способ обнаружения некультивируемых форм vibrio cholerae о1 и о139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии

Формула изобретения

1. Способ обнаружения некультивируемых форм Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии, отличающийся тем, что проводят предварительную подготовку бактериальной взвеси некультивируемых форм Vibrio cholerae O1 и O139 и бактериальной взвеси контрольного штамма Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп, определяют рабочее разведение бактериальных взвесей и конъюгата моноклональных антител (МКА), отбирают специфические МКА к консервативным и лабильным эпитопам ЛПС с последующей постановкой реакции дот-ИФА или твердофазного ИФА, регистрацией проявления цветового пятна или оптической плотности образца соответственно и по интенсивности окрашивания или оптической плотности выше 0,2-0,65 делают заключение о присутствии в образце некультивируемых форм Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп и их потенциальной способности к реверсии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительную подготовку некультивируемых форм производят путем их концентрации до 10⁶-10⁷ м.кл/мл. с последующим обеззараживанием, для этого к 1 мл микробной взвеси добавляют 20 мкл 4% стерильного раствора гентамицина с последующим охлаждением проб до 3-4°С в течение 2 ч.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактериальную взвесь контрольного штамма Vibrio cholerae О1 или Vibrio cholerae О139 готовят из 18-часовой культуры, выросшей на агаре Маретна, после этого ее суспендируют в физиологическом растворе рН 7,6 до конечной концентрации 10⁷ м.кл/мл.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют набор специфических моноклональных антител, полученных к различным эпитопам О-антигена ЛПС штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, а именно: 3A₉, D₁₁, B₁₁, 3Е₄ , 4Н₅, D₈D₆, С₃В ₄, F₈G₁₂, F₁₁E₅ .

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для специфической индикации и оценки потенциальной способности к реверсии некультивируемых форм холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, находящихся в водных объектах.

В настоящее время в мире ежегодно регистрируются случаи заболевания холерой, и сохраняется опасность завоза инфекции из эндемичных территорий. В сохранении возбудителя в окружающей среде немаловажную роль играют некультивируемые формы.

Большинство микроорганизмов, в том числе и холерный вибрион, способны в неблагоприятных условиях переходить в некультивируемое состояние (НС), в связи с чем некультивируемые формы (НФ) утрачивают способность расти на лабораторных питательных средах. Тем самым НФ ускользают из поля зрения при проведении мониторинговых мероприятий. Известная на данный момент способность к реверсии при наступлении благоприятных условий и сохранение вирулентности у ревертантов диктует необходимость разработки простых и наглядных методов обнаружения НФ холерных вибрионов в различных объектах.

Перспективным инструментом исследования являются моноклональные антитела (МКА), которые обладают высокой специфичностью, стандартностью и технологичностью получения.

Известен способ обнаружения опухолевого маркера RSP в жидкостях тела (см. RU пат. №2025734, кл. G 01 N 33/53, 30.12.1994), заключающийся в использовании анти-RSP антител (2S рАВ), выбранных из одного или нескольких моноклональных, поликлональных или очищенных по принципу сродства антител для захвата опухолевого маркера из образца биологической жидкости, путем реакции с РНК - фотобиотин - стрептавидин - щелочной фосфатазой, причем присутствие опухолевого маркера в образце обнаруживается посредством детектирующих систем в реакции проявления цвета.

Однако известный способ не может быть использован для выявления некультивируемых форм холерных вибрионов, так как применяемые в нем специфические моноклональные антитела (МКА) направлены к транспортной рибонуклеиновой кислоте (т-РНК) эукариотической клетки, а не к поверхностным клеточным антигенным структурам микроба.

За прототип выбран способ индикации холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы посредством специфических МКА к липополисахариду (см. статью Алексеевой Л.П., Чемисовой О.С., Маркиной О.В. и др., журнал «Биотехнология», 2002, №2, стр.79-83), заключающийся в проведении твердофазного ИФА со специфическими МКА, направленным на обнаружение бактериальных клеток V.cholerae и на предотвращение перекрестных реакций с бактериями, вступающими во взаимодействие с поликлональной О-холерной сывороткой.

