пэгилированный полипептид т1249
Классы МПК: | C07K14/16 ВИЧ-1 A61K38/16 пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные A61P31/18 против вируса иммунодефицита |
Автор(ы): | БЕЛОН Паскаль Себастьян (US), ВОНЬ Джзиоб (US) |
Патентообладатель(и): | Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2003-07-16 публикация патента:
10.03.2007 |
Изобретение относится к соединениям пэгилированного полипептида Т1249. Также описаны фармацевтические композиции, включающие соединения пэгилированного полипептида Т1249, их способы приготовления и применение фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства для ингибирования ВИЧ-инфекции. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 8 табл., 6 ил.
![пэгилированный полипептид т1249, патент № 2294938](/images/patents/174/2294938/2294938.jpg)
![пэгилированный полипептид т1249, патент № 2294938](/images/patents/174/2294938/2294938-18.jpg)
![пэгилированный полипептид т1249, патент № 2294938](/images/patents/174/2294938/2294938-19.jpg)
![пэгилированный полипептид т1249, патент № 2294938](/images/patents/174/2294938/2294938-20.jpg)
![пэгилированный полипептид т1249, патент № 2294938](/images/patents/174/2294938/2294938-21.jpg)
![пэгилированный полипептид т1249, патент № 2294938](/images/patents/174/2294938/2294938-22.jpg)
Формула изобретения
1. Соединение формулы (I)
в которой
R1 обозначает метоксигруппу,
m обозначает число от 1 до 17,
n обозначает число от 10 до 1000,
р обозначает число от 1 до 3 и
NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно связанный через концевую -аминогруппу.
2. Соединение по п.1, в котором р обозначает 3.
3. Соединение по п.1, в котором р обозначает 3, R 1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.
4. Соединение формулы
в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно связанный через концевую -аминогруппу.
5. Соединение по п.4, в котором n обозначает приблизительно число 450.
6. Фармацевтическая композиция, предназначенная для ингибирования ВИЧ-инфекции и включающая в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы
в которой R1 обозначает метоксигруппу,
m обозначает число от 1 до 17,
n обозначает число от 10 до 1000,
р обозначает число от 1 до 3 и
NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно связанный через концевую -аминогруппу.
7. Фармацевтическая композиция по п.6, в которой в предлагаемом соединении р обозначает 3, R 1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750.
8. Фармацевтическая композиция по п.6 в форме лиофилизированного порошка.
9. Фармацевтическая композиция по п.6 в форме раствора или суспензии для инъекций.
10. Применение фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы I, для приготовления лекарственного средства для ингибирования ВИЧ-инфекции
в которой R1 обозначает метоксигруппу,
m обозначает число от 1 до 17,
n обозначает число от 10 до 1000,
р обозначает число от 1 до 3 и
NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно связанный через концевую -аминогруппу.
11. Применение по п.10, в котором в предлагаемом соединении р обозначает 3, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.
12. Применение фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства по п.10, в котором для ингибирования ВИЧ-инфекции фармацевтическую композицию вводят инъекционно внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, внутривенно или путем непрерывного вливания.
13. Применение фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства по п.10, в котором для ингибирования ВИЧ-инфекции фармацевтическую композицию вводят в количестве от приблизительно 50 мг до приблизительно 300 мг за введение.
14. Применение фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы III для приготовления лекарственного средства для ингибирования ВИЧ-инфекции:
в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно связанный через концевую -аминогруппу.
15. Применение для приготовления лекарственного средства по п.14, в котором для ингибирования ВИЧ-инфекции фармацевтическую композицию вводят в количестве от приблизительно 300 мг до приблизительно 1500 мг в неделю в качестве однократной дозы.
Приоритет по пунктам:
24.07.2002 - пп.1-5, 7-10,
10.01.2003 - п.6.
Описание изобретения к патенту
Настоящее изобретение относится к пэгилированным Т 1249 полипептидным соединениям и к способам получения и применения таких соединений, например, в фармацевтических композициях и терапевтических способах лечения.
