способ гидролиза молочных белков

Формула изобретения

1. Композиция, содержащая гидролизованный казеиновый белок и сывороточный белок в весовом соотношении 9:1-1:1 в расчете на сухое вещество, представляющая собой прозрачную жидкость при рН 4, при растворении в воде или добавлении к воде в количестве 40 г/л при 10°С, в которой пептидная фракция гидролизованного белка с молекулярным весом менее 5000 Дальтон составляет более 90 мас.%, предпочтительно более 95 мас.% от количества белка, присутствующего в гидролизованном белке, и которая может быть получена за счет использования в гидролизе пролин-специфической эндопротеазы.

2. Композиция по п.1, в которой фракция сывороточного белка не гидролизована.

3. Композиция по п.1, в которой пептидная фракция гидролизованного белка с молекулярным весом менее 1500 Дальтон составляет более 80 мас.%, предпочтительно более 85 мас.% от количества белка, присутствующего в гидролизованном белке.

4. Композиция по п.1, в которой в качестве источника белка используют обезжиренное молоко.

5. Композиция по п.1, содержащая 10-150 г общего белка, в расчете на сухое вещество, на 1000 г композиции.

6. Пищевой продукт, предпочтительно напиток, содержащий композицию по любому из предыдущих пунктов.

7. Напиток по п.6, представляющий собой спортивный напиток, безалкогольный напиток или лечебный напиток.

8. Способ получения композиции, содержащей гидролизованный казеиновый белок и сывороточный белок, включающий гидролиз с использованием пролин-специфической эндопротеазы по меньшей мере казеинового белка с получением композиции, представляющей собой прозрачную жидкость при рН 4 при растворении в воде или добавлении к воде в количестве 40 г/л при 10°С, причем соотношение между присутствующим казеином и сывороточной белковой фракцией, в расчете на сухую массу материала, составляет 9:1-1:1, а пептидная фракция гидролизованного белка с молекулярным весом менее 5000 Дальтон составляет более 90 мас.%, предпочтительно более 95 мас.% от количества белка, присутствующего в гидролизованном белке.

9. Способ по п.8, в котором сывороточную фракцию и казеиновую фракцию подвергают гидролизу.

10. Способ по п.8, в котором казеиновую и/или сывороточную фракцию гидролизуют с помощью эндопротеазы, предпочтительно, пролин-специфичной эндопротеазы.

11. Способ по любому из пп.8-10, дополнительно включающий гидролиз в присутствии пролин-специфичной эндопротеазы, причем гидролиз с помощью пролин-специфичной эндопротеазы проводят до, после или одновременно с гидролизом в присутствии других эндопротеаз.

12. Применение композиции по любому из пп.1-5 в пищевых или кормовых продуктах.

13. Применение композиции по п.12 в пищевых или кормовых продуктах с целью понижения аллергенности или повышения биоактивности белка в пищевом или кормовом продукте, по сравнению с негидролизованным белком.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим гидролизованный молочный казеин и, предпочтительно, негидролизованный сывороточный белок, в частности, изобретение относится к новым способам получения гидролизатов, содержащих гидролизованный казеин и предпочтительно негидролизованный сывороточный белок. Полученные таким образом гидролизаты могут использоваться для производства таких напитков, как спортивные и безалкогольные напитки, диетических продуктов, детского питания, а также различных пищевых и ферментированных продуктов.

Область техники, к которой относится изобретение

Белковая фракция коровьего молока связана со здоровьем. Целебные свойства касаются не только питательных аспектов рассматриваемой белковой фракции, но и других факторов, способствующих здоровью.

Молочные белки содержат примерно 80% казеинов. Оставшаяся часть содержит большое число сывороточных белков. Казеиновая фракция представляет собой основной источник аминокислот, кальция и фосфата, т.е. веществ, которые требуются для нормального роста молодого животного. Фракция сывороточных белков также является источником аминокислот и, кроме этого, она содержит такие биологически активные, обладающие оздоровительными свойствами белки, как иммуноглобулины, белок, связывающий фолат, лактоферин, лактопероскидазу и лизоцим. Также известно, что в ходе метаболизма казеина и фракций сывороточных белков образуется большое число новых биоактивных пептидов. Примерами таких вновь образовавшихся биоактивных пептидов могут служить казоморфины, казокинины, иммуноглобулины, иммунопептиды, казеинфосфопептиды, лактифины и лактоферрицин. В связи с этим использование казеиновых и сывороточных белков в той комбинации, в которой они присутствуют в молоке, предполагает значительную пищевую ценность и пользу для здоровья.

Сравнительно недавно было установлено, что промышленно получаемые гидролизаты молочных белков содержат достаточное количество биоактивных пептидов и АСЕ-ингибиторов, позволяющее использовать эти вещества для борьбы с гипертонией.

То, что молоко имеет белый цвет, связано с дисперсией света на жировых шариках и казеиновых мицеллах. Обезжиренное молоко, т.е. молоко, из которого удалены все жиры, все еще остается белым, что связано с наличием казеиновых мицелл.