Недостатком известного способа является то, что он не предназначен для выявления некультивируемых форм (НФ) холерных вибрионов ввиду того, что некультивируемые холерные вибрионы отличаются представленностью и степенью экспонирования эпитопов, а их ЛПС чувствителен к нагреванию.

Эти обстоятельства указывают на невозможность выявить и охарактеризовать в динамике состояние поверхностных клеточных антигенных структур НФ холерных вибрионов посредством МКА к О-полисахариду для подтверждения таксономической принадлежности НФ и способности их к реверсии.

Задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа, позволяющего проводить специфическую индикацию и прогнозировать потенциальную возможность реверсии некультивируемых форм.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе обнаружения некультивируемых форм Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии проводят предварительную подготовку бактериальной взвеси некультивируемых форм Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп и бактериальной взвеси контрольного штамма Vibrio cholerae О1 и О139, определяют рабочее разведение бактериальных взвесей и конъюгата моноклональных антител (МКА), отбирают специфические МКА к консервативным и лабильным эпитопам ЛПС с последующей постановкой реакции дот-ИФА или твердофазного ИФА, регистрацией проявления цветового пятна или оптической плотности образца соответственно и по интенсивности окрашивания цветового пятна или по оптической плотности выше 0,2-0,65 делают заключение о присутствии в образце некультивируемых форм Vibrio cholerae О1 и О139 и их потенциальной способности к реверсии.

При этом предварительную подготовку НФ проводят путем их концентрации до 10⁶-10⁷ микробных клеток/мл с последующим обеззараживанием, для этого к 1 мл микробной взвеси добавляют 20 мкл 4% раствора гентамицина с последующим охлаждением проб до 3-4°С в течение двух часов.

Кроме того, бактериальную взвесь контрольного штамма Vibrio cholerae О1 или Vibrio cholerae О139 готовят из 18-часовой культуры, выросшей на агаре Мартена, после этого ее суспендируют в физиологическом растворе рН 7,6 до конечной концентрации 10⁷ м.кл/мл.

В предлагаемом способе используют набор специфических моноклональных антител, полученных к различным эпитопам O-антигена ЛПС штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, а именно: 3А₉, D ₁₁, В₁₁, 3Е₄, 4Н₅, D ₈D₆, С₃В₄, F₈ G₁₂, F₁₁Е₅.

Способ осуществляется по следующим этапам:

I. Первоначально проводят подготовку некультивируемых форм (НФ) холерных вибрионов.

II. Определяют рабочее разведение конъюгата для специфических МКА.

III. Проводят реакции: дот-ИФА с МКА к О-полисахариду (I вариант, при проведении экспресс-анализа), твердофазный ИФА с МКА к О-полисахариду ЛПС (II вариант, в случае низкой концентрации клеток в исследуемой пробе).

Пример 1.

Выявляют НФ холерных вибрионов О1 и О139 серогруппы в реакции дот-ИФА (по I варианту) с МКА к О-полисахариду ЛПС (ДИА).

По первому этапу экспериментальную пробу концентрируют и обеззараживают, для этого (3 мл) помещают в пробирку и определяют концентрацию взвеси по оптической плотности (ОП) и доводят ее до 0,015-0,055, что соответствует 10⁶ -10⁷ м.кл./мл. Если показатели выше, то пробу разводят физиологически раствором, рН 7,6. Если показатели ниже, то пробу концентрируют центрифугированием 10 мин при g 10000. Для обеззараживания проб к 1 мл добавляют 20 мкл 4% раствора коммерческого препарата гентамицина с последующим охлаждением до 3-4°С в течение двух часов. В условиях экспресс-анализа выдерживают при 4°С в течение часа, продолжают анализ с соблюдением правил работы с заразным материалом. Параллельно с некультивируемыми пробами готовят бактериальную взвесь контрольного штамма V.cholerae O1 или V.cholerae O139. Для этого 18-часовую культуру, выросшую на агаре Мартена, суспендируют в физиологическом растворе рН 7,6 до конечной концентрации 10⁷ кл/мл.

