полипептид и композиция, обладающие активностью ксиланазы, применение полипептида, полинуклеотид, кодирующий полипептид, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, способ получения полинуклеотида, способ обработки растительного или ксилансодержащего материала

Формула изобретения

1.Полипептид, обладающий активностью ксиланазы, содержащий

(i) аминокислотную последовательность с 23 по 408 аминокислоту SEQ ID No. 2; или

(ii) вариант (i), обладающий способностью расщеплять ксилан, при этом, по меньшей мере, на 70% он идентичен аминокислотной последовательности с 23 по 408 аминокислоту SEQ ID No. 2; или

(iii) фрагмент (i) или (ii), обладающий способностью расщеплять ксилан.

2. Полипептид по п.1, в котором вариант (ii), по меньшей мере, на 80% идентичен аминокислотной последовательности с 23 по 408 аминокислоту SEQ ID No. 2 и/или фрагменту (iii) длиной, по меньшей мере, 150 аминокислот.

3. Полипептид по п.1 или 2, расщепляющий (1 4) связи или смежные ксилопиранозильные единицы в -D-ксилане.

4. Полипептид по одному из пп.1-3, обладающий арабиноксилазной и ксилозидазной активностью.

5. Полипептид по одному из пп.1-4, полученный из гриба или организма рода Talaromyces, например, вида Talaromyces emersonii.

6. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью ксиланазы, содержащий

(a) нуклеотидную последовательность SEQ ID No.1 или последовательность, кодирующую полипептид по одному из пп.1-4;

(b) последовательность, комплементарную последовательности, или гибридизующуюся в жестких условиях с последовательностью по подпункту (а);

(c) фрагмент длиной, по меньшей мере, 100 нуклеотидов последовательности по подпунктам (а) или (b);

(d) последовательность, по меньшей мере, на 70% идентичная последовательности по подпунктам (а), (b) или (с); или

(e) последовательность, генетически вырожденная по отношению к одной из последовательностей по подпунктам (a)-(d).

7. Полинуклеотид по п.6, в котором фрагмент по подпункту (с) имеет длину, по меньшей мере, 200 оснований и/или идентичность по подпункту (d) составляет, по меньшей мере, 80%.

8. Полинуклеотид по п.7, содержащий

(а) последовательность, кодирующую полипептид, обладающий ксиланазной активностью, представляющую собой:

(1) кодирующую последовательность нуклеотидов с 69 по 1224 последовательности SEQ ID No.1;

(2) последовательность, которая в жестких условиях гибридизуется с комплементарной последовательностью по подпункту (1); или

(3) последовательность, генетически вырожденная по отношению к последовательности по подпунктам (1) или (2); или

(b) последовательность, комплементарная полинуклеотиду по подпункту (а).

9. Полинуклеотид по одному из пп.6-8, представляющий собой последовательность ДНК.

10. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по одному из пп.6-9.

11. Вектор по п.10, оперативно связанный с регуляторной последовательностью.

12. Способ получения полипептида по одному из пп.1-5, включающий в себя культивирование клетки-хозяина, содержащей в качестве гетерологичной последовательности полинуклеотид по одному из пп.6-9, в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида.

13. Способ по п.12, в котором клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяин, экспрессирующую в качестве гетерологичного белка полипептид по одному из пп.1-5.

14. Способ по п.12, в котором клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяин, трансформированную последовательностью ДНК по п.9 или вектором по п.10.

15. Композиция, обладающая активностью ксиланазы, содержащая активное вещество и обычные носители или разбавители, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит полипептид по одному из пп.1-5.

16. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит полипептид, обладающий целлюлазной, эндоарабинаназной, рамногалактуроназной или полигалактуроназной активностью.

17. Способ обработки растительного или ксилансодержащего материала, включающий в себя контактирование указанного материала с полипептидом по одному из пп.1-5 или композицией по п.15 или 16.

18. Способ по п.17, в котором контактирование направлено на разложение, гидролиз или модифицирование ксилана в указанном материале или разрушение или модификацию клеточных стенок растительного материала.

19. Способ по п.17, в котором контактирование направлено на расщепление ксиланопиранозильных или -D-ксилановых субъединиц указанного материала.

20. Способ по п.17, в котором контактирование направлено на снижение вязкости или улучшение прозрачности или фильтруемости указанного материала.

21. Обработанный материал, получаемый контактированием растительного или ксилансодержащего материала с полипептидом по одному из пп.1-5, или композицией по п.15 или 16.

22. Корм для животных, содержащий ингредиенты из группы, включающей белки, углеводы, жиры, витамины, микроэлементы и их смеси, а также полипептид по одному из пп.1-5.

23. Хлеб, содержащий полипептид по одному из пп.1-5.

Описание изобретения к патенту

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым ксиланазам, к таким как ксиланазы из Talaromyces, и их использованию в разложении ксилана в целлюлозе. Ксиланазы находят применение в хлебопечении, в кормах для животных (для улучшения переработки кормов) и в производстве бумаги.

Предпосылки к созданию изобретения

Состав клеточных стенок растений сложен и изменчив и содержит несколько углеводных биополимеров. Полисахариды главным образом находятся в форме длинных цепей целлюлозы (основной структурный компонент клеточной стенки растений), гемицеллюлозы (включающей в себя различные цепи -ксилана, такие как ксилоглюканы), пектин и лигнин. Наиболее распространенными гемицеллюлозами являются ксиланы и их производные, такие как арабиноксилан и ксилогликан.

Растительные гемицеллюлозы включают в себя ксилан, арабиноксилан, глюкуроноарабиноксилан и ксилоглюкан. Ксилан (CAS Registry No. 9014-63-5) состоит из основной цепи -1,4-связанных D-ксилопиранозильных звеньев, необязательно замещенных боковыми цепями, такими как арабиноза и/или остатки глюкуроновой кислоты. Эта структура представляет собой

4)- -D-Xylp-(1 4)- -D-Xylp(2 1A)-(1 4)- -D-Xylp-(1 4)- -D-Xylp(3 1B)-(1

(Xylp=ксилопиранозильное звено; A= -(4-О)-метил-(D-глюкуронопиранозильное звено), иногда ацетил; и B= -(L-арабинофуранозильное звено), иногда ацетил).

Ксиланы могут составлять более 30% сухого веса наземных растений. Следовательно, ксиланы представляют собой важный компонент материалов природных источников, которые используются в промышленном производстве, начиная от хлебопечения, улучшения кормов для животных до изготовления бумаги.

Существует основное различие между однодольными растениями (например, злаковые и травы) и двудольными растениями (например, клевер, рапсовые и соевые) и между семенными и вегетативными частями растений. Однодольные растения характеризуются присутствием арабиноксилановых комплексов как главного каркаса гемицеллюлозы, а основной структурой гемицеллюлозы в двудольных растениях является ксилоглюкановый комплекс. В двудольных растениях обнаружены более высокие концентрации пектина, чем в однодольных растениях. Семена обычно имеют высокое содержание пептических веществ, но относительно низкое содержание целлюлозной ткани.

Ферменты, разлагающие целлюлозу, используют для обработки растительного материала в пищевых продуктах, а также при применении кормов или в качестве пищевых или кормовых добавок благодаря их способности действовать на основные компоненты клеточной стенки.

Большинством ферментов, разлагающих целлюлозу, пригодных для промышленного применения, оказываются ксиланазы с относительно низкой молекулярной массой и умеренной стабильностью при высоких температурах. Однако для определенных применений желательно использовать ксиланазы с относительно высокой термостабильностью. В том случае, если ксиланазы применяются в качестве кормовых добавок для животных, тогда предпочтительна высокая термостабильность, поскольку в процессе гранулирования кормов для животных применяют высокие температуры.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новой ксиланазе, обладающей способностью расщеплять -D-ксилан, который присутствует в растительном материале. Эта ксиланаза также может обладать способностью гидролизовать арабиноксилан (или иметь арабиноксиланазную активность) и арил- -D-ксилопиранозид (или иметь ксилозидазную активность).

Соответственно настоящее изобретение относится к (изолированному) полипептиду -ксиланазы, содержащему:

(i) аминокислотную последовательность SEQ ID No:2; или

(ii) вариант последовательности (i), обладающий способностью расщеплять -D-ксилан; или

(iii) фрагмент последовательностей (i) или (ii), обладающий способностью расщеплять -D-ксилан.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему:

(a) последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID No.1 или последовательность, кодирующую полипептид по данному изобретению;

(b) последовательность, комплементарную, или гибридизующуюся с последовательностью, определенной в (а);

(c) фрагмент последовательности (a) или (b);

(d) последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную последовательности, определенной в (a), (b) или (c);

или

(e) последовательность, которая является генетически вырожденной по отношению к любой из последовательностей, определенных в (а)-(d).

Изобретение также относится к:

- вектору (например, экспрессирующему), включающему в себя полинуклеотид по данному изобретению и который может обладать способностью экспрессировать полипептид по данному изобретению;

- клеточной линии, включающей в себя вектор по данному изобретению;

- способу получения полипептида по данному изобретению, который включает в себя поддержание клеточной линии по данному изобретению в условиях, пригодных для экспрессии полипептида, и, если необходимо, выделение полипептида;

- способу разложения -D-ксилана, причем способ предусматривает взаимодействие материала, содержащего -D-ксилан с полипептидом по данному изобретению; и

- способу идентификации вещества, модулирующего активность ксиланазы, заключающемуся во взаимодействии полипептида по данному изобретению с тестируемым веществом в присутствии -D-ксилана и наблюдении за активностью или обнаружении какого-либо изменения активности.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID No.1 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую ксиланазу по настоящему изобретению из Talaromyces emersonii;

SEQ ID No.2 представляет собой аминокислотную последовательность ксиланазы; и

SEQ ID Nos.3 и 4 синтетические праймеры ПЦР, гибридизующиеся с SEQ ID No.1.

Подробное описание изобретения

A. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду (например, выделенному и/или очищенному), кодирующему полипептид по данному изобретению. Настоящее изобретение, таким образом, относится к полинуклеотиду, кодирующему ксиланазу, аминокислотная последовательность которой приведена в SEQ ID No.2 (как, например, зрелая последовательность из аминокислот 23-408). Далее, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, имеющий существенную гомологию аминокислотной последовательности к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No.2. Также включен полинуклеотид, выбранный из:

(a) полинуклеотида, включающего в себя нуклеотидную последовательность (например, полинуклеотиды 69-1224), приведенную в SEQ ID No.1, или комплементарную ей;

(b) полинуклеотида, включающего в себя нуклеотидную последовательность, обладающую способностью (например, селективно) гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID No.1, или с ее фрагментом;

(c) полинуклеотида, включающего в себя нуклеотидную последовательность, обладающую способностью (например, селективно) гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна приведенной в SEQ ID No.1, или ее фрагментом; и/или

(d) полинуклеотида, включающего в себя полинуклеотидную последовательность, которая является генетически вырожденной по отношению к полинуклеотиду, определенному в (a), (b) или (c).

Полинуклеотид по данному изобретению также включает в себя полинуклеотид, который:

(a) кодирует полипептид, обладающий ксиланазной активностью, причем полинуклеотид представляет собой:

(1) кодирующую последовательность SEQ ID No.1 (например, полинуклеотиды 69-1224);

(2) последовательность, селективно гибридизующуюся с последовательностью, которая комплементарна определенной в (1); или

(3) последовательность, которая является генетически вырожденной по отношению к последовательности, определенной в (1) или (2); или

(b) представляет собой последовательность, комплементарную полинуклеотиду, определенному в (a).

Ссылки на SEQ ID No.1 могут быть заменены зрелой кодирующей последовательностью (полинуклеотиды 69-1224), если иное не оговорено особо.

Гибридизующиеся последовательности

Термин «способный к гибридизации» означает, что полинуклеотид-мишень по данному изобретению может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, используемой в качестве зонда (например, нуклеотидная последовательность, приведенная в SEQ ID No.1, или ее фрагмент или последовательность, комплементарная ей) на уровне, значительно выше фонового. Данное изобретение также включает в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие ксиланазу или ее варианты, а также и нуклеотидные последовательности, комплементарные им. Нуклеотидная последовательность может быть РНК или ДНК и, таким образом, включает в себя геномную ДНК, синтетическую ДНК или кДНК. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность ДНК и более предпочтительно последовательность кДНК. Обычно полинуклеотид данного изобретения содержит непрерывную последовательность нуклеотидов, способную к гибридизации при селективных условиях с кодирующей последовательностью или последовательностью, комплементарной (например, зрелой) кодирующей последовательностью SEQ ID No.1. Такие нуклеотиды могут быть синтезированы в соответствии с методами, хорошо известными в данной области¹.

Полинуклеотид данного изобретения может гибридизоваться с кодирующей последовательностью или с последовательностью, комплементарной (например, зрелой) кодирующей последовательности SEQ ID No.1 на уровне, значительно выше фонового. Фоновая гибридизация может происходить, например, из-за присутствия других кДНК в кДНК-библиотеке. Уровень сигнала (например, образуемый взаимодействием между полинуклеотидом данного изобретения и кодирующей последовательностью или последовательностью, комплементарной кодирующей последовательности) обычно, по меньшей мере, в 10 раз, предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз, выше, чем при взаимодействии между другими полинуклеотидами и (например, зрелой) кодирующей последовательностью SEQ ID No.1. Сила взаимодействия может быть измерена, например, с помощью радиоактивно меченного зонда, например ³²P. Обычно селективная гибридизация может быть выполнена в условиях низкой жесткости (0,3 M хлорид натрия и 0,03 M цитрат натрия при приблизительно 40°C), средней жесткости (например, 0,3 M хлорида натрия и 0,03 M цитрата натрия при приблизительно 50°C) или высокой жесткости (например, 0,3 M хлорида натрия и 0,03 M цитрата натрия при приблизительно 60°C). Гибридизация может быть выполнена в любых подходящих условиях, известных в этой области¹ , и в качестве инструкции низкая жесткость может быть 2×SSC при 55°C, средняя жесткость может быть 0,5-1,0×SSC при 60°C и высокая жесткость может быть от 0,1 или 0,2×SSC при 60°C или выше (например, при 68°C), все при 0,5% SDS.

Модификации

Полинуклеотиды данного изобретения могут состоять из ДНК или РНК. Они могут быть одно- или двухцепочечными. Они также могут быть полинуклеотидами, которые содержат в себе один или несколько синтетических или модифицированных нуклеотидов. В существующем уровне техники известен ряд различных видов модификаций полинуклеотидов. Они включают в себя метилфосфонатные и фосфоротиоатные каркасы и/или добавление акридиновых или полилизиновых цепей на 3'- и/или 5'-концах молекулы. Для целей настоящего изобретения следует понимать, что полинуклеотиды, описанные здесь, могут быть модифицированы любыми способами, известными в данной области.

Следует понимать, что специалисты в данной области могут, используя обычные методики, произвести нуклеотидные замены, не влияющие на полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидами данного изобретения, основываясь на частоте использования кодонов любого конкретного организма-хозяина, например, в котором экспрессируются полипептиды данного изобретения.

Кодирующая последовательность (например, зрелая) SEQ ID No.1 может быть модифицирована нуклеотидными заменами, например, от или до 1, 2 или 3 до 10, 25, 50 или 100 замен. Альтернативно или дополнительно полинуклеотид может быть модифицирован одной или несколькими вставками, и/или делециями, и/или удлинением с одного или с обоих концов. Модифицированный полинуклеотид обычно кодирует полипептид, имеющий ксиланазную активность. Могут быть получены вырожденные замены и/или могут быть получены замены, приводящие в результате к консервативным заменам аминокислот, при которых транслируется модифицированная последовательность, например, как рассмотрено далее в отношении полипептидов.

