питательная среда (жидкая) для культивирования сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов

Формула изобретения

Питательная среда (жидкая) для культивирования сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов, содержащая питательную основу, натрия хлорид и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит дрожжевой экстракт в качестве стимулятора роста, в качестве питательной основы - патоку рафинадную, воды - водопроводную воду, при следующем содержании ингредиентов, г/л:

Патока рафинадная	20,0
Дрожжевой экстракт	10,0
Натрия хлорид	5,0
Водопроводная вода	Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред для культивирования сибиреязвенного микроба и близкородственных спорообразующих сапрофитов (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus) в процессе производства сибиреязвенных вакцин, антраксина, биотерапевтических препаратов, а также в научно-исследовательских целях.

Известна питательная среда следующего состава, г/л: 1% пептона, 0,5% х. ч. натрия хлорида, мясная вода - до 1 л, рН 7,3±0,1 (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О.Биргера, М.: Медицина, 1982, с.48).

Недостатком данной среды является использование дорогостоящих ингредиентов.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда бульон Хоттингера, включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса, разведенный дистиллированной водой до 1 л с содержанием общего азота 250-300 мг% и аминного азота 30-130 мг %; натрия хлорида 5,0; натрия дигидрофосфата 0,3, рН 7,4-7,6 (Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. Санкт-Петербург, 2003, с.56). Недостатками данной среды являются высокая себестоимость и сложная технология приготовления, обусловливаемые тем, что основу среды составляют продукты животного происхождения.

Цель настоящего изобретения заключается в подборе качественной дешевой основы питательных сред растительного происхождения, которая бы обеспечивала накопительный эффект и снижение ее стоимости, а также упрощение способа приготовления.

Поставленная цель достигается тем, что питательной основой предлагаемой питательной среды является патока рафинадная, натрия хлорид на водопроводной воде с добавлением в жидкую питательную среду стимулирующей добавки, причем в качестве стимулирующей добавки используют дрожжевой экстракт, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Патока рафинадная	20,0
Дрожжевой экстракт	10,0
Натрия хлорид	5,0
Водопроводная вода	остальное

Патока рафинадная (ОСТ 18-233-75) в своем составе содержит не менее 45% сахарозы. В отличие от прототипа, предлагаемая среда обеспечивает накопительные свойства, оптимальные условия и дешевизну.

Использование патоки рафинадной с дрожжевым экстрактом на водопроводной воде в качестве питательной основы является отличительным признаком предлагаемой питательной среды.

Способ поясняется следующим примером.

Питательную среду готовят следующим образом: патоку рафинадную растворяют в водопроводной воде, добавляют дрожжевой экстракт, натрия хлорид, нагревают до 60°С, доводят рН до 7,7-8,2 20% гидроокисью натрия, кипятят в течение 5 мин при помешивании. Выпавший осадок фильтруют через тканевой фильтр и фильтровальную бумагу. Устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью соляной кислоты в разведении 1:1. Готовую среду разливают в бактериологические пробирки по 10,0±0,1 мл и стерилизуют в автоклаве при 0-5 атм 30 мин.

Согласно методическим рекомендациям к контролю сред по биологическим показателям, М., 1980, готовят взвеси микробов испытуемых штаммов Bacillus anthracis 81/1, Bacillus anthracis СТИ-1 и сапрофитных спорообразующих штаммов Bacillus subtilis 3 и Bacillus mesentericus 1024, - концентрацией, равной 10 единицам оптического отраслевого стандарта мутности по ОСО ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем десятикратными разведениями в забуференном физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводят до разведения в 1 мл 100 м.к. Из данного разведения взвеси культур высевают по 0,1 мл стерильной бактериологической пипеткой по 3 пробирки опытной и контрольной сред. В качестве последней использовали заранее проверенную питательную среду (жидкую) бульон Хоттингера для культивирования микроорганизмов, рН 7,3±0,1. По 1 пробирке каждой из сред оставляли незасеянными. Посевы инкубировали при 37°С в течение 22-24 ч. Оценку ростовых свойств питательной среды проводили визуально: для сибиреязвенных штаммов 81/1 и СТИ-1 должен наблюдаться характерный рост в виде хлопьевидного осадка (комочка ваты) на дне пробирки при прозрачности надосадочного столбика жидкости с посевом из каждого разведения, тогда как для сапрофитных штаммов рост должен наблюдаться в виде равномерного помутнения бульона. Через 24 ч инкубации при 37°С рост всех тест-штаммов на экспериментальной среде был более выраженным. Из культур, выращенных на обеих средах, готовили мазки, окрашивали по Грэму и микроскопировали. Морфология вегетативных клеток была характерной для данных штаммов. Для изучения морфологии колоний из суточных культур, выращенных на экспериментальной и контрольной средах, производили посев по 0,1 мл на чашки с агаром Хоттингера, рН 7,3±0,1. Вне зависимости от среды выращивания морфология колоний была типичной для всех штаммов.

Пример 1.

Тест-штаммы выращивали на питательной среде (жидкой), содержащей, г/л: патоку рафинадную 18,0; дрожжевой экстракт 9,0; натрия хлорид 4,0; водопроводную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов наблюдался рост сибиреязвенных штаммов 81/1 и СТИ-1 в виде небольшого комочка ваты на дне пробирки в прозрачном бульоне, а для сапрофитных штаммов Bacillus subtilis 3 и Bacillus mesentericus 1024, - незначительное равномерное помутнение среды.

Пример 2.

Тест-штаммы выращивали на питательной среде (жидкой), содержащей, г/л: патоку рафинадную 20,0; дрожжевой экстракт 10,0; натрия хлорид 5,0; водопроводную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов наблюдался характерный рост сибиреязвенных штаммов 81/1 и СТИ-1 в виде выраженного комочка ваты на дне пробирки и прозрачной жидкости над ним, а для сапрофитных штаммов Bacillus subtilis 3 и Bacillus mesentericus 1024, - значительно выраженное равномерное помутнение среды.

Пример 3.

Тест-штаммы выращивали на питательной среде (жидкой), содержащей, г/л: патоку рафинадную 22,0; дрожжевой экстракт 11,0; натрия хлорид 6,0; водопроводную воду - остальное. При таком соотношении ингредиентов наблюдался рост сибиреязвенных штаммов 81/1 и СТИ-1 в виде небольшого комочка ваты на дне пробирки и прозрачной жидкости над ним, а для спорообразующих сапрофитных штаммов Bacillus subtilis 3 и Bacillus mesentericus 1024 - незначительное равномерное помутнение среды.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды (жидкой) на основе патоки рафинадной (пример 2).

Таким образом, на основании вышеизложенного можно сказать о явных преимуществах предлагаемой питательной среды, состоящей из патоки рафинадной 20 г/л, натрия хлорида 5 г/л, дрожжевого экстракта 10 г/л, водопроводной воды - остальное. Питательная среда технически проста в приготовлении (без предварительного этапа подготовки основы). Предлагаемая питательная среда дешевле, так как в основу берется растительное сырье (патока рафинадная с дрожжевым экстрактом) и для ее приготовления не требуется дистиллированной воды - среда готовится на водопроводной воде.