способ получения миорелаксантного лекарственного средства для лечения мышечных дистоний

Формула изобретения

Способ получения миорелаксантного лекарственного средства, выделенного из культуры Clostridium botulinum типа А, включающий культивирование штамма на питательной среде, отделение микробной массы, очистку и стерилизацию, отличающийся тем, что ботулинический токсин типа А получают из культуры штамма Clostridium botulinum 501, отделение микробной массы проводят микрофильтрацией, очистку осуществляют гель-проникающей хроматографией на колонке с сефарозой и после сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе, проводят сведение с криопротекторами, стерилизацию и лиофилизацию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и касается способа создания миорелаксантного лекарственного средства для лечения избыточных мышечных сокращений дистонической природы, таких как блефароспазм, гемифасциальный спазм, паралитическое косоглазие, спастическая кривошея, локальный мышечный спазм у взрослых.

Известен способ получения лекарственного средства на основе ботулинического нейротоксина типа А, включающий глубинное культивирование Clostridium botulinum (штамм Hall), двойное осаждение токсина сульфатом аммония при рН 3,5 с применением высокоскоростного центрифугирования, растворение осадка в фосфатном буфере при рН 6,8, повторное осаждение и экстракцию фосфатным буфером с последующим лиофильным высушиванием в растворе сывороточного альбумина человека. Препарат контролируется на специфическую активность - LD₅₀ мышей в 1 мл и на содержание нуклеиновых кислот измерением соотношения оптической плотности при длинах волн 260/278 нм. Если препарат имеет соотношение менее 0,6, он считается относительно чистым от нуклеиновых кислот [1].

Недостатками данного метода являются его трудоемкость, многостадийность (метод включает девять стадий), малый выход конечного продукта, обусловленный как физическими потерями на отдельных стадиях, так и частичное инактивации нейротоксина, связанной с его денатурацией в ходе выделения и очистки.

Наиболее близким аналогом является способ получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний, выделенного из культуры Clostridium botulinum, включающий культивирование штамма на питательной среде, двойное осаждение белков культуральной жидкости сернокислым аммонием, центрифугирование и выделение ботулинического нейротоксина из осадка, последовательную хроматографию целевого продукта на никелевом металлосорбенте, а также на ионообменном сорбенте при рН 6,1-6,9 с последующим получением жидкой лекарственной формы препарата путем смешивания очищенного нейротоксина с концентрированным раствором человеческого сывороточного альбумина. Препарат контролируется на специфическую активность - LD₅₀ мышей [2].

При получении препаратов указанными способами используются малотехнологичные и весьма опасные при работе с культурами III группы и токсином II группы патогенности приемы солевого осаждения с последующим высокоскоростным центрифугированием. Общими недостатками полученных указанными способами лекарственных средств является их высокая аллергенность, так как они содержат в составе сывороточный альбумин.

Задачей изобретения является обеспечение возможности получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний с гиппоаллергенными наполнителями-криопротекторами безопасным и менее трудоемким способом, который не теряет своей активности при хранении в сухой форме при температуре 5±2°С не менее 1 года.

Для решения поставленной задачи в способе получения миорелаксантного лекарственного средства, выделенного из культуры Clostridium botulinum типа А, включающем культивирование штамма на питательной среде, отделение микробной массы, очистку и стерилизацию, согласно изобретению ботулинический токсин типа А получают из культуры штамма Clostridium botulinum 501, отделение микробной массы проводят микрофильтрацией, очистку осуществляют гель-проникающей хроматографией на колонке с Сефарозой и после сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе проводят сведение с криопротекторами, стерилизацию и лиофилизацию.

Способ осуществляется следующим образом. Clostridium botulinum штамм 501 культивируют при температуре 29-30°С в течение 10 суток в условиях анаэростата в жидкой питательной среде. По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют от микробной массы методом микрофильтрации. Модификация способа и аппарат для микрофильтрации позволяет вести процесс без создания избыточного давления закрытым способом, что повышает безопасность работы с токсином II группы. На данном этапе производится определение токсичности культуральной жидкости и типоспецифичность полученного ботулотоксина. Отбирают 2 пробы культуральной жидкости по 1,0 мл каждая. В обеих пробах определяют биологическую активность в ДЛМ/ мл титрованием не беспородных белых мышах. Определение типоспецифичности проводят постановкой реакции нейтрализации на белых мышах с диагностическими противоботулиническими сыворотками А, В и Е. Культуральную жидкость используют в дальнейшей работе, если токсин, содержащийся в ней, строго типоспецифичен (тип А) и токсичность 1 мл раствора составляет не менее 1·10 ⁶ ДЛМ/мл.

Далее с целью выделения и очистки комплекса ботулотоксина с гемагглютинином, имеющего молекулярную массу 900 кДа, производится гельпроникающая хроматография на сефарозе.

Для этого 40-80 мл культуральной жидкости наслаивают на колонку (3,5×40 см) с вышеуказанным наполнителем, предварительно уравновешенную 0,15 М буферным раствором (рН 6,8). Оптическое поглощение элюата определяют с помощью проточного УФ-детектора при длине волны 280 нм.

Типичная хроматограмма представлена на чертеже. В последующей работе используют только фракции 2-го пика.

Фракция дает линии преципитации с антитоксической сывороткой ботулотоксина типа А (по Оухтерлони) и реакцию гемагглютинации формалинизированных эритроцитов.

На данном этапе достигается очистка целевого продукта от остатков неутилизированного культурой питательного субстрата, низкомолекулярных примесей, в том числе субъединичного нейротоксина, не связанного в комплекс, а также солей.