Гомологи

Нуклеотидная последовательность, обладающая способностью к селективной гибридизации с (например, последовательностью, комплементарной) кодирующей последовательностью ДНК SEQ ID No.1 (или нуклеотидами 69-1224) может иметь, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности (или гомологию) к кодирующей последовательности SEQ ID No.1. Это может быть в области, по меньшей мере, из 20, предпочтительно, по меньшей мере, из 30 или 60, например, по меньшей мере, из 100, по меньшей мере, из 200, более предпочтительно, по меньшей мере, из 300 смежных нуклеотидов, или, оптимально, по всей длине SEQ ID No.1.

Любое сочетание вышеупомянутых степеней гомологии и минимального размера может быть использовано для определения полинуклеотидов данного изобретения, причем более жесткие сочетания (т.е. с большей гомологией на большей протяженности) предпочтительны. Так, например, один аспект данного изобретения образует полинуклеотид, представляющий собой, по меньшей мере, 80% или 90% гомолог по 25, предпочтительно по 30 нуклеотидам, как и полинуклеотид, представляющий собой, по меньшей мере, 90% гомолог по 40 нуклеотидам.

Гомологи полинуклеотидной (или белковой) последовательности обычно имеют, по меньшей мере, 70% гомологию, предпочтительно, по меньшей мере, 80, 90%, 95%, 97% или 99% гомологию, например по области, по меньшей мере, 20, 25, 30, 100 более близких нуклеотидов (или аминокислот). Гомология может быть подсчитана на основании аминокислотной идентичности (иногда упоминаемой как «жесткая гомология»).

Например, UWGCG Package предлагает программу BESTFIT, которая может быть использована для подсчета гомологии (например, использованы ее настройки по умолчанию⁵). Алгоритмы PILEUP и BLAST могут быть использованы для подсчета гомологии или выравнивания последовательности (как, например, определение эквивалентных или аналогичных последовательностей, например, по настройке по умолчанию^6,7).

Программное обеспечение для выполнения BLAST анализов доступно через Национальный Центр Биотехнологической Информации (http://www.ncbi.nhn.nih.gov/). Этот алгоритм заключается в первом определении пары последовательности высокой отметки (HSPs) путем определения коротких слов длины W в искомой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторой позитивно оцениваемой пороговой отметке T при выравнивании со словом той же длины в последовательности базы данных. T называется пороговой отметкой соседнего слова^6,7. Эти исходные совпадения соседних слов действуют как затравка для инициации поиска для нахождения HSP, содержащих их. Совпадения слов распространены в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличена кумулятивная отметка выравнивания. Удлинения при совпадениях слов в каждом направлении останавливаются когда: кумулятивная отметка выравнивания выпадает количеством Х из ее максимально достигаемого значения; кумулятивная отметка принимает значение нуля или ниже вследствие аккумуляции одного или нескольких остаточных выравниваний; или при достижении конца любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLAST использует в качестве настроек по умолчанию длину слова (W) 11, оценку по матрице⁸ выравнивания BLOSUM62 (B) 50, математическое ожидание (E) 10, M=5, N=4, и сравнение обеих цепей.

Алгоритм BLAST проводит статистический анализ сходства между двумя последовательностями⁹. Одно измерение сходства, предлагаемое алгоритмом BLAST, представляет собой вероятность наименьшей суммы (P(N)), предусматривающее указание вероятности, при которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями произошло бы случайно. Например, последовательность, предположительно сходная с другой последовательностью, если вероятность наименьшей суммы в сравнении первой последовательности со второй последовательностью меньше, чем примерно 1, предпочтительно меньше чем примерно 0,1, более предпочтительно менее чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно менее чем 0,001.

Праймеры и зонды

Полинуклеотиды по данному изобретению содержат и могут быть использованы в качестве праймера, например ПЦР праймера, праймера для реакции альтернативной амплификации, зонда, или эти полинуклеотиды могут быть клонированы в векторы. Такие праймеры, зонды и другие фрагменты составляют в длину, по меньшей мере, или вплоть до 20, 25, 30 или 40, например, по меньшей мере, 25, 30 или 40 нуклеотидов. Обычно они бывают до 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 или 300 нуклеотидов в длину, или это число (даже вплоть до нескольких нуклеотидов как 5 или 10 нуклеотидов) короткой (например, зрелой) кодирующей последовательности SEQ ID No.1.

В общем, праймеры будут получены синтетическими способами, включающими в себя пошаговое получение требуемой нуклеотидной последовательности по одному нуклеотиду за один цикл. Методики выполнения этого с использованием автоматизированных технологий легко доступны в данной области. Примеры праймеров по данному изобретению приведены в SEQ ID Nos. 3 и 4.

Более длинные полинуклеотиды обычно получают рекомбинантными способами, например с использованием ПЦР (полимеразно-цепной реакции) методик клонирования. Это включает в себя получение пары праймеров (например, приблизительно 15-30 нуклеотидов) к области ксиланазы, которую требуется клонировать, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученных из клетки-мишени (например, дрожжевой, бактериальной, растительной, прокариотической или грибковой), предпочтительно штамм Talaromyces, проведения полимеразно-цепной реакции в условиях, которые обеспечивают амплификацию требуемой области, выделение амплифицированного фрагмента (например, очисткой реакционной смеси на агарозном геле) и восстановление амплифицированной ДНК. Праймеры могут быть сконструированы с включением в них сайтов распознавания соответствующего фермента рестрикции, так что амплифицированная ДНК может быть клонирована в соответствующий вектор клонирования.

Такие методики могут быть использованы для получения целой или части описанной здесь ксиланазной последовательности. Геномные клоны, соответствующие кДНК SEQ ID No. 1, или ген ксиланазы, содержащий, например, интронные и промоторные области также входят в данное изобретение и также могут быть получены аналогичным образом (например, рекомбинантные способы, ПЦР, методики клонирования), исходя из геномной ДНК из клеток грибов, дрожжей, бактерий, растений или прокариотов.

Полинуклеотиды или праймеры могут содержать распознаваемую метку, например радиоактивную или нерадиоактивную метку. Подходящие метки включают в себя радиоизотопы, такие как ³²Р или ³⁵S, ферментные метки, или другие белковые метки, такие как биотин. Такие метки могут быть добавлены к полинуклеотидам или праймерам по данному изобретению и могут быть обнаружены с использованием известных методик.

Полинуклеотиды, меченые или немеченые, могут быть использованы в исследованиях, основанных на нуклеиновых кислотах, для обнаружения или секвенирования ксиланазы или ее вариантов в образце (например, в грибах). Такие исследования для обнаружения в основном включают в себя приведение образца (например, грибкового), (предположительно) содержащего ДНК, в контакт с зондом или праймером по данному изобретению в условиях гибридизации и обнаружение каких-либо дуплексов, образованных между зондом и нуклеиновой кислотой в образце. Такое обнаружение может быть осуществлено с использованием методик, таких как ПЦР, или иммобилизацией зонда на твердой подложке, удаление нуклеиновой кислоты, которая не гибридизовалась с зондом в образце, и затем выявление нуклеиновой кислоты, которая гибридизовалась с зондом. Альтернативно, нуклеиновая кислота образца может быть иммобилизована на твердой подложке, и может быть определено количество связавшегося зонда.

Зонды по настоящему изобретению могут быть удобно упакованы в форме набора для исследования в подходящий контейнер. В этих наборах зонды могут быть связаны с твердой подложкой, если формат исследования, для которого сконструирован данный набор, требует такого связывания. Набор также может содержать реактивы для обработки исследуемых образцов, гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой в образце, контрольные реактивы, инструкции и подобное.

Предпочтительно полинуклеотид по данному изобретению получен из того же организма, что и полипептид, такого как гриб, в частности гриба рода Talaromyces.

Полинуклеотиды по данному изобретению также включают в себя варианты последовательности SEQ ID No.1, которые обладают ксиланазной активностью. Варианты могут быть образованы удлинениями, заменами и/или делециями и могут обладать способностью расщеплять -D-ксилановый полимер.

Получение полинуклеотидов

Полинуклеотиды, не имеющие 100% идентичности с (например, зрелой кодирующей последовательностью) SEQ ID No.1, но подпадающие под объем притязаний данного изобретения, могут быть получены в соответствии с рядом способов. Так, варианты описанной здесь последовательности ксиланазы могут быть получены, например, зондированием библиотек геномной ДНК, полученных из ряда организмов, например тех, которые указаны в качестве источников полипептидов по данному изобретению. Кроме того, могут быть получены другие грибковые, растительные или прокариотические гомологи ксиланазы и такие гомологи, и их фрагменты в общем будут обладать способностью к гибридизации с SEQ ID No.1. Такая последовательность может быть получена зондированием библиотек кДНК или библиотек геномной ДНК из других видов, и зондирование таких библиотек зондами, содержащими всю последовательность или часть SEQ ID No.1 в условиях средней или высокой жесткости (как описано ранее). Зонды нуклеиновой кислоты, содержащие целую последовательность или часть SEQ ID No.1, могут быть использованы для зондирования библиотек кДНК из других видов, таких, которые описаны как источники для полипептидов по данному изобретению.

Межвидовые гомологи также могут быть получены с использованием вырожденной ПЦР, которая использует праймеры, сконструированные для последовательностей-мишеней в пределах вариантов и гомологов, кодирующих консервативные аминокислотные последовательности. Праймеры могут содержать одно или несколько вырожденных положений и будут использованы в условиях меньшей жесткости, чем та, которая используется для клонирования последовательностей с единой последовательностью праймеров против известных последовательностей.

Альтернативно, такие полинуклеотиды могут быть получены сайт-направленным мутагенезом последовательностей ксиланазы или их вариантов. Это может быть применимо в тех случаях, когда, например, для последовательностей требуются молчащие замены кодонов в последовательностях для оптимизации преимущественности кодонов для конкретной клетки-хозяина, в которой экспрессируются полинуклеотидные последовательности. Другие изменения последовательностей могут требоваться для введения сайтов распознавания ферментов рестрикции или для изменения свойств или функций полипептидов, кодируемых полинуклеотидами.

Данное изобретение относится к двухцепочечным полинуклеотидам, включающим в себя полинуклеотид по данному изобретению и комплементарный ему.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды данного изобретения, описанные ниже. Поскольку такие полинуклеотиды будут использованы в качестве последовательностей для рекомбинантного получения полипептидов по данному изобретению, то им необязательно обладать способностью к гибридизации с последовательностью SEQ ID No.1, хотя обычно это желательно. Иначе, такие полинуклеотиды могут быть помечены, использованы и изготовлены, как описано выше, если требуется. Фрагменты ДНК могут быть приготовлены с использованием ПЦР методики со специфическими праймерами. ^33,34

B. Полипептиды

Настоящее изобретение относится к (например, существенно очищенной и/или выделенной) ксиланазе и ее вариантам. Полипептиды по данному изобретению могут, по существу, состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID No.2, или ее части (такой, как зрелая последовательность с положения 23 до 408), или ее варианта. Полипептиды также могут кодироваться полинуклеотидами по данному изобретению, как описано выше. Ссылки на SEQ ID No.2 могут быть заменены только зрелой последовательностью (остатки Ala²³ до Leu⁴⁰⁸ ), если в контексте не требуется другого.

Полипептиды по данному изобретению могут быть активными в отношении как арабиноксилана, так и арил- -D-ксилозидов (таких, которые имеют арабиноксиланазную и ксилозидазную активность).

Полипептид по данному изобретению может быть в изолированной или существенно очищенной форме. Понятно, что полипептид может быть смешан с носителями или разбавителями, которые не будут мешать намеченным целям и/или функции полипептида, и все же будет считаться по существу выделенным. Обычно полипептид включают в препарат, в котором более чем 20%, например более чем 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% или 99% от веса полипептида в препарате составляет полипептид по данному изобретению. Эти препараты представляют собой относительно чистые соединения: для каких-то применений полипептид может составлять до 10%, 5%, 2%, 1% или даже не более чем 0,5% от композиции. Могут быть использованы обычные способы очистки и/или синтеза белков согласно данному изобретению¹. Для некоторых составов (например, для нефармацевтического применения) количество присутствующего полипептида может быть небольшим, например от 0,01 до 10%, так например от 0,1 до 5%, или 2% или даже от 0,2 до 1%.

Предпочтительно полипептид по данному изобретению может быть получен из микроорганизма, который обладает геном, кодирующим фермент с ксиланазной активностью. Более предпочтительным микроорганизмом является гриб и оптимально нитчатый гриб. Предпочтительными организмами являются, таким образом, организмы рода Talaromyces, такие виды как Talaromyces emersonii (например CBS 393.64 или 814.70).

Активность

Полипептид по данному изобретению может иметь один или несколько из следующих признаков, а именно;

(1) обладает -D-ксиланазной активностью;

(2) имеет оптимум pH в диапазоне от 2 до 6, так например от 3 до 5, оптимально от 3,5 до 5,0;

(3) имеет оптимальную активность при температуре от 50 до 95°C, так например от 70 до 90°C, оптимально от 75 до 85°C;

(4) имеет молекулярную массу (дегликозилированный) от 30 до 50 кДа, предпочтительно от 35 до 45 кДа, оптимально от 40 до 44 кДа или (гликозилированный) от 50 до 75 кДа, предпочтительно от 55 до 70 кДа, оптимально от 60 до 66 кДа; и/или

(5) имеет изоэлектрическую точку от 3,0 до 3,6.

Полипептид может иметь активность EC.3.2.1.8. Предпочтительно полипептид из Семейства 10 (прежде F-тип).

«Ксиланазная активность» определена как способность расщеплять целлюлозу или -D-ксилановый полимер (например, обнаруженный в растениях, например овес или ячмень). Следовательно, такая активность позволяет расщеплять -D-ксилан, как например между соседними ксилопиранозильными конечными или неконечными звеньями. Предпочтительно расщепление происходит по [ксилопиранозил (1 4) ксилопиранозильной] связи. Полипептид может предпочтительно расщеплять между двумя соседними (например, незамещенными) звеньями. Следовательно, может иметь эндоактивность (т.е. быть эндоксиланазой). Полимер-субстрат может быть или не быть замещенным. Он также может иметь экзоактивность (т.е. быть экзоксиланазой), такой как отщепление концевых ксилопиранозильных звеньев. Предпочтительно полипептид не обладает глюканазной активностью.

Полипептиды по данному изобретению также могут быть активными (или проявлять активность) в отношении арабиноксилана. Арабиноксилан представляет собой подгруппу ксилана с L-арабино-фуранозильными боковыми цепями, связанными с C-2 или C-3, или и тем и другим вместе, ксилозных остатков главной цепи. Арабиноксилан имеет CAS Регистрационный №98513-12-3. Он может иметь структуру (1 4)- -D-ксилана с 3-связанными -L-арабинозными ветвями. Этот тип ксилана обычно встречается в ксилане овсяной шелухи.

Эта активность представляет собой способность гидролизовать необработанный арабиноксилан. Это означает, что арабиноксилан не был обработан или модифицирован, например, не был обработан арабинофуранозидазой. Этот фермент может удалять арабинозные боковые цепи. Полипептиды по данному изобретению способны гидролизовать (расщеплять) арабиноксилан, который не был предварительно обработан арабинофуранозидазой.

Арабиноксилан встречается в овсяной шелухе, и в этом подробном описании активность полипептида (EXU, также как и PAHBAH активность) определена по арабиноксилану из пшеничной муки (с соотношением арабиноза:ксилоза 41:59). Исследование арабиноксилана (как субстрата) описано далее в примерах.