Для второго этапа нитроцеллюлозную мембрану нарезают и расчерчивают на квадраты со стороной 5 мм, после чего ее помещают в чашку Петри малого диаметра и на каждый квадрат наносят 2 мкл взвеси клеток контрольного штамма и высушивают на воздухе. Проводят отмывку один раз фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и на 30 минут помещают в раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), после чего снова отмывают ФСБ один раз.

В лунках 96-луночного планшета титруют препараты МКА с шагом 1:2, начиная с разведения 1:10 до 1:640. В пластиковую чашку Петри диаметром 40 мм вносят 2-5 мл раствора МКА, погружают в него НЦМ и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. Мембраны отмывают ФСБ или дистиллированной водой 3 раза по 5 минут, затем помещают в раствор конъюгата антимышиных иммуноглобулинов (производства НИИЭМ им Гамалеи) на 45 минут. Снова трижды отмывают. На мембрану наносят 0,02% раствор диаминобензидина на 3-5 минут. Реакцию останавливают, помещая мембрану в дистиллированную воду, после чего НЦМ высушивают на воздухе. Для работы отбирают то разведение МКА, при котором получена максимальная интенсивность цветового пятна.

Затем НЦМ сенсибилизируют и обрабатывают, как описано во втором этапе. Мембрану на 60 мин помещают в рабочий раствор препаратов МКА, после чего отмывают, как было изложено выше. Конъюгат антимышиных иммуноглобулинов в объеме 100 мкл титруют в лунках полистиролового планшета. НЦМ инкубируют с конъюгатом 40 мин. Затем вносят 0,02% раствор БСА, останавливают реакцию дистиллированной водой, после чего НЦМ высушивают на воздухе. В пробу берут то разведение конъюгата, которое обеспечивает наибольшую интенсивность окраски.

Третий этап заключается в непосредственном проведении ДИА с некультивируемыми пробами и учете результатов.

Исследуемые пробы обеззараживают, как указано в первом этапе. НЦМ расчерчивают на квадраты и помещают в чашку Петри. На каждый квадрат наносят 2 мкл исследуемой пробы, подсушивают на воздухе. Параллельно в качестве контроля исследуют контрольный штамм V.cholerae O1 и V.cholerae O139. Сенсибилизированную НЦМ промывают один раз ФСБ. Затем помещают в 1% раствор БСА на 30 мин, после чего промывают один раз ФСБ. 3-5 мл препарата МКА вносят в чашку Петри малого диаметра и помещают в нее сенсибилизированную НЦМ на 60 мин при комнатной температуре. Отмывают мембрану три раза по 5 мин ФСБ или дистиллированной водой. Затем НЦМ инкубируют с конъюгатом антимышиных иммуноглобулинов 45 мин. Мембрану отмывают три раза, обрабатывают 0,02% раствором диаминобензидина 3-5 минут и останавливают реакцию внесением мембраны в дистиллированную воду. Результаты учитывают визуально по интенсивности окрашивания пятна.

Препараты специфических МКА, полученных к различными эпитопам O-антигена ЛПС штаммов холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы: 3А₉, D₁₁, F₈G ₁₂, D₈D₆ исследуют с некультивируемыми пробами в различных водных образцах (см. таблицы 1 и 2).

Из приведенных в таблице 1 данных видно, что холерные вибрионы O1 серогруппы как в бактериальной, так и в измененной переходной или некультивируемой форме взаимодействуют со специфическими МКА в реакции ДИА.

Исходные бактериальные (строка 1), переходные (строка 2), НФ (строки 3-9) любого возраста взаимодействуют с МКА к эпитопу D₈D₆ в речной, морской, дистиллированной воде и растворе 0,85% NaCl. Степень проявления цветового пятна кореллирует с возрастом популяции, снижаясь по мере старения (строки 4 и 7).