Сывороточная белковая фракция молока, т.е. молоко после удаления жира и казеиновой фракции, имеет желтоватый цвет, но представляет собой прозрачный белковой раствор, обогащенный различными белками, пептидами, лактозой, минералами и витаминами. Все перечисленные компоненты полностью растворимы даже в кислых условиях. Несмотря на это, в результате растворения сывороточных белков могут образовываться мутные растворы, что является следствием частичной денатурации в ходе распылительной сушки. Неполный ферментативный гидролиз способен улучшить характеристики растворимости в некоторой степени денатурированных высушенных распылением сывороточных белков. Более глубокий ферментативный гидролиз сывороточных белков дополнительно улучшает их растворимость, но также приводит к некоторому усилению горьковатого вкуса и увеличению содержания свободных аминокислот. Обычно цель более глубокого ферментативного гидролиза сывороточных белков состоит в достижении пониженной аллергенности и улучшенного поглощения в кишечнике. Особенно важным с коммерческой точки зрения является аспект, связанный с аллергенностью. Так, например, в различных странах Северной Европы непереносимость коровьего молока диагностируется почти у 3% общего числа детей в возрасте двух первых лет жизни. Основными аллергенами коровьего молока являются бета-лактоглобулин и казеины. Во взрослом возрасте случаи аллергии к коровьему молоку достаточно редки и специализированные продукты для группы людей, подверженных таким аллергическим реакциям, должны быть адаптированы к легкой ассимиляции, они должны иметь хороший вкус и обладать длительным сроком годности, особенно в кислых условиях. В связи со сказанным выше, неудивительно, что имеется значительное число работ, касающихся полного ферментативного гидролиза сывороточных гидролизатов, направленного на их применение в лечебных целях, в качестве диетических и спортивных продуктов, а также в качестве детского питания.

В отличие от сыворотки, казеин обогащен гидрофобными аминокислотами, вследствие чего его гидролизаты известны своим горьким вкусом и другими посторонними вкусовыми характеристками. В связи с чрезвычайно горьким вкусом ферментативно-гидролизованных казеинов они находят лишь ограниченное применение. Кроме этого, в связи с высоким содержанием гидрофобных аминокислот, пептиды казеинового происхождения труднорастворимы, особенно в кислотных условиях.

Способы получения неполных гидролизатов казеина, описанные в литературе, обычно включают многостадийный гидролиз в присутствии небольшого числа эндопротеаз с последующей инкубацией в присутствии одной или более экзопротеаз. Комбинации различных эндопротеаз обычно используются для достижения высокой степени гидролиза (высокой DH), требуемой для минимизации возможных аллергических реакций и для повышения устойчивости. С помощью последующей инкубации в присутствии экзопротеаз происходит выделение амино- или карбокситерминальных аминокислотных остатков с целью уменьшения горьковатого привкуса. Однако выделение свободных аминокислот подразумевает потери выхода продукта и уменьшение его питательной ценности. Поскольку высокие содержания свободных аминокислот могут также усиливать нежелательный посторонний привкус и повышать осмотические характеристики целевых гидролизатов на практике используют дополнительные технологические стадии для удаления свободных аминокислот и высокогидрофобных пептидов, ответственных за нежелательные вкусовые свойства продукта.

В заявке на патент ЕР 0610411 описываются полностью растворимые казеиновые гидролизаты хорошего органолептического качества, содержащие низкомолекулярные пептиды и имеющие значения DH порядка 15-35%.

В заявке на патент WO 96/131744 раскрывается способ получения гидролизата молочного белка, характеризующийся тем, что реакция гидролиза протекает с участием нейтральной и щелочной протеазы из Bacillus в комбинации с ферментным комплексом Aspergillus, содержащим как эндо-, так и экзопептидазы, причем степень гидролиза составляет 35-55%.

В заявке на патент ЕР 384303 раскрывается способ получения белкового гидролизата с пониженным горьковатым вкусом и низким значением DH при использовании аминопептидазы.

В заявке на патент ЕР 223560 раскрывается способ получения молочных белков с помощью последовательного ферментативного гидролиза.

В заявке на патент ЕР 0631731 описывается неполный гидролизат белковой смеси, содержащей сывороточный белок и казеин, в котором гидролизат характеризуется степенью гидролиза в интервале 4-10%, причем гидролизат низкой горькости получают с использованием комбинации из трипсина и химотрипсина.

В патенте US 4600588 описывается гидролизат молочного белка, содержащий кислотно-осажденный казеин, подвергнутый обработке кислотной грибковой протеазой.

В заявке на патент JP11243866 описывается казеиновый гидролизат, используемый в напитках и пищевых продуктах, не имеющий вкуса и запаха, характеризующийся степенью гидролиза 17-30%.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к белковой композиции, содержащей гидролизованный казеиновый белок и сывороточный белок в соотношении 9:1 -1:1 сухой мас.ы. Предпочтительно, сывороточный белок не подвергается гидролизу. Такая белковая композиция представляет собой прозрачную жидкость при рН 4 в том случае, когда гидролизованный казеиновый белок и сывороточный белок растворены или присутствуют в воде в количестве порядка 40 г белка (в расчете на сухое вещество)/литр при 10°С.

В том случае, когда белковая композиция содержит менее 40 г белка (в расчете на сухое веществ)/литр, такая композиция все еще остается прозрачной жидкостью при 10°С, при концентрировании с получением жидкости, содержащей 40 г белка (в расчете на сухое вещество)/литр.

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает способ получения композиции, содержащей казеиновый белок и сывороточный белок, в которой гидролизована по меньшей мере казеиновая фракция.

Настоящее изобретение также относится к продукту, содержащему композицию по изобретению, например, к такому напитку, как спортивный или безалкогольный напиток, или лечебный напиток, либо к пищевому продукту для пожилых или худых людей, или состав для питания младенцев в послеродовой или последующий период. Кроме этого, такой продукт может вводиться в различные препараты для персонального ухода.