Полипептиды по данному изобретению могут также иметь ксилозидазную активность, например обладать способностью гидролизовать замещенные (например, арил)- -D-ксилозиды (также известные как ксилопиранозиды). Например, они могут быть способны к гидролизу 4-метилумбеллиферил- -D-ксилопиранозида (CAS Регистрационный №6734-33-4, полученный из Sigma Chemical Co). Эта активность представляет собой способность высвобождать флуоресцентную метку из субстрата. Она также может гидролизовать (быть активной в отношении) 5-бромо-4-хлоро-3-индоксил- -D-ксилопиранозида (CAS Регистрационный №207606-55-1). Это сочетание активности в отношении как арабиноксилана, так и арил- -D-ксиланозида является необычным^36,37 и является новым сочетанием активностей для полипептида, обладающего ксиланазной активностью.

Варианты и гомологи

Полипептид по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID No. 2, или существенно гомологичную последовательность, или фрагмент одной из двух последовательностей и может обладать ксиланазной активностью. Вообще, предпочтительна природная аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID No.2.

В частности, полипептид по данному изобретению может содержать:

a. (зрелую) полипептидную последовательность SEQ ID No.2 (остатки с 23 по 408) или целую последовательность SEQ ID No.2;

b. природный вариант или его межвидовой гомолог; или

c. белок, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 75%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности к (a) или (b).

Вариант может быть одним из встречающихся в природе, например в грибковых, бактериальных, дрожжевых или растительных клетках и который может функционировать в значительной мере сходным образом с белком SEQ ID No.2, например иметь ксиланазную активность. Подобным образом межвидовой гомолог белка будет представлять собой эквивалентный белок, который встречается в природе в другом виде и который может функционировать как ксиланаза. Варианты включают в себя аллельные варианты или из того же штамма, что и полипептид по данному изобретению, или из другого штамма, но того же рода, или того же вида.

Варианты и разновидности гомологов могут быть получены следующими способами, описанными здесь для получения полипептида SEQ ID No.2, выполнение таких способов на соответствующем источнике клеток, например бактериальной, дрожжевой, грибковой или растительной клетке. Также возможно использовать зонд, определенный выше, для зондирования библиотек, составленных из дрожжевых, бактериальных, грибковых или растительных клеток для получения клонов, включающих в себя варианты или межвидовые гомологи. На клоны можно воздействовать общепринятыми методиками для получения полипептида по данному изобретению, которые затем будут получены рекомбинатным или синтетическим известным способом.

Полипептид по данному изобретению предпочтительно имеет к ней, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к белку SEQ ID No.2, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности, например по области, протяженностью, по меньшей мере, 40, 60, 100, 150, 200, 300 или 400 аминокислот или по всей длине SEQ ID No.2.

Последовательность полипептида SEQ ID No.2 и вариантов и межвидовых гомологов может быть, следовательно, модифицирована для обеспечения полипептидов по данному изобретению. Может быть сделано, например от 1, 2 или 3 или до 10, 20, 30, 50 или 100 аминокислотных замен. Может быть произведено такое же число делеций или вставок. Эти изменения могут быть произведены за пределом областей, необходимых для функционирования полипептида, и также могут по-прежнему давать в результате активный фермент. Модифицированный полипептид в основном сохраняет активность ксиланазы.

Полипептиды по данному изобретению включают в себя фрагменты вышеупомянутых полноразмерных полипептидов и их вариантов, включая в себя фрагменты последовательности, представленной в SEQ ID No.2. Такие фрагменты обычно сохраняют активность ксиланазы. Фрагменты могут составлять в длину, по меньшей мере, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200 или 250 аминокислот, или быть на это количество аминокислот короче полной длины последовательности (показанной в SEQ ID No.2). Фрагменты или варианты включают в себя или представляют связывающую -D-ксилан область или расщепляющую -D-ксилан область.

Полипептиды по данному изобретению при необходимости могут быть получены синтетическими способами, хотя обычно их получают рекомбинантно, как описано ниже. Они могут быть модифицированы, например, путем добавления остатков гистидина или метки T7 для того, чтобы способствовать их идентификации или очистке, или путем добавления сигнальной последовательности, способствующей их секреции из клетки.

Термин «варианты» относится к полипептидам, которые могут иметь такое же основное свойство или основную биологическую функцию, что и ксиланаза, и включают в себя аллельные варианты. Основным свойством ксиланазы является то, что она является ферментом, который может расщеплять 1 4 связи в -D-ксилане. Полипептид, обладающий тем же основным свойством, что и ксиланаза, может быть идентифицирован исследованием разложения целлюлозы, как описано далее.

Варианты SEQ ID No.2 также включают в себя последовательности, которые отличаются от SEQ ID No.2, но которые не обязательно происходят из природной ксиланазы. Эти варианты могут быть описаны как имеющие % гомологии к SEQ ID No.2 или имеющие ряд замен этой последовательности. Альтернативно, вариант может кодироваться полинуклеотидом, который гибридизуется с SEQ ID No.1.

Варианты могут быть определены сходным образом для вариантов SEQ ID No.1. Следовательно, варианты могут содержать иную последовательность, происходящую из других штаммов Talaromyces. Другие варианты могут быть установлены из других штаммов Talaromyces путем поиска ксиланазной активности и клонирования и установления последовательности как раньше. Варианты могут содержать делеции, модификации или дополнения единичных аминокислот или групп аминокислот в пределах белковой последовательности, пока пептид сохраняет основную биологическую функцию ксиланазы.

Могут быть произведены консервативные замены, например, согласно следующей таблице 10. Аминокислоты одного и того же блока во второй колонке и предпочтительно в одной и той же строке в третьей колонке могут быть заменены друг другом. Предпочтительно замены не влияют на укладку или активность полипептида.

Таблица 10
АЛИФАТИЧЕСКИЕ	Неполярные	G A P
		I L V
	Полярные незаряженные	C S T M
		N Q
	Полярные заряженные	D E
		K R
АРОМАТИЧЕСКИЕ		H F W Y

Модификации

Полипептиды по данному изобретению могут быть химически модифицированы, например модифицированы посттрансляционно. Например, они могут быть гликозилированы (один или несколько раз, одним и тем же или различными сахарами) или содержать модифицированные аминокислотные остатки. Они также могут быть модифицированы добавлением остатков гистидина (способствующих их очистке) или добавлением сигнальной последовательности (для облегчения встраивания в клеточную мембрану). Полипептид может иметь одно или несколько (N) амино- или (C) карбокси- концевых удлинений, таких как аминоконцевые остатки метионина, (небольшой) линкерный пептид приблизительно до 20-25 остатков, или (небольшое) удлинение, облегчающее очистку, такое как полигистидин или метку Т7, антигенный эпитоп или (например, мальтозу) связывающий домен¹⁴ (например, на С-конце). Эти удлинения могут быть или могут не быть присоединены через линкер.

Полипептид по данному изобретению может быть помечен обнаруживаемой меткой. Обнаруживаемая метка может быть любой подходящей меткой, которая позволяет обнаружить полипептид. Подходящие метки включают в себя радиоизотопы, например ¹²⁵I, ³⁵S, ферменты, антитела, полинуклеотиды и линкеры, такие как биотин.

Полипептиды могут быть модифицированы включением в них неприродных аминокислот или для повышения стабильности полипептида. В том случае, когда белки или пептиды получены синтетическими способами, такие аминокислоты могут быть введены в процессе синтеза. Белки или пептиды также могут быть модифицированы следующей синтетической или рекомбинантной обработкой.

Полипептиды по данному изобретению также могут быть получены с использованием или включением в них D-аминокислот. В таких случаях аминокислотные остатки могут быть связаны с использованием обычной последовательности N-C, как описано в этой заявке.

В данной области известен ряд модификаций боковых цепей, и они могут быть произведены с боковыми цепями белков или пептидов настоящего изобретения. Такие модификации включают в себя, например, модификации аминокислот путем восстановительного алкилирования путем взаимодействия с альдегидом с последующим восстановлением NaBH₄, амидинирования метилацетимидатом или ацилирования уксусным ангидридом.

Последовательности по настоящему изобретению также могут быть использованы в качестве исходного материала для конструирования ферментов «второго поколения». Ксиланазами «второго поколения» могут быть таковые, измененные с помощью мутагенеза (например, сайт-направленного мутагенеза), которые обладают свойствами, отличными от свойств ксиланаз дикого типа или рекомбинантных ксиланаз, например, полученных в соответствии с настоящим изобретением. Например, температура или оптимум pH, удельная активность, сродство к субстрату или термостабильность могут быть изменены для большего соответствия для применения в определенном технологическом процессе.

Аминокислоты, необходимые для активности ксиланаз по данному изобретению и, следовательно, предпочтительные объекты для замен могут быть установлены в соответствии с методиками, известными в данной области, такими, как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез¹⁰. В последней методике мутации вводят по каждому остатку в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы исследуют на биологическую активность (например, ксиланазную активность) для определения аминокислотных остатков, которые важны для активности молекулы. Участки фермент-субстратного взаимодействия могут быть установлены путем анализа структуры кристалла, определяемой такими способами как ядерно-магнитный резонанс, кристаллография или фотоаффинное мечение^{11, 12, 13} или молекулярное моделирование.

Ожидается, что применение дрожжевых или грибных клеток-хозяев обеспечит посттрансляционные модификации (например, протеолитический процессинг, миристилирование, гликозилирование, усечение и фосфорилирование тирозина, серина или треонина), как потенциально необходимые для придания оптимальной биологической активности рекомбинантных продуктов экспрессии по данному изобретению.

Полипептиды по данному изобретению могут быть получены в том виде, как они находятся вне их естественного клеточного окружения. Таким образом, они могут быть в значительной степени изолированы или очищены, как обсуждалось выше, или находиться в клетках, в которых они не встречаются в природе, например в клетках других видов грибов, животных, дрожжей или бактерий.

C. Рекомбинантные аспекты

Данное изобретение также относится к векторам, содержащим полинуклеотид по данному изобретению, включая клонирующие и экспрессирующие векторы, и способы культивирования, трансформирования или трансфицирования такими векторами в соответствующей клетке-хозяине, например в условиях, при которых происходит экспрессия полипептида по данному изобретению. Предложены также клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид или вектор по данному изобретению, где полинуклеотид является гетерологичным к геному клетки-хозяина. Термин «гетерологичный» обычно в отношении к клетке-хозяину означает, что этот полинуклеотид не встречается в геноме клетки-хозяина в природе или что этот полипептид не продуцируется этой клеткой в природе. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку, например дрожжевую клетку рода Kluyveromyces или Saccharomyces, или грибную клетку, например, рода Aspergillus.

Полинуклеотиды по данному изобретению могут быть включены в состав рекомбинантного реплицируемого вектора, например, клонирующего или экспрессирующего вектора. Этот вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке-хозяине. Следовательно, в дальнейшем варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения полинуклеотидов по данному изобретению путем введения полинуклеотида по данному изобретению в реплицируемый вектор, введение этого вектора в совместимую клетку-хозяина и выращивание клетки-хозяина в условиях, которые обеспечивают репликацию этого вектора. Этот вектор может быть выделен из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева описаны ниже в связи с векторами экспрессии.

Векторы

Полинуклеотид по данному изобретению может быть встроен в экспрессирующую кассету. Вектор, в который встроена экспрессирующая кассета или полинуклеотид по данному изобретению, может быть любым вектором, который удобно подвергнуть методикам рекомбинантных ДНК, и выбор вектора зачастую будет зависеть от клетки-хозяина, в которую его встраивают. Так, вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. вектором, который существует как внехромосомный объект, репликация которого не зависит от репликации хромосом, например плазмида. С другой стороны, вектор после введения в клетку-хозяина может быть интегрирован в геном клетки-хозяина и реплицирован вместе с хромосомой(ами), в которую он был интегрирован.

Предпочтительно полинуклеотид по данному изобретению в векторе оперативно связан с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечить экспрессию кодирующей последовательности клеткой-хозяином, т.e. вектор является вектором экспрессии. Термин «оперативно связан» относится к соединению, где описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предназначенным им образом. Регуляторная последовательность, такая как промотор, энхансер или регулирующий экспрессию сигнал, «оперативно связанная» с кодирующей последовательностью, расположена таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с контрольными последовательностями, или последовательности расположены так, что они функционируют в соответствии со своим предназначением, например транскрипция начинается с промотора и продолжается по последовательности ДНК, кодирующей полипептид.

Вектор может быть плазмидой, космидой, вирусным или фаговым вектором, обычно снабженным точкой начала репликации, необязательно промотором для экспрессии полинуклеотида и необязательно энхансером и/или регулятором промотора. Может присутствовать терминаторная последовательность, также может быть полиаденильная последовательность. Вектор может содержать один или несколько селектируемых маркерных генов, например ген устойчивости к ампициллину (в случае бактериальной плазмиды) или ген устойчивости к неомицину (для вектора млекопитающего). Векторы могут быть использованы in vitro, например, для получения РНК или использованы для трансфицирования или трансформирования клетки-хозяина. Они могут содержать два или несколько полинуклеотидов по данному изобретению, например, для сверхэкспрессии.

Последовательность ДНК, кодирующая полипептид, предпочтительно введена в подходящего хозяина как часть экспрессирующей кассеты (или конструкции), в которой последовательность ДНК оперативно связана с сигналами экспрессии, которые способны управлять экспрессией последовательности ДНК в клетках-хозяевах. Для трансформации подходящего хозяина экспрессирующей конструкцией доступны методики трансформации, которые хорошо известны специалистам в данной области^3,4. Экспрессирующая конструкция может быть использована для трансформации хозяина как часть вектора, несущего селектируемый маркер, или экспрессирующая конструкция может быть ко-трансформирована как отдельная молекула вместе с вектором, несущим селектируемый маркер. Вектор может содержать один или несколько селектируемых маркерных генов.

Предпочтительные селектируемые маркеры^15,16, не ограничиваясь, включают в себя маркеры, восполняющие дефект клетки-хозяина или наделяющие устойчивостью к лекарственному средству. Они включают в себя, например, универсальные маркерные гены, которые могут быть использованы для трансформации большинства нитчатых грибов и дрожжей, такие как гены ацетамидазы или кДНК (amdS, niaD, facA гены или кДНК из A.nidulans, A.oryzae, или A.niger), или гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, такую как устойчивость к G418, гигромицину, блеомицину, канамицину, флеомицину или беномилу (benA). Альтернативно, могут быть использованы специально подобранные маркеры, такие как ауксотрофные маркеры, которые требуют соответствующие мутантные штаммы хозяина: например, URA3 (из S.cerevisiae или аналогичные гены из других дрожжей), pyrG или pyrA (из A.nidulans или A.niger), argB (из A.nidulans или A.niger) или trpC. В предпочтительном варианте осуществления селектируемый маркер удаляется из трансформированной клетки-хозяина после введения экспрессирующей конструкции так, чтобы получить трансформированные клетки-хозяева, способные продуцировать полипептид, который свободен от селектируемых маркерных генов ^21,22.

Другие маркеры включают в себя АТФ синтетазу, субъединицу 9 (oliC), оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазу (pvrA), бактериальный ген устойчивости к G418 (это также может быть использовано в дрожжах, но не в грибах), ген устойчивости к ампициллину (E.coli), ген устойчивости к неомицину (Bacillus) и ген uidA E.coli, кодирующий -глюкуронидазу (GUS). Векторы могут быть использованы in vitro, например, получения РНК или использованы для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.

