обратного" праймера. Продукт PCR-реакции расщепляют при использовании Hind III и Bc1 I и лигируют вместе с фрагментом кДНК, отщепляемым с помощью Bc1 I/Xba I, кодирующим аминокислотные последовательности, соответствующие шарнирному, СН2 и СН3-участкам IgC(гамма)1, в вектор экспрессии, расщепляемый при использовании Hind III/Xba I, CDM8 или расщепляемый с помощью Hind III/Xba I вектор экспрессии piLN (также известный как LN).

ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность, соответствующую CTLA4Ig, депонирована АТСС по условиям Будапештского соглашения 31 мая 1991 года и получила номер 68629 АТСС.

Мутагенез CTLA4Ig на основе кодонов

Мутагенез и стратегия скрининга предприняты для того, чтобы идентифицировать молекулы мутантного CTLA4Ig, более медленно диссоциирующие (скорости off ) в молекулах с CD80 и/или CD86, т. е. повышенную способность к связыванию. В данном варианте изобретения осуществляют мутации в аминокислотных остатках и/или около этих остатков в областях CDR-1, CDR-2 (также известной как С' цепь) и/или CDR-3 внеклеточного домена CTLA4 (как описано в патентах США 6090914, 5773253 и 5844095, одновременно поданной патентной заявке США 60/214065; и Peach, R.J., et al., в J. Exp. Med., 180:2049-2058 (1994). CDR-подобная область охватывает каждую область CDR и простирается на несколько аминокислот "выше" (в 3'-5' направлении) и "ниже" (в 5'-3' направлении) от мотива CDR). Эти сайты выбирают на основании исследований химерных CD28/CTLA4 слитых белков (Peach, R.J., et al, в J. Exp. Med., 180:2049-2058 (1994) и модели, прогнозирующей, боковые цепи каких аминокислотных остатков будут подвергаться действию растворителя, и отсутствие идентичности или гомологии аминокислотных остатков в некоторых положениях между CD28 и CTLA4. Также любой остаток, находящийся в пространственной близости (5-20 А) к идентифицируемым остаткам, представляет собой рассматриваемую часть настоящего изобретения.

Для синтеза и скрининга молекул мутантного растворимого CTLA4 с измененной аффинностью в отношении молекулы В7 (например, CD80, CD86) предпринята двухстадийная стратегия. Эксперименты привели к синтезу библиотеки мутаций в специфическом кодоне внеклеточной части CTLA4, а затем к скринингу мутаций методом BIAcore (Biacore) для идентификации мутантов с измененной реактивностью в отношении В7. Аналитическая система Biacore (Pharmacia, Piscataway, N.J.) использует резонансную детекторную систему поверхностного плазмона, которая практически включает ковалентное связывание CD80Ig или CD86Ig с покрытым декстраном сенсорным чипом, расположенным в детекторе. Тестируемое соединение (молекулы) можно затем инъецировать в камеру, содержащую сенсорный чип, и количество комплементарного белка, которое связывается, можно оценить на основании изменения молекулярной массы, которая физически ассоциирована с покрытой декстраном стороной сенсорного чипа; изменение молекулярной массы можно определить с помощью детекторной системы.

Конкретно нуклеотидную последовательность для односайтового мутанта получают, используя не-мутантную (например, дикого типа) ДНК, кодирующую CTLA4Ig (патенты США 5434131, 5844095, 5851795 и 5885796; АТСС №68629), в качестве матрицы. Мутагенные олигонуклеотидные PCR-праймеры предназначены для случайного мутагенеза специфического кодона, допускающего любое основание в положениях 1 и 2 кодона, но только гуанин или тимин в положении 3 (XXG/T или также известный как NNG/T). Таким образом, в специфическом кодоне, кодирующем аминокислоту, можно получать такие случайные мутации, чтобы кодировать каждую из 20 аминокислот. При этом XXG/T мутагенез дает 32 потенциальных кодона, кодирующих каждую из 20 аминокислот. PCR-продукты, кодирующие мутации непосредственно около CDR3-подобной петли CTLA4Ig (MYPPPY), расщепляют с помощью SacI/XbaI и субклонируют в аналогичным образом разрезанный LN вектор экспрессии CTLA4Ig (включенный в Фигуру 24). Этот метод используют для получения моносайтовой CTLA4 мутантной молекулы L104EIg (включена в Фигуру 18).

Для мутагенеза в пространственной близости к CDR-1-подобной петле CTLA4Ig сначала 5' к этой петле с помощью PCR праймер-направленного мутагенеза вводят молчащий сайт NheI рестрикции. PCR-продукты расщепляют с помощью NheI/XbaI и пересаживают в аналогичным образом разрезанные векторы экспрессии CTLA4Ig или L104EIg. Этот метод используют для получения двухсайтовой мутантной молекулы CTLA4, L104EA29YIg (включенной в Фигуру 19). В частности, нуклеотидная молекула, кодирующая моносайтовую CTLA4 мутантную молекулу, L104EIg, используется в качестве матрицы для получения двухсайтовой мутантной молекулы, L104EA29YIg.

Двухсайтовые мутантные нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулы мутантного CTLA4, такие как L104EA29YIg (депонирована 19 июня 2000 года Американской коллекцией типовых культур (АТСС), 10801, University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 и получила АТСС номер РТА-2104), получены повторением описанной выше процедуры мутагенеза с применением в качестве матрицы L104EIg. Этот метод используют для получения большого количества нуклеотидных последовательностей для двухсайтовых мутантов, таких как нуклеотидные последовательности, кодирующие СТЕА4-молекулы L104EA29YIg (включена в последовательность, показанную на Фигуре 19), L104EA29LIg (включена в последовательность, показанную на Фигуре 20), L104EA29TIg (включена в последовательность, показанную на Фигуре 21) и L104EA29WIg (включена в последовательность, показанную на Фигуре 22). Также получены трехсайтовые мутанты, такие как мутанты, кодирующие L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg и L104EA29YS25RIg.

Молекулы растворимого мутантного CTLA4 экспрессируют на основе нуклеотидных последовательностей и используют во II фазе клинических исследований, описанной ниже, в Примере 3.

Как оценят специалисты в данной области техники, репликация нуклеотидных последовательностей, в особенности с помощью PCR-амплификации, позволяет просто вводить замены оснований в цепь ДНК. Однако нуклеотидные замены не обязательно транслируются в аминокислотные замены, так как некоторые кодоны избыточно кодируют ту же самую аминокислоту. Любые замены нуклеотида исходной последовательности или последовательности дикого типа, молчащие (т.е. не вызывающие изменения в транслируемой аминокислоте) или иные, не представленные подробно в данном описании, входят в объем настоящего изобретения.