Интенсивность взаимодействия холерных вибрионов с МКА к эпитопу F₈G₁₂ в ДИА зависит от возраста некультивируемой популяции и ее способности к реверсии. В пробах, утративших способность возобновлять рост, цветовое пятно отсутствует пли проявляется очень низкой интенсивности (строки 4, 7, 9). Положительные взаимодействия с МКА к F ₈G₁₂ регистрируются в пробах, способных к реверсии в благоприятных условиях (строки 1, 2, 3, 5, 6, 8).

Как видно из приведенных в таблице 2 данных, холерные вибрионы O139 серогруппы, как в бактериальной, так и в измененной некультивируемой или переходной форме, взаимодействуют со специфическими МКА к ЛПС.

Исходные бактериальные (строка 1), переходные (строка 4), НФ (строки 2, 3, 5, 6, 7, 8) любого возраста взаимодействуют с МКА к 3А₉ в речной, морской, дистиллированной воде и растворе 0,85% NaCl. По мере старения популяции снижается интенсивность проявления цветового пятна.

Интенсивность взаимодействия холерных вибрионов с МКА к F₈G₁₂ зависит от возраста некультивируемой популяции и кореллирует со способностью к реверсии. В пробах, утративших способность возобновлять рост, цветовое пятно отсутствует или проявляется в слабой степени (строки 3, 7). Положительные взаимодействия с МКА к F₈G ₁₂ регистрируются в пробах, способных к реверсии в благоприятных условиях (строки 1, 2, 5, 6, 8).

Пример 2.

Выявляют НФ холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы в реакции твердофазного ИФА (по II варианту) с МКА к O-полисахариду ЛПС (ТИФА).

Образцы НФ холерных вибрионов готовят так же, как описано в I варианте по первому этапу.

По второму этапу способа в полистироловый планшет вносят взвесь клеток в бактериальной форме, концентрация взвеси 10⁶-10⁷ м.кл./м, инактивированную гентамицином, в объеме 100 мкл. Панель сенсибилизируют 18 часов при температуре 4°С. Содержимое лунок удаляют и вносят по 200 мкл ФСБ на 30-60 сек. Процедуру отмывания повторяют дважды. После этого в лунки вносят по 100 мкл 1% БСА, затем отмывают один раз ФСБ. В лунки вносят по 100 мкл раствора препаратов МКА, приготовленных двукратным разведением, начиная с 1:10 до 1:640. Инкубируют 1 час при 37°С. Лунки трижды отмывают ФСБ или дистиллированной водой. Вносят по 100 мкл конъюгата антимышиных иммуноглобулинов. Инкубируют 45 мин при 37°С. Трижды отмывают ФСБ. Вносят орто-фенилендиамид (ОФД) и через 20 минут реакцию останавливают внесением 100 мкл серной кислоты. В работу берут то разведение препарата МКА, при которой получено максимальное значение оптической плотности (ОП).

После этого проводят сенсибилизацию планшета, как описано выше (пример 2, этап 2). В лунки вносят по 100 мкл рабочего разведения препарата МКА, инкубируют в течение часа при 37°С и отмывают троекратно ФСБ. Мышиные антитела, конъюгированные с перокидазой хрена, титруют в объеме 100 мкл. Панель инкубируют и отмывают, как описано в этапе 2. В лунки вносят 0,04% раствора ОФД и через 20 минут реакцию останавливают 1М серной кислотой. Выбирают ту концентрацию разведения конъюгата, при которой показатели оптической плотности (ОП) максимальные.

Третий этап - проведение реакции твердофазного ИФА (ТИФА) с НФ холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы.

В лунки планшета вносят по 100 мкл исследуемой пробы. Панель инкубируют 18 часов при температуре 4°С. Содержимое лунок удаляют, лунки дважды отмывают 200 мл ФСБ. Вносят по 100 мкл 1% БСА, после чего промывают один раз ФСБ. Вносят 100 мкл рабочего разведения МКА, инкубируют 1 час при 37°С и отмывают трижды ФСБ. Добавляют 100 мкл ОФД и через 20 минут реакцию останавливают 1М серной кислотой. Результаты реакции учитывают визуально и спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность при длине волны 492 нм. Положительными считаются пробы, в которых ОП в два раза превышает показатели фоновых значений.