Далее проводится доочистка целевого продукта от нуклеиновых кислот методом сорбции на ДЭАЕ-целлюлозе. Для этого полученную фракцию второго пика пропускают через колонку размерами 3,0×10 см с ДЭАЕ-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,15 М фосфатным буфером (рН 6,8). Целевой продукт выходит одним пиком объемом 80 мл. По результатам аналитического определения содержания нуклеиновых кислот по методу Спирина, концентрация нуклеиновых кислот на данном этапе очистки снижается с 8,45 мкг/мл до 1,62 мкг/мл.

В полученной высокоочищенной лекарственной основе, содержащей комплексный белок ботулинического токсина с гемагглютинином, определяется активность LD₅₀ на мышах.

Расчет LD₅₀ и 95% доверительный интервал рассчитывают по методу Ашмарина-Кербера [3]. Активность очищенного ботулинического токсина составляет не менее 10⁴ LD ₅₀ в 1 мл.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата полученный высокоочищенный комплекс ботулотоксина типа А с гемагглютинином сводят с одним или более криопротекторов, выбранных из группы, включающей сахарозу, мальтозу, полиглюкин, желатозу. В качестве растворителя используется вода для инъекций. Сведение приводят, учитывая фактор разведения, который рассчитывается по общепринятым методикам полсчета. Конечная активность составляет 300 ед/флакон (1 ед=1 LD₅₀ мыши). Производится стерилизующая фильтрация пропусканием через мембрану 0,22 мкм.

Полученный конечный продукт разливают по 0,5 мл во флаконы вместимостью 5 или 10 мл и лиофильно высушивают. После высушивания флаконы с препаратом стерильно укупоривают. Полученный препарат не теряет активность, как минимум, в течение 1 года хранения при температуре 5±2°С. Он представляет собой стерильный лиофилизированный порошок или таблетку белого или бежевого цвета. Для практического применения препарат растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида изотоническом для инъекции. Раствор имеет рН от 5,6 до 6,6 (потенциометрически). Миорелаксантное действие препарата нейтрализуется антитоксической сывороткой Clostridium botulinum типа А.

Было проведено изучение аллергизирующих свойств и хронической токсичности предварительно детоксицированного препарата (4). Исследование показало, что детоксицированный препарат не обладает аллергизирующими свойствами и относится к классу малотоксичных веществ, не вызывающих признаков интоксикации у подопытных животных.

Пример осуществления способа.

Пример. В качестве продуцента природного комплекса ботулинического нейротоксина с гемагглютином используют штамм Clostridium botulinum 501. Культивирование осуществляют в условиях анаэростата при температуре 29-30°С в течение 10 суток в бутылях с 500 мл питательной среды следующего состава:

- кукурузный экстракт - 2,5 мл;

- натрия хлорид - 1,8 г;

- гидролизат рыбной муки

(аминный азот 100-120 мг%) - до 200 мл;

- вода очищенная - до 500 мл;

- рН 6,2-6,5.

По окончании культивирования проводят отделение культуральной жидкости штамма от микробных клеток метолом микрофильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм закрытым способом без создания избыточного давления.

В осветленной культуральной жидкости определяют биологическую активность в DLM/мл (на мышах) и типоспецифичность с ботулинической антитоксической сывороткой типа А.

Культуральную жидкость используют в дальнейшей работе, если токсин, содержащийся в ней, был строго типоспецифичен, а токсичность составляет не менее (5-8)×10 ⁵ DLM 1 мл.

На следующем этапе 40-80 мл культуральной жидкости наносят на колонку объемом 500 мл с сефарозой, предварительно калиброванную метчиками с известной молекулярной массой и уравновешенную 0,15 М натрийфосфатным буфером с 0,1 М NaCl (рН=6,2). Элюцию проводят со скоростью 1 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют тот же буферный раствор.

Оптическое поглощение элюата измеряют УФ-детектором с проточной кюветой при длине волны 280 нм. Культуральная жидкость элюирует тремя пиками; в дальнейшей работе используют только фракции второго пика, соответствующего молекулярной массе 900 кД.

Фракцию второго пика с целью очистки от нуклеиновых кислот подвергают сорбции на колонке объемом 50 мл с древесно-волокнистой ДЭАЕ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0,15 М натрий-фосфатным буфером (рН=6,5). Первую фракцию, равную объему колонки и не содержащую белка, отбрасывают. Остаточный объем токсиносодержащей жидкости вытесняют из колонки 50 мл того же буфера.

В полученной очищенной лекарственной основе, содержащей комплексный белок ботулинического токсина с гемагглютинином, определяется активность LD₅₀ мышах. Расчет LD₅₀ и 95% доверительный интервал рассчитывают по методу Ашмарина-Кербера [3].

Для приготовления окончательного лекарственного препарата полученный очищенный комплекс ботулотоксина типа А с гемагглютинином сводят с сахарозой в конечной концентрации 20 мг/флакон. В качестве растворителя используют воду для инъекций. Сведение производят, учитывая фактор разведения, который рассчитывается по общепринятым методикам подсчета. Конечная активность составляет 300 ед/флакон (1 ед=1 LD₅₀ мыши).

Полученный конечный продукт стерилизуют фильтрацией через мембраны с размером пор 0,2 мкм, разливают по 0,5 мл во флаконы вместимостью 5 или 10 мл и лиофильно высушивают. После высушивания флаконы с препаратом укупоривают.

Обеспечивается получение препарата, не теряющего активность, как минимум, в течение 1 года хранения при температуре 5±2°С.

Источники информации

1. Goodnough M.C., Johnson E.A., Schantz E.J. Pharmaceutical compositions containing botulinum toxin and method of preparation / Patent EP 0593176. - 1994-04-20.

2. Вертиев Ю.В. Лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний и способ его получения / Патент RU 2206337.

3. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962, 180 с.

4. Санитарные правила СП 3.5.2.561-96 для иммунобиологических препаратов.