способ стимуляции регенерации поврежденного периферического нерва

Формула изобретения

Способ стимуляции регенерации поврежденного периферического нерва у экспериментальных животных после операции его перерезки и сшивания, включающий введение лекарственных препаратов, отличающийся тем, что в качестве лекарственных препаратов используют витамины группы В и антихолинэстеразные препараты, причем животным дополнительно в послеоперационном периоде вводят внутримышечно нейротоксин яда пестрого скорпиона в дозах 40-50 мкг/кг один раз в 2 дня в течение 30-40 дней, повторяя курс 2-3 раза с интервалом 20-30 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к нейрофизиологии и нейрохирургии, и может быть использовано для стимуляции роста нервной ткани.

Известен способ лечения повреждений периферического нерва, защищенный патентом РФ №2022558, кл. А 61 К 31/35, опубл. 15.11.1994.

Способ заключается в том, что после невролиза или шва нерва по общепринятому способу и введению лекарственных препаратов, стимулирующих регенерацию нервных волокон, препятствующих атрофии денервированных мышц и прогрессированию трофических расстройств, дополнительно осуществляют тубаж области операции гелем кверцетина и одновременно назначают пероральный прием гранул кверцетина.

Однако любой тубаж периферического нерва может привести к образованию пленки, механически препятствующей реваскуляризации как эпиневрия, так и самого ствола нерва.

Известен также способ стимуляции нервов с помощью субэпиневральной микроинъекции в периферический нерв токсина яда скорпиона, защищенный патентом РФ №2107507, кл. А 61 К 35/58, опубл. 27.03.1998.

Недостатком известного способа является то, что он может быть использован только местно, во время оперативного вмешательства и не пригоден для системного терапевтического лечения.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению, выбранным в качестве прототипа, является способ регенерации аксонов раздробленного седалищного нерва крысы, которым вводили препарат V-10367, содержащий нейротрофическое количество соединения, которое связывается с FK-506 - связывающим белком (FKBR) и нейротрофический фактор, такой как фактор роста (ФРН) (патент РФ №2197240, кл. А 61 К 31/40, опубл. 27.01.2003).

Недостатком известного способа является то, что при использовании модели раздробленного седалищного нерва не достигается полная деиннервация конечности, а также сохраняется возможность спонтанной реиннервации.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, - создание высокоэффективного способа восстановления функций конечностей после повреждения нервных тканей.

Технический результат от использования изобретения заключается в ускорении процесса регенерации и увеличении объема регенерирующих нервных волокон в периферическом нерве.

Указанный результат достигается тем, что в способе стимуляции регенерации поврежденного периферического нерва у экспериментальных животных после операции его перерезки и сшивания, включающий введение лекарственных препаратов, в качестве лекарственных препаратов используют витамины группы В и антихолинэстеразные препараты, причем животным дополнительно в послеоперационном периоде вводят внутримышечно нейротоксин яда пестрого скорпиона в дозах 40-50 мкг/кг один раз в 2 дня в течение 30-40 дней, повторяя курс 2-3 раза с интервалом 20-30 дней.

Нейротоксин яда пестрого скорпиона ранее не применялся для стимуляции регенерации поврежденного периферического нерва. Известно его применение для изучения структурно-функциональной организации быстрых натриевых каналов мембран нервных волокон. По современным представлениям механизм действия нейротоксинов яда скорпиона заключается в нарушении процесса натриевой инактивации электровозбудимых мембран нервного волокна (Каменская М.А., Нейротоксины в физиологических исследованиях. Итоги науки и техники, сер. Физиология человека и животных, М., 1982, - Т.28. - 140 с.; Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б., Зоотоксинология (ядовитые животные и их яды), М.: Высшая школа,1985, 280 с.).

Для очистки яда пестрого скорпиона и выделения из него индивидуальных нейротоксинов применяются современные методы биоорганической химии.