Подробное описание изобретения

Продукт согласно настоящему изобретению, предпочтительно, содержит сывороточный белок и казеин в соотношении, в котором эти вещества присутствуют в коровьем молоке. Принимая во внимание полезные свойства биоактивных пептидов и белков, предпочтительно, чтобы ферментативный гидролиз сывороточного белка осуществлялся в минимальной степени. Ферментативный гидролиз казеинов должен осуществляться в достаточной мере для гарантии высокого содержания белка в прозрачном продукте в кислых условиях. В связи с этим казеиновый продукт гидролизуют в присутствии достаточного количества ферментов в течение достаточного времени с тем, чтобы получить практически полностью гидролизованный белок. Практически полный гидролиз подразумевает, что лишь несколько процентов казеината растворяются неполностью, что может вызвать помутнение конечного гидролизата. Аналогичным образом, сывороточная фракция может содержать некоторое количество остаточного нерастворенного материала, например следы казеина. Для удаления такого нерастворимого материала из смеси казеинового гидролизата с сывороткой, приемлемые для промышленности технологические стадии получения прозрачного продукта могут включать низкоскоростное центрифугирование (например, при 2000-5000g) или простое осаждение с последующей декантацией. Следует иметь в виду, что стандартное коровье молоко не может быть осветлено с использованием низкоскоростного центрифугирования или проведения стадии осаждения/декантации. После смешивания гидролизованных казеиновых белков с сывороточными белками и, предпочтительно, центрифугирования с низкой скоростью, полученный продукт образует прозрачную жидкость с рН 4 при его растворении или присутствии в воде в количестве 40 г белка (в расчете на сухое вещество) на литр. Обычно гидролиз проводят при рН в интервале 3,5-9 и при температуре 40-80°С. Предпочтительный белковый гидролизат имеет то же соотношение между сывороткой и казеином, что и коровье молоко, и в кислых условиях представляет собой прозрачную жидкость. Предпочтительный гидролизат характеризуется улучшенным нейтральным или слабовыраженным вкусом и хорошей устойчивостью при хранении.

Жидкая композиция является "прозрачной", если ее оптическое поглощение, измеренное при 10°С и рН 4, при длине волны 480 нанометров и при использовании стеклянной ячейки длиной 1 см, имеет значение менее 1,00, предпочтительно, менее 0,5, в том случае, когда измерение проводят при 10°С и рН 4 относительно супернатанта того же состава, полученного после 20-минутного центрифугирования при 20000g.

Настоящее изобретение обеспечивает получение смеси гидролизатов молочных белков, предпочтительно, казеинового гидролизата и сыворотки, при весовом соотношении между ними в интервале 9:1 - 1:1 в расчете на сухое вещество, предпочтительно в соотношении, которое существует в коровьем молоке. Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает способ получения таких смесей и питательных напитков на их основе. Белковый гидролизат также может использоваться в детском питании, диетических пищевых продуктах, пищевых добавках, мороженном, муке, ферментированных продуктах, йогуртах и средствах личной гигиены. В целом, композиция согласно настоящему изобретению характеризуется сильно пониженной аллергенностью по сравнению с коровьим молоком. Как правило, композиция согласно настоящему изобретению имеет нейтральный или слабовыраженный вкус, характеризуется повышенной устойчивостью и прозрачностью в кислых условиях и может использоваться в качестве основы для различных напитков, например, спортивных и безалкогольных напитков, или лечебных напитков, а также ферментированных продуктов. Под термином "слабовыраженный вкус" подразумевается уровень горечи, равный или ниже уровня горечи раствора 15 мг/литр кининсульфата в дистиллированной воде, при его дегустации при температуре 14°С.

С целью дополнительного усиления лечебного действия продукта согласно настоящему изобретению белковую композицию можно смешивать с витаминными концентратами, фруктами или фруктовыми фракциями с целью повышения содержания витаминов и волокон в конечном продукте или с фракциями гидролизата с целью повышения уровня содержания биоактивных пептидов. Кроме этого, продукт согласно настоящему изобретению можно подвергать ферментации с большим числом микробных культур с целью улучшения вкуса, усиления лечебного действия или повышения вязкости конечного продукта. В идеальном случае, ферментацию проводят одновременно с инкубацией пролин-специфичной эндопротеазы, при температуре 40-50°С. Если исходная культура имеет высокую вязкость, то ферментацию лучше всего проводить после центрифугирования с низкой скоростью. После инокуляции подходящей исходной культурой или комбинацией различных исходных культур полученную смесь подвергают ферментации до достижения желаемого кислого значения рН, после чего охлаждают до 10-20°С. Полученное таким образом ферментированное основание может быть подвергнуто гомогенизации или разбавлено водой или соком, охлаждено до 4°С и залито в подходящие для розничной продажи контейнеры, с проведением стадии пастеризации или стерилизации, или без них. Для достижения широкого спроса среди потребителей с немедицинскими потребностями высокие вкусовые качества, а также некоторые физико-химические аспекты, например растворимость в кислых условиях, приобретают главенствующее значение. Важными обстоятельствами являются прозрачность и не белый цвет, а также отсутствие вкуса и запаха диацетила, который обычно ассоциируется с молочными продуктами. В соответствии со сказанным выше, настоящее изобретение относится к способу получения прозрачной жидкости в кислых условиях, обладающей низкой аллергенностью по сравнению с коровьим молоком, а также лечебными свойствами и питательной ценностью молока, причем такая жидкость может использоваться в таких отраслях пищевой промышленности, как получение напитков, включая газированные напитки, ферментированных продуктов и пищевых продуктов.

Способ получения гидролизатов согласно настоящему изобретению может осуществляться с использованием обезжиренного молока, сухого обезжиренного молока, концентратов молочных белков, смесей из сывороточного белка и казеина, взятых в предпочтительных соотношениях, или изолированных сывороточных фракций и изолированных казеиновых фракций, которые смешивают в предпочтительных соотношениях, причем перечисленные вещества могут использоваться в качестве исходных материалов, могут смешиваться друг с другом после гидролиза части фракций или могут смешиваться в ходе гидролиза.