Препараты специфических МКА к эпитопам D₈D₆, F₁₁E₅, С ₃В₄, F₈G₁₂ ЛПС исследуют с пробами морской воды, дистиллированной воды (см. таблицы 3 и 4).

Из приведенных в таблице 3 и 4 данных видно, что оптическая плотность (ОП) прямо пропорциональна концентрации клеток в микрокосмах и плотности экспонирования эпитопов. Положительными являются пробы, в которых ОП>0,2-0,65, слабоположительными - 0,15-0,2, отрицательными - ОП<0,15.

Из приведенных в таблице 3 данных видно, что МКА к эпитопу D₈D ₆ выявляют стабильный эпитоп как в микрокосмах с морской водой, так и в дистиллированной воде. Плотность его экспонирования снижается по мере старения популяции, но положительный ответ в ТИФА наблюдается даже в пробах, утративших спсобность к реверсии.

МКА к F₁₁Е₅ также направлены к стабильному эпитопу, но плотность его экспонирования изначально ниже.

МКА к С₃В₄ и F₈G₁₂ направлены к лабильным эпитопам, которые представлены в исходных, переходных и НФ, способных к реверсии. После утраты реверсируемости плотность экспонирования снижается до уровня отрицательных значений.

Таблица 4 отражает взаимодействие бактериальных V.cholerae O139 и их некультивируемых вариантов со специфическими МКА: D ₁₁, B₁₁, 3А₉, 3Е₄, 4Н ₅ ЛПС в реакции ТИФА.

Из таблицы 4 видно, что МКА к D₁₁ и В₁₁ направлены к консервативным эпитопам, которые регистрируются независимо от возраста и среды микрокосма. Положительные значения получены во всех пробах, как способных к реверсии, так и нереверсируемым. В последнем случае плотность экспонирования снижена по сравнению с исходным вариантом.

МКА к 3А₉ направлены к лабильному эпитопу, который хорошо выражен в исходных и переходных культурах. Плотность экспонирования существенно снижается в НС. Указанный эпитоп не обнаружен у НФ, утративших способность к реверсии.

МКА к 4Н₅ не обнаружен у исходных и измененных вариантов, служит доказательством специфичности связывания МКА с эпитопами ЛПС.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что поверхностные антигены бактериальных клеток или НФ холерных вибрионов O139 серогруппы, потенциально способных к реверсии, взаимодействуют с МКА к эпитопам 3A ₉, D₁₁, В₁₁, 3Е₄, что проявляется в образовании коричневого пятна разной интенсивности на НЦМ в ДИА или оптической плотности образцов выше 0,15±0,025 в ТИФА. Положительные результаты взаимодействия только с МКА к эпитопам D₁₁ и В₁₁ свидетельствуют о присутствии в пробе НФ холерных вибрионов, утративших способность к реверсии.

В пробах, содержащих бактериальные или потенциально реверсируемые НФ холерных вибрионов O1 серогруппы, происходит взаимодействие с МКА к эпитопам D₈D₆, С ₃В₄, F₈G₁₂, F₁₁ Е₅, что также проявляется в образовании цветового пятна на НЦМ в ДИА или ОП не ниже 0,12±0,01 в ТИФА.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет поэтапного проведения подготовки некультивируемых форм и контрольного штамма в бактериальной форме, определения рабочего разведения МКА и конъюгата МКА, с последующим отбором специфических МКА и постановкой ДИА и ТИФА, дает возможность проводить специфическую индикацию при мониторинговых исследованиях водоисточников и прогнозировать потенциальную возможность реверсии обнаруженных НФ.

При этом в зависимости от поставленной задачи, а именно получить экспресс-ответ, позволяет проведение реакции ДИА через 2 часа, а в случае, если концентрация клеток в пробе низкая, то используют реакцию ТИФА, ответ получают через 20 часов с более высокой степенью чувствительности.