Пример 2

В следующем примере дано описание методов скрининга, применяемых для идентификации моно- и двухсайтовых мутантных CTLA полипептидов, экспрессируемых конструкциями, описанными в Примере 1, которые проявляют более высокую авидность связывания с молекулами В7 по сравнению с не-мутантными молекулами CTLA4Ig.

Современные исследования in vitro и in vivo показывают, что сам по себе CTLA4Ig не способен полностью блокировать примирование антиген-специфических активированных Т-клеток. Исследования in vitro с CTLA4Ig и любым моноклональным антителом, специфичным к CD80-или CD86-определению ингибирования Т-клеточной пролиферации, показывают, что анти-CD80 моноклональное антитело не стимулирует ингибирование CTLA4Ig. Однако анти-СD86 моноклональное антитело стимулирует ингибирование, это указывает, что CTLA4Ig недостаточно эффективно блокирует взаимодействия CD86. Эти данные подтверждают ранее сделанное открытие Linsley et al. (Immunity, (1994), 1:793-801), что для ингибирования опосредуемых CD80 клеточных реакций требуются, примерно, в 100 раз более низкие концентрации CTLA4Ig, чем для ингибирования реакций, опосредуемых CD86. Исходя из этого было высказано предположение, что молекулы растворимого мутантного CTLA4, обладающие более высокой авидностью в отношении CD86, чем CTLA4 дикого типа, способны лучше блокировать примирование антиген-специфических активированных клеток, чем CTLA4Ig.

В конце концов молекулы растворимого мутантного CTLA4, описанные выше, в Примере 1, подвергают скринингу с применением новой методики скрининга с целью идентификации нескольких мутаций во внеклеточном домене CTLA4, которые повышают авидность связывания с CD80 и CD86. Эта стратегия скрининга дает эффективный метод непосредственного определения мутантов со сравнительно более медленньми "off" ("от")-скоростями, не требующий очистки белков или количественных определений, так как определение скоростей "от" не зависит от концентрации (O'Sharmessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).

Клетки COS трансфецируют при использовании минипрепарата отдельной очищенной плазмиды ДНК и культивируют в течение нескольких дней. Трехдневные кондиционированные культуральные среды подают на биосенсорные чипы BIAcore (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), покрытые растворимым CD80Ig или CD86Ig. Специфическое связывание и диссоциацию мутантных белков определяют методом поверхностного плазмонного резонанса (O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468). Все эксперименты на биосенсорах BIAcore или BIAcore 2000 проводят при 25°С. Лиганды иммобилизуют на сенсорных чипах NCM5 (степень чистоты - "для исследовательских работ") (Pharmacia), используя взаимодействие со стандартным N-этил-N'-(диметиламинопропил)-карбодиимид-N-гидроксисукцин имидом (Johnsson, В., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277; Khilko, S.N., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:15425-15434).

Метод скрининга

Клетки COS, выращенные в 24-луночных планшетах для тканевых культур, транзиторно трансфецируют при использовании мутантного CTLA4Ig. Культуральные среды, содержащие секретируемый растворимый мутантный CTLA4Ig, собирают через 3 дня.

Кондиционированные культуральные среды клеток COS пропускают через биосенсорные чипы BIAcore, дериватизированные при использовании CD86Ig или CD80Ig (как описано в Greene et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:26762-26771), и мутантные молекулы идентифицируют как молекулы с замедленными "от" ( off )-скоростями по сравнению со скоростями, наблюдаемыми для CTLA4Ig дикого типа. ДНК, соответствующие выбранным образцам сред, секвенируют и готовят большее количество ДНК для осуществления транзиторной трансфекции клеток COS в больших масштабах, при использовании этой ДНК получают СТLА4Ig-мутантный белок после очистки культуральной среды от протеина А.

Условия анализа BIAcore и анализ данных равновесного связывания см. в Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-2677 и в патентных заявках США 09/579927 и 60/214065, которые вводятся в данное описание в качестве ссылок.

Данные анализа BIAcore

Диаграмма чувствительности перед анализом нормализована по уровню нулевого отклика (RU). Образцы пропускают через псевдодериватизированные проточные кюветы для определения фоновых значений RU вследствие большой разницы между показателями преломления растворов. Константы равновесной диссоциации (Kd) вычисляют из графиков зависимости R_ед от С, где R_ед обозначает отклик в стационарном состоянии минус отклик на псевдодериватизированном чипе, а С обозначает молярную концентрацию аналита. Кривые связывания анализируют, используя программное обеспечение для построения нелинейных кривых (Prism, GraphPAD Software).

Экспериментальные данные сначала аппроксимируют к модели связывания одного лиганда с одним рецептором (1-сайтовая модель, т.е. простая система Ленгмюра, А+В АВ) и константы равновесной ассоциации (K_d=[A] [B][AB]) вычисляют по уравнению R=R_max C/(K_d+C). Затем данные подгоняют к простейшей двухсайтовой модели связывания с лигандом (т.е. с рецептором, содержащим два невзаимодействующих независимых сайта связывания, что описывается уравнением R=R_max1 C((K_d1+C)+R_max2 C((K_d2+C).

Согласие этих двух моделей анализируют визуально, сравнивая с экспериментальными данными, и статистически, используя F-распределение суммы квадратов. Более простую моносайтовую модель выбирают из-за ее лучшего соответствия, если только двухсайтовая модель не находится в значительно лучшем соответствии (р<0,1).

Анализ ассоциации и диссоциации осуществляют, используя программное обеспечение BIA (Pharmacia). Константы скорости ассоциации k_on вычисляют двумя путями, принимая во внимание гомогенные моносайтовые взаимодействия и параллельные двухбайтовые взаимодействия. Для моносайтовых взаимодействий k_on вычисляют по уравнению R_t =R_eq(1-exp^-ks(t-t ₀), где R _t обозначает отклик (реакцию) в данное время, t; R _eq обозначает отклик в равновесном состоянии; и k_s =dR/dt=k_on Ck_off; где С обозначает концентрацию аналита, вычисленную для мономерных сайтов связывания. Для случая двухсайтового взаимодействия значения k_on вычисляют по уравнению R_t=R_eq1(1-exp^-ks(t-t) ₀ )+R_eq2(1-exp^-ks(t-t) ₀). Для каждой модели значения k_on определяют по вычисленному тангенсу угла наклона (около 70% максимальной ассоциации) кривой зависимости k_s от С.