Источником сывороточных белков может служить жидкая сыворотка, получаемая в ходе процесса производства сыра, предпочтительно сладкая сыворотка, например, получаемая в результате коагуляции казеина под действием сычужного фермента животного или микробного происхождения, которую дополнительно очищают от казеиновых примесей, например, путем подкисления и последующего центрифугирования. Предпочтительно используют концентрированные, не подвергнутые распылительной сушке формы таких сывороточных продуктов. В необязательном порядке могут использоваться такие коммерчески доступные сухие сывороточные белки, как BiPRO (Davisco Foods International), PROXIME 660 или HIPROTAL 875 или DOMOVICTUS 535 (BDI, The Netherlands), и более предпочтительно, их эквиваленты, не подвергнутые сушке распылением. Используемые сыворотки могут быть необязательно подвергнуты воздействию не протеолитических ферментов, таких, как лактаза, с целью превращения присутствующей лактозы в глюкозу и галактозу. Сывороточный материал может быть подвергнут необязательной деминерализации.

Предпочтительно настоящее изобретение предусматривает проведение очень ограниченного гидролиза сывороточной белковой фракции, или его отсутствие. Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает, что в гидролизате как сывороточная фракция, так и казеиновая фракция подвергаются гидролизу по мере их появления в ходе гидролиза, например, обезжиренного молока или сухого обезжиренного молока. Снятое (или обезжиренное) молоко представляет собой молоко, подвергнутое обезжириванию, в результате чего предпочтительное содержание жира составляет менее 1 г/литр, предпочтительно, менее 0,8 г/литр. В продукте согласно настоящему изобретению, полученном с использованием обезжиренного молока или сухого обезжиренного молока в качестве исходного материала, пептидная фракция с молекулярным весом менее 1500 Дальтон обычно составляет более 85 мас.% от мас.ы белка, присутствующего в композиции изобретения, тогда как пептидная фракция с молекулярным весом ниже 5000 Дальтон обычно составляет более 95% от мас.ы белка, присутствующего в композиции по изобретению. В связи с этим продукты согласно настоящему изобретению обладают значительно более низкой аллергенностью, чем исходный белок. Кроме этого, настоящее изобретение относится к гидролизатам с пониженными осмотическими характеристиками, которые могут быть достигнуты после нанофильтрации, ионного обмена или электродиализа.

Прозрачность и кислотная стабильность казеиновой фракции может быть достигнута в результате ферментативного гидролиза казеиновых мицелл с образованием более мелких пептидов. Источником казеина может служить любой сычужный казеин, кислотный казеин или казеинат натрия, кальция или калия. В целях настоящего изобретения белки разбавляют или подвергают реконституции с образованием раствора, содержащего 10-150 г белка на литр (1-15 мас.%/мас.), предпочтительно, 20-60 г белка на литр.

Для получения неполных гидролизатов белки вначале подвергают воздействию эндопротеаз при оптимальном значении рН в интервале 4-10, создавая предпочтительные условия для расщепления белков с карбокситерминальной стороны громоздких гидрофобных аминокислотных остатков. Предпочтительно, чтобы эндопротеазы не содержали экзопротеаз.

Предпочтительными эндопротеазами с такими характеристиками являются субтилизин (ЕС3.4.24.4 или Пескалаза, поставляемая DSM Food Specialities, Seclin, France или Алкалаза, поставляемая NOVO, Bagsvared, Denmark), термолизин (ЕС3.4.24.4 или Термоаза, поставляемая Daiwa Kesei, Osaka, Japan), нейтральные металлопротеазы (EC3.4.24.28 или Brewers Протеаза 2000, поставляемая DSM Food Specialities, Seclin, France или Ньютраза, поставляемая NOVO) или химотрипсин (ЕС3.4.21.1). Другая предпочтительная эндопротеаза представляет собой пролин-специфичную эндопротеазу. Пролин-специфичная эндопротеаза может обеспечивать расщепление как с аминотерминальной, так и с карбокситерминальной стороны пролина. Известны эндопротеазы, способствующие расщеплению пролина с аминотерминальной стороны (Nature, vol 391, 15 January, p. 301-304, 1998). Также известны эндопротеазы, способствующие преимущественному расщеплению с карбокситерминальной стороны пролина (ЕС3.4.21.26). Пролин-специфичные эндопротеазы последнего типа предпочтительно получают из таких пищевых, сверхпродуцирующих рекомбинантных штаммов как Aspergillus. Пример подходящего продуктора такого фермента описан в совместно поданной заявке на Европейский патент РСТ/ЕРО01/14480. Поскольку такая пролин-специфичная эндопротеаза способна гидролизовать лишь пептидные связи в остатках пролина, этот фермент может с успехом объединяться с одной или более предпочтительными эндопротеазами с целью гидролиза смеси из сывороточного белка и казеина или отдельных фракций. Одним из главных преимуществ использования пролин-специфичной эндопротеазы является тот факт, что она способна расщеплять основные аллергенные эпитопы как в казеине, так и в сывороточных белках. Так, например, казеин обогащен пролиновыми остатками и, вследствие этого, может часто разрезаться поролин-специфичной эндопротеазой. Все три основных аллергенных эпитопа бета-лактоглобулина (фрагменты 41-60, 102-124 и 149-162; Clinical and Experimental Allergy, 1999, vol 29, p.1055-163) содержат центральный пролиновый остаток, вследствие чего совместная инкубация с эндопротеазой, по-видимому, может уменьшить степень распознавания релевантным человеческим IgE, вследствие чего понижается аллергенность конечного продукта. Предпочтительное осуществление способа согласно настоящему изобретению состоит в том, что казеиновую фракцию или смесь сывороточной фракции с казеиновой фракцией подвергают гидролизу с участием, по меньшей мере, пролин-специфичной эндопротеазы.

