способ и мембрана для регенерации слизистой оболочки

Формула изобретения

1. Способ ускорения регенерации слизистой оболочки, отличающийся тем, что участок поврежденной слизистой оболочки покрывают восстанавливающим слизистую оболочку материалом, включающий мембрану, состоящую из очищенного коллагенового материала, полученного из природной ткани, содержащей коллаген, фиксируют мембрану на рассматриваемом участке и дают возможность восстанавливаться слизистой оболочке на указанном участке, где указанная мембрана представляет собой барьерный слой, имеющий внешнюю гладкую барьерную поверхность и, кроме того, имеющий на стороне, противоположной указанной гладкой барьерной поверхности, волокнистую поверхность.

2. Способ по п.1, где барьерный слой преимущественно состоит из коллагена типа I, коллагена типа III или их смеси.

3. Способ по п.2, где мембрана представляет собой многослойный лист из коллагенового мембранного материала, который включает матриксный слой из коллагенового материала, присоединенный к волокнистой поверхности.

4. Способ по п.3, где матриксный слой состоит из коллагена типа I, коллагена типа II, коллагена типа III, коллагена типа IV, коллагена типа VII или их комбинации.

5. Способ по п.1, где мембрана имеет толщину приблизительно 0,5-5 мм.

6. Способ по п.4, где матриксный слой состоит преимущественно из коллагена I.

7. Способ по п.4, где матриксный слой состоит преимущественно из коллагена II.

8. Способ по п.1, где мембрана содержит по меньшей мере один регенерирующий слизистую оболочку фактор роста.

9. Способ по п.8, где по меньшей мере один фактор роста выбирают из группы, включающей эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), фактор роста фибробластов ( -FGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста (TGF-P) или их смесь.

10. Способ по п.1, где повреждение слизистой оболочки представляет собой повреждение слизистой оболочки рта.

11. Регенерирующий слизистую оболочку препарат, предназначенный для усиления регенерации слизистой оболочки, включающий мембрану, состоящую из очищенного коллагенового материала, полученного из природной ткани, содержащей коллаген, где указанная мембрана представляет собой барьерный слой, имеющий внешнюю гладкую барьерную поверхность и, кроме того, имеющий на стороне, противоположной указанной гладкой барьерной поверхности, волокнистую поверхность, для применения по п.1.

12. Применение очищенного коллагенового материала, полученного из природной ткани, содержащей коллаген, для изготовления регенерирующего слизистую оболочку препарата, предназначенного для ускорения регенерации слизистой оболочки по п.1.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки создания изобретения

Область техники изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к способам регенерации слизистой оболочки.

Обсуждение существующего уровня техники

В течение последних лет стало обычным применение трансплантатов типа «расщепленного лоскута» кожи и трансплантатов типа «свободного лоскута» слизистой оболочки рта в вестибулярных углублениях и других типах вестибулопластики в полости рта (пластика свода полости рта). Кроме того, трансплантаты типа «свободного лоскута» слизистой оболочки, взятые из слизистой оболочки неба и щечной области, применяли для восстановления поверхностей присоединенной слизистой оболочки в областях лишенных зубов альвеолярных отростков, в частности, в связи с применением имплантатов корневого типа.

Несмотря на широкое применение таких методов трансплантации, разработка эффективного аллопластического материала или ксеногенного материала-заменителя для трансплантата, которые можно применять для восстановления и регенерации нормальной слизистой мембраны, позволила бы существенно расширить применение хирургических операций, связанных с пластикой свода полости рта.

Таким образом, в данной области существует необходимость в усовершенствовании методов, ускоряющих регенерацию слизистой оболочки, в целом и в частности после хирургических операций, связанных с пластикой свода полости рта

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно настоящему изобретению регенерацию слизистой оболочки ускоряют путем использования мембраны, состоящей из очищенного коллагенового материала, полученного из природных тканей, содержащих коллаген.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлен вид в плане лоскута материала, представляющего собой коллагеновую мембрану, покрывающий участок слизистой оболочки, который подлежит лечению.

На фиг.2 представлен вид сбоку мембраны, применяемой согласно настоящему изобретению.

На фиг.3 представлен вид сбоку еще одного типа мембраны, применяемой согласно настоящему изобретению.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Настоящее изобретение относится к способу ускорения регенерации слизистой оболочки. Несмотря на то что способ описан применительно к ускорению регенерации слизистой оболочки в полости рта после определенных типов хирургических операций в полости рта, следует иметь в виду, что способ можно применять для ускорения регенерации слизистой оболочки в любой части тела, где имеется повреждение слизистой ткани.