Данные, полученные для ассоциации, анализируют в соответствии с моносайтовой (АВ=А+В) и двухсайтовой (AiBj=Ai+Bj) моделями, и константы скорости (k _off) вычисляют, исходя из того, какая из кривых соответствует лучше. Используют модель сайта связывания, за исключением тех случаев, когда остаток больше, чем фон прибора (2-10RU, в зависимости от прибора), в этом случае применяют модель с двумя сайтами связывания. Полупериоды размещения рецептора рассчитывают по уравнению t _1/2=0,693/k_off.

Проточная цитометрия

Используют мышиные mAb (анти-CDSO) фирмы Becton Dickinson (San Jose, California) и IТ2.2 (анти-В7-0 [также известные как CD86] от фирмы Pharmingen (San Diego, California). Для иммуноокрашивания СВ80-позитивные и/или CD86-позитивные СНО клетки отбирают из емкостей с культурой, инкубируя в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS), содержащем 10 мМ EDTA. Клетки СНО (1-10×10 ⁵) сначала инкубируют с mAbs или белками, слитыми с иммуноглобулином, в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (сыворотки плода коровы, FBS), затем отмывают и инкубируют с реагентами второй стадии конъюгации флуоресцеинизотиоцианата с антителом козы к мышиному или человеческому иммуноглобулину (Tago, Burlingame, California). Клетки отмывают последний раз и анализируют на FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE (ДСН-ПААГ) и хроматография по размеру молекул

SDS-PAGE осуществляют на Tris/глицин 4-20% акриламидных гелях (Novex, San Diego, CA). Аналитические гели окрашивают кумасси голубым и снимки влажных гелей получают цифровым сканированием. CTLA4Ig (25 мкг) и L104EA29YIg (25 мкг) анализируют с помощью хроматографии по размеру молекул на колонке TSK-GEL G300 SW_XL (7,8×300 мм, Tosohaas, Montgomeryville, PA), уравновешенной физиологическим раствором с фосфатным буфером, содержащим 0,02% NaN3, при скорости потока 1,0 мл/мин.

CTLA4X_c120S и L104EA29YX_C120S

Одноцепочечный CTLA4X_C120S получен методом, впервые описанным Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). Короче говоря, плазмиду экспрессии онкостатина М CTLA4 (OMCTLA4) используют в качестве матрицы, "прямой" праймер, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG, выбирают из-за соответствия последовательностям в векторе; а "обратный праймер", GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC, соответствующий последним семи аминокислотам (т.е. аминокислотам 118-124) внеклеточного домена CTLA4 и содержащий сайт рестрикции и терминирующий кодон (TGA). "Обратный" праймер определяет мутацию С120S (цистеин на серин в положении 120). В частности, нуклеотидная последовательность GCA (нуклеотиды 34-36) "обратного" праймера, изображенного выше, заменяется на одну из следующих нуклеотидных последовательностей: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT или GCT. Как понятно специалистам в данной области техники, нуклеотидная последовательность GCA представляет собой обратную комплементарную последовательность кодона TGC для цистеина. Аналогично нуклеотидные последовательности AGA, GGA, TGA, CGA, ACT или GCT представляют собой обратные комплементарные последовательности кодонов для серина. Продукты полимеразной цепной реакции расщепляют при использовании HindIII/XbaI и непосредственно субклонируют в вектор экспрессии LN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). Аналогичным образом получают LI 04EA29YX_C120S. Каждую конструкцию методом секвенирования ДНК.

Идентификация и биохимические характеристики мутантов с высокой авидностью.

Для мутагенеза выбирают двадцать четыре аминокислоты и полученные в результате ˜2300 мутантных белка анализируют на связывание с CD86Ig методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR; см. выше). Преобладающие эффекты мутагенеза в каждом сайте суммированы в Таблице II, см. выше. Случайный (неспецифический) мутагенез в каждом сайте в области CDR-1 (S25-R33), по-видимому, не меняет связывания с лигандом. Мутагенез Е31 и R33 и остатков M97-Y102, по-видимому, приводит к снижению способности связываться с лигандом. Мутагенез остатков S25, А29 и Т30, К93, L96, Y103, L104 и G105 приводит к белкам с пониженными "к" ("on") и "от" ( off ) скоростями. Эти результаты подтверждают ранее сделанное открытие, что остатки в области CDR-1 (S25-R33) и остатки на участке или рядом с участком M97-Y102 влияют на связывание с лигандом (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).

Мутагенез по сайтам S25, Т30, К93, L96, Y103 и G105 позволяет идентифицировать некоторые мутантные белки более низкими скоростями "off ("от") от CD86Ig. Однако в этих случаях более низкие скорости "от" нейтрализуются (компрометируются) пониженными скоростями "on" ("к"), и в результате получаются мутантные белки с общей авидностью к CD86Ig, по-видимому, аналогичной авидности, к CD86Ig, наблюдаемой для CTLA4Ig дикого типа. Помимо этого, мутагенез К93 приводит к значительной агрегации, которая может быть причиной наблюдаемых кинетических изменений.

Случайный мутагенез 1104 с последующими трансфекцией клеток COS и скринингом методом SPR образцов культуральных сред над иммобилизованным CD86Ig дает шесть образцов среды, содержащей мутантные белки, off скорости которых, примерно, вдвое ниже, чем off скорости CTLA4Ig дикого типа. При секвенировании соответствующих кДНК этих мутантов найдено, что каждая из них кодирует мутацию замена лейцина на глутаминовую кислоту (L104E). По-видимому, замена лейцина 104 на аспарагиновую кислоту (L104D) не влияет на связывание CD86Ig.

Затем мутагенез повторяют в каждом сайте, перечисленном в Таблице II, на этот раз с L104E в качестве PCR-матрицы вместо CTLA4Ig дикого типа, как описано выше. Анализ методом SPR, снова с применением иммобилизованного CD86Ig, позволяет идентифицировать шесть образцов культуральных сред в результате мутагенеза аланина 29 с белками, имеющими, примерно, в 4 раза более низкие off скорости, чем CTLA4Ig дикого типа. Два наиболее медленных представляют собой белки с заменами на тирозин (L104EA29Y), два с заменой на лейцин (L104EA29L), один с заменой на триптофан (L104EA29W) и один с заменой на треонин (L104EA29T). По-видимому, не идентифицировано никаких мутантов с низкой off скоростью при случайном мутагенезе аланина 29, одного, в CTLA4Ig дикого типа.