Другое предпочтительное осуществление способа согласно настоящему изобретению состоит в том, что ферментативный гидролиз сывороточной фракции, казеиновой фракции или белковой фракции, присутствующих в цельном молоке, осуществляют с использованием только эндопротеаз, т.е. без применения экзопротеаз.

В зависимости от оптимального значения рН пролин-специфичной эндопротеазы гидролиз может осуществляться в комбинации с другими эндопротеазами или отдельно от них. Гидролиз может проводиться при постоянном значении рН или без регулирования значения рН. Предпочтительный гидролиз осуществляют в две стадии, на первой из которых белки подвергают инкубации в нейтральных или щелочных условиях в присутствии эндопротеазы, способной расщеплять белки преимущественно с карбокситерминальной стороны громоздких гидрофобных аминокислотных остатков. В ходе гидролиза величина рН уменьшается до кислотных значений (т.е. ниже рН 7) и лишь после этого добавляют вторую эндопротеазу, предпочтительно, пролин-специфичную эндопротеазу, более предпочтительно, пролин-специфичную эндопротеазу, полученную из Aspergillus.

Количество фермента, которое требуется для достижения желаемой степени гидролиза, зависит от природы используемого фермента. Однако количество фермента и условия инкубации оптимизируют таким образом, чтобы большая часть казеиновой белковой фракции растворялась в водной фазе реакционной смеси после периода инкубации длительностью 6-20 часов. Термин "большая часть" подразумевает, что при рН 4, в результате 10-минутного центрифугирования при 2000g, из казеиновой фракции может быть осаждено менее 20%, предпочтительно, менее 10%, более предпочтительно, менее 5% присутствующего белка.

Полезным может оказаться дополнительное снижение горечи гидролизата, полученного в результате совместной инкубации с эндопротеазами. Дополнительное снижение горечи предпочтительно осуществляют в результате одновременной или последовательной инкубации с экзопротеазным препаратом, предпочтительно, не обладающим эндопротеолитической активностью. В том случае, когда инкубацию проводят после инкубации с эндопротеазами, может потребоваться регулирование рН с помощью хлористоводородной кислоты; в этом случае обычно нет необходимости в инактивации эндопротеазы. Уменьшение горечи также может осуществляться в нейтральных или слегка кислотных условиях с использованием аминопептидазы, которая способствует удалению таких аминотерминальных гидрофобных аминокислотных остатков, как, например, Accellerzyme (DSM Food Specialities; Delft, The Netherlands) или Corrolase LAP (Rohm, Darmstadt, Germany) или APII из Bacillus stearothermofilus, выделенных и описанных Stoll et al. (BBA 438 (1976) 212-220). С другой стороны, уменьшение горечи может осуществляться в слабокислых условиях в присутствии подходящей карбоксипептидазы, которая способствует преимущественному удалению карбокситерминальных гидрофобных аминокислотных остатков, таких как CPDI (PepG) из Aspergillus (Dal Degan et al., Appl. Environ Microbial, 58(7) 2144-2152). В необязательном порядке, комбинация из двух таких типов экзопротеаз может использоваться в слабокислотных условиях. Предпочтительные температуры инкубации для эндопротеаз, а также для экзопротеаз составляют 40°С или выше, предпочтительно 50-80°С.

Независимо от условий проведения гидролиза, конечный гидролизат предпочтительно подвергают дополнительной стадии инактивации фермента. Стадия инактивации фермента может представлять собой тепловую обработку, которая заключается в нагревании до температуры по меньшей мере 85°С в течение по меньшей мере 10 минут. При более высоких температурах и более экстремальных значениях рН стадию проводят в течение меньших периодов времени. Тепловую обработку предпочтительно проводят при кислотных значениях рН, предпочтительно в интервале 3-7. Для удаления нерастворенного материала из конечного продукта можно использовать декантацию или низкоскоростное центрифугирование, например, при 2000-4000g, что соответствует условиям широкомасштабного промышленного процесса. Гидролизат может подвергаться необязательной фильтрации с использованием ультрафильтра, микрофильтра, диатомовой земли, фильтров из стекловолокна или с использованием фильтрации с поперечным потоком. Полнота инактивации фермента может подтверждаться пробой на окрашивание желатина. Отфильтрованный конечный гидролизат может быть подвергнут необязательной обработке активированным углем или нанофильтрации, ионному обмену или электродиализу с целью удаления избыточного количества солей. Отфильтрованный гидролизат может быть подвергнут пастеризации или стерилизации и, если необходимо, дополнительному концентрированию с помощью таких способов сушки, как выпаривание, нанофильтрация, распылительная сушка, сушка в псевдоожиженном слое или их комбинации. Предпочтительно, продукт получают в гранулированной форме.

Соотношение между казеином и сывороточным белком предпочтительно соответствует их соотношению в коровьем молоке. Предпочтительно, сывороточный белок представляет собой негидролизованный белок.