Для большинства нитчатых грибов и дрожжей вектор или экспрессирующая конструкция предпочтительно интегрированы в геном клетки-хозяина с получением стабильных трансформантов. Однако для некоторых дрожжей также доступны подходящие эписомальные векторы, в которые может быть включена экспрессирующая конструкция для стабильной высокопродуктивной экспрессии, их примеры включают в себя векторы, полученные из плазмид 2 pKD1 Saccharomyces и Kluyveromyces соответственно, или векторы, содержащие последовательность АМА (например, АМА1 из Aspergillus^3,20). В случае, когда экспрессирующие конструкции интегрированы в геном клеток-хозяев, конструкции или интегрированы в произвольные локусы в геноме, или в заранее установленные локусы-мишени, с использованием гомологичной рекомбинации, и в этом случае локусы-мишени предпочтительно содержат высокопродуктивный ген. Высокопродуктивный ген представляет собой ген, мРНК которого может составить, по меньшей мере, 0,01% от массы всей клеточной мРНК, например, в индуцированных условиях или альтернативно, ген, генный продукт которого может составить, по меньшей мере, 0,2% от массы общего клеточного белка, или в случае секретируемого генного продукта, может быть секретирован в концентрации, по меньшей мере, 0,05 г/л. Ряд примеров подходящих высокопродуктивных генов приводится ниже.

Вектор или экспрессирующая конструкция для заданной клетки-хозяина может содержать следующие элементы, оперативно связанные друг с другом в следующем порядке от 5'-конца к 3'-концу относительно кодирующей цепи последовательности, кодирующей полипептид первого изобретения:

(1) промоторная последовательность, способная управлять транскрипцией последовательности ДНК, кодирующей полипептид в данной клетке-хозяине;

(2) необязательно, сигнальная последовательность, способная управлять секрецией полипептида из данной клетки-хозяина в культуральную среду;

(3) последовательность ДНК, кодирующая зрелую и предпочтительно активную форму полипептида;

и предпочтительно также

(4) область терминации транскрипции (терминатор), способную прерывать транскрипцию ниже последовательности ДНК, кодирующей полипептид.

Ниже последовательности ДНК, кодирующей полипептид, может располагаться 3'-нетранслируемая область, содержащая один или несколько сайтов терминации транскрипции (например, терминатор). Происхождение терминатора менее важно. Терминатор может, например, быть нативным к последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Однако предпочтительно используют дрожжевой терминатор в дрожжевых клетках-хозяевах, а терминатор нитчатых грибов используют в клетках-хозяевах нитчатых грибов. Более предпочтительно, терминатор является эндогенным для клетки-хозяина (в которой экспрессируется последовательность ДНК, кодирующая полипептид).

Усиленная экспрессия полинуклеотида, кодирующего полипептид по данному изобретению, также может быть осуществлена путем выбора гетерологичных регуляторных областей, например, промотора, секреторной лидерной и/или терминаторной областей, которые могут служить для усиления экспрессии и при необходимости уровней секреции интересующего белка, из экспрессирующего хозяина и/или для обеспечения индуцибельного контроля экспрессии полипептида по данному изобретению.

Помимо промотора, нативного к гену, кодирующему полипептид по данному изобретению, другие промоторы могут быть использованы для управления экспрессией полипептида по данному изобретению. Промотор может быть подобран по его эффективности в управлении экспрессией полипептида по данному изобретению в необходимом экспрессирующем хозяине.

Промоторы/энхансеры и другие регуляторные сигналы экспрессии могут быть выбраны совместимыми с клеткой-хозяином, для которой создан вектор экспрессии. Например, могут быть использованы прокариотические промоторы, в частности, подходящие для использования в штаммах E.coli. Когда экспрессию проводят в клетках млекопитающих, могут быть использованы промоторы млекопитающих. Также могут быть использованы тканеспецифичные промоторы, например гепатоцитарные клеточно-специфичные промоторы. Также могут быть использованы вирусные промоторы, например длинные терминальные повторы вируса мышиного лейкоза Moloney (MMLV LTR), промотор вируса саркомы Рауса (RSV) LTR промотор, SV40 (например, большой Т антиген) промотор, IE промотор цитомегаловируса человека (ЦМВ), промоторы вируса простого герпеса или аденовирусные промоторы, промоторы HSV, такие как промоторы HSV IE), или промоторы HPV, в частности, верхняя регуляторная область HPV (URR). Промоторы дрожжей включают в себя промоторы S. cerevisiae GAL4 и ADH, промоторы nmt 1 и adh S. pombe. Промоторы млекопитающих включают в себя промотор металлотионеина, который может быть индуцирован в ответ на тяжелые металлы, такие как кадмий, и -актиновые промоторы. Тканеспецифичные промоторы, в частности эндотелиальные или нейрональные клеточно-специфические промоторы (например, DDAHI и DDAHII промоторы), особенно предпочтительны.

Может быть использован ряд промоторов^15,16, которые способны управлять транскрипцией в клетках-хозяевах по данному изобретению. Предпочтительно промоторная последовательность получена из высокопродуктивного гена, как определено предварительно. Примеры предпочтительных высокопродуктивных генов, из которых предпочтительно получать промоторы и/или которые содержатся в предпочтительных заранее определенных локусах мишенях для интегрирования экспрессирующих конструкций, включают в себя, не ограничиваясь, гены, кодирующие гликолитические ферменты, такие как триозофосфатные изомеразы (ТФИ), глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФДГ), фосфоглицераткиназы (ФГК), пируваткиназы (ПИК или ПКИ), алкогольдегидрогеназы (АДГ), а также и гены, кодирующие амилазы, глюкоамилазы, протеазы, ксиланазы, целлобиогидролазы, -галактозидазы, алкоголь(метанол)оксидазы, факторы элонгации и рибосомальные белки. Отдельные примеры соответствующих высокопродуктивных генов включают в себя, например, LAC4 ген из Kluyveromyces sp., метанолоксидазные гены (AOX и MOX) из Hansenula и Pichia, соответственно глюкоамилазные (glaA) гены из A-niger и A.awamori, A.oryzae TAKA-амилазный ген, A-nidulans gpdA ген и T.reesei целлобиогидролазные гены.

Примерами сильных конститутивных и/или индуцибельных промоторов, которые предпочтительны для использования в грибных экспрессирующих хозяевах^15,16,35, являются промоторы, которые получены из генов грибов для ксиланазы (xlnA), фитазы, АТФ-синтетазы, субъединицы 9 (oliC), триозофосфатизомеразы (tpi), алкогольдегидрогеназы (AdhA) -amylase (amy) амилоглюкозидазы (AG - из гена glaA), ацетамидазы (amdS) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gpd).

Примерами сильных дрожжевых промоторов являются промоторы, полученные из генов для алкогольдегидрогеназы, лактазы, 3-фосфоглицераткиназы и триозофосфатизомеразы.

Примерами сильных бактериальных промоторов являются -амилаза и Spo2 промоторы, также как и промоторы из генов внеклеточной протеазы.

Нативный промотор гена, кодирующего ксиланазу, может быть перенесен промотором, который регулируется иначе, чем нативный промотор.

Промоторы, подходящие для клеток растений, включают в себя нопалинсинтазные (nos), октопинсинтазные (ocs), маннопинсинтазные (mas), малой субъединицы рибулозы (rubisco ssu), гистоновые, рисового актина, фазеолина, вируса мозаики цветной капусты (CMV) 35S и 19S и цирковирусные промоторы. Все эти промоторы легкодоступны в этой области.

Вектор также может включать в себя последовательности, фланкирующие полинуклеотид, индуцирующие образование РНК, которые включают в себя последовательности, гомологичные эукариотическим геномным последовательностям, предпочтительно геномным последовательностям млекопитающих или вирусным геномным последовательностям. Это также позволит встраивать полинуклеотиды по данному изобретению в геном эукариотических клеток или вирусов путем гомологичной рекомбинации. В частности, плазмидный вектор, содержащий экспрессирующую кассету, которую фланкируют вирусные последовательности, может быть использован для получения вирусного вектора, пригодного для доставки полинуклеотидов по данному изобретению в клетку млекопитающего. Другие примеры подходящих вирусных векторов включают в себя векторы вируса простого герпеса^18,19 и ретровирусы, включая лентивирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и вирусы HPV (такие как HPV-16 или HPV-18). Методики генного переноса с использованием этих вирусов известны специалистам в данной области. Ретровирусные векторы, например, могут быть использованы для стабильного интегрирования полинуклеотида, индуцирующего образование антисмысловой РНК в геноме клетки-хозяина. Дефектные по репликации аденовирусные векторы в противоположность этому остаются эписомальными и, следовательно, делают возможной транзиторную экспрессию.

Вектор может содержать полинуклеотид по данному изобретению, ориентированный в антисмысловом направлении для обеспечения образования антисмысловой РНК. Это может быть использовано для снижения, если требуется, уровней экспрессии полипептида.

Клетки-хозяева и экспрессия

Следующий аспект данного изобретения относится к способу получения полипептида в соответствии с данным изобретением, который включает в себя культивирование клетки-хозяина (например, трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии, как описано выше) в условиях, обеспечивающих экспрессию (этим вектором) кодирующей последовательности, которая кодирует полипептид, и, необязательно, выделение экспрессированного полипептида. Полинуклеотиды по данному изобретению могут быть включены в состав рекомбинантного реплицируемого вектора, например вектора экспрессии. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке-хозяине. Таким образом, в следующем варианте осуществления изобретение относится к способу получения полинуклеотида по данному изобретению путем введения полинуклеотида по данному изобретению в реплицируемый вектор, введения этого вектора в совместимую клетку-хозяина и выращивания этой клетки-хозяина в условиях, способствующих репликации вектора. Вектор может быть выделен из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева включают в себя бактерии, такие как E.coli, дрожжи, клеточные линии млекопитающих и другие эукариотические клеточные линии, например клетки насекомых, такие как Sf9 клетки и клетки грибов (например, нитчатых).

Предпочтительно полипептид получен как секретируемый белок, в этом случае последовательность ДНК, кодирующая зрелую форму полипептида в экспрессирующей конструкции, оперативно связана с последовательностью ДНК, кодирующей сигнальную последовательность. Предпочтительно сигнальная последовательность является нативной (гомологичной) последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Альтернативно сигнальная последовательность является чужеродной (гетерологичной) последовательности ДНК, кодирующей полипептид, в этом случае сигнальная последовательность предпочтительно является эндогенной для клетки-хозяина, в которой экспрессируется последовательность ДНК. Примерами подходящих сигнальных последовательностей для дрожжевых клеток-хозяев являются сигнальные последовательности, происходящие из генов -фактора дрожжей. Подобным образом подходящая сигнальная последовательность для клеток-хозяев нитчатых грибов представляет собой, например, сигнальную последовательность, происходящую из гена амилоглюкозидазы (AG) нитчатых грибов, например гена A.niger glaA. Она может быть использована в комбинации с амилоглюкозидазным (называемым также (глюко)амилазным) промотором, также как и в комбинации с другими промоторами. Гибридные сигнальные последовательности также могут быть использованы в контексте настоящего изобретения.

Предпочтительными гетерологичными секреторными лидерными последовательностями являются последовательности, происходящие из гена амилоглюкозидазы (AG) гриба (glaA - оба 18 и 24 аминокислотных варианта, например, из Aspergillus), гена -фактора (дрожжи, например Saccharomyces и Kluyveromyces) или гена -амилазы (Bacillus).

Векторами может быть трансформирована или трансфицирована подходящая клетка-хозяин, как описано выше, для обеспечения экспрессии полипептида по данному изобретению. Этот процесс может включать в себя культивирование клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, как описано выше в условиях, обеспечивающих экспрессию вектором кодирующей последовательности, кодирующей полипептид.

Дальнейший аспект данного изобретения, следовательно, предлагает клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные, или содержащие полинуклеотид или вектор по данному изобретению. Предпочтительно полинуклеотид вводят в вектор для репликации и экспрессии полинуклеотида. Эти клетки выбирают совместимыми с указанным вектором и могут быть, например, прокариотическими (например, бактериальными), клетками грибов, дрожжей или растений.

Также может быть выбран гетерологичный хозяин, в котором полипептид по данному изобретению образуется в форме, по существу не содержащей других целлюлозоразлагающих ферментов. Это может быть достигнуто путем выбора хозяина, который обычно не образует такие ферменты, как, например, Kluyveromyces lactis.

Данное изобретение относится к способам получения полипептида по данному изобретению методами экспрессии рекомбинантной последовательности ДНК, кодирующей этот полипептид. С этой целью последовательность ДНК по данному изобретению может быть использована для амплификации генов и/или обмена сигналами экспрессии, таких как промоторы, секреторные сигнальные последовательности, чтобы добиться экономичного получения полипептида в подходящей гомологичной или гетерологичной клетке-хозяине. Гомологичная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина, которая является клеткой того же вида или вариантом вида, из которого происходит последовательность ДНК.

Подходящими клетками-хозяевами предпочтительно являются прокариотические микроорганизмы, такие как бактерии, или более предпочтительно эукариотические организмы, например грибы, такие как дрожжи или нитчатые грибы, или растительные клетки. В основном дрожжевые клетки предпочтительнее, чем клетки грибов, поскольку с ними легче манипулировать. Однако некоторые белки либо плохо секретируются из дрожжей, либо в некоторых случаях не процессируются должным образом (например, гипергликозилирование у дрожжей). В этих случаях следует выбирать грибной организм-хозяин.

Клетка-хозяин может сверхэкспрессировать полипептид, и методики для создания сверхэкспрессии хорошо известны³. Так, хозяин может иметь две или несколько копий кодирующего полинуклеотида (и вектор, следовательно, может иметь две или несколько копий соответственно).

В качестве гетерологичных хозяев очень подходят бактерии из рода Bacillus из-за их способности секретировать белки в культуральную среду. Другими бактериями, пригодными в качестве хозяев, являются бактерии из родов Streptomyces и Pseudomonas. Предпочтительной дрожжевой клеткой-хозяином для экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид, является клетка родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia и Schizosaccharomyces. Более предпочтительно дрожжевая клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из видов Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (также известный как Kluyveromyces marxianus вар. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica и Schizosaccharomyces pombe.

Однако более предпочтительными являются грибные (например, нитчатые) клетки-хозяева. Предпочтительные клетки-хозяева нитчатых грибов выбраны из группы, состоящей из родов Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia и Talaromyces. Клетка-хозяин из нитчатого гриба более предпочтительно является клеткой родов Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans или видов из группы Aspergillus niger ²³. Они включают в себя, но не ограничены, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae и Aspergillus ficuum, и, кроме того, состоящие из видов Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum и Thielavia terrestris. Примерами предпочтительных экспрессирующих хозяев в пределах объема настоящего изобретения являются грибы, такие как Aspergillus виды^24,25 и виды Trichoderma; бактерии, такие как виды Bacillus^26,27 , например Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, виды Pseudomonas; и дрожжей, как например, виды Kluyveromyces²⁸, например Kluyveromyces lactis ²⁹ и виды Saccharomyces, например Saccharomyces cerevisiae.

Клетки-хозяева по данному изобретению включают в себя клетки растений, и данное изобретение, следовательно, относится к трансгенным организмам, таким как растения и их части, которые содержат одну или несколько клеток данного изобретения. Эти клетки могут гетерологично экспрессировать полипептид по данному изобретению или могут гетерологично содержать один или несколько полинуклеотидов данного изобретения. Трансгенные (или генетически модифицированные) растения могут, следовательно, иметь встроенную (например, стабильно) в геном последовательность, кодирующую один или несколько полипептидов данного изобретения. Трансформация растительных клеток может быть выполнена с использованием известных методик, например с использованием плазмиды Ti или Ri из Agrobacterium tumefaciens. Эта плазмида (или вектор) может, следовательно, содержать последовательности, необходимые для инфицирования растений, могут быть применены производные Ti и/или Ri плазмид.

