тест-система для количественного определения анти-hbs в биологическом образце

Формула изобретения

Тест-система для количественного определения анти-HBs в биологическом образце методом иммуноферментного анализа, содержащая планшет стрипированный, сорбированный HBsAg, HBsAg- конъюгат, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, промывающий раствор, субстратный буферный раствор с перекисью водорода, хромоген, стоп-реагент, отличающаяся тем, что в качестве антигена для сорбирования планшета и для изготовления HBsAg-конъюгата, состоящего из HBsAg, конъюгированного непосредственно с ферментом пероксидазой, используют вирусбезопасный HBsAg, очищенный из плазмы осаждением иммунного комплекса, в качестве положительного контрольного образца используют иммуноглобулин человека нормальный, содержащий анти-HBs в концентрации 50 мМЕ/мл, стабилизированный нормальной донорской плазмой и мальтозой в конечной концентрации 2-20%, оттитрованный по международному стандарту содержания анти-HBs, в качестве субстратного раствора и хромогена используют 0,2%-ный раствор 3, 3', 5,5' - тетраметилбензидина в диметилсульфоксиде, разбавленный в 5 раз цитратным буфером с содержанием гидроперита в конечной концентрации 0,015% и 2-хлорацетамида в конечной концентрации 0,1%, а расчет количественного содержания антител к HBsAg осуществляют по формуле:

где СХ - концентрация анти-HBs в исследуемом образце (мМЕ/мл),

ОПср.Х - среднее значение оптической плотности исследуемого образца,

ОПср.К^- - среднее значение оптической плотности контрольного отрицательного образца,

ОПср.K₅₀ ⁺- среднее значение оптической плотности контрольного положительного образца,

50 - концентрация анти-HBs в K₅₀ ⁺(мМЕ/мл),

n - кратность разведения исследуемого образца,

при этом результаты оценивают, если Оп_ср.К^- 0,150; ОП_ср.К₅₀ ⁺>2,5 (ОП_крит.), где ОП_крит=ОП_ср.К ^-+0,060, концентрацию анти-HBs определяют, если значения ОП исследуемого образца находятся в диапазоне от ОП_крит. до 1,500 о.е., если ОП образца выходит за верхнюю границу указанного диапазона, то эмпирически подбирают его разведение.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и иммунологии и касается разработки тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В.

Известна тест-система для определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В: «Monolisa anti - HBs 3.0». Код 72400. 96 тестов. Franch National Centre for Blood Transfusion, 2000, описанная в инструкции по применению (09/95).

При использовании известной тест-системы иммуноферментный анализ (ИФА) проводится в 2 стадии, что неудобно в применении.

Наиболее близкой к заявляемой по технической сущности и достигаемому результату является тест-система для определения антител к HBs-антигену, защищенная патентом РФ №2206095, кл. C 12 N 15/51, G 01 N 33/576, А 61 К 39/29, опубл. 06.10.2003.

Известная тест-система для определения антител к HBsAg содержит стрипированный планшет, сенсибилизированный дрожжевым рекомбинантным HBsAg серотипов ау и/или ad, промывающий раствор, конъюгат биотин-HBsAg, конъюгат авидин-пероксидазу или стрептавидин-пероксидазу, субстратный буфер с перекисью водорода, хромоген, стоп-реагент, отрицательный контроль, положительный контроль в виде сыворотки крови, полученной иммунизацией здоровых доноров рекомбинантной дрожжевой вакциной против гепатита В, оттитрованной по международному стандарту содержания анти-HBs, или отраслевой стандартный образец иммуноглобулина человека против вируса гепатита В, блокатор, в виде 5%-ного раствора казеината натрия в натрий-боратном буфере с рН 8,3, референс-стандарт для количественного определения антител к HBs-антигену в виде сыворотки крови, полученной иммунизацией здоровых доноров рекомбинантной дрожжевой вакциной против гепатита В, оттитрованной по международному стандарту содержания анти-HBs, или отраслевой стандартный образец иммуноглобулина человека против вируса гепатита В и таблицу логарифмов для расчета количественного содержания антител к HBs-антигену.

При изготовлении известной тест-системы используется сложная биотин-стрептавидиновая технология введения ферментной метки, а также усложнен расчет концентрации анти-HBs - необходимо построение калибровочного графика.

В известной тест-системе для определения антител к HBs-антигену для получения иммуносорбента используется дрожжевой рекомбинантный HBsAg, в котором присутствует определенное количество белков штамма-продуцента, приводящее к повышению процента ложноположительных результатов, что требует введения дополнительного реагента - блокатора. Кроме того, положительный контрольный образец представлен лиофилизированной формой, что усложняет его производство и применение.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, - совершенствование тест-системы для определения анти-HBs в биологическом образце.