Казеин или сывороточный белок, или их комбинацию предпочтительно подвергают гидролизу в присутствии только эндопротеаз, т.е. без использования экзопротеаз. Предпочтительная конечная белковая смесь содержит 10-50% сывороточного белка и 90-50% казеина. Более предпочтительно, белковая смесь содержит 20-40% сывороточного белка и 80-60% казеина. Приведенные количества казеина и сывороточного белка выражены в мас.овых процентах.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, казеинат подвергают гидролизу в присутствии предпочтительной эндопротеазы, после чего подвергают инкубации в присутствии пролин-специфичной эндопротеазы. После этого, предпочтительно, после центрифугирования, казеиновый гидролизат концентрируют и сушат. Высушенный продукт может быть повторно растворен в негидролизованной сыворотке с получением продукта с желаемой концентрацией белка и желаемым белковым соотношением, после чего, если необходимо, проводят стадию центрифугирования или фильтрации, а также пастеризации или стерилизации с получением продукта согласно настоящему изобретению. Альтернативно, концентрированный казеиновый гидролизат смешивают с концентрированным, негидролизованным сывороточным белком для достижения желаемой концентрации белка и соотношения белков, после чего осуществляют необязательное центрифугирование или фильтрацию и необязательную пастеризацию или стерилизацию с получением продукта согласно настоящему изобретению.

Полученный продукт может быть подвергнут дополнительной обработке ферментами, например лактазой, или ферментации в присутствии различных типов исходных культур, или использован в комбинации с различными компонентами, например фруктовыми концентратами, отдушками, красителями, спиртом, диоксидом углерода, загустителями, подкислителями, антиоксидантами, травами или травяными экстрактами, лечебными соединениями, например витаминами или провитаминами, либо биоактивными пептидами, карбогидратами или аминокислотами, для формирования продукта, соответствующего рыночным потребностям.

В результате всех обработок может быть получен продукт со значением рН, как правило, выше 3, предпочтительно, более 3,5 и общей концентрацией белка менее 5 мас.%/мас., предпочтительно, менее 3,5 мас.%/мас., оптической плотностью раствора (содержащего 40 г/л белка), измеренной при длине волны 480 нм, менее 1000, предпочтительно, менее 0,50, при измерении относительно супернатанта раствора, который было получен после центрифугирования при 20000g в течение 20 минут, с использованием 1 см стеклянной ячейки, при 10°С и рН 4.

Пример 1

Гидролиз казеина с использованием пролинспецифичной эндопротеазы

В результате инкубации 1 г термолизина в расчете на 1 кг порошкообразного казеината натрия, в растворе/суспензии, с концентрацией казеината натрия (Mipridan 30, полученный от MD Foods, Viby, Denmark) 60 г/литр, при рН 6,7 и 75°С, при постоянном поддержании значения рН, через 3 часа получали осветленный раствор, практически не содержащий осадка. После установления рН на значении 5,0 фермент инактивировали при 95°С в течение 45 минут. Жидкость охлаждали и дегустировали, в результате чего констатировали очень горький вкус. рН устанавливали на значении 6,0 и к 25 мл гидролизата казеината добавляли 3 единицы пролин-специфичной эндопротеазы из A. Niger. Одна активная единица пролин-специфичной эндопротеазы из A. Niger соответствует количеству фермента, которое требуется для выделения 1мкмоль pNA в минуту из N-карбобензокси-глицин-пролин-п-нитроанилида (z-Gly-Pro-pNA) (Bachem, Switzerland) при рН 5 и 37°С. Выделение pNA измеряют по оптическому поглощению при 410 нм. После инкубации в течение ночи при 50°С рН снова устанавливали на значении 5,0 и проводили еще одну стадию инактивации фермента (30 минут при 90°С). После охлаждения до комнатной температуры полностью растворялся в системе и образовывал прозрачный раствор.

Дегустация показала отсутствие какого-либо горького вкуса.

ВЭЖХ с использованием ионно-захватного масс-спектрометра (Thermoquest, Breda, the Netherlands), соединенного с насосом Р4000 (Thermoquest, Breda, the Netherlands) использовали для определения молекулярно-весового распределения казеиновых пептидов, полученных в результате инкубации в присутствии фермента. Образовавшиеся пептиды разделяли с использованием PEPMAP C18 300A (MIC-15-03-C18-PM, LC Packing, Amsterdam, The Netherlands) колонки в комбинации с градиентом из 0,1% муравьиной кислоты в Milli Q воде (Millipore, Bedford, MA, USA; раствор А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (раствор В) в качестве элюента. Градиентное элюирование начинали со 100% раствора А, переходя за 45 минут к 70% раствору В, причем последнее соотношение выдерживали в течение 5 дополнительных минут. Объем вводимой пробы составлял 50 мкл, объемная скорость -50 мкл/мин, а температура колонки составляла 30°С. Концентрация белка в вводимом образце составляла примерно 50мкг/мл. В соответствии с данными анализа большая часть казеиновых пептидов имела молекулярные веса в интервале 300-1200 D.

Пример 2

Прозрачный не горький напиток молочного типа, полученный смешиванием экстенсивно гидролизованного казеината с негидролизованной сладкой сывороткой.

К 200 мл раствора казеината натрия (Miprodan 30, от MD Foods, Vibly, Denmark) с концентрацией 60 г/л добавляли 300 мг Термоазы (термостабильная металло-эндопротеаза из Bacillus thermoproteolyticus Rokko с активностью 14000PU/мг, производимая Daiwa Kasei, Osaka, Japan). В ходе инкубации при рН 6,7 и 75°С наблюдалось немедленное выпадение хлопьев и осаждение казеинообразного белка. В результате дополнительной инкубации в течение трех часов при постоянном значении рН образовывался осветленный раствор, не содержащий осадка. рН полученного раствора устанавливали равным 5,0 и Термоазу инактивировали нагреванием в течение 45 минут при 95°С. После охлаждения раствор дегустировали и констатировали его очень горький вкус. После установления рН на значении 6,0 к 25 мл гидролизата добавляли 3 единицы пролин-специфичной эндопротеазы (измерено с использованием Z-Gly-Pro-pNA при рН 5 и 37°С) из A. niger. После инкубации в течение 20 часов при 50°С проводили другой цикл инактивации фермента в результате нагревания раствора при 90°С в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры и установления рН 4,0 гидролизат казеината полностью растворялся с получением прозрачного раствора, т.е. его оптическое поглощение, измеренное спектрофотометрически при длине волны 480 нм в 1 см ячейке относительно воды, составило 0,24. Дегустациия продемонстрировала отсутствие горького вкуса и посторонних запахов.