Альтернативно, может быть выполнено направленное инфицирование частей растений, как, например, листа, корня или стебля. При этой методике инфицированное растение может быть повреждено, например, разрезанием бритвой или прокалыванием растения иглой или натиранием абразивом. Затем повреждение иннокулируют Agrobacterium. Растение, или часть растения, может быть выращено на подходящей культуральной среде и развиться во взрослое растение. Регенерация трансформированных клеток в генетически модифицированные растения может быть осуществлена и использованием известных методик, например отбора трансформированных ростков с использованием антибиотиков и субкультивирования этих ростков в среде, содержащей соответствующие питательные вещества, гормоны растений и подобное¹⁷ .

Культура клеток-хозяев и производство рекомбинантов

Данное изобретение также относится к клеткам, которые были модифицированы для экспрессирования ксиланазы или ее вариантов. Такие клетки включают в себя транзиторные или предпочтительно стабильные клеточные линии высших эукариотических клеток, таких как клетки млекопитающих или насекомых, низшие эукариотические клетки, как, например, клетки дрожжей и (например, нитчатых) грибов или прокариотические клетки, как, например, бактериальные клетки.

Для белков данного изобретения также возможна временная экспрессия в клеточной линии или на мембране, как, например, в бакуловирусной экспрессирующей системе. Такие системы, которые адаптированы для экспрессии белков в соответствии с данным изобретением, также включены в объем настоящего изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением получение полипептида данного изобретения может быть осуществлено путем культивирования микробиологических экспрессирующих хозяев, которые были трансформированы одним или несколькими полинуклеотидами настоящего изобретения, в обычной ферментативной питательной среде.

Рекомбинантные клетки-хозяева в соответствии с данным изобретением могут быть культивированы с использованием методик, известных в данной области. Для каждой комбинации промотора и клетки-хозяина доступны условия культивирования, способствующие экспрессии последовательности ДНК, кодирующей данный полипептид. После достижения требуемой клеточной плотности или титра полипептида культивирование останавливают и выделяют полипептид с использованием известных методик.

Ферментативная среда может включать в себя известную культуральную среду, содержащую источник углерода (например, глюкозу, мальтозу, меллас и т.д.), источник азота (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония и т.п.), источник органического азота (например, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, пептон и т.д.) и источники неорганических питательных веществ (например, фосфата, магния, калия, цинка, железа и т.д.). Необязательно, может быть включен стимулятор (например, целлюлоза, пектин, мальтоза, мальтодекстрин или ксилогалактуронан).

Подбор соответствующей среды может быть основан на выборе экспрессирующего хозяина и/или основан на регуляторных требованиях экспрессирующей конструкции. Такие среды известны специалистам в данной области. Среда может, если требуется, содержать дополнительные компоненты, благоприятные для экспрессирующих хозяев более, чем для других потенциально загрязняющих микроорганизмов.

Ферментация может быть выполнена за период 0,5-30 дней. Это может быть серийный, непрерывный или серийно-подаваемый процесс, приемлемый при температуре в интервале от 0 до 45°C и, например, при pH между 2 и 10. Предпочтительными условиями ферментации являются температура в интервале от 20 до 37°C и/или pH между 3 и 9. Соответствующие условия обычно подбирают на основании выбора экспрессирующего хозяина и экспрессируемого белка.

После ферментации, если необходимо, клетки могут быть удалены из ферментного бульона способами центрифугирования или фильтрации. После остановки ферментации или после удаления клеток полипептид данного изобретения затем может быть извлечен и, если требуется, очищен и изолирован обычными методами.

D. Применение ксиланазы и способы обработки растений или целлюлозо(например, ксилан)-содержащих материалов.

Полипептиды данного изобретения, обладающие ксиланазной активностью, могут быть использованы для обработки грибного или растительного материала, включающего в себя растительную массу или растительные экстракты. Например, они могут быть использованы для обработки зерна, овощей, фруктов или из экстрактов. Удобно, если полипептид данного изобретения объединен с подходящим (твердым или жидким) носителями или разбавителями, включающими в себя буферы, для образования композиции/ферментного препарата. Этот полипептид может быть прикреплен к или связан с носителем, например иммобилизован на твердой фазе. Следовательно, настоящее изобретение предлагает в дальнейшем аспекте композицию, содержащую полипептид данного изобретения. Это может быть форма, пригодная для упаковки, транспортировки и/или хранения предпочтительно в тех случаях, когда сохранена ксиланазная активность. Композиции могут быть пастой, жидкостью, эмульсией, порошком, хлопьями, гранулой, шариком или другой формой.

Кроме того, композиция может содержать дополнительные ингредиенты, такие как, один или несколько, ферменты, например пектиназы, включая эндоарабиназы и рамногалактуроназу, целлюлазы, (другие) ксиланазы, галактуроназы, маннаназы и/или ксилоглюканазы. Полипептид обычно стабильно формулирован либо в жидкой, либо в сухой форме. Обычно продукт изготовлен как композиция, которая необязательно включает в себя, например, стабилизирующий буфер и/или консервант. Композиции могут также включать в себя другие ферменты, способные разлагать растительный материал или целлюлозу, например другие целлюлазы, например ( -D-)глюканазы. Для определенных применений может быть предпочтительна иммобилизация фермента на твердой матрице или инкорпорация на или внутри частиц твердого носителя. Композиция также может включать в себя ряд других ферментов, разлагающих растительный материал, например целлюлазы или другие пектиназы.

Полипептиды и композиции данного изобретения могут быть, следовательно, использованы в способах обработки растительного материала для разложения или модифицирования целлюлозных компонентов (например, ксилана) клеточных стенок растительного или грибного материала. Таким образом, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу разложения или модифицирования растительных клеток, этот способ включает в себя взаимодействие растительной или грибной клетки с полипептидом или композицией данного изобретения.

Данное изобретение также относится к способу обработки растительного материала, который включает в себя взаимодействие растительного материала с полипептидом или композицией данного изобретения для разложения или модифицирования целлюлозы в (растительном) материале. Предпочтительно растительный материал представляет собой растительную массу или растительный экстракт, как, например, соки.

В частности, разложение предпочтительно включает в себя расщепление ксилановых субъединиц целлюлозного компонента клеточных стенок растений. Предпочтительно растительный материал представляет собой злаковые, овощи, фрукты или овощную или фруктовую пульпу или экстракт. Настоящее изобретение, более того, предлагает обработанный растительный материал, полученный взаимодействием растительного материала с полипептидом или композицией данного изобретения.

Настоящее изобретение также относится к способу снижения вязкости растительных экстрактов, который предусматривает взаимодействие растительного экстракта с полипептидом или композицией данного изобретения в количестве, эффективном для разложения целлюлозы (или ксилана), содержащейся в растительном экстракте.

Растительные или целлюлозосодержащие материалы включают в себя растительную пульпу, части растений и растительные экстракты. В контексте данного изобретения экстракт из растительного материала представляет собой любое вещество, которое может быть получено из растительного материала путем экстракции (механической и/или химической), обработки или другими разделяющими методиками. Экстрактом может быть сок, нектар, основа или концентраты, полученные из них. Растительный материал может включать в себя, или быть полученным из овощей, например моркови, сельдерея, лука, бобов или бобовых растений (сои, соевых бобов, гороха) или фруктов, например семечковых или семенных фруктов (яблок, груш, айвы и т.п.), винограда, томатов, цитрусовых (апельсинов, лимонов, лайм, мандаринов), дынь, сливы, вишни, черной смородины, красной смородины, малины, клубники, клюквы, ананаса и других тропических фруктов, деревьев и их частей (например, пыльцы из хвойных деревьев) или злаковых (овса, ячменя, пшеницы, кукурузы, риса). Этот материал (гидролизованный) также может быть сельскохозяйственными отходами, такими как пульпа сахарной свеклы, кочерыжка кукурузного початка, солома пшеницы, скорлупа (земляного) ореха, или повторно используемыми материалами, например бумагой (макулатурой).

Полипептиды данного изобретения, следовательно, могут быть использованы для обработки растительного материала, включающего в себя растительную пульпу или растительные экстракты. Они также могут быть использованы для обработки жидких или твердых кормов или съедобных пищевых ингредиентов, или быть использованы при экстракции кофе, растительных масел, крахмала или как сгуститель в пищевых продуктах.

Обычно полипептиды данного изобретения используются в качестве композиции/ферментного препарата, как описано выше. Как правило, композиции будут добавлены к растительной пульпе, полученной, например, механической обработкой, такой как дробленый или молотый растительный материал. Инкубация композиции с растением, как правило, будет проведена в течение времени от 10 минут до 5 часов, как, например, от 30 минут до 2 часов, предпочтительно в течение приблизительно 1 часа. Температура обработки предпочтительно составляет 10-55°C, например от 15 до 25°C, оптимально примерно 20°C, и может использовать 10-300 г, предпочтительно 30-70 г, оптимально примерно 50 г фермента на тонну обрабатываемого материала. Все используемые фермент(ы) или их композиции могут быть добавлены последовательно или одновременно с растительной пульпой. В зависимости от состава ферментного препарата растительный материал сначала может быть размочен (например, для пюре) или разжижен. С использованием полипептидов данного изобретения могут быть улучшены параметры обработки, такие как эффективность экстракции, вязкость экстракта и/или качество экстракта.

Альтернативно или дополнительно к вышесказанному полипептид данного изобретения может быть добавлен к необработанному соку, полученному из прессованной или разжиженной растительной мякоти. Обработка неочищенного сока будет выполнена подобным образом для растительной мякоти в отношении дозы, температуры и времени выдерживания. Кроме того, могут быть включены другие ферменты, как, например, рассмотренные ранее. Обычные условия инкубации описаны в предыдущем разделе. Необработанный сок, однократно инкубированный с полипептидами данного изобретения, затем центрифугируют или (ультра)фильтруют с получением конечного продукта.

После обработки полипептидом по данному изобретению (конечный) продукт может быть обработан нагреванием, например, при 100°C в период времени от 1 минуты до 1 часа в условиях для частичной или полной инактивации полипептида(ов) данного изобретения.

Композиция, содержащая полипептид данного изобретения, также может быть использована во время приготовления фруктовых или овощных пюре.

Полипептид данного изобретения также может быть использован в пивоварении, изготовлении вина, перегонке или хлебопечении. Кроме того, он может быть использован при изготовлении спиртных напитков, таких как вино и пиво. Например, он может улучшать фильтруемость или прозрачность (пива, сусла или вина). Белок может способствовать удалению растворенных органических веществ из бульона или культуральной среды, например, в тех случаях, когда отходы перегонного завода органического происхождения биопревращаемы в микробиологическую биомассу. Ксиланаза может улучшать фильтруемость и/или снижать вязкость в сиропах глюкозы, таких как из злаковых, полученных путем разжижения (например, -амилазой).

В хлебопечении полипептид может улучшать структуру теста, изменять его липкость или эластичность, улучшать объем батона и/или структуру хлебного мякиша или придавать лучшие структурные характеристики, как, например, ломкость, крошимость или качество хлебного мякиша. Полипептид может быть добавлен в количествах от 100 до 3000, так, например, от 150 до 2000, оптимально от 200 до 1600 EXU/кг муки.

Полипептиды находят применение в различных областях промышленности благодаря ксиланазной активности. Эти области могут включать в себя не только производство алкоголя, но и также в биометилировании, изготовлении хлеба и хлебопечении, в гигиене полости рта (например, композиции для зубов или полости рта), при обработке или производстве кожи, при производстве бумаги, фармацевтических препаратов, в чае, в производстве или обработке тканей и при обработке отходов. Один аспект данного изобретения представляет собой, следовательно, корм или продукты питания, содержащие полипептид, такие как алкогольные напитки, хлеб, тесто или чай. Полипептид может быть формулирован в подходящие композиции для любого из этих применений. Полипептид может находиться в водной композиции (например, горячей воде), предпочтительно с одним или несколькими фунгицидами, для обработки растительного материала (например, луковиц), особенно для проверки паразитических насекомых, клещей и нематод. Так как полипептиды данного изобретения обладают способностью разлагать ксилан, они могут быть добавлены к пище или продуктам питания (например, потребляемым людьми). Данное изобретение также включает в себя фармацевтические и ветеринарные композиции, которые содержат полипептид данного изобретение и фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители.

Полипептиды данного изобретения также могут проявлять противогрибковую активность. Они могут обладать способностью разлагать клеточные стенки грибов и, следовательно, могут быть использованы для лизиса клеточных стенок грибов, для раскрытия клеток. Это может высвобождать внутриклеточные белки. Таким образом данные полипептиды могут быть использованы для приготовления дрожжевых и/или грибных экстрактов.

E. Корма для животных

Данное изобретение дополнительно относится к продуктам питания или кормовым составам для животных или добавкам, содержащим один или несколько полипептидов данного изобретения. Полипептид может находиться в корме в концентрации, отличной от его естественной концентрации. Предпочтительные количества составляют 0,6-35, такие как 1,5-15, предпочтительно 3-15 мг на кг корма. Подходяще полипептид данного изобретения находится в корме от 1000 до 50000 EXU/кг корма, так, например, от 2500 до 25000 EXU/кг, оптимально от 5000 до 20000 EXU/кг.

Данное изобретение также относится к способу получения кормовой композиции для животных, этот способ включает в себя добавление к одному (или нескольким) пищевому веществу(ам) или ингредиенту(ам), содержащему(им) ксилан, полипептида по данному изобретению. Данные полипептиды могут быть добавлены к кормовой композиции для животных отдельно от кормовых веществ или ингредиентов, в отдельности или комбинации с другими кормовыми добавками. Данный полипептид может быть существенной частью одного или нескольких кормовых веществ или ингредиентов.

Полипептиды данного изобретения также могут быть добавлены к кормам для животных, богатым целлюлозой для улучшения разрушения клеточной стенки растения, приводя к улучшенному усвоению животными растительных питательных веществ. Полипептиды данного изобретения могут быть добавлены к корму или силосу, если предпочтительны предварительное размачивание или жидкое питание. Преимущественно полипептиды данного изобретения могут продолжать разлагать целлюлозу в корме in vivo. Полипептиды данного изобретения, основанные на грибах, в частности, в основном имеют более низкий оптимум рН и обладают способностью высвобождать важные питательные вещества в такую кислотную среду, как в желудке животного. Данное изобретение, таким образом, также рассматривает корма (например, для животных) или продукты питания, содержащие один или несколько полипептидов данного изобретения.

Полипептиды данного изобретения также могут быть использованы при производстве заменителей молока из соевых бобов. Эти заменители молока могут употребляться как людьми, так и животными. Типичной проблемой при производстве этих заменителей молока является высокая вязкость кашицы соевых бобов, что в результате приводит к необходимости нежелательного разбавления кашицы до концентрации сухого твердого вещества от 10 до 15%. Ферментный препарат, содержащий полипептид данного изобретения, может быть добавлен к или во время обработки кашицы, позволяя проводить обработку при более высоких концентрациях (обычно от 40 до 50%) сухого твердого вещества. Данные ферменты могут быть использованы при приготовлении приятных на вкус продуктов, например, из соевых бобов.

Данная композиция дополнительно может содержать (в частности, в случае формулирования для использования в кормах для животных) один или несколько ионофоров, окислителей, поверхностно-активных веществ, «rumen protected» аминокислоты, усилителей ферментов или ферментов, которые могут образовываться естественным путем в желудочно-кишечном тракте накормленных животных.