Относительную молекулярную массу и состояние агрегации очищенных L104E и L104EA29YIg определяют методом SDS-PAGE и хроматографией по размеру молекул. L104EA29YIg (˜1 мкг; дорожка 3) и L104EIg (˜1 мкг; дорожка 2), по-видимому, имеют такую же электроферетическую подвижность, как и CTLA4Ig (˜1 мкг; дорожка 1), в условиях восстановления (˜50 кДа; +рМЕ; плюс меркаптоэтанол) и в отсутствие восстановителя (˜100 кДа; - МЕ) (Фиг.25А). Хроматография по размеру частиц показывает, что L104EA29YIg (Фиг.25С), по-видимому, имеет такую же подвижность, что и димерный CTLA4Ig (Фиг.25В). Основные пики соответствуют димеру белка, тогда как быстрее элюирующий минорный пик на Фиг.25В соответствует агрегатам с более высокой молекулярной массой. Примерно 5,0% CTLA4Ig присутствует в виде более высокомолекулярных агрегатов, но нет никаких доказательств агрегации L104EA29YIg или L104EIg. Следовательно, более прочное связывание с CD86Ig, наблюдаемое для L104EIg и L104EA29YIg, нельзя отнести за счет агрегации, вызванной мутагенезом.

Исследование равновесия и кинетики связывания

Равновесие и кинетику связывания изучают на очищенном от протеина А CTLA4Ig, L104EIg и L104EA29YIg методом поверхностного плазменного резонанса (SPR). Результаты приведены выше, в Таблице I. Наблюдаемые константы равновесной диссоциации (К_d; Таблица I) рассчитывают по кривым связывания в интервале концентраций (5,0-200 нМ). L104EA29YIg связывается с CD86Ig более прочно, чем L104EIg или CTLA4Ig. Более низкое значение К_d для L104EA29YIg (3,21 нМ), чем для L104EIg (6,06 нМ) или CTLA4Ig (13,9 нМ), указывает на более высокую авидность связывания L104EA29YIg с CD86Ig. Более низкое значение К_d для L 104EA29YIg (3,66 нМ), чем для L104EIg (4,47 нМ) или CTLA4Ig (6,51 нМ), указывает на более высокую авидность связывания L104EA29YIg с CD80Ig.

Изучение кинетики связывания показывает, сравнительные "on" ("к") скорости связывания CTLA4Ig, L104EIg и L104EA29YIg с CD80 аналогичны, как и "on" скорости для CD86Ig (Таблица I). Однако off скорости для этих молекул не эквивалентны (Таблица I). Для L104EA29YIg скорость off , от CD80Ig в 2 раза ниже, а "от" CD86Ig примерно в 4 раза ниже, чем для CTLA4Ig, L104EIg имеет off скорости, промежуточные между L104EA29YIg и CTLA4Ig. Так как введение этих мутаций не оказывает значительного влияния на "on" скорости, то увеличение авидности к CD80Ig и CD86Ig, наблюдаемое для L104EA29YIg, по-видимому, прежде всего вызвано понижением off скоростей.

Для того, чтобы определить, вызвано ли повышение авидности L104EA29YIg к CD86Ig и CD80Ig тем, что мутации влияют на то, каким образом каждый мономер ассоциирует в димер, или же эти мутации представляют собой повышающие авидность структурные изменения, вводимые в каждый мономер, получают одноцепочечные конструкции внеклеточных доменов CTLA4Ig и L104EA29YIg в соответствии с мутагенезом цистеина 120 в серин, как описано выше и Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424 (84). Методом гель-хроматографии показано, что очищенные белки CTLA4X_C120S и L104EA29YX_C120S, до того, как их свойства связываться с лигандами анализируют методом SPR, являются мономерными (Linsley et al., (1995), см. выше). Результаты показывают, что аффинность связывания обоих мономерных белков с CD86Ig примерно в 35-80 раз ниже, чем аффинность связывания, наблюдаемая для соответствующих димеров (Таблица I). Это подтверждает опубликованные ранее данные, устанавливающие, что для высокой авидности связывания с лигандом требуется димеризация CTLA4 (Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771).

Обнаружено, что авидность связывания L104EA29YX_C120S как с CD80Ig, так и с CD86Ig, примерно, вдвое выше, чем авидность связывания CTLA4X_C120S c этими лигандами. Повышение авидности вызвано, примерно, 3-кратным замедлением скорости диссоциации от этих лигандов. Следовательно, вероятнее всего, более прочное связывание при участии L104EA29Y возникает вследствие повышающих авидность структурных изменений, которые вводятся в каждую мономерную цепь, нежели вследствие изменений в молекуле в процессе димеризации.

Локализация и структурный анализ мутаций, повышающих авидность

Решение структуры внеклеточного IgV-подобного домена CTLA4 недавно осуществлено методом ЯМР-спектроскопии (Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4:527-531). Это сделало возможным точное отнесение местоположение лейцина 104 и аланина 29 в трехмерной складке (Фиг.26, левый и правый рисунки). Лейцин 104 расположен около высококонсервативной аминокислотной последовательности MYPPPY. Аланин расположен близ С-конца области CDR-1 (S25-R33), которая пространственно прилегает к участку MYPPPY. Хотя между остатками этих двух участков существует значительное взаимодействие, по-видимому, нет непосредственного взаимодействия между L104 и А29, хотя они оба составляют часть соседнего гидрофобного ядра в белке. Влияние на структуру этих двух повышающих авидность мутантов оценивают с помощью моделирования. Мутация A29Y может легко расположиться в углублении между областью CDR-1 (S25-R33) и участком MYPPPY. В молекуле CTLA4 дикого типа наблюдается мощное взаимодействие между L104 и L96 и V94 близ участка MYPPPY. По двум причинам в высшей степени невероятным кажется, что мутация глутаминовой кислоты принимает конформацию, сходную с конформацией L104. Во-первых, в структуре, без значительных изменений в области CDR-1 (S25-R33), недостаточно места для расположения глутаминовой кислоты с более длинной боковой цепью. Во-вторых, энергетические затраты на то, чтобы поместить ("похоронить") отрицательный заряд боковой цепи глутаминовой кислоты в гидрофобной области, были бы высоки. Напротив, изучение моделей позволяет прогнозировать, что боковая цепь глутаминовой кислоты "выталкивается" на поверхность, где ее заряд может стабилизироваться за счет сольватации. Такое изменение конформации позволяет G105 легко расположиться при минимальном искажении (конформации) других остатков в этих областях.