Некоторые вирусы, в частности ВИЧ, должны пройти сложный процесс, называемый слиянием, для того чтобы проникнуть в клетку хозяина и репродуцироваться. Во время слияния, наружная мембрана вируса сливается с мембраной клетки хозяина. В случае ВИЧ в ходе репродукции наружная мембрана вируса ВИЧ сливается с мембраной Т-клеток CD4+.
Т1249 является членом нового класса антивирусных средств, которые ингибируют вирус/мембранное слияние. В случае ВИЧ, это приводит к двум ценным эффектам: блокируется репродукция ВИЧ и в результате не происходит гибели Т-клеток CD4+.
Устойчивость вирусов к одобренным современным лекарственным средствам против ВИЧ является существенной проблемой клинической тактики в отношении ВИЧ в настоящее время. У многих больных, начинающих комбинированное антиретровирусное лечение одобренными в настоящее время препаратами, со временем развивается устойчивость к одному или нескольким из этих средств. Однако исследования показывают, что развитие устойчивости к любому из одобренных в настоящее время антиретровирусных классов, возможно, не затрагивает Т1249. (Данные, представленные на 5-ом Международном семинаре по лекарственной устойчивости и стратегии лечения в Скоттсдейле, Аризона, 4-8 июня, 2001 г.)
Анализ действия различных доз Т1249 в клиническом испытании показывает, что суточная доза Т1249, а не предшествующий опыт антиретровирусного лечения, включая мутации, затрагивающие чувствительность ко всем одобренным классам лекарственных препаратов против ВИЧ, является единственной переменной, которая связана со снижением вирусной нагрузки у больных с опытом лечения. Дополнительные исследования показывают, что на активность Т1249 in vitro не влияют мутации, связанные с устойчивостью к ингибиторам обратной транскриптазы и ингибиторам протеазы.
Подобно многим полипептидным терапевтическим средствам Т1249 обычно вводят путем инъекции. Современные протоколы лечения часто включают более одной инъекции в сутки.
Поэтому было бы полезно предусмотреть полипептиды Т1249 и фармацевтические композиции с улучшенными действием и фармакокинетическими характеристиками. Особенно полезно было бы предусмотреть низкие терапевтические дозы Т1249, менее частые введения и/или пролонгированное действие.
Эти и другие задачи настоящего изобретения более детально описываются ниже.
Настоящее изобретение предусматривает соединение формулы
в которой
R1 обозначает кэп-группу,
m обозначает число от 1 до 17,
n обозначает число от 10 до 1000,
р обозначает число от 1 до 3, и
NHT1249 представляет собой полипептид Т1249, ковалентно присоединенный к концевой -аминогруппе.
В одном из вариантов осуществления изобретения в предлагаемом в нем соединении R 1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.
Также предлагается фармацевтическая композиция, включающая в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R 1, m, n, р и NHT1249 имеют указанные выше значения.
В одном из вариантов осуществления изобретения в соединении предлагаемой фармацевтической композиции R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.
Настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся в введении фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R 1, m, n, р и NHT1249 имеют указанные выше значения. Если изобретение относится к «способу ингибирования ВИЧ-инфекции, включающему соединение» подразумевается «применение соединения для приготовления лекарственного средства для ингибирования ВИЧ».
В одном из вариантов осуществления способа ингибирования ВИЧ-инфекции в предлагаемом соединении R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.
Также предлагается способ получения пэгилированного полипептида Т1249, заключающийся во взаимодействии полипептида Т1249 с альдегидом полиэтиленгликоля формулы
в которой R1, m, n и р имеют указанные выше значения; с получением соединения формулы (I): в которой молекула альдегида полиэтиленгликоля присоединена к N-концевой аминогруппе полипептида Т1249. Если настоящее изобретение относится к «способу получения», подразумевается «процесс получения».
Фиг.1 показывает сравнение ферментативного гидролиза ПЭГ-модифицированного и немодифицированного Т1249. Показан гидролиз посредством эндопротеиназы Lys-C и последовательное разделение с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой.
Фиг.2 показывает времяпролетную с лазерной десорбцией/ионизацией с матрицы масс-спектрометрию (MALDI TOF) собранной ВЭЖХ фракции ПЭГ-34 (фиг.1). Спектры получены в линейном режиме с транс-3-индолакриловой кислотой в качестве матрицы.