В результате смешивания дважды концентрированного казеинового раствора с таким же количеством свежей дважды концентрированной сладкой сыворотки, очищенной от примесей казеинового белка подкислением до рН 4,0 с последующим низкоскоростным центрифугированием, получали прозрачный не горький напиток молочного типа.

Пример 3

Прозрачный не горький раствор гидролизованных сывороточных белков, полученный гидролизом сладкой сыворотки.

Сладкую сыворотку получали из казеинового белка путем подкисления раствора до рН 4. После центрифугирования прозрачный супернатант декантировали. рН сывороточной фракции устанавливали равным 6,8. К 200 мл полученного раствора добавляли 200 мг Термоазы (термостабильная метало-эндопротеаза из Bacillus thermoproteolyticus Rokko с активностью 14000PU/мг, производимая Daiwa Kasei, Osaka, Japan). В ходе инкубации при рН 6,7 и 75°С наблюдалась некоторая флоккуляция и осаждение белка. В результате дополнительной трехчасовой инкубации при постоянном значении рН получали осветленный раствор, все еще содержащий некоторое количество осадка. рН полученного раствора устанавливали равным 5,0 и Термоазу инактивировали нагреванием при 95°С в течение 45 минут. После охлаждения раствор дегустировали и констатировали наличие горьковатого вкуса. После установления рН на значении 6,0 к 25 мл гидролизата добавляли 3 единицы пролин-специфичной эндопротеазы (измерено с использованием Z-Gly-Pro-pNA при рН 5 и 37°С) из A. niger. После инкубации в течение 20 часов при 50°С проводили другой цикл инактивации фермента в результате нагревания раствора при 90°С в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры и установления рН 4,0 гидролизат казеината полностью растворялся с получением прозрачного раствора, т.е. его оптическое поглощение, измеренное спектрофотометрически при длине волны 480 нм в 1 см ячейке относительно воды, составило 0,35. Дегустация продемонстрировала отсутствие горького вкуса и посторонних запахов.

Пример 4

Прозрачный не горький раствор на основе молочных белков, полученный гидролизом обезжиренного молока без использования экзопротеаз.

К 200 мл коммерчески доступного обезжиренного молока добавляли 300 мг Термоазы (термостабильная метало-эндопротеаза из Bacillus thermoproteolyticus Rokko с активностью 14000 PU/мг, производимая Daiwa Kasei, Osaka, Japan). В ходе инкубации при рН 6,7 и 75°С наблюдалась некоторая флоккуляция и осаждение белка. В результате дополнительной трехчасовой инкубации при постоянном значении рН получали осветленный раствор, почти не содержащий осадка. рН полученного раствора устанавливали равным 5,0 и Термоазу инактивировали нагреванием при 95°С в течение 45 минут. После охлаждения раствор дегустировали и констатировали наличие очень горького вкуса. После установления рН на значении 6,0 к 25 мл гидролизата добавляли 3 единицы пролин-специфичной эндопротеазы (измерено с использованием Z-Gly-Pro-pNA при рН 5 и 37°С) из A. niger. После инкубации в течение 20 часов при 50°С проводили другой цикл инактивации фермента в результате нагревания раствора при 90°С в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры и установления рН 4,0 гидролизат казеината полностью растворялся с получением прозрачного раствора, т.е. его оптическое поглощение, измеренное спектрофотометрически при длине волны 480 нм в 1 см ячейке относительно воды, составило менее 0,900. Дегустация показала отсутствие горького вкуса и посторонних запахов.

Пример 5

Прозрачная кислотоустойчива не горькая молочно-подобная жидкость, полученная смешиванием гидролизованного казеината натрия с различными негидролизованными сывороточными препаратами.

рН 6 (мас.%) раствора казеината натрия (90% белок, полученный от DWI International, The Netherlands) устанавливали равным 8,0, после чего добавляли 40 микролитров Дельволазы (Delvolase®, 560000DU на грамм, получено от DSM Food Specialities, Seclin, France) в расчете на грамм казеина. Затем смесь инкубировали при 60°С при постоянном перемешивании в течение 150 или 210 минут при рН, значение которого специально не регулировали или устанавливали равным 8,0. После завершения инкубации реакцию гидролиза останавливали понижением рН до 5,0 с использованием молочной кислоты с последующим 10-минутным тепловым шоковым воздействием при 90°С. После этого температуру понижали до 50°С и добавляли пролин-специфичную эндопротеазу из A. niger (см. W0 02/45523). В расчете на грамм казеина добавляли 250 микролитров раствора фермента, содержащего 8 единиц на миллилитр (т.е. 2 единицы/грамм казеината, в соответствие с измерением по методике, описанной в Примере 1), после чего проводили инкубацию в течение 240, 480 или 960 минут. Наконец образцы подвергали термоудару в течение 10 минут при 95°С, после чего все образцы разбавляли дистиллированной водой до достижения концентрации казеината 3%, охлаждали до 14°С и затем оценивали с помощью специального дегустационного жюри, натренированного на количественное определение горьковатого привкуса молочных продуктов. В результате дегустации все эксперты пришли к выводу, что образцы, полученные в результате инкубации в присутствии Дельволазы и последующих инкубаций в течение 480 или 960 минут в присутствии пролин-спецуифичной эндопротеазы, не обладали горьким вкусом. Образцы, полученные после инкубации только с Дельволазой, оказались чрезвычайно горькими, а образцы, полученные с использованием Дельволазы и последующей 240-минутной инкубации в присутствии пролин-специфической эндопротеазы, были оценены как слабогорькие.