Связывание высокоавидных мутантов с клетками СНО, экспрессирующими CD80 или CD86

FACS-анализ (Фиг.27) связывания молекул CTLA4Ig и мутантных молекул с устойчиво трансфецируемыми CD80+ и CD86+ СНО-клетками осуществляют, как представлено в данном описании. СD80-позитивные и СD86-позитивные СНО-клетки инкубируют с CTLA4Ig, L104EA29YIg или L104EIg при возрастающих концентрациях последних, а затем отмывают. Связанный иммуноглобулиновый слитый белок обнаруживают при использовании конъюгированного с флуоресцеинизотиоцианатом антитела козы к человеческому иммуноглобулину.

Как показано на Фигуре 27, СD80-позитивные или CD86-позитивные СНО-клетки инкубируют в указанных концентрациях с CTLA4Ig (черные квадраты), L104EA29YIg (круги) или L104EIg (треугольники) в течение 2 ч при 23°С, отмывают и инкубируют с конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом антителом козы к человеческому иммуноглобулину. Всего на FACScan анализируют связывание на 5000 жизнеспособных клетках (единственное определение) и значение средней интенсивности флуоресцентности (MFI) вычисляют из данных гистограмм при использовании PC-LYSYS. Данные корректируют в соответствии с фоновой флуоресцентностью, измеренной на клетках инкубированных только с реагентом второй стадии (MFI=7). Контрольное mAb (80 мкг/мл) дает значение MFI<30. Эти результаты являются репрезентативньми из четырех независимых экспериментов.

Связывание L104EA29YIg, L104EIg и CTLA4Ig с человеческими CD80-трансфецированными СНО-клетками примерно эквивалентно (Фиг.27А). L104EA29YIg и L104EIg более прочно связываются с устойчиво трансфецированными человеческими CD86, чем CTLA4Ig (Фиг.27В).

Функциональные анализы

Человеческие CD4-позитивные Т-клетки выделяют методом иммуномагнитной негативной селекции (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Выделенные CD4-позитивные Т-клетки стимулируют, добавляя форболмиристатацетат (ФМА, РМА) плюс CD80-позитивные или СD86-позитивные СНО-клетки в присутствии титруемых концентраций ингибитора. CD4-позитивные Т-клетки (8-10×10⁴/лунка) культивируют в присутствии 1 нМ РМА в присутствии стимуляторов облучаемых СНО-клеток или в их отсутствие. Пролиферативные реакции измеряют, добавляя [ ³H]тимидин (1 мкКи/лунка) в течение 7 последних часов 72-часового культивирования. Под действием L104EA29YIg и CTLA4Ig происходит ингибирование, РМА плюс CD80-позитивных СНО или CD86-позитивных СНО, стимулированных Т-клеток. Результаты показаны на Фиг.28. L104EA29YIg эффективнее ингибирует пролиферацию CD80-позитивных обработанных РМА СНО-клеток, чем CTLA4Ig (Фиг.28А). L104EA29YIg также эффективнее ингибирует пролиферацию СD86-позитивных обработанных РМА СНО-клеток, чем CTLA4Ig (Фиг.28В). Следовательно, L104EA29YIg является более мощным ингибитором как CD80-, так и СD86-опосредуемой костимуляции Т-клеток.

На Фигуре 29 показано ингибирование с помощью L104EA29YIg и CTLA4Ig аллостимулированных человеческих Т-клеток, полученных выше, и дополнительно аллостимулированных при использовании человеческой клеточной линии В лимфобластов (LCL), называемой РМ, которая экспрессирует CD80 и CD86 (Т-клетки в количестве 3,0×10⁴/лунка и РМ в количестве 8,0×10³/лунка). Первичная аллостимуляция осуществляется в течение 6 дней, затем клетки выдерживают в пульсовом режиме с ³H-тимидином в течение последних 7 часов прежде, чем проводят определение (включения) радиоактивной метки.

Вторичную аллостимуляцию осуществляют следующим образом. Первичные аллостимулированные в течение семи дней Т-клетки собирают над средой для разделения лимфоцитов (LSM) (ICN, Aurora, ОН) и оставляют на 24 часа. Затем Т-клетки повторно стимулируют (вторично) в присутствии титрующихся количеств CTLA4Ig или L104EA29YIg с добавлением РМ в том же соотношении, какое указано выше. Стимуляцию проводят в течение 3 дней, затем клетки выдерживают в пульсовом режиме с радиоактивной меткой и собирают, как указано выше. Действие L104EA29YIg на первичные аллостимулированные Т-клетки показано на Фиг.29А. Действие L104EA29YIg на вторичные аллостимулированные Т-клетки показано на Фиг.29В. L104EA29YIg ингибирует пролиферативную реакцию как первичных, так и вторичных Т-клеток эффективнее, чем CTLA4Ig.

Для измерения продуцирования цитокинов (Фигура 30) устанавливают планшеты для вторичной аллостимуляции в двух экземплярах. Через 3 дня питательные среды анализируют, используя наборы ELISA (Biosource, Camarillo, CA), в условиях, рекомендуемых производителем. Найдено, что L104EA29YIg более эффективно, чем CTLA4Ig, блокирует продуцирование Т-клеточных цитокинов IL-2, IL-4 и -IFN после вторичного аллогенного стимулятора (Фигуры 30А-С).

Действие L104EA29YIg и CTLA4Ig на реакцию лимфоцитов в смешанной культуре обезьян (MLR) показано на Фигуре 31. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC'S; 3,5×10⁴ клеток/лунка от каждой обезьяны) двух обезьян очищают в среде для разделения лимфоцитов (LSM) и смешивают с 2 мкг/мл фитогемагглютинина (РНА). Клетки стимулируют в течение 3 дней, затем выдерживают в пульсовом режиме с радиоактивной меткой в течение 16 часов перед тем, как их собирать. L104EA29YIg ингибирует пролиферацию Т-клеток обезьян эффективнее, чем CTLA4Ig.

Пример 3

Ниже приводится описание II стадии клинических исследований, проводимых при участии больных людей, которым вводят молекулы растворимого мутантного CTLA4 - L104EA29YIg (также известного как LЕА29Y или LEA) или CTLA4Ig, для ослабления, по меньшей мере, одного симптома, обусловленного ревматоидным артритом, включая ослабление: слабости суставов, воспаления, утренней тугоподвижности суставов и боли. Молекулы CTLA4Ig, применяемые по данному описанию, начинаются с метионина в положении +1 (или же с аланина в положении -1) и заканчиваются лизином в положении +357, как показано на Фигуре 24. ДНК, кодирующая вариант молекулы CTLA4Ig по изобретению, депонирована в АТСС под номером 68629. Молекула L104EA29YIg, применяемая по данному описанию, начинается с метионина в положении +1 (или же с аланина в положении -1) и оканчивается лизином в положении +357, как показано на Фигуре 19. ДНК, кодирующая вариант молекулы L104EA29YIg по изобретению, депонирована как АТСС РТА 2104.