Фиг.3 показывает N-концевое (по Эдману) секвенирование ВЭЖХ фракции ПЭГ-34 (фиг.1).
Фиг.4 показывает профиль концентрация-время мПЭГ 20к-СМАВ-Т1249 у крыс после подкожного введения однократной дозы.
Фиг.5 показывает профиль концентрация-время Т1249 у крыс после подкожного введения однократной дозы.
Фиг.6 показывает влияние различных доз Т1249 и мПЭГ 20к-СМАВ-Т1249 на количество ВИЧ-1 у мышей SCID.
Как указано выше, Т1249 является полипептидом-«ингибитором слияния». Т1249 состоит из 39 аминокислот. Полипептид Т1249 имеет следующую аминокислотную последовательность:
WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF [SEQ.ID.№ 1].
N-концевой (или аминоконцевой) аминокислотой является триптофан (W). С-концевой (или карбоксиконцевой) аминокислотой является фенилаланин (F).
Как описано в табл.1 в патенте US 6348568 (Seq ID №1071), который включается в настоящее изобретение в качестве ссылки, последовательность полипептида Т 1249 можно заблокировать/изменить на одном или обоих из его амино- и карбоксиконцов. Как указано в патенте US 6348568, триптофановый аминоконец можно заблокировать/ изменить путем введения ацильной группы и фенилаланиновый карбоксиконец можно заблокировать/изменить путем введения аминогруппы (последнее приводит к превращению -СООН -CONH2).
В контексте настоящего описания под «Т1249» подразумевается пептид [SEQ.ID.№ 1], необязательно заблокированный аминогруппой на фенилаланиновом С-конце. Другими словами, при ссылке на «Т1249» подразумевается, что фенилаланиновый С-конец представляет собой либо -СООН, либо -CONH 2.
Настоящее изобретение предлагает пэгилированные соединения Т 1249 следующей формулы
в которой
R1 обозначает кэп-группу,
m обозначает число от 1 до 17,
n обозначает число от 10 до 1000,
р обозначает число от 1 до 3 и
NHT1249 представляет собой полипептид Т 1249, ковалентно связанный по концевой -аминогруппе.
В контексте настоящего описания термин R1-«кэп-группа» обозначает любую приемлемую химическую группу, которая в зависимости от того, что предпочтительнее, является обычно нереакционноспособной или обычно способной вступать в реакцию с другими химическими частями. В приведенном выше соединении полиэтиленгликоль ковалентно присоединен к -аминогруппе полипептида Т 1249. R1 -кэп-группа подбирается так, чтобы разрешить или же предотвратить бифункциональность, например, ковалентное присоединение ко второй представляющей интерес химической части.
В том случае когда кэп-группа является обычно неспособной вступать в реакцию с другими химическими частями, R1 является относительно инертным и поэтому не будет ковалентно присоединяться к другой химической части. Приемлемые обычно нереакционноспособные кэп-группы R1 включают: водород, гидроксил, низший алкил, низшую алкоксигруппу, низший циклоалкил, низший алкенил, низший циклоалкенил, арил и гетероарил.
В контексте настоящего описания под термином «низший алкил» подразумевается алкильная группа с прямой или разветвленной цепью, содержащая от 1 до 7, предпочтительно от 1 до 4, атомов углерода, такая как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, mpem-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил и им подобные. «Низший алкил» необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.
Термин «низшая алкоксигрупа» означает низшую алкильную группу, указанную ранее, которая присоединена посредством атома кислорода; примерами низших алкоксигрупп являются метоксигруппа, этоксигруппа, н-пропоксигруппа, изопропоксигруппа, н-бутоксигруппа, втор-бутоксигруппа, трет-бутоксигруппа, н-пентоксигруппа и им подобные. «Низшая алкоксигрупа» необязательно замещена одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.
Термин «низший циклоалкил» означает циклоалкильную группу, содержащую от 3 до 7, предпочтительно от 4 до 6 атомов углерода, т.е. циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил или циклогептил. «Низший циклоалкил» необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.
В контексте настоящего описания под термином «низший алкенил» подразумевают алкенильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от 2 до 7, предпочтительно от 2 до 5 атомов углерода, например этенил, бутенил, пентенил, гексенил и им подобные. «Низший алкенил» необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.