Технический результат от использования изобретения заключается в упрощении технологии производства тест-системы и способа ее применения при сохранении высокой чувствительности и специфичности.

Указанный результат достигается тем, что в тест-системе для количественного определения анти-HBs в биологическом образце методом иммуноферментного анализа, содержащая планшет стрипированный, сорбированный HBsAg, HBsAg-конъюгат, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, промывающий раствор, субстратный буферный раствор с перекисью водорода, хромоген, стоп-реагент, в качестве антигена для сорбирования планшета и для изготовления HBsAg-конъюгата, состоящего из HBsAg, конъюгированного непосредственно с ферментом пероксидазой. используют вирусбезопасный HBsAg, очищенный из плазмы осаждением иммунного комплекса, в качестве положительного контрольного образца используют иммуноглобулин человека нормальный, содержащий анти-HBs в концентрации 50 мМЕ/мл. стабилизирований нормальной донорской плазмой и мальтозой в конечной концентрации 2-20%, оттитрованный по международному стандарту содержания анти-HBs, в качестве субстратного раствора и хромогена используют 0,2%-ный раствор 3, 3',5, 5' - тетраметилбензидина в диметилсульфоксиде, разбавленный в 5 раз цитратным буфером с содержанием гидроперита в конечной концентрации 0,015% и 2-хлорацетамида в конечной концентрации 0,1%, а расчет количественного содержания антител к HbsAg осуществляют по формуле:

где СХ - концентрация анти-HBs в исследуемом образце (мМЕ/мл),

ОП_ср.Х - среднее значение оптической плотности исследуемого образца,

ОП_ср. К^- - среднее значение оптической плотности контрольного отрицательного образца,

ОП_ср.К⁺ ₅₀ - среднее значение оптической плотности контрольного положительного образца,

50 - концентрация анти-HBs в К ⁺ ₅₀ (мМЕ/мл),

n - кратность разведения исследуемого образца,

при этом, результаты оценивают, если ОП_ср.К^- 0,150; ОП_ср.К⁺ ₅₀>2,5 (ОП_крит.), где ОП_крит.=ОП_ср. К^-+0,060, концентрацию анти-HBs определяют, если значения ОП исследуемого образца находятся в диапазоне от ОП_крит. до 1,500 о.е., если ОП образца выходит за верхнюю границу указанного диапазона, то эмпирически подбирают его разведение.

Предлагаемая тест-система представляет собой набор реагентов, необходимых для количественного определения антител к поверхностному антигену возбудителя гепатита В методом ИФА в сыворотке крови или плазме, а также препаратах иммуноглобулинов. В состав тест-системы входят: иммуносорбент, конъюгат, контрольный отрицательный образец (К-), контрольный положительный образец (К⁺ ₅₀ ), оттитрованный по ОСО 42-28-320 до концентрации 50 мМЕ/мл, цитратный буферный раствор (ЦБ), содержащий водорода перекись, тетраметилбензидин (ТМБ), фосфатно-солевой буферный раствор (ФСР-Т) и раствор серной кислоты (стоп-реагент).

Для приготовления иммуносорбента и конъюгата с пероксидазой хрена используют HBsAg, очищенный из донорской плазмы оригинальным способом, позволяющим упростить технологию их изготовления и исключить риск заражения при работе с данной тест-системой с сохранением высокой специфичности и чувствительности иммуноферментного анализа ИФА.

Приготовление компонентов тест-системы осуществляют следующим образом.

1. Получение HBsAg.

Пулируют 2 л плазмы крови доноров, содержащей HBsAg в конечной концентрации 50-100 мкг/мл, и прогревают на водяной бане при температуре 60°С в течение 1 ч.

К плазме, охлажденной до температуры (2-8)°С добавляют ПЭГ-6000 до конечной концентрации 2,5-4%, выдерживают в течение ночи при температуре (2-8)°С, затем осветляют центрифугированием (ЦФ) при 15000-20000 об/мин в течение 30 мин. К 20 объемам осветленной плазмы добавляют 1 объем козьей антисыворотки против HBsAg с титром анти-HBs 1:64-1:128 в РПГ и выдерживают в течение суток при температуре (2-8)°С. Образовавшийся осадок, состоящий из иммунного комплекса HBsAg-aHra-HBs, отделяют ЦФ, и промывают от примесей других белков ресуспендированием в 40-50 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида с последующим ЦФ. Процедуру промывки иммунного комплекса повторяют 3 раза. Промытый осадок растворяют в 40-50 мл 2%-ного раствора лимонной кислоты, содержащего пепсин в конечной концентрации 1 мг/мл, выдерживают при температуре 37°С в течение суток, затем рН смеси доводят до 7,0 добавлением 1 М раствора натрия гидроокиси. К раствору добавляют твин-80 до конечной концентрации 2%, выдерживают при температуре (2-8)°С в течение суток, затем осветляют ЦФ. Раствор ультрацентрифугируют на ступенчатом градиенте плотности 20-50% раствора сахарозы при 27000 об/мин (70000 g) и температуре (18-22)°С в течение 20 ч. Собирают зону над 50%-ным раствором сахарозы, содержащую HBsAg, и диализуют против 0,9%-ным раствора натрия хлорида при температуре (2-8)°С в течение суток, затем фильтруют через стерилизующую мембрану с диаметром пор 0,22 мкм.