Кроме того, ниже дано описание группы больных (людей), которым вводят L104EA29YIg или CTLA4Ig с целью снижения количества, по меньшей мере, одного биологического суррогатного маркера, ассоциируемого с ревматоидным артритом, включая снижение скорости оседания эритроцитов и уровни С-реактивного белка и/или рецептора IL2.

Группы больных

В исследовании участвуют в общей сложности 214 больных, включая 54 мужчины и 160 женщин (Фигуры 1А, 1В). У больных на уровне фона (базовая линия) средняя продолжительность заболевания составляет 3,4 (± 2,0) года и их лечение, по меньшей мере, одним модифицирующим заболевание противоревматическим лекарственным препаратом (DMARD) оказалось неудачным. Стабильные нестероидные противовоспалительные средства (NSAID, НСПВС) или стероиды ( 10 мг/день) разрешены, а сопутствующие DMARD запрещены. Больных произвольно делят на группы по 25-32 человека в группе для испытаний. 32 человека получают плацебо, 92 человека получают L104EA29YIg и 90 человек получают CTLA4Ig. Больные, следующие указаниям протокола и не прекращающие лечение до дня 57, в общей сложности получают 4 внутривенные инфузии, по одной инфузии в дни 1,15,29 и 57. Состояние больных оценивают в дни 1, 15, 29, 43, 57, 71 и 85. Дозы вводимого препарата содержат 0,5; 2,0 или 10,0 мг/кг L104EA29YIg (обозначаемого на Фигурах 1А-1Е как LEA.5; LEA2 и LEA10, соответственно), или CTLA4Ig (на Фигурах 1А-1Е обозначаемого как CTLA.5; CTLA2 и CTLA10, соответственно).

Всех больных проверяют с помощью анкеты со списком возможных побочных явлений, чтобы избежать осложнений при вливании. Больные отвечают на вопросы о возможных побочных явлениях, которые могут произойти в течение 24 часов после инфузии. Помимо этого, больных побуждают немедленно сообщать о любых неблагоприятных ощущениях, которые они испытывают. Врачи регулярно проверяют результаты лабораторных анализов больных, проверяя отклонения в химическом и гематологическом составе крови, например, оценивая уровни медиаторов воспалительной реакции, таких как цитокины (TNF, IL-6), триптаза и комплемент. Первичной конечной точкой является число больных, отвечающих критериям ACR 20 на 85 день.

Хранение материалов для испытаний

CTLA4Ig и L104EA29YIg поступают в стеклянных ампулах (флаконах) одноразового пользования, содержащих 200 мг/ампула CTLA4Ig или 100 мг/ампула L104EA29YIg, соответственно. Перед вливанием CTLA4Ig и L104EA29YIg разбавляют стерильной водой для инъекций (SWFI) до конечной концентрации 25 мг/мл.

Протокол применения

Внутривенные вливания осуществляют в течение 1 часа. Всем больным делают, по меньшей мере, одно вливание изучаемого препарата.

Группа 1: 32 пациента, плацебо, соответствующее CTLA4Ig или L104EA29YIg.

Группа 2: 26 пациентов; дозировка 0,5 мг/кг CTLA4Ig.

Группа 3: 32 пациента; дозировка 2,0 мг/кг CTLA4Ig.

Группа 4: 32 пациента; дозировка 10,0 мг/кг CTLA4Ig.

Группа 5: 32 пациента; дозировка 0,5 мг/кг L104EA29YIg.

Группа 6: 29 пациентов; дозировка 2,0 мг/кг L104EA29YIg.

Группа 7: 31 пациент; дозировка 10,0 мг/кг L104EA29YIg.

Клинический контроль

У больных перед любым вливанием проверяют базовые показатели (симптомы) интенсивности заболевания. Эти базовые симптомы включают: опухание суставов, слабость суставов, воспаление, утреннюю тугоподвижность суставов, интенсивность заболевания по оценке больного и врача, а также нетрудоспособность по оценкам Анкеты оценки состояния здоровья (HAQ) (приводится на Фигуре 1С как показатель физической функции) и боль (Фигуры 1A-1D). Помимо этого базовые показатели включают скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и уровни сывороточного С-реактивного белка(СКР) и сывороточного рецептора IL-2 (IL-2r) (Фигуры 1С и 1D).

Изучение клинической реакции осуществляется на основе критериев, установленных Американской коллегией ревматологии (ACR). Больной удовлетворяет критериям ACR20, если наблюдается 20%-ное улучшение показателей слабости и опухания суставов и 20%-ное улучшение трех из пяти оставшихся определяемых симптомов, таких как общие изменения характера болезни по оценке больного и врача, боль, нетрудоспособность и реагент на острой стадии (Felson, D.T., et al., 1993, Arthritis and Rheumatism, 36:729-740; Felson, D.T., etal., 1995, Arthritis and Rheumatism, 38:1-9).

Биомаркеры (биологические показатели)

Также оценивают потенциальные биологические показатели интенсивности заболевания (ревматоидный фактор, CRP, ESR, растворимый IL-2R, растворимый ICAM-1, растворимый Е-селектин и ММР-3). Для определения концентрации IL-2sRa, sICAM-1, sE-селектина и ММР-3 в сыворотке применяют утвержденные методы иммуноферментного анализа (EIA). TNF и IL-6 определяют перед вливанием и через 2 часа после вливания, если это необходимо.

IL-2sR , sICAM-1, sE-селектин определяют, используя промышленные колориметрические наборы EIA от R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Нижний и верхний пределы количественного определения составляют 312-20000 пг/мл, 40-907 нг/мл и 10-206 нг/мл, соответственно. Интервал коэффициента вариации между анализами составляет 4,48-8,4%; 3,8-5,0% и 5,5-9,0%, соответственно. Согласно инструкции производителя, нормальный интервал содержания в сыворотке составляет 676-2132 пк/мл, соответственно.

ММР-3 определяют, используя промышленный колориметрический EIA набор от Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Нижний и верхний пределы количественного определения составляют 30-7680 нг/мл. "Межаналитический" интервал коэффициента вариации составляет 6,3-10,6%. Согласно инструкции производителя, нормальное содержание в сыворотке составляет 28-99 нг/мл.

Значения TNF и IL-6 определяют, используя промышленные хемилюминесцентные наборы EIA от R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Нижний и верхний пределы количественного определения составляют 0,3-3000 пг/мл и 0,7-7000 пг/мл, соответственно. Интервал коэффициента вариации между анализами составляет 3,1-5,7% и 6,4-20,7%, соответственно. Согласно инструкции производителя, нормальный интервал содержания в сыворотке составляет <0,3-12 пк/мл и <0,7-7,5 пг/мл.