В предпочтительных вариантах осуществления способ ускорения регенерации слизистой оболочки предусматривает стадии наложения на участок, подлежащий лечению, лоскута материала, представляющего собой лист коллагеновой мембраны, где материал, представляющий собой коллагеновую мембрану, содержит по меньшей мере один слой, имеющий с одной стороны гладкую поверхность, а сторона, противоположная гладкой поверхности, имеет волокнистую поверхность, где волокнистая поверхность обеспечивает возможность клеткам расти на ней, причем коллагеновая мембрана предпочтительно содержит второй слой, состоящий в основном из коллагена типа II (коллагена II) или смеси коллагена типа I (коллагена I) и коллагена типа III (коллагена III), имеющий снаружи губчатое строение. Лоскут материала закрепляют на поврежденном участке слизистой оболочки предпочтительно с помощью шовного материала и слизистой оболочке дают возможность регенерироваться.

Согласно настоящему изобретению, как это показано на фиг. 1, повреждение на слизистой оболочке М восстанавливают, покрывая поврежденный участок лоскутом 10 и закрепляя лоскут по краям слизистой оболочки вокруг повреждения. Затем дают возможность регенерироваться слизистой оболочке на закрытом лоскутом участке. Как показано на фиг.1, лоскут 10 закрепляют на поверхности слизистой оболочки М с помощью шовного материала 12. В альтернативном варианте лоскут можно закреплять над поврежденным участком, присоединяя с помощью адгезива лоскут к слизистой оболочке хозяина или другим структурам, окружающим поверхность, подлежащую лечению, например, с помощью известного в данной области органического клея, или с помощью другого пригодного метода.

Лоскут 10 изготавливают из препарата, представляющего собой коллагеновую мембрану, обладающую необходимостью гибкостью для плотного примыкания к имеющей определенную форму поверхности участка слизистой оболочки, на который ее помещают. В предпочтительном варианте осуществления коллагеновая мембрана состоит по меньшей мере из одного коллагенового слоя, имеющего достаточную прочность для того, чтобы можно было использовать шовный материал для ее прикрепления к слизистой оболочке и для обеспечения защиты поверхности слизистой оболочки от травмы в процессе заживления.

Первый вариант коллагеновой мембраны, которую можно применять в качестве лоскута согласно настоящему изобретению, представлен на фиг.2 под номером 14. Мембрана 14 содержит один коллагеновый слой 16, имеющий с одной стороны гладкую поверхность 18 и текстурированную или волокнистую поверхность 20 с другой стороны, противоположной гладкой поверхности. Гладкая поверхность 18 предпочтительно не должна являться пористой для обеспечения механической защиты, например, в процессе еды. Конфигурация волокнистой поверхности 20 приспособлена для обеспечения возможности роста клеток на ней. При практическом применении гладкую поверхность предпочтительно ориентируют в направлении, противоположном поверхности, подлежащей обработке, а волокнистую поверхность предпочтительно ориентируют в направлении участка, подлежащего обработке.

В предпочтительных вариантах осуществления коллагеновый слой 16 состоит преимущественно из коллагена I, коллагена III или из их смеси Одним из материалов, которые можно применять для данной цели, является Biogide^®, выпускаемый фирмой Ed. Geistlich Söhne AG für Chemische Industrie, которая является правоприемником настоящего изобретения. Biogide ^® описан в патенте США 5837278, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.

На фиг.3 представлена многослойная коллагеновая мембрана 14, которую можно применять в качестве лоскута согласно настоящему изобретению. Как представлено на фиг. 2, эта мембрана содержит первый коллагеновый слой 16 и второй коллагеновый слой 22, имеющий снаружи губчатую структуру. Второй коллагеновый слой 22 предпочтительно прикрепляют к волокнистой поверхности 20 первого коллагенового слоя 16 для того, чтобы потом поместить его на поверхность слизистой оболочки для ускорения регенерации слизистой оболочки. Второй слой 22 может состоять из коллагена I, II, III, IV или VII или из любой комбинации коллагенов этих типов, но предпочтительно он состоит в основном из коллагена I, коллагена II или из комбинации коллагена I и коллагена III (например, 95% коллагена I и 5% коллагена типа III). При использовании комбинации первого (16) и второго (22) слоев увеличивается толщина мембраны 14', что позволяет облегчить процедуру ее применения и улучшить процесс заживления. Толщина мембраны может варьироваться в зависимости от цели применения, но обычно она составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 мм, предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 5 мм, при этом наиболее предпочтительной является толщина приблизительно 3 мм.