В случае добавления к кормам (включая силос) для жвачных или моногастральных животных (например, домашней птицы или домашней свиньи) корма могут содержать злаковые, такие как ячмень, пшеница, кукуруза, рожь или овес или побочные продукты злаковых, такие как пшеничные отруби или кукурузные отруби, или другие растительные материалы, такие как соевые бобы и другие бобовые. Данный фермент(ы) может(гут) значительно улучшать разрушение клеточных стенок растений, что приводит к лучшему усвоению растительных питательных веществ животными. И, как следствие, могут быть улучшены темп роста и/или переработка корма. Полипептиды данного изобретения могут быть добавлены к корму (напрямую или в качестве добавки или компонента) или могут быть добавлены вместо обработанного кормового компонента (например, целлюлоза/ксилан).

Данные белки могут снижать вязкость корма (содержащего ксилан): белки могут продолжать гидролиз ксилана in vivo. Белки данного изобретения, в частности, являются применимыми для кормов для животных, поскольку остаются активными в условиях высокой кислотности, таких как в желудке животных.

Особенно предпочтительным способом для (экзогенного) добавления модифицированной ксиланазы является добавление полипептида данного изобретения в качестве трансгенного растительного материала и/или (например, трансгенных) семян. Следовательно, данный полипептид синтезирован посредством гетерологичной генной экспрессии, например ген, кодирующий требуемый фермент, может быть клонирован в растительный вектор экспрессии в условиях, подходящих для растительных сигналов экспрессии, например тканеспецифичный промотор, такой как специфический промотор семян. Вектор экспрессии, содержащий ген, кодирующий полипептид, может быть впоследствии трансформирован в растительные клетки, и трансформированные клетки могут быть отобраны для регенерации в целые растения. Полученные таким образом трансгенные растения могут быть выращены и собраны, и части растений, содержащие гетерологичный (данному растению) полипептид, могут быть включены в состав одной из композиций, либо как таковые, либо после дальнейшей обработки. Известны общепринятые способы для (гетерологичной) экспрессии ферментов в (трансгенных) растениях, включая способы для семяспецифической экспрессии ферментов³⁰. Данный гетерологичный полипептид может содержаться в семени трансгенного растения, или он может содержаться в других частях растения, таких как корни, стебли, листья, древесина, цветы, кора и/или плоды. Растение может быть однодольным или двудольным. Подходящие растения включают в себя злаковые, такие как овес, ячмень, пшеница, кукуруза и рис. Предпочтительно полинуклеотид данного изобретения стабильно включен в геном растения.

Добавление полипептида в виде трансгенного растительного материала, например, в трансгенных семенах может потребовать обработки растительного материала так, чтобы сделать фермент доступным, или, по меньшей мере, улучшить его доступность. Такие методики обработки могут включать в себя разнообразные механические (например, размалывающие и/или измельчающие) методики или термомеханические обработки, такие как экструзия или экспансия.

Настоящее изобретение, следовательно, также относится к способу активизации роста и/или переработки корма у моногастральных или нежвачных животных, данный способ включает в себя кормление животных полипептидом по данному изобретению. Подходящие животные включают в себя сельскохозяйственных животных, моногастральных и/или нежвачных животных, таких как свиньи (или поросята), домашняя птица (такая как цыплята, индейки), телята или водные (например, морские) животные (например, рыба).

Изучение ферментов, разлагающих целлюлозу

Также в пределах настоящего изобретения находится применение полипептидов в соответствии с данным изобретением для скрининговых методов для определения веществ, которые могут действовать как антагонисты, которые могут модулировать ксиланазу. В общих чертах такие скрининговые методы могут предусматривать взаимодействие полипептида данного изобретения с тестируемым веществом и затем измерение активности или инкубирование полипептида данного изобретения с тестируемым веществом и затем выявление какого-либо изменения активности ксиланазы. Также могут быть определены действующие вещества, связывающиеся с полипептидом данного изобретения путем исследования связывания.

Модулятор активности может быть установлен путем взаимодействия клеток, экспрессирующих полипептид данного изобретения, с исследуемым веществом и наблюдением эффекта, опосредованного полипептидами. Клетки, экпрессирующие полипептид, могут находиться in vitro, и предпочтительно исследование проводят in vitro с использованием клеток, экспрессирующих рекомбинантный полипептид.

Исследования и субстраты, описанные здесь, позволили установить и подтвердить ксиланазную активность. Эти исследования могут быть использованы для выявления других ферментов, разлагающих целлюлозу, например, с ксиланазной активностью. Субстрат, который может быть использован для этого исследования, может содержать ксилан.

Другой аспект данного изобретения относится к исследованию для определения или выявления полипептида, который обладает способностью разлагать целлюлозу. Активность может быть ксиланазной, или может быть пектинлиазной, полигалактуроназной, эстеразной, целлюлазной, ксилоглюканазной, галактоназной, арабинаназной или рамногалактуроназной. Данное исследование может включать в себя:

(a) обеспечение в качестве субстрата для кандидатного вещества (обычно полипептида), подходящего субстрата (как описано); и

(b) взаимодействие субстрата с кандидатным веществом и обнаружение, образуются ли какие-либо продукты ксиланазной активности.

Вышеуказанные исследования могут быть использованы для определения модуляторов ксиланазной активности. Такие вещества могут снижать размягчение фруктов, что может придать лучший вкус и улучшить цвет фруктов и также может продлить срок хранения и/или транспортировки. Таким образом, эти исследования могут быть использованы для определения ингибиторов полипептидов данного изобретения, которые могут быть способны препятствовать размягчению фруктов.

Предпочтительными особенностями и характеристиками одного аспекта данного изобретения являются применимость к другим аспектам mutatis mutandis.

Данное изобретение теперь будет описано с ссылкой на следующие примеры, которые предназначены для иллюстрации, но не для ограничения.

ПРИМЕРЫ

Общие методики

Стандартные методики молекулярного клонирования, такие как выделение ДНК, гель электрофорез, ферментативные рестрикционные модификации нуклеиновых кислот, Саузерн анализы, трансформация E.coli, colony lifts и гибридизация на фильтре и т.д., проводили с использованием стандартных методик^1,2 . Синтетические олигодезоксинуклеотиды были получены из ISOGEN Bioscience (Maarssen, Нидерланды). Анализы последовательностей ДНК проводили на ДНК секвенсере Applied Biosystems 373A согласно инструкциям.

Маркирование и гибридизации ДНК выполняли согласно ECL^ТМ прямого маркирования нуклеиновой кислоты и детекционных систем (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, England) или в соответствии со стандартными методиками радиоактивного маркирования¹.

ПРИМЕР 1: выделение РНК из T. emersonii и синтезирование кДНК

T.emersonii штамм CBS 393.64 ферментировали в ксилан-индуцирующих условиях. В отдельные моменты времени собирали мицелий и культуральный супернатант методом фильтрации с использованием Miracloth filtration wrap. Мицелий хорошо промывали деминерализованной водой и выжимали в бумажные полотенца для удаления избытка воды. Мицелий выбранных моментов времени (основанных на измерениях целлюлазы в культуральных супернатантах) немедленно замораживали в жидком азоте и измельчали в мелкий порошок с использованием ступки и пестика. Полученный в результате порошок переносили в стерильную 50 мл пробирку и взвешивали: на каждые 1-1,2 г мицелия добавляли 10 мл реактива TRIzol (Gibco/BRL) (максимально 25 мл на пробирку). Порошок мицелия сразу же растворяли интенсивным перемешиванием (вихревое, 1 мин), с последующей 5-минутной инкубацией при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Добавляли 0,2 (оригинал TRIzol) объема хлороформа (следовательно, 2 мл на каждые 10 мл изначально использованного TRIzol), перемешивали интенсивным вращением и оставляли при комнатной температуре на 10 минут. Впоследствии смесь центрифугировали при 4°C, 6000 g в течение 30 минут. Верхнюю водную фазу переносили в чистую пробирку и всю РНК осаждали добавлением 0,5 (исходного TRIzol) объема изопропилового спирта (следовательно, 5 мл изопропилового спирта на каждые 10 мл изначально используемого TRIzol). Через 10 минут осаждения при комнатной температуре РНК извлекали центрифугированием в течение 30 минут при 6000 g. После удаления супернатанта осадок РНК промывали одним объемом 70% этанола. После удаления этанола осадок РНК высушивали на воздухе. Высушенный осадок РНК растворяли в 3 мл GTS буфером (100 мМ Трис-Cl, pH 7,5, 4M тиоцианатом гуанидина, 0,5% лаурилсаркозинатом натрия). 10 мкл раствора РНК использовали для определения качества и концентрации нуклеиновых кислот.

Проводили Нозерн анализ³ и выделенную РНК в дальнейшем очищали.^1,3 Для выделения мРНК использовали видоизмененный протокол (с использованием безнапорного потока вместо центрифугирования) PHARMACIA набора для очистки (Cat no. 27-9258-02).³ Для синтеза кДНК использовали STRATAGENE cDNA Synthesis KIT в соответствии с инструкциями производителя, за исключением ряда критериев оптимальности для использования векторов pGBFIN со значительными изменениями, как было описано ранее.³

Количество синтезированной кДНК оценивали ТСА преципитацией и впоследствии анализировали с помощью электрофореза в щелочном агарозном геле.³

ПРИМЕР 2: Получение библиотек кДНК из мРНК T. emersonii

Пул кДНК, полученный в Примере 1, затупляли, лигирован с адаптерами и расщеплен ферментом рестрикции. ³

Клонирование кДНК в вектор экспрессии pGBFIN-11 ³ требует присутствия сайта EcoRI на 5'- and сайта XhoI на 3'-конце кДНК. Следовательно, используемые праймерные олигонуклеотиды первой цепи и адаптерные последовательности (Pharmacia) были выбраны согласно предварительным условиям, установленным для вектора экспрессии.

Полученные кДНК разделяли фракционированием по размеру через SEPHAROSE CL-2B матрицу, исходя из размера, полученные индивидуальные пулы анализировали посредством неденатурирующего гель-электрофореза.³ Два пула кДНК, полученные путем отсеканий при 0,5 т.п.н. и 1,0 т.п.н. соответственно, были отобраны для конструирования библиотеки кДНК в pGBFIN-11. Для pGBFIN-11 готовили пул расщепленного по двум цепям (EcoRI-XhoI) pGBFIN-11 вектора (фоновое лигирование <1%). Отобранные пулы кДНК лигировали в pGBFIN-11 вектор и трансформировали в E.coli XL10-Gold бактериальные клетки для генерирования двух праймерных кДНК библиотек. Трансформационные частоты двух пулов были >1,0×10⁶.

Из фракции обеих E.coli библиотек кДНК случайным образом отбирали клоны и выделяли плазмидную ДНК. Анализ этой плазмидной ДНК показал, что обе библиотеки кДНК имели процентное содержание вставок между 90 и 95%.

Кроме того, colony lifts проводили из фракции библиотеки generated filters, впоследствии гибридизовали с геном T.emersonii gpdA, кодирующим ген глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. Далее, выделяли плазмидную ДНК и посредством рестрикционного анализа было показано, что все плазмиды содержали единичные вставки в правильной ориентации. Секвенирование 5'-концов кДНК в пределах T.emersonii gpdA показало, что содержание плазмид составило >85% полной длины.

ПРИМЕР 3: Трансформация экспрессирующей библиотеки в A.niger

Из библиотеки кДНК E.coli выделяли ДНК, как описано ранее. Общую плазмидную ДНК расщепляли в течение 4 часов при 37°C с NotI для удаления плазмидных последовательностей, происходящих из E.coli. После очистки ДНК растворяли в стерильной деминерализованной воде.

Проводили³ множественные трансформации A.niger DS2978 с использованием от 1,5×10 ⁷ до 3,0×10⁷ протопластов и 10 мкг плазмидной ДНК на трансформацию. Трансформанты отбирали по наличию amdS маркера селекции путем выращивания на ацетамиде, как единственном источнике азота. Так как и amdS селектируемый маркер и экспрессирующая кассета кДНК присутствуют на интегрирующем фрагменте, выращивание на ацетамиде является указанием на наличие экспрессирующей кассеты кДНК.

После приблизительно 7-10 дней инкубации при 30°C были очищены 10000 трансформантов: трансформанты Aspergillus niger были перенесены автоматизированно (Flexys^TM colony picker automater) из трансформационных чашек на 96-луночные MTP делительные диски Master Plates (MPs), содержащих 150 мкл на лунку затвердевшей селективной среды (SM) (на 1000 мл: 0,52 г KCl, 1,52 г K₂HPO₄, 0,52 г MgSO₄ , 20 г глюкозы, 1 г ацетамида, 0,1 M MES буфера, 15 г агара, 1 мл раствора микроэлементов (содержащий на литр: 2,2 г ZnSO ₄/7H₂О, 1.1 г H₃BO₃, 0,5 г FeSO₄/7H₂О, 0,17 г CoCl₂/6H ₂O, 0,16 г CuSO₄/5H₂О, 0,15 г NaMoO ₄/2H₂O, 5,0 г EDTA, pH 6,5) pH 5,5. Трансформантов выращивали на SM в течение 5 дней при 34°C. И генерированную таким образом группу MPs использовали для инокулирования MTPs для выращивания и последующего выявления фермента и дублирующие чашки (BPs) библиотеки кДНК хранили при -80°C.

ПРИМЕР 4: Анализ экспрессирующей библиотеки T.emersonii

5-дневные ростки MPs использовали в качестве реплицируемого контроля и реплики располагали на чашках со свежей селективной средой, содержащих 0,075% AZCL-ксилана (содержащий на литр: 0,52 г KCl, 1,52 г K ₂HPO₄, 0,52 г MgSO₄, 20 г глюкозы, 1 г ацетамида, 0,1 M MES буфера, 15 г агара, 1 мл раствора микроэлементов (на 1 литр: 2,2 г ZnSO₄/7H₂О, 1,1 г H ₃BO₃, 0,5 г FeSO₄/7H₂О, 0,17 г CoCl₂/6Н₂О, 0,16 г CuSO₄ /5H₂O, 0,15 г NaMoO₄/2Н₂О, 5,0 г EDTA, pH 6,5) pH 5,5, 0,75 г AZCL-ксилана (Megazyme, Australia).

Однократно инокулированные чашки инкубировали при 34°C в течение 48 часов и затем в течение 6 часов при 65°C. Чашки просматривали до и после высокотемпературной инкубации. Позитивные колонии, проявляющие ксиланазную активность, показывали размытый голубой ореол.

Позитивные ксиланазные клоны после первого отбора пересеивали на свежую среду SM и выращивали в течение 5 дней при температуре 34°C. Полученные таким образом контрольные чашки затем реплицировали на селективной среде и на среде, содержащей 0,075% (масс/об) AZCL-ксилана (Megazyme). AZCL-ксилановые чашки обрабатывали, как описано ранее.

Чашки с SM инкубировали в течение 48 часов при 34°C и затем наполняли доверху агаром, содержащим ксилан овсяной шелухи (5 г агарозы, 0,5 г ксилана овсяной шелухи (Sigma ref: X0627)), приготовленного в 1 литре 50 мМ фосфатного буфера (pH 7). По затвердении верхнего слоя агара чашки помещали на 4 часа при 65°C. Для визуализации активности чашки окрашивали раствором Конго красного (10 г Конго красного на 1 литр фосфатного буфера pH 7,0) в течение 15 минут. Красящий раствор отбрасывали и чашки промывали 1 M NaCl. Этот этап промывки повторяли дважды. Позитивные колонии проявлялись образованием бледного ореола просветления на фоне (Конго) красного. В результате были обнаружены 9 ксиланаза позитивных клонов.