Так, в Институте биоорганической химии РАН им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова фракционированием яда пестрого скорпиона Buthus eupeus, обычного для Средней Азии и Закавказья, на биогеле Р-10, карбоксиметилцеллюлозе СМ-32 и ДЕАЕ-сефадексе А-50 было выделено в общей сложности 20 индивидуальных токсинов. Гомогенность всех полученных токсинов доказана диск-электрофорезом и анализом N-концевых аминокислотных остатков. (Ю.А.Овчинников, Биоорганическая химия полипептидных нейротоксинов. Химия жизни: Избранные труды / Ю.А.Овчинников, М.: Наука, 1990, с.206-293; Гришин Е.В., Солдатов Н.М., Выделение, свойства и аминокислотный состав токсинов яда среднеазиатского скорпиона Buthus eupeus, Биоорганическая химия, 1978, т.4, с.450-458).

Способ осуществляют следующим образом.

Под общим наркозом у крысы препарируют седалищный нерв или большеберцовый нерв и пересекают. Непосредственно после операции накладывают 3-4 микрохирургических шва, например, с помощью атравматической иглы фирмы «Коно» (Япония) под визуальным контролем с помощью бинокулярного микроскопа, добиваясь сопоставления друг с другом нервных пучков. Через 5-10 суток после операции животным вводят лекарственные препараты, стимулирующие регенерацию нервных волокон, препятствующие атрофии денервированных мышц и прогрессированию трофических расстройств: внутримышечно витамины B₁, В₁₂, антихолинэстеразные соединения: прозерин, дибазол в терапевтических дозах и дополнительно внутримышечно вводят нейротоксин яда пестрого скорпиона в дозах 40-50 мкг/кг 1 раз в 2 дня в течение 30 дней, повторяя курс 2-3 раза с интервалом 20-30 дней.

Пример 1.

Указанным способом у крысы перерезают и сшивают большеберцовый нерв, в результате чего наступает выпадение чувствительности на подошвенной стороне стопы - зоне локальной анестезии. У животного общепринятым способом измеряют порог болевой чувствительности (ПБЧ) к электрическому раздражителю на здоровой и оперированной конечностях. Изменения ПБЧ оперированной конечности выражают в процентах по отношению к здоровой. Сравнительные данные по значению ПБЧ под влиянием традиционной фармакотерапии, включающей внутримышечное введение витаминов B₁, В₁₂ и антихолинэстеразных соединений: прозерина, дибазола в терапевтических дозах и при дополнительном введении внутримышечно нейротоксина яда пестрого скорпиона приведены в таблице.

Поскольку критерий Левина свидетельствует о различии дисперсий распределений признаков в сравниваемых группах, был применен расчет t - критерия Стьюдента с учетом неравных дисперсий. Статистический анализ показал наличие существенных различий между сравниваемьми группами. Таким образом, можно заключить, что введение в комплексную терапию повреждений периферических нервов нейротоксина яда пестрого скорпиона статистически значимо снижает порог болевой чувствительности, что свидетельствует о большем объеме реиннервации травмированной конечности.

Пример 2.

Способ стимуляции регенерации поврежденного периферического нерва осуществляли, как описано в примере 1.

Анализ гистологических препаратов продольных срезов большеберцового нерва крыс с моделью первичной травмы (перерезка и наложение микрохирургического шва) с последующим проведением в качестве стимуляции регенерации традиционной фармакотерапии, включающей внутримышечное введение витаминов B₁, В₁₂ и антихолинэстеразных соединений: прозерина, дибазола в терапевтических дозах, а также с применением внутримышечных инъекций нейротоксина яда пестрого скорпиона показал, что в группе животных получивших традиционное лечение на фоне микрохирургического шва через 40 суток отмечен довольно компактный с отчетливыми проявлениями васкуляризации глиально-соединительнотканный рубец.

На фиг.1 (Серия традиционное лечение. Микрофото. Импрегнация серебром. Ув. 600) видны проросшие, растущие и вторично дегенерирующие нервные волокна в рубце, через 40 суток после операции. При импреганции серебром наблюдаются регенерирующие мякотные и безмякотные волокна, образующие в области рубца картину невромы. Неврома в области рубца содержит небольшое количество колб роста. Наряду с хаотичным расположением нервных волокон и невроме характерно наличие рядов аксонов, переходящих непосредственно из центрального в периферический отрезок нерва. В дистальной части периферического отрезка нерва отмечается почти полная невротизация, главным образом, тонкими и средними по диаметру аксонами.