Степень гидролиза с использованием ОРА способа, описанного Nielsen, P.M. et al. (Journal of Food Science, Vol 66, №5, pp 642-646, 2001), измеренная после инкубации с Дельволазой, составила около 12%; после инкубации с пролин-специфичной эндопротеазой значения DH повышались до значений в интервале 16-20%.

Для получения продукта, имеющего состав, практически идентичный составу коровьего молока, различные дважды концентрированные (концентрация 6 г/л), не горькие казеиновые гидролизаты, полученные по описанным выше методикам, смешивали с равным объемом дважды концентрированных (концентрация 1,3 г/л) негидролизованных сывороточных белков. Вначале готовили растворы различных сывороточных белков с использованием коммерческих и некоммерческих продуктов. Среди различных тестированных сывороточных продуктов, BiPRO (Davisco Foods International), PROXIME 660 или HIPROTAL 875 или DOMOVICTUS 535 (BDI, The Netherlands) обеспечивали получение относительно прозрачных продуктов с мягким вкусом. При использовании свежей сырной сыворотки получали желтоватый мутный продукт с сильным молочным ароматом. Среди комбинаций, полученных с использованием различных сывороточных продуктов и различных казеиновых гидролизатов, особый интерес представляет комбинация с не-пастеризованной (некоммерческой) версией PROXIM 660, что связано с ее привлекательным вкусом, относительной прозрачностью и отсутствием посторонних запахов.

Несмотря на тот факт, что полученные таким образом молокоподобные смеси являются относительно прозрачными, в результате 10-минутного центрифугирования с низкой скоростью при 2000g или простого осаждения в течение нескольких часов, с последующей декантацией получают совершенно прозрачные продукты. Продукты, подвергнутые центрифугированию, обычно характеризуются значением оптического поглощения менее 0,90, которое определяют спектрофотометрически при длине волны 480 нм в 1 см ячейке, относительно воды. Весьма важно, что в результате проведения последних из описанных технологических стадий могут происходить потери белка, которые, обычно, меньше 10% от количества растворенной фракции. Полученные таким образом прозрачные растворы сохраняют прозрачность даже после подкисления до значений рН порядка 4,0 и 2,8.

Пример 6

Упрощенная методика гидролиза, предназначенная для превращения обезжиренного молока в прозрачный и кислотно-устойчивый конечный продукт со слабовыраженным вкусом.

Коммерчески доступное обезжиренное молоко (Friesche Vlag, The Netherlands), содержащее 39 г/л белков, 51 г/л карбогидрата, 0,5 г/л жира и имеющее конечное значение рН 6,5, уравновешивали на водяной бане при 60°С, после чего добавляли 40 микролитров Дельволазы (см. Пример 5) в расчете на грамм казеина (используемое обезжиренное молоко содержит 30г казеина/литр). Смесь инкубировали при постоянном перемешивании без регулирования рН. Через 150 минут инкубации рН понижали до 5,0 с использованием молочной кислоты и раствор разделялся на две части. Одну часть нагревали в течение 10 минут до 90°С с целью инактивации субтилизина, в то время, как другую часть выдерживали в течение 10 минут при 60°С. Обе порции переносили на водяную баню при 50°С и после уравновешивания, пролин-специфичную эндопротеазу добавляли в обе пробирки для достижения концентрации порядка 250 микролитров фермента (например, 2 единицы; см. Пример 5) на грамм присутствующего казеина. После дополнительной инкубации в течение 960 минут при 50°С обе порции подвергали тепловому удару в течение 10 минут при 95°С. Затем определяли значения DH, следуя методике, описанной в Примере 5. После инкубации с Делволазой значение DH составило 20%. После инкубации в присутствии пролин-специфичной эндопротеазы образец подвергали тепловому удару с целью инактивации Деволазы, имеющей значение DH порядка 26%, тогда как другой образец демонстрировал значение DH порядка 30%. Дегустацию двух конечных растворов при 14°С снова проводила та же группа экспертов, что принимала участие в дегустации в Примере 5. В соответствии с заключением экспертной группы оба раствора оказались в равной степени не горькими.

В результате низкоскоростного центрифугирования двух рассматриваемых препаратов получали прозрачные растворы, сохраняющие прозрачность в ходе дальнейшего подкисления до рН 4. Определение размера пептидов проводили методом хроматографии на колонке с Superdex Peptide 1030. В соответствии с полученными данными было установлено, что в материале, полученном при инактивации Делволазы, фракция, содержащая пептиды размером менее 1500 Дальтон, составляет 94 мас.% от количества белка, присутствующего в растворе, тогда как фракция, содержащая пептиды размером менее 5000 Дальтон, составляет 99 мас.% от количества белка, присутствующего в растворе. В материале, приготовленном без инактивации Делволазы, фракция, содержащая пептиды размером менее 1500 Дальтон, составила 87 мас.%, а фракция, содержащая пептиды размером менее 5000 Дальтон, составила 99 мас.% от количества присутствующих белков.

Таким образом, результаты, полученные в настоящем Примере, демонстрируют тот факт, что обезжиренное молоко, а также казеины способны эффективно гидролизоваться в не горькие прозрачные гидролизаты с использованием упрощенной методики гидролиза. Присутствие очень большого количества мелких пептидов позволяет предположить значительное понижение аллергенности полученного обезжиренного молочного гидролизата по сравнению со стандартным снятым молоком.