Ксиланаза продуцирующие трансформанты Aspergillus, как определено в исследовании ксиланазы на чашках, выращивали в шейкере для ферментации³. Образцы среды получали через 5 дней ферментации и анализировали на ксиланазную активность следующим образом.

Супернатант (предварительно разбавленный в случае необходимости) разбавляют 5 раз в 0,25 M ацетатно-натриевым буфером, pH 4,5. 20 мкл разбавленного супернатанта переносили на микротитратные чашки и добавляли 50 мкл субстрата (4% (масс/об) Remazol Brilliant Blue RBB-Xylan (растворенный при 70°C в деминерализованной воде) и тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз. Реакционную смесь инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 96% этанола и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. После окончания реакции микротитратные чашки центрифугировали в течение 10 минут при 2500 rpm в центрифуге Beckman GPK при комнатной температуре. 100 мкл супернатанта переносили на новую микротитратную чашку и поглощение голубого цвета измеряли спектрофотометрически при 620 нм в Anthosreader (Proton and Wilton). Удельную активность вычисляют по калибровочной кривой с использованием ксиланазного стандарта, растворенного в 0,25 M ацетатнатриевом буфере pH 4,5.

ПРИМЕР 5: Генетический анализ позитивных трансформантов

Позитивные (повторно подтвержденные) трансформанты, определенные в примере 4, выращивали на жидкой среде, мицелий собирали и выделяли общую (хромосомную) ДНК с использованием Puregene Isolation System (Biozym B.V.) для выделения ДНК из нитчатых грибов. Выделение ДНК и очистку проводили с соответствии с протоколом поставщика, но немного измененным: повторили стадии 3 и 4 преципитации белка.

Хромосомную ДНК использовали в качестве контроля в ПЦР с использованием праймеров 12207 (SEQ ID No.4) и 11937 (SEQ ID No.3) для амплификации вставки (вставок), находящихся в экспрессирующей кассете интегрированных в хромосомную ДНК.

Направление ПЦР на трансформанты проводили в соответствии с адаптированной версией известного протокола ⁴ за исключением того, что полученный мицелий впоследствии обрабатывали Glucanex^TM (Novo Nordisk) с концентрацией 5 мг/мл вместо NOVOzyme.

ПЦР содержали буфер eLONGase ^TM B (Life Technologies, Breda, The Netherlands), dNTPs (200 мкМ каждого), 1 мкл eLONGase^TM Enzyme Mix, 1-5 мкл контроля, и 10-30 пмоль каждого олиго, в конечном объеме 50 мкл. Оптимальные количества олиго определяли экспериментально для каждой полученной группы. В среднем использовали от 10 до 30 пмоль. Реакции проводили при следующих условиях цикла: 1×(2 мин) 94°C, 35×(1 мин 94°C, 1 мин 55°C, 6 мин 72°C), 1×(7 мин 72°C). Образцы помещали на агарозные гели для анализа продуктов ПЦР.

Полученный таким образом продукт ПЦР субклонировали в E.coli pcr2.1 клонирующий вектор (Invitrogen, согласно инструкциям поставщика), плазмиды pGBXEA-1. Штамм E.coli, принявший плазмиду pGBXEA-1, был депонирован в Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Нидерланды, под инвентарным номером CBS 102183.

Субклонированный продукт ПЦР секвенировали. Полученная в результате нуклеотидная последовательность кодирующей области изображена в SEQ ID No.1 и выведенная аминокислотная последовательность белка в SEQ ID No.2. Этот белок был назван XEA.

ПРИМЕР 6: Характеристика ксиланазы Talaroymyces emersonii

Определение эндоксиланазной единицы (EXU) для данного описания.

Единицу ксиланазной активности (EXU) определяют как количество фермента (endoI эндо-1,4- -ксиланаза из Asp.niger³¹), которое высвобождает 4,53 мкмоль восстанавливающихся сахаров (измененное как ксилозные эквиваленты) в минуту в условиях исследования. Условия исследования включают в себя:

5 мг/мл арабиноксилана из пшеничной муки (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) в 100 мМ цитратнатриевом буфере (pH 3,5), температура 40°C, при продолжительности реакции 60 минут. Реакции останавливали добавлением 1 M NaOH. Определение проводили колориметрически при 420 нм после инкубации образцов с Fe-III-гексацианидом в течение 15 минут в кипящей воде. Гексацианоферратный реактив готовили растворением 1,17 г KFe(CN) и 19,5 г безводного карбоната натрия в 1 литре воды.

Вискозиметрическое исследование

В дополнение к вышеуказанному абсолютному определению активности ксиланазы могут быть использованы соответствующие способы, которые применяют для снижения вязкости раствора арабиноксилана пшеницы (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) при добавлении определенного количества фермента. Арабиноксилан пшеницы растворяли в 0,425 M цитратнатриевом буфере (pH 3,5) до концентрации 8,3 мг/мл. Субстрат инкубировали при 55°C в течение 10 минут. Затем добавляли небольшое количество фермента (в интервале 0,01-0,05 единиц/мл) и проводили реакцию. После 60 минут продолжительности реакции определяли вязкость образца по сравнению с соответствующим образцом, который инкубировали с эндоксиланазным стандартом Aspergillus niger³¹ известной ЭКЕ активностью. Абсолютные активности в ЭКЕ для стандарта определяли методом восстанавливающихся сахаров с использованием Fe-III-гексацианида, как описано выше. Вязкость определяли вручную с использованием аппарата падения вязкой капли Haake.

Анализ активности восстанавливающихся сахаров

Ферментативную активность согласно XPU определению измеряли путем определения восстанавливающихся сахаров с использованием гидразида 4-гидроксибензойной кислоты (PAHBAH). Одна XPU активности определена как количество фермента, требуемого для высвобождения одного мкмоль восстанавливающихся сахаров, образующихся в минуту из арабиноксилана пшеницы при рН 5,0 и 60°C в течение 15 минут, с использованием калибровочной кривой D(+)ксилозы. Это модифицированное известное исследование ³² проводят с реактивом PAHBAH следующим образом: 0,05 M трицитрата натрия, 0,1 M Na₂SO₃, 0,02 M CaCl₂, 0,5 M NaOH и 0,1 M гидразида п-гидроксибензойной кислоты (PAHBAH). Конечный рН составил 12. Реактив, содержащий PAHBAH в щелочном растворе, хранили при комнатной температуре, использовали в течение одного дня. Поглощение измеряли при 420 нм. Контроль готовили добавлением 100 мкл 0,1 М ацетатнатриевого буфера вместо раствора фермента. Активность ксиланазы исследовали смешиванием 100 мкл (разбавленного) раствора фермента с 400 мкл 0,35% арабиноксилана пшеницы (Megazyme) в 0,1 M ацетатнатриевом буфере (pH 5,0). Пробирки Эппендорф с субстратом предварительно инкубировали в течение 5 минут при 60°C. Реакцию запускают добавлением раствора фермента. Через 15 минут добавление 1,0 мл PAHBAH-реактива заканчивает реакцию. Пробирки Эппендорф нагревали в течение 5 минут при 100°C и затем охлаждали на льду. Образцы центрифугировали при соответствующей скорости для осаждения любых твердых материалов, например 1 минуту при полной скорости в Beckman Microfuge E. Поглощение измеряли при 420 нм. Контроль готовили добавлением 100 мкл вместо раствора фермента. Интервал измерения составляет 0,01-0,1 XPU/мл.

Очистка ксиланазы

10,45 г сульфата аммония добавляли к 43 мл свободного от клеток бульона и доставляли на Ethyl Sepharose^TM колонку с использованием Äkta explorer 100 (Pharmacia Biotech) Column: 15 ETH Source (code 17-0146-01, Pharmacia Biotech) (D=1,6 см, l=4,8 см, V=9,6 мл). Колонку уравновешивали 100 мМ ацетатом натрия и 40% насыщенным сульфатом аммония рН 5,0. Элюцию проводили линейным градиентом, сводящимся к 100 мМ ацетата натрия (рН 5,0) в 20 объемах колонки. Размер фракции: 5 мл. Скорость потока: 10 мл/минуту. Наблюдаемые длины волн: 280, 254, 214 нм. Фракции проверяли на ксиланазу и анализировали на ВЭЖХ - по размеру молекул (SEC).

Наиболее чистые фракции ксиланазы добавляли к Сефакрил S200 колонке согласно следующим условиям. Оборудование Äkta explorer 100 (Pharmacia Biotech). Колонка: HiPrep 16/60 Sephacryl S200 HR (Pharmacia Biotech). Уравновешивание и элюцию проводили 100 мМ ацетатом натрия (pH 5,0). Скорость потока: 1 мл/мин. Размер фракции 4 мл. Наблюдаемые длины волн: 280, 254, 214 нм. Чистоту элюентных фракций анализировали ВЭЖХ-SEC, SDS-ПАГЭ и простым ПАГЭ.

Концентрация белка

Концентрацию белка определяли измерением OD280. (Зрелая) ксиланаза из T.emersonii содержит 11 Trp остатков (положения 72, 108, 115, 121, 148, 300, 302, 308, 322, 377 и 385) и 23 Tyr остатка (положения 36, 51, 109, 141, 146, 161, 167, 169, 174, 192, 193, 196, 200, 218, 281, 306, 316, 326, 332, 348, 395, 403 и 404). Вычисленный коэффициент молярной экстинкции составил 89530 M^-1·см^-1. Молекулярная масса составила 41,637 г/моль. OD280 для 1 мг/мл XEA составил 2,15.

Удельная активность ксиланазы из T.emersonii (XEA)

Удельную активность определяли с использованием PAHBAH метода восстанавливающихся сахаров при 40°C и 60°C. Удельная активность ксиланазы для XEA составила 150 XPU и 500 XPU при указанных двух температурах соответственно (таблица 11). Концентрацию белка определяли путем анализа ОП 280.

Таблица 11
Температура (°C)	Удельная активность (XPU/мг)
40	150
60	500

N-концевая последовательность

Обнаружили, что N-концевая аминокислотная последовательность очищенной зрелой XEA представляет собой:

Ala-Gly-Leu-Asn-Thr-Ala (в зрелой последовательности первый остаток Ala представляет собой Ala ²³ в SEQ ID No.2).

Изоэлектрическая точка (ИЭТ)

Оборудование: Phast system (Pharmacia Biotech), IEF 3-9 Phastgels (Pharmacia Biotech). Гели пропускали и окрашивали (кумасси) в соответствии со стандартными протоколами Phast system, предоставляемыми производителями. ИЭТ, определенная изоэлектрофокусированием, с использованием PhastGel IEF3-9 составила примерно 3,3.

Молекулярная масса

SDS-PAGE электорофорез проводили с использованием Phast system (Pharmacia Biotech), Phastgels (Pharmacia Biotech), SDS-буферных полос/нативных буферных полос (Pharmacia Biotech).

Обработка образцов: один объем буфера (500 мМ Трис-HCl pH 6,8, 10% SDS, 0,1% бромофенольный синий) смешивали с 4 объемами образца и кипятили в течение 3 минут. Гели пропускали и окрашивали (кумасси или серебро) в соответствии со стандартными методами Phast system. Молекулярный вес на основании SDS-PAGE с использованием маркеров молекулярного веса (Pharmacia) составил примерно 63 кД. Молекулярная масса, вычисленная на основании аминокислотного состава, составила 41637 Дальтон.

Кроме того, молекулярную массу определяли проникающей гель- хроматографией с использованием стандартов молекулярной массы для гель-фильтрации (BIORAD, cat. no.151-1901). Молекулярная масса, определенная посредством высокоэффективной-SEC, составила 42 кД. (HP-SEC проводили с использованием TSK G3000SW (cat. no 05103, Toso Haas) колонка. Образцы элюировали в 0,1 М фосфате натрия (pH 7) при 1 мл/мин при комнатной температуре. Определение выполняли при 280 нм). Высокая молекулярная масса, как наблюдали по SDS-PAGE, кажется завышенной. Вероятной причиной этого является гликозилирование ксиланазы.

Дегликозилирование

5 мкл очищенного фермента (ca. 5 мг/мл) смешивали с 20 мкл 0,5% SDS и 25 мкл 1% меркаптоэтанола. Смесь кипятили в течение 4 минут. После охлаждения добавляли 20 мкл N-гликозидазы F (500 U/мл) и 20 мкл 3% Тритона Х-100 в 1 М фосфатнатриевом буфере (pH 7,0). Затем инкубировали в течение ночи при 37°C и дегликозилирование анализировали посредством SDS-PAGE. Аминокислотная последовательность предлагает 2 сайта гликозилирования (Asn⁵⁶ и Asn ¹²³, см. SEQ ID No.2).

SDS-PAGE показывает, что N-гликозидаза F, обработанная ксиланазой, перемещается далее, и молекулярная масса является ниже, чем у необработанной или предварительно обработанной (прокипяченной с SDS и -меркаптоэтанолом) ксиланазы. Таким образом, неожиданно высокая молекулярная масса, наблюдаемая при SDS-PAGE, возможно, вызвана гликозилированием.

pH- и температурный профиль

Бесклеточный бульон анализировали на ксиланазную активность при различных рН и температурах. Ксиланазную активность анализировали методом восстанавливающихся сахаров с использованием PAHBAH при pH 4 при различных температурах (см. таблицу 1A) или при 60°C при различных рН (таблица 1B). Таблица 1А показывает, что температурный оптимум XEA составляет примерно 80°C. Таблица 1 В показывает, что оптимум рН XEA находится между pH 4 и pH 5 (представлены 2 колонки цифр, поскольку эксперименты проводили дважды).

Таблица 1A Температурная зависимость ксиланазы
Температура (°C)	Активность (мкМ ксилозы/15 мин)	Относительная активность (%)
30	20-30	10
40	40-50	19
50	90-100	40
60	120-130	52
70	195-205	83
80	235-245	100
90	65-75	29

Таблица 1B pH зависимость
рН	Активность (мкМ ксилозы/15 мин)	Активность (мкМ ксилозы/15 мин)
3,0	118,1	123,4
3,5	141,8	127,8
4,0	145,2	148,3
4,5	140,8	149,1
5,0	117,9	124,8
5,5	91,7	99,1
6,0	57,3	60,1

Термостабильность

Дифференциальный сканирующий калориметрический (ДСК) анализ температуры разворачивания

Температуру разворачивания XEA определяли с использованием ДСК. Использованные условия измерения были с ацетатом натрия (pH 5), 2-4 мг/мл и скорость нагревания 2,5°C/мин. Обнаружили, что температура разворачивания (Td) XEA составляет 80,1°C.

Измерение T50

T50 представляет собой температуру, при которой остается 50% остаточная активность после 20 минут инкубации и, таким образом, это измерение на термостабильность. T50 инкубации проводили следующим образом. Образец ксиланазы разводили так, что конечная концентрация ксиланазы находилась в пределах измеряемого интервала для PAHBAH теста (XPU единицы). Затем образец разводили 0,1 М ацетатнатриевым буфером (pH 5,0), содержащим 1 мг/мл БСА во избежание неспецифического связывания и денатурации на поверхности пробирок. Буфер предварительно нагревали при 60, 70, 80, 85 и 90°C в термомиксерах в течение 5 минут и затем добавляли ксиланазу. Образцы нагревали в течение 20 минут и охлаждали на льду. Активность измеряли с использованием PAHBAH теста.

В таблице 2 показано процентное соотношение остаточной активности по отношению с неинкубированным контролем после 20 минут инкубации при данной температуре. Из этой таблицы может быть получена T50: она составила 82°C.