Под термином «низший циклоалкенил» подразумевают циклоалкенильную группу, содержащую от 4 до 7 атомов углерода, например циклобутенил, циклопентенил, циклогексенил и им подобные. «Низший циклоалкенил» необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.
Термин «арил» означает фенильную и нафтильную группу, которая является незамещенной или необязательно моно- или многозамещенной галогеном, низшим алкилом, низшей алкоксигруппой, трифторметилом, гидроксилом, карбоновой кислотой, сложным эфиром карбоновой кислоты, нитрогруппой, аминогруппой или фенилом, особенно галогеном, низшим алкилом, низшей алкоксигруппой, трифторметилом, гидроксилом, нитрогруппой, аминогруппой или фенилом.
Под термином «гетероарил» подразумевают 5- или 6-членную гетероароматическую группу, которая содержит один или несколько гетероатомов, выбранных из N, S и О, и которая может быть сконденсированной с бензольным ядром и/или замещенной тем же способом, как указанный выше «арил».
Предпочтительные обычно нереакционноспособные R1-кэп-группы включают метоксигруппу, гидроксигруппу или бензилоксигруппу. Особенно предпочтительной R1-кэп-группой является метоксигруппа. Когда R1 представляет собой метоксигруппу, пэгилированные полипептидные соединения иногда указываются в настоящем изобретении частично как «мПЭГ-соединения», где «м» обозначает метоксигруппу.
Если R 1-кэп-группа представляет собой группу, обычно вступающую в реакции с другими химическими частями, тогда R 1 является функциональной группой, способной к химическому взаимодействию с некоторыми функциональными группами, такими как амин и/или сульфгидрил в пептиде и/или белке. В таком случае R1 может быть функциональной группой, которая может легко взаимодействовать с электрофильными или нуклеофильными группами на других молекулах в противоположность тем группам, которым для вступления в реакцию требуются сильные катализаторы или трудновыполнимые условия реакции. Если R1 является относительно химически активным, альдегид полиэтиленгликоля может ковалентно присоединяться к другой химической части.
Примеры приемлемых обычно химически активных R 1-кэп-групп включают: галоген, эпоксид, имид малеиновой кислоты, ортопиридилдисульфид, тозилат, изоцианат, гидразингидрат, циануровый галид, N-сукцинимидилоксигруппу, сульфо-N-сукцинимидилоксигруппу, 1-бензотриазолилоксигруппу, 1-имидазолилоксигруппу, пара-нитрофенилоксигруппу, и
Термин «галоген» означает фтор, хлор, бром или иод. Предпочтительной обычно химически активной R1 -кэп-группой является . Когда присутствует данная R1-кэп-группа, следует принимать во внимании, что в соединениях настоящего изобретения первые m, n и/или р могут совпадать или отличаться от вторых m, n и/или р в формуле. Предпочтительнее, однако, когда оба m имеют одно и то же значение, оба n имеют одно и то же значение и оба р имеют одно и то же значение.
В предлагаемом в настоящем изобретении соединении m обозначает число от 1 до 17. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в предлагаемом в нем соединении m обозначает число от 1 до 14. Более предпочтительно, когда m обозначает число от 1 до 7, и еще более предпочтительно, когда m обозначает число от 1 до 4. Особо предпочтительно, когда m обозначает 1.
В настоящем изобретении в предлагаемом в нем соединении n обозначает число от 10 до 1000. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в предлагаемом в нем соединении n обозначает число от 20 до 1000. Предпочтительно, когда n обозначает число от 50 до 1000, еще более предпочтительно, когда n обозначает число от 75 до 1000. Особо предпочтительно, когда n обозначает число от 100 до 750.
В настоящем изобретении в предлагаемом в нем соединении р обозначает число от 1 до 3. Предпочтительно, когда р обозначает 3.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения в предлагаемом в нем соединении р обозначает 3, R1 представляет собой метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750; или р обозначает 2, R1 представляет собой метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750; или р обозначает 1, R1 представляет собой метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.
В вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается формула (I), в которой R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750, р обозначает 3 и NHT1249 обозначает полипептит Т1249, ковалентно связанный с концевой -аминогруппой.