Полученный данным способом препарат очищенного HBsAg имеет вид слегка опалесцирующей жидкости желтоватого цвета. Концентрация белка - 2-4 мг/мл, титр HBsAg в реакции обратной пассивной гемагглютинации - 1:200000-1:400000. Препарат не взаимодействует с антисывороткой к белкам сыворотки крови человека в реакции преципитации в геле и не содержит ДНК вируса гепатита В в ПЦР-анализе. Препарат HBsAg используют в приготовлении иммуносорбента и конъюгата.

2. Приготовление иммуносорбента.

HBsAg, разведенный в 0,9%-ном растворе натрия хлорида до концентрации белка 2-4 мкг/мл вносят по 150 мкл в каждую лунку 96-луночного разборного полистиролового планшета фирмы "Costar" (США, кат. №92592) или другого аналогичного качества. Планшет герметично закрывают и выдерживают в течение суток при комнатной температуре, затем содержимое лунок удаляют. Полученный иммуносорбент высушивают на воздухе в течение суток при комнатной температуре и герметично запаивают под вакуумом в пакет из пленки металлизированной.

3. Приготовление HBsAg-конъюгата (HBsAg-ПХ).

К раствору, содержащему 4 мг пероксидазы хрена (RZ 3,0) в 1 мл воды дистиллированной, добавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,02 М раствора перйодата натрия и перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. Полученный раствор диализуют против 0,001 М Na-ацетатного буфера (рН 4,4) в течение ночи при температуре 4°С. К раствору пероксидазы добавляют 20 мкл 0,2 М Na-карбонатного буфера (рН 9,5) и 8 мг HBsAg в 2 мл того же буфера. Раствор перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, добавляют 0,1 мл свежеприготовленного водного раствора натрия боргидрида (4 мг/мл) и перемешивают в течение 2 ч при температуре 4°С. Конъюгат диализуют против 0,9%-ного раствора натрия хлорида в течение суток при температуре 4°С, затем добавляют равный объем глицерина. 4. Приготовление контрольных образцов (К^- и К⁺ ₅₀ ).

Нормальную донорскую плазму, не содержащую HBsAg, антител к HBsAg, к вирусам иммунодефицита человека ВИЧ-1, ВИЧ-2 и вирусу гепатита С, прогревают на водяной бане при температуре 60°С в течение 1 ч. Затем к плазме, охлажденной до 2-8°С, добавляют консервант фенол до конечной концентрации 0,2% и осветляют ЦФ. Используют для приготовления К^-.

Для приготовления К⁺ ₅₀ (содержащего анти-HBs в концентрации 50 мМЕ/мл; коэффициент вариации не более±10%) используют иммуноглобулин человека нормальный, содержащий анти-HBs в концентрации 50 мМЕ/мл, нормальную донорскую плазму и мальтозу до конечной концентрации 2-20%.

На протяжении срока наблюдения (12 месяцев) не было выявлено статистически достоверных изменений концентрации анти-HBs в К⁺ ₅₀ при содержании мальтозы в диапазоне от 2 до 20%. При хранении К⁺ ₅₀ без стабилизации наблюдалось снижение концентрации анти-HBs более чем на 10%. При внесении мальтозы более 20% наблюдалось снижение ее растворимости.

5. Приготовление ЦБ.

К 0,05 М цитратному буферному раствору (рН 4,0±0,1), добавляют гидроперит в конечной концентрации 0,015% и 2-хлороацетамид конечной концентрации 0,1%.

6. Приготовление ТМБ (концентрат).

Готовят 0,2%-ный раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина на диметилсульфоксиде (димексиде).

7. Приготовление ФСР-Т (концентрат).

Готовят фосфатно-солевой раствор (рН 7,5±0,3) с детергентом:

натрия хлорид - 250,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 25,0 г; твин 80 - 50,0 мл; вода дистиллированная до 1,0 л.

8. Приготовление стоп-реагента. Готовят 1 М раствор кислоты серной.

ИФА проводят следующим образом.

Иммуносорбент перед использованием промывают 2 раза добавлением в лунки по 250-350 мкл раствора ФСР-Т, полученного разведением концентрата в 25 раз водой дистиллированной.