Таблица 2 Термостабильность XEA ксиланазы
Температура (°C)	Остаточная активность (%)
40	100
50	104
60	103
70	99
75	90
80	85
85	8
90	1

Кроме того, значения T50 измерили при различных рН и в присутствии EDTA. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Установление влияния pH ионов металла на стабильность XEA
pH	T50 (°C)
3	73
3,5	77
4	80
4,5	80
5	81
5 (+EDTA)	81
6	75
71	<72
81	<72
1 pH 7 и 8: слишком незначительное число результатов обработки данных в области низкой температуры

XEA является наиболее стабильной в области рН от рН 4 до рН 5. Ниже pH 3,5 и выше pH 5,5 термостабильность начинает ухудшаться, но остается значительно лучше, чем у большинства известных в настоящее время грибных ксиланаз. Присутствие EDTA не влияет на T50. Это означает, что стабильность XEA независима от положительных ионов металлов, которые комплексованы EDTA.

ПРИМЕР 7: Применение Talaromyces ксиланазы (XEA) при кормлении животных

Испытание проводили с использованием самцов бройлеров (Cobb). С 1-дневного до 5-дневного возраста их держали в небольших загонах и предлагали коммерческий корм бройлер-стартер. В возрасте 5 дней животных случайным образом распределяли по 54 клеткам на основании их индивидуального веса. В одну клетку поселили 15 бройлеров с 5-19-дневного возраста. На 19 день количество животных в одной клетке уменьшили до 12. Шесть клеток выделили на один режим. С этого момента клетка представляет собой экспериментальную единицу, это означает, что было 6 повторений на один режим.

Клетки устанавливали в искусственно отапливаемом, освещенном и проветриваемом бройлерном жилище с использованием трехзвенной системы клеток. Каждая клетка имела площадь 0,98 м², проволочный пол. Помещение было освещено 24 часа/день, но интенсивность света постепенно снижали в процессе испытания. Также постепенно снижали температуру: с 28°C на протяжении первой недели до 23°C во время последней недели. Влажность во время исследования поддерживали приблизительно при 60%. Животных вакцинировали в соответствии с обычной программой вакцинации против инфекционного бронхита и заболевания Нью Кастла.

В испытание было включено девять режимов. К корму, основанному на пшенице (см. таблицу 4), фермент не добавляли (контроль), или добавляли количество, равное приблизительно 2500, 5000, 10000 или 25000 EXU/кг корма либо эндоксиланазы Talaromyces (XEA), либо эндоксиланазы Aspergillus niger (EndoI, эндо-1,4- -эндоксиланазы³¹, коммерчески доступной из DSM N.V., Agri Ingredients, Delft, Нидерланды) в качестве контроля. Ферменты добавляли в корм в виде гранулированного продукта, который подмешивали в заранее приготовленную смесь до смешивания ее с кормом. Корма предлагали животным ad libitum в виде шариков. В процессе изготовления шариков температура шариков не превышала приблизительно 70°C. Воду также не ограничивали.

Прирост массы тела (ПМТ) и коэффициент переработки корма (КПК) определяли в течение периода с 5-19-дневного возраста до 5-33-дневного возраста.

Таблица 4 Кормовая композиция и содержание основных питательных веществ
Ингредиент	Содержание (%)
Пшеница	50,0
Рожь	10,0
Соевая мука	20,0
Необезжиренные соевые бобы (подсушенные)	1,5
Маниока	1,69
Мясо и костная мука	5,5
Рыбная мука	2,0
Смешанный животный жир	6,0
Минеральная и витаминная смесь	1,0
Известняк	0,85
Монофосфат кальция	0,75
Соль	0,3
L-лизин.HCl	0,16
DL-метионин	0,22
L-треонин	0,03
ME бройлеров (MJ/кг)	12,0
Неочищенный белок (%)	21,4
Неочищенный жир (%)	8,5
Легкоусвояемый лизин (%)	1,06
Легкоусвояемый метионин+цистеин (%)	0,78
Пища содержала уровни витаминов и микропримеси минералов, как принято в Нидерландах. К пище не добавляли ни антибиотиков, ни кокцидиостатиков.

Результаты этого испытания представлены в таблице 5, которая показывает средний ПМТ и КПК бройлеров в двух периодах. Ферментные добавки показаны в активных единицах (EXU). Так как возрастает ПМТ, то КПК снижается, поскольку КПК представляет собой количество корма (г), необходимое для прироста.

Таблица 5
	ПМТ (г/птица)		КПК(г/г)
	5-19 дней	5-33 дня	5-19 дней		5-33 дня
Контроль	647	1665	1,486		1,749
Talaromyces (XEA, по изобретению)
+2500 EXU/кг	668	1696		1,447	1,666
+5000 EXU/кг	683	1757		1,419	1,647
+10000 EXU/кг	662	1736		1,444	1,673
+25000 EXU/кг	676	1731		1,429	1,656
Aspergillus niger EndoI (для сравнения)
+2500 EXU/кг	682	1742		1,440	1,659
+5000 EXU/кг	682	1730		1,458	1,704
+10000 EXU/кг	672	1686		1,417	1,662
+25000 EXU/кг	696	1743		1,466	1,685

В обоих случаях прирост и КПК значительно улучшились (P<0,05) для кормов, содержащих ферменты, в обоих случаях после 14 дней экспериментального периода, как и после всего экспериментального периода. Наблюдались незначительные различия между различными дозами, но XEA фермента была такой хорошей (если не лучше чем) коммерчески доступного фермента.

ПРИМЕР 8: Хлебопекарная характеристика эндоксиланазы Talaromyces emersonii (XEA)

Получение формованного хлеба в стандартном хлебопекарном процессе осуществляли смешиванием 3500 г пшеничной муки (смесь пшеничной муки 80% Колибри и 20% Ибис (Meneba, Голландия) примерно при 21°C), 77 г прессованных дрожжей (Konings), 70 г соли, 25 ppm аскорбиновой кислоты, 10 ppm грибной -амилазы Fermizyme^TMР₂₀₀, (DSM N.V., Bakery Ingredients, Delft, Нидерланды) и различных количеств эндоксиланазного ХЕА фермента и 203 мл воды (8-15°C) в спиральном миксере (Hobart) в течение 2 минут (на 1 скорости) и в течение 6 минут (на 2 скорости) с расходом энергии 125 Втч (Ватт-часов). Температура теста составила 28°C. Пригодность теста к обработке машинным способом определялась вручную квалифицированным пекарем.

Непосредственно после перемешивания тесто разделяли на 6 кусков, по 875 г каждый, округляли и давали подойти в течение 35 минут в специализированном шкафу при 34°C и 85% ОВ (относительной влажности). В конце этого периода тесту придавали форму и гранулировали и окончательно давали подойти 75 минут в специализированном шкафу при 38°C и 87% ОВ. Впоследствии полностью подошедшее тесто выпекали в электроплите при 210°C в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры объемы батонов хлеба определяли методом the rape seed displacement. После 16-24 часов хранения в запечатанных полиэтиленовых пакетах при комнатной температуре качество хлебного мякиша оценивалось квалифицированным пекарем. Результаты показаны в таблице 6.

Таблица 6
Доза XEA (EXU/кг муки)	Объем батона (мл)(%)		Разделывание теста	Пекарные характеристики (шкала 0-10)	Качество мякиша (шкала 0-10)
0	4123	100	Легко, не липкое	6	6
176	4420	107	Легко, не липкое	7	7
527	4756	115	Легко, не липкое	7,5	7
1581	4794	116	Легко, чуть- чуть липкое	7,5	7,5

Качество теста было хорошее. Только при самой высокой дозе эндоксиланазы XEA испытывалась незначительная липкость при разделывании теста. Однако эта незначительная липкость не влияла на пригодность теста к машинной обработке. Все тесто, содержащее эндоксиланазную XEA, было очень эластичным и легким для обработки.

По этим результатам хлебопечения был сделан вывод о том, что эндоксиланазная ХЕА является очень эффективной для улучшения качества хлеба, как в показателях объема батона, так и в показателях качества хлебного мякиша. Несмотря на большие объемы батонов структура хлебного мякиша оставалась равномерной и высокого качества.

ПРИМЕР 9 и СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 10: Сравнение пекарной характеристики Talaromyces emersonii фермента (XEA) с эндоксиланазой из Asp.niger

Пекарную характеристику of XEA сравнивали при производстве голландского формованного хлеба с используемой в настоящее время грибной эндоксиланазой из Aspergillus niger. Эту A.niger эндоксиланазу поставляли в чистой коммерчески доступной форме, т.е. Fermizyme^TM HSP₆₀₀₀. Fermizyme^TM HSP представляет собой хороший фермент для применения при изготовлении хлеба, но он может приводить к липкости теста и не всегда обеспечивает значительное увеличение объема батона.

Повторили в точности процесс примера 7, за исключением того, что использовали различные количества либо эндоксиланазы ХЕА, либо Fermizyme^TM HSP_6000.

Результаты показаны в таблице 7.

Таблица 7
№ примера	Доза (EXU/кг муки)	Объем батона (мл) (%)		Разделывание теста	Ломкость и крошимость (шкала 0-10)	Качество мякиша (шкала 0-10)
9: эндоксиланаза XEA	0	4170	100	Хорошее, не липкое	6	6
	264	4430	106	Хорошее, не липкое	6,5	7,5
	528	4647	111	Хорошее, не липкое	7	7,5
	1056	4761	114	Эластичное, не липкое	7,5	8
	1584	4880	117	Эластичное, немного недопеченное, не липкое	5#	7,5
10: Fermizyme ТМ HSP6000	0	4170	100	Хорошее, не липкое	6	6
	264	4304	103	Эластичное, не липкое	6,5	6
	528	4355	104	Эластичное, немного липкое	6,5	7
	1056	4539	109	Эластичное, липкое, немного недопеченное	7	7,5
	1584	4698	113	Эластичное, липкое, немного недопеченное	7,5	8
# объем батона был слишком большой, поэтому хлебу придали форму гриба.

Из полученных результатов ясно, что эндоксиланаза XEA не приводит к липкости теста и объем батона увеличен в большей степени, чем полученный введением Fermizyme ^TM HSP. Более того, для обычного объема батона требовалась мука с меньшими единицами/кг эндоксиланазы в случае применения ХЕА вместо Fermizyme HSP. Ломкость и качество нарезания были сходны при равнозначных объемах. Структура хлебного мякиша, полученная добавлением XEA, была, по меньшей мере, такой же хорошей, как полученная использованием Fermizyme^TM HSP.

В общем, эндоксиланаза XEA решает некоторые проблемы, связанные с тестом и изготовлением хлеба при использовании Fermizyme^TM HSP. У теста не появлялось липкости, объемы полученных батонов были больше и структура хлебного мякиша, несмотря на более большие объемы оставалась равномерной и высокого качества.

ПРИМЕР 11: Испытание стабильности гранулирования

Кукурузный крахмал (4543 г) помещали в Erweka ^TM Z-тестомесилку. Затем к крахмалу добавляли 1069 г ультрафильтрата из ферментатора, содержащего ксиланазу по данному изобретению (порция XEA 502-8m, содержащая 43553 EXU/г и 6,7% сухого вещества) при перемешивании до получения сырой смеси, содержащей около 15000 EXU/г (при высушивании до 94% сухого вещества). После добавления жидкости смесь оставляли еще на 10 минут.

В вакуумной сушке (40°C) смесь сушили в течение 12 часов до получения 94,5% сухого вещества. Затем измельчали в мельнице Erweka^TM Freewitt через 1-мм решетку. Это был пример 11 A.

Тот же самый способ повторили с использованием Lyxasan^TM Batch OP 0036 (содержащую эндо-1,4- -эндоксиланазу³¹, коммерчески доступную из DSM N.V., Agri Ingredients, Delft, Нидерланды). К 5885 г крахмала добавляли 1984 г УФ (ультрафильтрата) с 42550 EXU/г и 3,7% сухого вещества. Эту смесь сушили до содержания 94% сухого вещества и измельчали, как в примере 11A (это составляет сравнительный пример 11B).

Третий образец представляет собой коммерчески покрытый продукт, называемый Biofeed Wheat CT, который коммерчески доступен из Novo Nordisk, Дания. Он содержит ксиланазу G-типа из Thermomyces lanuginosis и имеет жировое покрытие (сравнительный пример 11C).

Все три образца тестировали в исследовании гранулирования при трех различных температурах. К корму для животных (состав показан в таблице 8 ниже) добавляли ферментную смесь в двух различных концентрациях, 0,24% (11A) и 0,1% (11B, 11C). После перемешивания корм нагревали водяным паром в кондиционере до 65°C, 75°C или 85°C и впоследствии гранулировали через 65-мм решето с отверстиями 5 мм в диаметре. Сразу же охлаждали. Затем измеряли остаточную активность в шариках, и результаты тестов на стабильность показаны в таблице 9.

Таблица 8 Состав корма для животных
Сырье	Содержание (%)
Кукуруза	20,00
Пшеница	30,00
Соевые бобы (температурно обработанные)	10,00
Соевые бобы (мука) (46,7 cp)	22,50
Тапиока	5,07
Рыбная мука (70% cp)	1,50
Перьевая мука (гидролизованная)	1,00
Соевое масло	1,30
Животный жир	4,50
Витамин/Минеральная смесь (кукуруза)	1,00
Лиместон	1,300
Монофосфат кальция	1,20
Соль	0,32
L-лизин	0,12
DL-метионин	0,19

Таблица 9 Стабильность ферментов при гранулировании
Остаточная	Пример 11А	Сравнительный	Сравнительный
активность(%)		пример 11B	пример 11C
65°C	84	64	86
75°C	82	16	83
85°C	66	4	56

Как видно, стабильность при высокой температуре (85°C) XEA белка по данному изобретению показала более хорошие результаты, чем продаваемый в настоящее время коммерческий продукт.

ПРИМЕР 12: Активность в отношении арил- -D-ксилозидов

Два субстрата 5-бром-4-хлор-3-индоксил- -D-ксилопиранозид (CAS Reg No.207606-55-1, также называемый X-b-D-xyl) и 4-умбеллиферил- -D-ксилопиранозид (CAS Reg No.6734-33-4, также называемый 4-MU-b-D-xyl) использовали для скрининга ксилозидазной активности. Их добавляли непосредственно в среду. Штаммы, составляющие библиотеку, располагали на 96-луночном планшете. Таким способом контрольную чашку легко реплицировали на среде определения. Библиотеку выращивали на селективной среде (0,52 г/л KCl, 1,52 г/л K₂HPO ₄, 0,52 г/л MgSO₄, 2% глюкозы, 10 мМ ацетамида, 1/1000 микроэлементов (2,2 г ZnSO₄/7H₂О, 1,1 г H₃BO₃, 0,5 г FeSO₄/7H ₂О, 0,17 г CoCl₂/6H₂О, 0,16 г CuSO ₄/5H₂О, 0,15 г NaMoO₄/2H₂ О, 5,0 г EDTA, pH доводят до 6,5 с помощью KOH и стерилизованного фильтра 0,45 мкм), pH доведено с помощью KOH (10 н до 6), содержащий либо X-b-D-xyl, либо 4-MU-b-D-xyl (в концентрациях 200 мг/л и 150 мг/л соответственно). X-b-D-xyl предварительно растворяли в минимальном объеме диметилформамида (ДМФ). Планшеты инкубировали при 33°C в течение 48 часов и затем инкубировали в течение 6 часов при 65°C. Планшеты оценивали до и после 6-часовой 65°C инкубации. X-xyl планшеты анализировали сразу на основании наличия (или отсутствия) бирюзово-голубой зоны, наличие которой было обнаружено. Определение ксилозидазной активности на 4-MU-xyl планшетах проверяли путем установки планшета под ультрафиолетовый свет с длиной волны 310 нм. Позитивные клоны появлялись окруженные голубой флюоресцентной зоной.