Как отмечалось выше, в пэгилированных соединениях Т1249 настоящего изобретения -аминогруппа Т1249 ковалентно присоединена к производному полиэтиленгликоля, имеющему особую структуру. Пэгилированные соединения можно получать любым желаемым способом, но обычно их получают путем химического взаимодействия Т1249 с отдельно полученными производными полиэтиленгликоля. Например, полипептид Т 1249 можно пэгилировать, блокируя все остатки лизина и подвергая взаимодействию этот блокированный Т1249 с производным полиэтиленгликоля. Затем блокированные остатки лизина полипептита Т1249 деблокируют, получая пегилированный на конце Т1249.
Полипептид Т1249 можно получать любым приемлемым способом. Например, данные соединения можно синтезировать, применяя традиционные методы твердофазного синтеза Меррифилда, включая твердофазный метод с использованием Вос-аминокислоты (Chem. Soc., 85, 1963, с.2149), с применением ручного или автоматизированного процессов, применяя твердофазный метод с использованием Fmoc-аминокислоты (R.C.Sheppard и др., J.Chem. Soc. Chem. Comm., 1985, сс.165-166), используя Advanced Chemtech, модель 200 фирмы Advanced Chemtech., Луисвилл, США, штат Кентукки, используя Millipore 9050+ фирмы Millipore, Bedford Mass, или другие подходящие приборы.
Т1249 можно получать путем включения кДНК, кодирующей соединения настоящего изобретения, в функционально активные векторы на основе вирусной или кольцевой плазмидной ДНК. Векторы или плазмиды можно использовать для трансфекции или трансформации выбранных микроорганизмов. После трансформации или трансфекции микроорганизмы можно культивировать в условиях, способствующих экспрессии последовательностей трансмиссивной ДНК, и из питательной среды можно осуществлять выделение искомых пептидов (см., например, патент US 5955422, сущность которого включена в настоящее изобретение в качестве ссылки, как если бы цитировали целиком).
Т1249 можно также получать посредством традиционной генной инженерии с использованием хорошо известных в данной области методов. Например, эти методы описаны Sambrook и др. в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-ое издание, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк) или Ausubel и др. в Current Protocols в Molecular Biology, John Wiley и Sons, Нью-Йорк, 1995; обе эти работы включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.
Особый метод получения Т 1249 описан в патенте US 62587872 и в патенте US 6348568, каждый из которых включен в настоящее изобретение в качестве ссылки.
После расщепления и удаления защитной группы можно проводить очистку Т1249 любыми приемлемыми способами. Например, для очистки Т1249 полной длины от его фрагментов можно применять ионообменную, гель-фильтрационную хроматографию и/или колонку с обращенной фазой/систему ВЭЖХ. В том случае когда сначала получают предшественник Т 1249 с блокирующей/защитной группой, присоединенной к N-концу (например, ацильной группой) и/или С-концу (например, аминогруппой), одну или обе из этих групп можно удалить, используя известные приемы.
Последовательность аминокислот в Т 1249 можно подтвердить или идентифицировать, применяя традиционный аминокислотный анализ, а также ручное или автоматизированное расщепление белков по Эдману и определение каждой аминокислоты. Чтобы проконтролировать получение Т 1249 можно также использовать ВЭЖХ-анализ и масс-спектрометрию.
Альдегидные соединения полиэтиленгликоля, которые можно подвергать взаимодействию с Т1249, также можно получать любым желаемым способом. Предпочтительно, однако, когда полиэтиленгликоль получают в соответствии с методами, описанными в заявке на патент US 60/398196, зарегистрированной 24 июля 2002 г., озаглавленной «Альдегиды полиэтиленгликоля», сущность которой включена в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Обычно для пэгилирования Т 1249 применяют альдегид полиэтиленгликоля формулы
в которой R1, m, n и р имеют указанные выше значения. Альдегид полиэтиленгликоля, применяемый для пэгилирования Т1249, можно получать любыми приемлемыми способами. Один из предпочтительных альдегидов полиэтиленгликоля получают следующим способом
Схема реакции для получения мПЭГ 10к-бутаноальдегида
Варьирующие по размеру альдегиды полиэтиленгликоля (например, различающиеся значениями n) можно получать по следующей вышеуказанной общей схеме реакций.