Для вариантов осуществления, представленных на фиг.2 и 3, первый слой 16 можно получать различными путями, включающими (но не ограничиваясь ими) стадии процесса, описанные в патенте US 5837278; путем деаэрации и сушки на воздухе суспензии (прозрачная напоминающая пленку мембрана); путем деаэрации и вакуумной сушки суспензии (прозрачная напоминающая пленку мембрана), или использовать для него подвергнутые прессованию губчатые материалы. Первый слой 16 можно изготавливать из коллагена I, II, III или IV или из комбинации коллагенов этих типов.

Второй губчатый слой 22 в варианте осуществления, представленном на фиг. 3, предпочтительно получают путем сушки вымораживанием коллагеновой суспензии. Второй слой 22 можно изготавливать из коллагена I, II, III, IV или VII или из комбинации коллагенов этих типов. Предпочтительно второй слой изготавливают из коллагена I, коллагена II или из смеси коллагена I и коллагена III

Второй коллагеновый слой 22 можно изготавливать из вещества, полученного из организма коров или свиней, предпочтительно из организма свиней.

В варианте, представленном на фиг.3, первый (16) и второй (22) слои мембраны можно соединять друг с другом или объединять любым пригодным методом. Тремя примерами методов, которые можно применять для этой цели, могут служить: прикрепление первого слоя мембраны ко второму слою мембраны с помощью фибринового клея; прикрепление первого слоя мембраны ко второму слою мембраны с помощью коллагеновой суспензии; или нанесение на первый слой мембраны покрытия из коллагеновой суспензии, содержащей коллаген требуемого типа, с последующей сушкой вымораживанием полученной комбинации.

При необходимости в состав мембраны можно вводить факторы роста, такие как EGF (эпидермальный фактор роста), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста), -FGF (фактор роста фибробластов), PDGF (тромбоцитарный фактор роста), TGF- (трансформирующий фактор роста), которые ускоряют регенерацию слизистой оболочки, и/или их можно наносить на мембрану, которую помещают на слизистую оболочку

Пример 1

Получение лоскута

(А) Первый слой мембраны получают согласно методу, описанному в WO 93/11723 (препарат, содержащий очищенный коллаген типа I, полученный из свиной кожи), который включен в настоящее описание в качестве ссылки. Полученные в итоге промытые волокна не подвергают сушке вымораживанием, но продукт подвергают вакуумной деаэрации при нанесении в виде полос и сушат в ламинарном потоке воздуха при комнатной температуре.

(Б) Второй слой мембраны получают согласно методу, описанному в WO 93/11723 (препарат, содержащий очищенный коллаген типа I, полученный из свиных сухожилий). Полученные в итоге промытые волокна не подвергают сушке вымораживанием. Их снова подкисляют с помощью соляной кислоты до получения значения рН 2,9-3,2, при этом содержание сухого вещества составляет 1,2-1,8%. Полученную суспензию сушат вымораживанием, получая продукт в виде губки.

(В) Первый и второй слои мембраны объединяют путем нанесения на одну сторону первого слоя мембраны указанной выше суспензии, имеющей значение рН 2,9-3,2. Суспензию превращают в продукт в виде губки и сушат вымораживанием.

Пример 2

Получение лоскута

(A) Первый слой мембраны получают согласно методу, описанному в патенте US 5837278.

(Б) Второй слой мембраны получают согласно методу, описанному в WO 99/19005, который включен в настоящее описание в качестве ссылки, получая суспензию коллагена типа II. Следует отметить, что процесс получения замороженной хрящевой ткани от момента взятия ее от только что убитых свиней до стадии промывки холодной водой занимает достаточно много времени, в течение которого значение рН понижается до 3-3,5. После этого продукт 5 раз подвергают гомогенизации и разбавляют водой, получая гомогенную массу, имеющую содержание сухого вещества 0,5-2,0%.

(B) Первый и второй слои мембраны объединяют путем нанесения полученной на предыдущей стадии суспензии на первый слой. Через 30 мин объединенный продукт сушат вымораживанием.

Пример 3

Получение лоскута

(А) Первый слой мембраны получают согласно методу, описанному в патенте US 5837278.

(Б) Второй слой мембраны получают путем обработки обезжиренных свиных кож в течение приблизительно 4 ч при приблизительно 20°С 1 н. раствором гидроксида натрия, затем обработки в течение приблизительно 2 ч при приблизительно 20°С 1 н. раствором соляной кислоты и гомогенизации согласно процессу, описанному в примере 2.