Испытание антител

Перед тем как вводить дозу (лекарственного вещества) в день 1 и, примерно, в дни 15, 29, 57, 85 и 169, получают образцы сыворотки для оценки антител, специфических в отношении лекарственных препаратов ("противолекарственных" антител). Так как первоначальные титры антител к иммуноглобулиновому (Ig) участку молекулы высоки, также определяют образование специфических антител против CTLA4Ig и LEA29Y без константной Ig-области.

На девяностошестилуночные планшеты Immunolon II ELISA (Dynex, Chantilly, Virginia) наносят CTLA4Ig, CTLA4Ig без константных участков Ig, LEA29Y или LEA29Y без константных участков Ig в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) с концентрацией 2, 4, 2 или 1 мкг/мл, соответственно, и инкубируют в течение ночи при 2-8°С. Планшеты отмывают PBS, содержащим 0,05% Tween 20, и блокируют в течение 1 часа при 37°С с PBS, содержащим 1% бычий сывороточный альбумин (BSA). Затем планшеты отмывают, в соответствующие лунки добавляют серийные разведения испытуемых сывороток или контрольной сыворотки (качественный контроль, QC) и инкубируют в течение 2 часов при 37°С. Сыворотки в три раза разводят PBS с 0,25%BSA и 0,05% Tween 20, начиная с разведения 1:10. Планшеты отмывают и добавляют антисыворотку конъюгированного со щелочной фосфатазой антитела козы к каппа- и лямбда-цепям человеческого иммуноглобулина (Southern Associates, Inc., Birmingham, Alabama). После инкубации в течение 1 часа при 37°С планшеты отмывают и в каждую лунку добавляют 1 мг/мл пара-нитрофенилфосфата в буфере на основе диэтаноламина. Через 30 минут при 25°С реакцию прекращают, добавляя 3N NaOH, и определяют оптическую плотность (двойная длина волны: 405 нм и 550 нм). Результаты выражают как титр в конечной точке (ЕРТ), определяемый как величина, обратная наибольшему разведению, при котором оптическая плотность планшета в пять раз больше средней фоновой оптической плотности или равна средней фоновой оптической плотности. Фоновое значение для планшета определяют как оптическую плотность в отсутствие сыворотки. Значения считаются позитивными в отношении сероконверсии, если они, по меньшей мере, составляют два серийных разведения (девятикратных) или более по сравнению со значениями ЕРТ перед введением дозы. Образцы QC сыворотки, позитивные в отношении либо CTLA4Ig-, либо LЕА29Y-специфических антител, получают от вакцинированных обезьян. Аликвоту подходящего QC-образца анализируют одновременно с каждой аналитической серией. Аналитические серии учитываются только в том случае, если QC-образцы соответствуют принятым аналитическим критериям.

Результаты

CTLA4Ig и L104EA29YIg обычно хорошо переносятся в любых дозах. Побочные явления, связанные с вливанием, сходны во всех группах, получающих различные дозы, за исключением головной боли. Число больных с головной болью увеличивается на 85 день в зависимости от дозы на 23%, 44% и 53% среди пациентов, получающих CTLA4Ig, и на 34%, 45% и 61% среди пациентов, получавших L104EA29YIg, в дозировке 0,5; 2,0 и 10 мг/кг, соответственно. Для сравнения, головную боль испытывает 31 пациентов, принимающих плацебо.

Процент больных, прервавших лечение в клинике из-за внезапного обострения артрита и вследствие других побочных явлений, суммирован на Фигуре 2. Значительно более высокий процент прервавших лечение больных вследствие обострения артрита наблюдается в группе, принимавшей плацебо. Больные, получающие CTLA4Ig, реже прерывают лечение при увеличении дозы. Очень мало больных, получающих L104EA29YIg, прерывает лечение. Эти результаты указывают на достаточно высокий обратный эффект дозы для CTLA4Ig и более сильный терапевтический эффект при лечении с помощью L104EA29YIg.

ACR-20, -50 и -70 реакции больных, получающих CTLA4Ig, L104EA29YIg и плацебо, на 85 день суммированы на Фигуре 3А. Аналогично, на Фигурах 3В и 3С показаны реакции ACR-20 с доверительным пределом 95%. По-видимому, реакции зависят от дозы, причем отчетливая заметная реакции наблюдается при дозировке 10 мг/кг веса тела больного.

Количество - в процентах - больных с пониженными показателями, характеризующими опухание и слабость суставов, по сравнению с количеством больных, не реагирующих на лечение CTLA4Ig, L104EA29YIg или плацебо, показано на Фигурах 4А и В. Реакция на терапию, по-видимому, зависит от дозы. В группах, получающих 2 и 10 мг/кг обоих продуктов, более высокий процент больных с улучшением на 20, 50, 70 и даже 100%.

Процент больных с ослабленной болью и интенсивностью заболевания, по оценкам больного и врача, средние значения в единицах, в результате приема CTLA4Ig, L104EA29YIg или плацебо, показаны на Фигурах 5А. В, С и D. Терапевтическая реакция, по шкале Ликерта, по-видимому, зависит от дозы, предпочтительными, по сравнению на 85 день с плацебо, являются группы, получающие активное вещество. Шкала Ликерта является утвержденной вербальной шкалой рейтинга, использующей прилагаемые материалы для классификации симптомов (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6): 729-740).

Изменение оценки больным и врачом интенсивности заболевания по сравнению с фоном, по меньшей мере, на 2 единицы в результате лечения CTLA4Ig, L104EA29YIg или плацебо, показано на Фигурах 6А и В. Реакция, по-видимому, зависит от дозы, более заметное улучшение наблюдается при более высоких дозах активных лекарственных веществ.

Снижение уровня С-реактивного белка (CRP) у больных, получающих CTLA4Ig, L104EA29YIg или плацебо, выраженное в процентах, показано на Фигурах 7А и В. Реакция, по-видимому, зависит от дозы, при этом отчетливо видно уменьшение в группах, получающих 2 и 10 мг/кг активного лекарственного вещества. Помимо этого, на Фигуре 7В показано, что различие весьма значительно по сравнению с плацебо, с доверительными интервалами 95%. На Фигуре 7С показаны изменения уровней в сыворотке на 85 день по сравнению с базовым уровнем.

Количество сывороточного растворимого рецептора IL-2 у больных, получающих CTLA4Ig, L104EA29YIg или плацебо, показано на Фигуре 8. Снижение уровней растворимого рецептора IL-2, по-видимому, зависит от дозы.

