способ выделения мононуклеарных клеток костного мозга человека

Формула изобретения

Способ выделения мононуклеарных клеток костного мозга человека, заключающийся в получении аспирата костного мозга во время пункции гребня подвздошной кости, наслаивании его на градиент плотности (1,077 г/л), центрифугировании в течение 30 мин при 400 g и температуре 18-22°С, сборе слоя мононуклеарных клеток с границы раздела фаз, отличающийся тем, что взятие 100 мл аспирата костного мозга проводят с 20 мл гепаринизированного физиологического раствора с концентрацией гепарина 2500 ЕД/мл, перед наслаиванием гепаринизированный аспират костного мозга предварительно отстаивают в течение 30 мин при температуре 18-22°С, затем собирают верхние 2/3 клеточной взвеси обедненной эритроцитами, после чего эту пробу разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл, а далее, после наслаивания и центрифугирования, слой клеток собранный с границы раздела фаз отмывают гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл трехкратным центрифугированием по 10 мин при 400 g и температуре 18-22°С, после чего доводят клеточность суспензии до нужной концентрации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в кардиологии при внедрении методов регенерационной клеточной терапии у больных инфарктом миокарда.

Известен способ выделения фракции мононуклеаров из периферической крови и костного мозга человека [1], который включает взятие 3 мл костного мозга или 5 мл периферической крови с гепарином в дозе 20 ЕД на 1 мл костного мозга или периферической крови. В случае работы с цельной кровью ее разводят равным объемом фосфатно-солевого буфера с рН 7,2 (ФСБ). В случае работы с лейковзвесью кровь предварительно термостатируют в течение 30 мин при 37°С для оседания эритроцитов, затем собирают лейковзвесь, не затрагивая осевшие эритроциты. Взвесь клеток, полученную обоими способами, наслаивают на рабочий раствор градиента плотности (1,077 г/л) и центрифугируют 30 мин при 400 g и температуре 18-22°С. Собранный с границы раздела фаз слой клеток центрифугируют 10 мин при 300 g, удаляют надосадочную жидкость и после разведения раствором Хэнкса центрифугируют 10 мин при 300 g. После чего удаляют надосадочную жидкость, подсчитывают количество клеток, определяют их жизнеспособность и доводят до нужной рабочей концентрации.

Недостатком этого способа является значительная потеря мононуклеарных клеток в результате тромбообразования в шприце и их адгезии на стенках пробирок.

Цель изобретения: увеличение количества жизнеспособных мононуклеарных клеток костного мозга для их использования в различных способах регенерационной клеточной терапии.

Поставленная цель достигается техническим решением, представляющим способ выделения мононуклеарных клеток костного мозга человека, заключающийся в получении 100 мл аспирата костного мозга во время пункции гребня подвздошной кости с 20 мл гепаринизированного физиологического раствора с концентрацией гепарина 2500 ЕД/мл в шприцах. Далее гепаринизированный аспират костного мозга предварительно отстаивают в течение 30 мин при температуре 18-22°С, затем собирают верхние 2/3 клеточной взвеси обедненной эритроцитами, после чего эту пробу разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором (рН 7,2-7,4) с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл. Затем полученную пробу наслаивают на градиент плотности HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics), центрифугируют в течение 30 мин при 400 g и температуре 18-22°С. После чего собирают слой мононуклеарных клеток с границы раздела фаз. Собранные мононуклеарные клетки трехкратно отмывают гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл центрифугированием по 10 мин при 400 g и температуре 18-22°С, после чего доводят клеточность суспензии до нужной концентрации.

Новым в предлагаемом способе является то, что взятие аспирата костного мозга проводят с гепаринизированным физиологическим раствором в шприцах, перед наслаиванием гепаринизированный аспират костного мозга предварительно отстаивают, собирают верхние 2/3 клеточной взвеси, обедненной эритроцитами, разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором, после наслаивания и центрифугирования слой клеток отмывают гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором, 3-кратным центрифугированием и доводят клеточность суспензии до нужной концентрации, а также режимы и условия осуществления данных новых стадий.