(В) Первый и второй слои мембраны объединяют путем нанесения полученной на предыдущей стадии суспензии на первый слой. Через 30 мин объединенный продукт сушат вымораживанием.

Пример 4

Получение лоскута

(A) Первый слой мембраны получают путем сушки суспензии, полученной согласно методу, описанному в примере 3, удаляя воду с помощью ацетона, после чего содержащий ацетон влажный продукт зажимают между двух стеклянных пластин и ацетон удаляют в вакууме в течение приблизительно 48 ч при давлении менее приблизительно 1 мбар и при температуре приблизительно 35°С.

(Б) Второй слой мембраны получают путем смешения равных количеств суспензий, полученных на вторых стадиях примеров 2 и 3, и сушки вымораживанием полученной смеси с образованием продукта в виде губки.

(B) Первый и второй слои мембраны объединяют путем склеивания с помощью фибринового клея.

Пример 5

Тестирование

Предназначенный для исследования материал мембраны, состоящий из двух слоев, получали из свиного коллагена типа I и типа III. Глубокий или внутренний (второй) слой коллагеновой мембраны имел шероховатую поверхность, которую помещали на обработанный хирургическим путем участок хозяина для облегчения образования сгустка крови и стимуляции неоангиогенеза. Внешний (первый) слой двухслойной коллагеновой мембраны имел гладкую структуру и обладал упругими характеристиками, достаточными для того, чтобы лоскут можно было прикреплять с помощью шовного материала к краям слизистой оболочки хозяина и защищать материалы трансплантата (лоскута) от травмы при нахождении в полости рта в процессе биоразложения и заживления. Во всех случаях участками для тестирования служили четыре квадрата слизистой оболочки рта взрослых бабуинов Papio anubis. В вестибулярных областях клыка и премоляра вырезали участок эллиптической формы размером 3 см×2 см до глубины слоя, расположенного под слизистой оболочкой. Такая модель позволяла получить двенадцать образцов для исследования в областях вестибулярных углублений.

Кроме того, для оценки эффективности материала при его применении в качестве основы для приживления присоединенной мембраны слизистой оболочки в лишенных зубов областях альвеолярных отростков, использовали лишенные зубов участки присоединенной слизистой оболочки верхней челюсти. У трех животных вырезали по участку поверхности неба размером 1,5 см×3 см, расположенному билатерально вдоль гребня отростка, находящегося на расстоянии 1 см от буккальной поверхности и гребня отростка.

Материал мембраны помещали и закрепляли по краям поверхности слизистой оболочки хозяина с помощью узловых швов с использованием найлонового моноволоконного шовного материала с номером 4-0. (Общее количество швов для закрепления каждой коллагеновой мембраны варьировалось от 10 до 16). После операции в течение четырех дней животным вводили внутримышечно антибиотическое лекарственное средство, содержащее 150000 ед. пенициллина, прокаина и 150000 ед. бициллина. Животных содержали на обычной диете и давали возможность свободно передвигаться кругами в больших клетках.

По истечении трехнедельного и шестинедельного периодов осуществляли биопсию из вестибулярных областей, подвергнутых хирургическому вмешательству. Через три недели осуществляли биопсию каждого животного с одной стороны (2 квадратных участка) в области, простирающейся от верхней части нативной оставшейся поверхности слизистой оболочки хозяина через поверхность материала мембраны до противоположного нижнего края участка слизистой оболочки трансплантата хозяина. Поверхности образцов метили соответствующим образом с помощью шовного материала в целях идентификации их ориентации при проведении гистологических исследований. Подвергнутую биопсии область закрывали с помощью узловых швов и оставлял для заживления. Два квадратных участка у каждого животного сохраняли в течение шести недель, после чего вырезали всю область и поверхность слизистой оболочки отделяли и сводили вместе для осуществления первичного смыкания.

Аналогичным образом осуществляли биопсию областей присоединенной слизистой оболочки: через 3 недели - с одной стороны, а через 6 недель - с другой стороны у каждого животного, отбирая каждый раз по три образца.

Во всех случаях шовный материал удаляли на 14-й день после операции. Клинический послеоперационный период для животных проходил без осложнений. Не наблюдалось клинических проявлений воспаления или инфекции, а также отделения материала мембраны. Мембраны оставались на месте и на краях проявлялось постепенное восстановление эпителия от периферических участков поверхностей слизистой оболочки хозяина. Участки остаточного материала мембраны обнаруживались в клинических условиях в течение 2-3 недель после операции. Через 6 недель во всей подвергнутой хирургическому вмешательству области эпителий восстанавливался с образованием слизистой оболочки, имеющей нормальный вид.