Количество сывороточного растворимого ICAM-1 и растворимого Е-селектина у больных, получающих CTLA4Ig, L104EA29YIg или плацебо, показано на Фигуре 33. Снижение уровней растворимого ICAM-1 и растворимого Е-селектина, по-видимому, зависит от дозы.

Медианное и среднее значение величин, определяющих слабость суставов у больных, получающих CTLA4Ig или плацебо, во времени показано на Фигурах 9А и В. Изменение по сравнению с базовой линией (например, уменьшение слабости, хрупкости суставов), по-видимому, более значимо в группах, принимающих 2 и 10 мг/кг активного вещества, чем в группе, принимающей плацебо, или в группе, принимающей 0,5 мг/кг CTLA4Ig.

Медианное и среднее значение величин, определяющих опухание суставов у больных, получающих CTLA4Ig или плацебо, во времени показано на Фигурах 10А и В. Изменение по сравнению с базовой линией (например, уменьшение опухания суставов), по-видимому, более значимо в группах, принимающих 2 и 10 мг/кг активного вещества, чем в группе, принимающей плацебо, или в группе, принимающей 0,5 мг/кг CTLA4Ig.

Средние показатели оценки боли у пациентов, получающих CTLA4Ig или плацебо, во времени даны на Фигуре 11. Изменение по сравнению с базовой линией (например, уменьшение боли), по-видимому, более значимо в группах, принимающих 2 и 10 мг/кг активного вещества, чем в группе, принимающей плацебо, или в группе, принимающей 0,5 мг/кг CTLA4Ig.

Средние показатели интенсивности заболевания по оценке больного и врача у пациентов, получающих CTLA4Ig или плацебо, во времени представлены на Фигурах 12А и В. Изменение по сравнению с базовой линией (например, уменьшение интенсивности заболевания), по-видимому, более значимо в группах, принимающих 2 и 10 мг/кг активного вещества, чем в группе, принимающей плацебо, или в группе, принимающей 0,5 мг/кг CTLA4Ig.

Медианное и среднее значение величин, определяющих слабость суставов у больных, получающих L104EA29YIg (обозначенный на фигурах как LEA) или плацебо, во времени показано на Фигурах 13А и В. Изменение по сравнению с базовой линией (например, уменьшение слабости, хрупкости суставов), по-видимому, зависит от дозы.

Медианное и среднее значение величин, определяющих опухание суставов у больных, получающих L104EA29YIg (обозначенный на фигурах как LEA) или плацебо, во времени показано на Фигурах 14А и В. Изменение по сравнению с базовой линией (например, уменьшение опухания суставов), по-видимому, более значимо в группах, принимающих 2 и 10 мг/кг активного вещества, чем в группе, принимающей плацебо, или в группе, принимающей 0,5 мг/кг L104EA29YIg.

Средние показатели оценки боли у пациентов, получающих L104EA29YIg (обозначенный на фигурах как LEA) или плацебо, во времени даны на Фигуре 15. Изменение по сравнению с базовой линией (например, уменьшение боли), по-видимому, зависит от дозы.

Средние показатели интенсивности заболевания по оценке больного и врача, у пациентов, получающих L104EA29YIg (обозначенный на фигурах как LEA) или плацебо, во времени представлены на Фигурах 16А и В. Изменение по сравнению с базовой линией (например, уменьшение интенсивности заболевания), по-видимому, зависит от дозы.

Уменьшение физической нетрудоспособности (улучшение состояния) в процентах по оценке HAQ на 85 день для больных, получающих CTLA4Ig, L104EA29YIg или плацебо, показано на Фигуре 17 (Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J.F., et al., 1982, J. of Rheumatology 9:789-793). Наблюдается четкая зависимость улучшения этого параметра от дозы.

Изменения уровней растворимого IL-2r и С-реактивного белка, по сравнению с базовой линией (фоном), зависит от дозы в обеих группах, проходящих лечение. После курса лечения уровни IL-2r составляют -2%, -10% и -22% для CTLA4Ig и -4%, -18% и -32% для L104EA29YIg при 0,5; 2,0 и 10 мг/кг, соответственно, по сравнению с +3% для плацебо. Уровни C-реактивного белка составляют +12%, -15% и -32% для CTLA4Ig и +47%, -33% и -47% для L104EA29YIg при 0,5; 2,0 и 10 мг/кг, соответственно, по сравнению с +20% для плацебо (Фигура 7А).

Ничего клинически значимого в том, что касается соответствующих гематологических испытаний, лабораторных химических анализов, за исключением слабой супрессии уровней IgA и IgB при более высоких дозах обоих лекарственных веществ, физических изменений или изменений показателей жизненно важных функций, не наблюдается. Следует отметить, что медикаментозное лечение не индуцирует антитела к лекарственным веществам.

Пример 4

В следующих примерах описывается II стадия (фаза) клинических испытаний на людях, которым вводят L104EA29YIg для уменьшения или предупреждения структурного нарушения, - включая узурацию (истончение) костей и суставов, - оцениваемого по установленной радиографической (рентгенографической) шкале. Это улучшение, наблюдаемое как ослабление или предотвращение структурного поражения, происходит одновременно (параллельно) с клиническими улучшениями, определяемыми с помощью клинических показателей.

Состояние структуры костей проверяют у некоторых больных (людей) перед терапией с помощью CTLA4Ig или L104EA29YIg. Этим больным вводят 0,5-20 мг/кг CTLA4Ig или L104EA29YIg постоянно через каждые две недели - двенадцать недель (самостоятельно или в сочетании с другими агентами) для поддержания состояния терапевтического улучшения во времени. Радио(рентгено)граммы кистей рук и стоп ног снимают через предварительно определенные интервалы: 6 месяцев, а затем ежегодно, как рекомендовано FDA-руководствами. Этих больных проверяют через 6 и 12 месяцев для того, чтобы определить, замедляет ли терапия с помощью CTLA4Ig или L104EA29YIg прогрессирующее разрушение костей, а затем ежегодно. Больных проверяют радиографическими методами, включая рентгеновскую и/или ЯМР-томографию, в соответствии со стандартной практикой, принятой в данной области техники (Larsen, A.К. and M.Eak, 1977, Acta Radiol. Diag. 18:481-491; Sharp, J.T., et al., 1985, Arthritis and Rheumatism 28:1326-1335). Результаты радиографических данных оценивают с целью предупреждения структурного поражения, включая замедление прогрессии истончения костей и поражения хряща, с одновременным уменьшением толщины суставов и/или предотвращением новой узурации.