В регенерационной клеточной терапии, в настоящее время, используются стволовые клетки костного мозга в силу их плюрипотентности. Вместе с тем, способы выделения чистого пула стволовых клеток костного мозга слишком затратны. Стволовые клетки (гемопоэтические и мезенхимальные) содержатся в мононуклеарной фракции клеток костного мозга. Обладая мультипотентными свойствами, эти клетки могут способствовать замещению дефектов тканей и неоангиогенезу. Кроме того, лимфоидные клетки этой фракции в силу своих морфогенетических способностей могут принимать участие в процессах восстановительной регенерации поврежденных органов и тканей. Это обусловливает востребованность мононуклеарных клеток костного мозга в клинической медицине.

Несмотря на то что, костный мозг является очень пластичным материалом, и при потерях быстро восстанавливает свою клеточность, в клинических условиях, мы ограничены в объеме его одномоментного забора. Кроме того, стволовые клетки являются адгезирующими, и прилипают к стеклу и пластику во время их выделения. Это свойство затрудняет работу с ними особенно тогда, когда стоит задача их обратного переноса в организм человека для создания высокой концентрации в поврежденном органе. Поэтому оптимизация способов выделения стволовых клеток костного мозга, обеспечивающая получение их максимального количества, является необходимой задачей, решение которой будет способствовать повышению эффективности клеточной терапии.

Работа с костным мозгом осложняется известной проблемой, а именно его повышенной свертываемостью. Это очень актуально при получении большого количества (100 мл) аспирата костного мозга, в результате чего пролонгируется время его забора, и экспозиция аспирата в шприце до начала выделения клеток. Наличие в шприце чистого гепарина в дозе 25000 ЕД во время забора костного мозга не приводит к полной профилактике тромбообразования. А разведение гепарина физиологическим раствором, до получения объема 20 мл, без увеличения дозы гепарина, приводит к увеличению поверхности соприкосновения гепарина и аспирата, что обеспечивает их быстрое взаимодействие, и в конечном итоге, обеспечивает отсутствие тромбообразования в шприце. Поскольку силикон снижает потери прикрепляющихся клеток, можно использовать силиконирование центрифужных пробирок. Это легко реализуется при работе in vitro. Однако когда выделенные клетки используются в терапевтических целях (для трансплантации), необходимо соблюдение определенных правил [2], предъявляемых экспертным советом Минздрава России. Одним из требований этой инструкции является использование стерильных одноразовых пластиковых расходных материалов. Из-за сложности соблюдения стерильности силиконирование пробирок в этих условиях не является эффективным способом решения проблемы потери клеток. По нашему мнению, применение гепаринизированного фосфатно-забуференного физиологического раствора во время работы с мононуклеарными клетками костного мозга устраняет необходимость силиконирования пробирок. Гепарин имеет большой отрицательный заряд [3] и обладает способностью адсорбироваться на клетках крови [4], и в результате отталкивания отрицательных зарядов нарушается адгезия и агрегация клеток крови. Кроме того, ингибирование образования тромбина гепарином приводит к прерыванию коагуляционного каскада гемостаза, следствием чего является отсутствие тромбообразования в шприце с аспиратом костного мозга.

Новые существенные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в исследованной авторами литературе.

Предлагаемый способ может быть использован в медицинской практике, так как позволяет получить необходимое количество жизнеспособных мононуклеарных клеток костного мозга для различных способов регенерационной клеточной терапии.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое техническое решение соответствующим критериям охраноспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом. После обезболивания 10%-ным раствором лидокаина пунктируется крыло подвздошной кости человека в области ее передне-верхней трети по известной методике [5]. Взятие аспирата костного мозга выполняется в два 60-миллитровых шприца, в каждом из которых содержится 25000 ЕД гепарина и 10 мл стерильного физиологического раствора. Затем полученный аспират отстаивают для осаждения эритроцитов в течение 30 минут при температуре 18-22°С, собирают верхние 2/3 клеточной взвеси обедненной эритроцитами и разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором (рН 7,2-7,4). После чего приготовленную пробу наслаивают на раствор HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics) в соотношении 1:1 в десяти 50-миллилитровых центрифужных пробирках. После чего выполняют центрифугирование в течение 30 мин при 400 g и температуре 18-22°С. Собирают слой мононуклеарных клеток с раздела фаз и переносят в 4 другие центрифужные пробирки, разводят в 3-5 раз гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором, тщательно ресуспендируют, центрифугируют 10 мин при 400 g, удаляют надосадочную жидкость, полученный осадок клеток в каждой пробирке разводят 10 мл гепаринизированного фосфатно-забуференного физиологического раствора и центрифугируют 10 мин при 400 g, удаляют надосадочную жидкость, вновь разводят клеточный осадок в каждой пробирке 10 мл гепаринизированного фосфатно-забуференного физиологического раствора и центрифугируют 10 мин при 400 g, удаляют надосадочную жидкость и разводят весь клеточный осадок в пробирках 20 мл гепаринизированного физиологического раствора. Подсчитывают общее количество выделенных клеток. Для этого смешивают 0,2 мл пробы суспензии мононуклеаров из каждой пробирки и 3%-ный водный раствор уксусной кислоты в соотношении 1 к 20. Считают в камере Горяева и получают количество клеток в одном миллилитре. Проводят определение жизнеспособности клеток методом отторжения красителя (трипановый синий), при котором краситель не проникает сквозь мембраны живых клеток. Доводим концентрацию жизнеспособных клеток до 2-4×10⁶ в 1 мл гепаринизированным физиологическим раствором.