К⁺ ₅₀ и К^- вносят по 100 мкл в 3 лунки каждый. В оставшиеся лунки вносят по 100 мкл исследуемых образцов. Затем во все использованные лунки добавляют по 50 мкл раствора конъюгата и содержимое лунок перемешивают осторожным постукиванием по краям планшета в течение 20-30 сек.

Планшет накрывают крышкой и выдерживают во влажной камере в течение 2 ч при температуре (40±2)°С, затем промывают 6 раз раствором ФСР-Т.

Свежеприготовленный субстратный раствор, полученный разведением концентрата ТМБ в 5 раз раствором ЦБ, вносят в лунки по 150 мкл и выдерживают в течение 20-25 мин при температуре от 18 до 25°С в защищенном от света месте.

Ферментативную реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл стоп-реагента и немедленно производят учет результатов ИФА.

Результаты рассчитывают следующим образом. Проводят двухволновое измерение оптической плотности (ОП) раствора в лунках планшета с помощью анализатора иммуноферментного «SUNRISE» фирмы TECAN (Австрия) или аналогичного, установив "0" прибора по воздуху. Тест-фильтр 450 нм, референс-фильтр - 620-680 нм.

Результаты ИФА оценивают, если ОП_ср.К^- 0,150; ОП_ср.К⁺ ₅₀>2,5 (ОП_крит.).

Расчет значения ОП критического уровня (ОП_крит.) производят по формуле:

ОП_крит. =ОП_ср.К^-+0,060.

Значения ОП неразведенных образцов ниже ОП_крит.считают отрицательными. Концентрацию анти-HBs определяют для образцов со значением ОП, находящейся в диапазоне ОП_крит. и 1,500 оптических единиц (о.е.). Если ОП образца выходит за верхнюю границу указанного диапазона, эмпирически подбирают его разведение. Разведение готовят на растворе ФСР-Т. Концентрацию анти-HBs в исследуемом образце вычисляют по формуле:

где СХ - концентрация анти-HBs в исследуемом образце (мМЕ/мл);

ОП_ср.Х - среднее значение оптической плотности исследуемого образца;

ОП_ср. К^- - среднее значение оптической плотности контрольного отрицательного образца;

ОП_ср.К⁺ ₅₀ - среднее значение оптической плотности контрольного положительного образца;

50 - концентрация анти-HBs в К ⁺ ₅₀ (мМЕ/мл);

n - кратность разведения исследуемого образца.

Пример конкретного применения.

Если ОП исследуемого образца, разведенного в 10 раз, равна 0,290 о.е., ОП_ср.К^- равна 0,070 о.е., а ОП_ср.К⁺ ₅₀ равна 0,452, о.е., то концентрация анти-HBs в неразведенном исследуемом образце, рассчитанная по вышеприведенной формуле будет равна:

При сравнении результатов определения уровня анти-HBs в 25 образцах плазмы донорской крови и в 20 образцах препаратов иммуноглобулинов с использованием калибровочного графика и формулы статистически достоверных различий между значениями концентраций антител, рассчитанными двумя способами не установлено.

Оценка специфической активности разработанной тест-системы проводилась при помощи прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием стандартного образца иммуноглобулина человека против вируса гепатита В ОСО-42-28-320-00 и контрольных образцов для оценки качества выявления суммарных антител к вирусу гепатита В ФСВОК (Федеральной системы внешней оценки качества).

Показатель чувствительности разработанной тест-системы по ОСО составил не менее 10 мМЕ/мл. Зависимость между логарифмом показателей оптической плотности (ОП) ОСО и логарифмом его концентраций носила линейный характер (коэффициент корреляции более 0,995).

Специфическая активность тест-системы с контрольными образцами ФСВОК составила 100%.

Преимуществами разработанной тест-системы являются высокая специфическая активность, сокращение стадий анализа, простота и удобство в применении и расчете концентрации анти-HBs. Использование HBsAg, очищенного из плазмы осаждением иммунного комплекса, позволяет избежать использования дополнительных реагентов (блокаторов) для устранения неспецифических реакций. Конъюгирование HBsAg непосредственно с ферментом упрощает технологию производства тест-системы.

Преимуществом изобретения является более экономичная технология получения тест-системы для количественного определения анти-HBs с высокой специфической активностью, что обеспечивается использованием реагентов, полученных из природных источников, а также более простые методики проведения ИФА и расчета количественного содержания анти-HBs.

Разработанная тест-система может быть использована для количественного определения анти-HBs с целью изучения иммунного статуса населения, при отборе плазмы с высоким содержанием антител для производства специфического иммуноглобулина, для контроля препаратов иммуноглобулина.