В группе животных дополнительно к традиционному лечению получавших нейротоксин яда пестрого скорпиона через 40 суток рубец содержит меньше соединительной ткани по сравнению с традиционным лечением. Между пучками нервных волокон часто встречаются развитые капилляры артериолы, венулы, что свидетельствует о хорошей васкуляризации регенерирующего нерва (фиг.2. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 600).

При импрегнации серебром наблюдается масса регенерирующих мякотных и безмякотных нервных волокон, образующих в области рубца характерную картину регенерационной невромы с хаотичным и направленным расположением нервных волокон. Наряду с основным направленным расположением нервных волокон, переходящих в дистальный отрезок, выделяется обильный, ненаправленный рост и прохождение через рубец тонких волокон. Рост волокон в этой серии более массовый.

Пример 3.

Способ стимуляции регенерации поврежденного периферического нерва осуществляли, как описано в примере 1.

Клиническое обследование восстановления нарушенных функций конечности оперированных крыс на 30 сутки показало, что:

- ноцицептивная чувствительность ступни оперированной конечности у крыс, получавших традиционную фармакотерапию, включающую внутримышечное введение витаминов B₁, В₁₂ и антихолинэстеразных соединений: прозерина, дибазола в терапевтических дозах, было ниже, чем у экспериментальных животных, которым дополнительно вводился нейротоксин яда пестрого скорпиона;

- у крыс, получавших традиционную фармакотерапию, включающую внутримышечное введение витаминов B₁, B₁₂ и антихолинэстеразных соединений: прозерина, дибазола в терапевтических дозах, практически отсутствовало разгибательное движение стопы оперированной конечности, тогда как дополнительное введение нейротоксина яда пестрого скорпиона приводило к появлению начальных признаков экстензии;

- у большей части животных, получавших традиционную фармакотерапию, включающую внутримышечное введение витаминов В₁, B ₁₂ и антихолинэстеразных соединений: прозерина, дибазола в терапевтических дозах, наблюдалась выраженная контрактура мышц задней поверхности бедра, в то время как у крыс, которым дополнительно вводили нейротоксин яда пестрого скорпиона, мышцы были гораздо мягче и эластичнее;

- применение тепловизионного метода показало, что у крыс, получавших традиционную фармакотерапию, включающую внутримышечное введение витаминов В₁, В ₁₂ и антихолинэстеразных соединений: прозерина, дибазола в терапевтических дозах, на теплограмме подошвенной поверхности задней конечности через 30 суток после перерезки и сшивания большеберцового нерва видно снижение свечения вплоть до симптома «тепловизионной ампутации».

Теплограмма подошвенной поверхности задней конечности крысы через 30 суток после перерезки и сшивания большеберцового нерва на фоне традиционной фармакотерапии приведена на фиг.3. Видно снижение свечения вплоть до симптома «тепловизионной ампутации» на оперированной конечности.

- Теплограмма подошвенной поверхности задней конечности крысы через 30 суток после перерезки и сшивания большеберцового нерва на фоне традиционной фармакотерапии и получавших дополнительно нейротоксин яда пестрого скорпиона приведена на фиг.4. Видно отсутствие симптома "тепловизионной ампутации" на оперированной конечности.

Введение нейротоксина яда пестрого скорпиона в дозе, меньшей чем 40 мкг/кг, и менее чем 30 дней неэффективно, а в большей чем 50 мкг/кг и более чем 40 дней повышает риск возникновения побочных эффектов.

Таким образом, предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом ускоряет процесс регенерации и увеличивает объем регенерирующих нервных волокон в периферическом нерве.

Таблица
Экспериментальные группы	Среднее значение ПБЧ	Дисперсия	Стандартное отклонение	Уровень значимости	Критерий Левина
Традиционная фармакотерапия	1,16	0,019	±0,14	Р=0,027	Р<0,006
Традиционная фармакотерапия + токсин яда скорпиона	2,03	1,80	±0,33