По истечении 3 недель биопсии свидетельствовали о восстановлении эпителия на краях участка с образованием нормальной сетчатой структуры. Были видны области разлагающегося коллагена, включающие эпителий, распространяющийся по поверхности мембраны. В центральной части мембраны размером приблизительно 0,5×0,3 см (исходный размер 3×2 см) восстановления эпителия не наблюдалось.

В образцах, взятых через 6 недель, наблюдалось очень хорошее развитие поверхности слизистой оболочки на всей площади, закрытой лоскутом, при этом по данным биопсии полностью вырезанного закрытого лоскутом участка наблюдался неоангиогенез в слое, расположенном под слизистой оболочкой, и образование нормально расслоенного сквамозного эпителия. Наблюдалась полная приживляемость материала мембраны. Можно было видеть лишь небольшие участки остаточного коллагена под поверхностью эпителия. В качестве красителей использовали трихромовый краситель Мазона и гематоксиклин и эозин.

Для обеспечения полного исследования всех закрытых лоскутом областей получали большое количество срезов с образцов, взятых через шесть недель, при этом по данным гистологического анализа не было обнаружено остатков материала мембраны.

При помещении лоскута на заднюю часть альвеолярного отростка и поверхность неба верхней челюсти наблюдалось замещение мембраны, аналогичное тому, которое происходило в исследованной области типа вестибулярного углубления. Через три недели наблюдалось присутствие остатков материала мембраны в центральной части области, закрытой лоскутом. Можно было обнаружить фибробласты и эпителий, распространяющийся от периферических краев области, закрытой лоскутом. Во всех образцах, взятых через шесть недель, была обнаружена новая присоединенная слизистая оболочка на гребне альвеолярного отростка и на щечной стороне альвеолярного выступа. Это свидетельствует о полной приживляемости материала и очень хорошем восстановлении присоединенной слизистой оболочки.

Данные гистологического анализа свидетельствуют о том, что этот материал можно применять для восстановления присоединенной слизистой оболочки в задней области верхней челюсти при использовании имплантатов корневого типа, хотя эффективность для этой области специально не изучалась в данном опыте.

Участки для вестибулярной трансплантации у животных были выбраны в области вестибулярной слизистой оболочки у клыков на верхней и нижней челюсти и у премоляра. Эта область наиболее чувствительна к травме у бабуина Papio anubis в процессе еды и разжевывания пищи и она может служить в качестве наиболее стрессовой тест-области. Таким образом материал помещали в условия, в которых имелась высокая вероятность травмы с последующей инфекцией и отделением лоскута. Таких случаев не наблюдалось ни в одной из исследованных областей, материалы оставались на месте и подвергались очень слабому процессу биоразложения в результате клеточной активности.

На основании результатов этих опытов было сделано заключение о том, что коллагеновая мембрана, используемая в качестве лоскута согласно настоящему изобретению, представляет собой очень хороший заместитель аутогенных трансплантатов мягких тканей. Некоторые типы аллопластичных или аллогенных поверхностных повязок имеют тенденцию вызывать контрактуру раны и образование рубца. Для поверхностных повязок из искусственной кожи характерна тенденция либо преждевременно подвергаться биоразложению и отслаиваться, либо сохраняться в течение продолжительного периода времени, что сопровождается длительной воспалительной реакцией. При использовании настоящего изобретения не было выявлено ни образования рубцов, ни продолжительной воспалительной реакции. Не было выявлено каких-либо проявлений фиброза слоя, находящегося под слизистой оболочкой, что иногда наблюдается при использовании хирургических повязок.

Таким образом, по-видимому, предлагаемый материал можно применять в качестве заместителя трансплантатов типа «свободного лоскута» слизистой оболочки или трансплантатов типа «расщепленного лоскута» кожи при сохранении высоты вестибулярной полости и при восстановлении присоединенной слизистой оболочки в области введения имплантатов корневого типа. Одним из очевидных преимуществ такого способа является то, что мембрана (а) подвергается биоразложению, не вызывая вредной воспалительной реакции, (б) усиливает регенерацию в области, имеющей нормальную слизистую оболочку, и (в) технически пригодна для применения при хирургическом вмешательстве и выдерживает наложение швов.

Поскольку в представленных в настоящем описании вариантах осуществления могут быть сделаны многочисленные модификации, вариации и изменения отдельных деталей, то подразумевается, что все варианты, представленные в приведенном выше описании и проиллюстрированные на сопровождающих чертежах, следует рассматривать лишь в качестве иллюстраций, которые не ограничивают объем изобретения.