Пример.

Больной Г., 60 лет, поступил в отделение неотложной кардиологии через 5 часов от начала ангинозного статуса с признаками ишемического повреждения миокарда в области переднебоковой стенки левого желудочка и острой сердечной недостаточности II ФК по Т. Killip. Больному выполнена системная тромболитическая терапия кабикиназой 750000 ЕД. На 16-е сутки болезни под местной анестезией 10%-ным раствора лидокаина, пунктировали гребень подвздошной кости в области передне-верхней ости и получили 100 мл аспирата костного мозга в шприцы, содержащие гепаринизированный физиологический раствор. Далее этот гепаринизированный аспират костного мозга отстаивали течение 30 мин при температуре 20°С, после чего собрали верхние 2/3 клеточной взвеси, обедненной эритроцитами, развели эту пробу в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл. Полученную пробу наслаивали на градиент плотности HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics), центрифугировали в течение 30 мин при 400 g и температуре 20°С. Слой мононуклеарных клеток собрали с границы раздела фаз. Собранные мононуклеарные клетки трехкратно отмыли гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл с помощью центрифугирования по 10 мин при 400 g и температуре 20°С. Развели клеточный осадок в 20 мл гепаринизированного физиологического раствора с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл. Считали общее количество выделенных клеток в камере Горяева. Для этого смешали 0,2 мл пробы суспензии мононуклеаров из каждой пробирки и 3%-ный водный раствор уксусной кислоты в соотношении 1 к 20. В результате получили 108×10⁶ клеток с концентрацией 5,4×10 ⁶мл. Провели определение жизнеспособности клеток методом отторжения красителя (трипановый синий), которая составила 98%. Довели концентрацию жизнеспособных клеток до 2,5×10 ⁶ в 1 мл гепаринизированного физиологического раствора.

В случаях, когда аспират костного мозга забирали в шприцы, без гепарина, происходило очень быстрое образование сгустка в шприце, что делало невозможным дальнейшую работу с клетками, если аспират костного мозга забирали в шприцы, содержащие неразведенный физиологическим раствором гепарин в той же дозе (25000 ЕД гепарина на шприц), образовывались тромбы, количество выделенных мононуклеарных клеток снижалось до 15-20 млн. Отмывание мононуклеарных клеток костного мозга фосфатно-забуференным физиологическим раствором без гепарина приводило к снижению количества выделенных клеток на 30%.

Таким образом, применение предлагаемого способа выделения мононуклеарных клеток костного мозга в отличие от прототипов приводило к увеличению количества получаемых жизнеспособных мононуклеарных клеток костного мозга, что, несомненно, будет способствовать повышения эффективности лечения.

Список литературы

1. Тотолян А.А., Балдуева И.А., Бубнова Л.Н., Закревская А.В., Зуева Е.Е., Калинина Н.М., Лисицина З.Н. Методические рекомендации. Стандартизация методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека // Медицинская иммунология. - 1999. - T.1, №5. - С.21-43.

2. Временная инструкция о порядке исследований в области клеточных технологий и их использования в учреждениях здравоохранения // www.Celltransplantation.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2 т. Т.2: пер. с англ. - М.: Мир, 2004. - С.330.

4. Венгеровский А.И. Лекции по фармакологии для врачей и провизоров. - Томск: STT, 2001. - С.476.

5. Руководство по гематологии: В 2 т. T.1/ под редакцией А.И.Воробьева. - М.: Медицина. - 1985. - С.53-57.