Кроме того, исследования, проведенные специалистами Ростовского-на-Дону противочумного института использования набора специфических МКА, являющихся перспективным инструментом обнаружения НФ холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп в образцах морской воды, речной воды, дистиллированной воды, одновременно подтверждают видовую принадлежность НФ роду Vibrio.

Таблица 1
№	форма	возраст, сутки	среда микрокосма	наличие окраски		Реверсия
				F8 G12	D 8D6
1	исходная	-	физиологический раствор	положительная	положительная	+
2	переходная	-	дистиллированная вода	положительная	положительная	+
3	НФ	3	дистиллированная вода	положительная	положительная	+
4	НФ	30	дистиллированная вода	отрицательная	положительная	-
5	НФ	10	морская вода	положительная	положительная	+
6	НФ	30	морская вода	положительная	положительная	±
7	НФ	90	морская вода	отрицательная	положительная	-
8	НФ	10	речная вода	положительная	положительная	+
9	НФ	90	речная вода	отрицательная	положительная	-

Таблица 2
№	форма	возраст, сутки	среда микрокосма	наличие окраски		Реверсия
				3А9	D11
1	исходная	-	физиологически раствор	положительная	положительная	+
2	НФ	3	дистиллированная вода	положительная	положительная	+
3	НФ	30	дистиллированная вода	отрицательная	положительная	-
4	переходная	-	морская вода	положительная	положительная	+
5	НФ	10	морская вода	положительная	положительная	+
6	НФ	30	морская вода	положительная	положительная	±
7	НФ	90	морская вода	слабоположительная	положительная	-
8	НФ	3	речная вода	положительная	положительная	+

Таблица 3
форма/среда/возраст	ОП E420				Реверсия
	D8D6	F11E 5	С3В 4	F8G 12
исходная	0,362±0,003	0,266±0,007	0,347±0,012	0,28±0,009	+
переходная/дист.вода	0,168±0,002	0,198±0,004	0,218±0,008	0,25±0,005	+
переходная/морская вода	0,155±0,005	0,168±0,003	0,261±0,004	0,22±0,011	+
НФ/дист.вода/3 сут	0,288±0,007	0,253±0,005	0,305±0,005	0,299±0,003	+
НФ/морская вода/10 сут	0,264±0,009	0,255±0,008	0,181±0,003	0,154±0,002	+
НФ/дист.вода/30 сут	0,251±0,002	0,218±0,004	0,155±0,015	0,09±0,006	-
НФ/морская вода/30 сут	0,237±0,007	0,2±0,003	0,145±0,02	0,03±0,007	±
НФ/дист.вода/90 сут	0,22±0,003	0,16±0,001	0,12±0,006	0,11±0,012	-
НФ/морская вода/90 сут	0,2±0,001	0,188±0,003	0,09±0,007	0,05±0,009	-

Таблица 4
форма/среда/возраст	ОП Е420					Реверсия
	D11	В11	3А 9	3Е4	4Н5
исходная	0,352±0,007	0,278±0,003	0,256±0,006	0,181±0,003	0,019±0,007	+
переходная/дист. вода	0,31±0,001	0,25±0,003	0,421±0,011	0,172±0,007	0,085±0,003	+
переходная/морская вода	0,302±0,006	0,233±0,008	0,283±0,005	0,188±0,009	0,019±0,006	+
НФ/дист. вода/3 сут	0,367±0,013	0,271±0,007	0,155±0,002	0,2±0,005	0,022±0,001	+
НФ/морская вода/15 сут	0,341±0,007	0,255±0,005	0,09±0,004	0,191±0,003	0,005±0,004	+
НФ/дист. вода/30 сут	0,315±0,003	0,255±0,005	0,09±0,003	0,15±0,001	0,002±0,001	-
НФ/морская вода/30 сут	0,248±0,009	0,225±0,003	0,084±0,008	0,185±0,004	0,002±0,006	±
НФ/дист. вода/90 сут	0,297±0,003	0,214±0,011	0,093±0,006	0,053±0,005	0,047±0,003	-
НФ/морская вода/90 сут	0,221±0,004	0,23±0,008	0,06±0,003	0,130±0,005	0,061±0,008	-