Пэгилированные соединения Т 1249 настоящего изобретения можно получать любыми приемлемыми способами. Однако более предпочтительным по настоящему изобретению является способ пэгилирования полипептида Т1249, заключающийся в химическом взаимодействии полипептида Т1249, NHT1249, с альдегидом полиэтиленгликоля формулы
в которой R1, m, n и р имеют указанные выше значения;
с образованием соединения формулы:
в которой молекула альдегида полиэтиленгликоля присоединена к N-концевой аминогруппе полипептида Т1249.
Пэгилированный Т1249 готовят добавлением Т1249 и реагента ПЭГ в диапазоне молярных соотношений от 1:1 до 1:100. Т 1249 имеет свободную -аминогруппу (удалена одна из ацильных групп) и либо свободную карбоксигруппу, либо амино-защищенную карбоксигруппу, как обсуждалось выше. Реакционную смесь помещают в боратный или фосфатный буфер при комнатной температуре или при температуре 4°С на приблизительно 5-24 ч при диапазоне рН от 5,5 до 7,4. Молярное отношение реагента ПЭГ к пептиду/белкам составляет от 1:1 до 100:1. Концентрация пептида/белков составляет от 1 до 10 мг/мл. Концентрация буфера обычно составляет от 10 до 500 мМ.
Для очистки Т1249 берут реакционную смесь пэгилированных Т1249 и разбавляют ее уравновешивающим буфером (20 мМ Трис, рН 7,5). Затем полученную смесь наносят на колонку с Q-сефарозой. После нанесения смеси на QA-колонку ее промывают уравновешивающим буфером, элюируют 75 мМ NaCl; элюируют 200 мМ NaCl; элюируют 1 M NaCl; и регенерируют 1М НОАС +1М NaCl и 0,5М NaOH.
Используя ВЭЖХ с обращенной фазой, можно без труда отделить и выделить N-концевой монопэгилированный продукт из смеси с другими побочными продуктами. Например, на хроматограмме пэгилированного Т 1249 могут формироваться несколько пиков, каждый с особым временем удерживания. Первый пик может представлять не прореагировавший пептид, 10,7 мин, второй пик может представлять монопэгилированный пептид, 17,6 мин, за которым следует дипэгилированный пептид, 19 мин. Каждый собранный продукт был подтвержден время-пролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией с матрицы (MALDI TOF).
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения в предлагаемых в нем пэгилированных полипептидах Т 1249 р обозначает 3, R1 обозначает метил, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750; или р обозначает 2, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750; или р обозначает 1, R 1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.
В настоящем изобретении также предлагается пэгилированный полипептид Т 1249 следующей формулы
в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т 1249, ковалентно присоединенный к концевой -аминогруппе. В одном из вариантов осуществления изобретения в формуле предлагаемого соединения n обозначает число, близкое 225, например 227. В другом варианте осуществления изобретения в формуле предлагаемого соединения n обозначает примерно 450.
Этот пэгилированный полипептид Т1249 можно получать любым желаемым способом, предпочтительно его получают способом, описанным в примере 7.
Фармацевтические композиции изобретения включают в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R1, m, n, p и NHT1249 имеют указанные выше значения.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения, включающие пэгилированные полипептиды Т1249 или их соли, могут быть приготовлены любым желаемым способом, например путем традиционных процессов смешивания, инкапсулирования, растворения, гранулирования, эмульгирования, улавливания или лиофилизации. Эти фармацевтические препараты могут быть приготовлены в смеси с терапевтически неактивными, неорганическими или органическими эксципиентами или носителями. Приемлемые для инъекции эксципиенты включают воду, спирты, высокомолекулярные спирты, глицерин, растительные масла, фосфолипиды и поверхностно-активные вещества.
Фармацевтические препараты могут также содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, увлажнители, эмульгаторы, подсластители, красители, вкусовые вещества, соли для изменения осмотического давления, буферы, вещества для покрытия или антиоксиданты. Они также могут содержать другие терапевтически ценные вещества, включая дополнительные действующие вещества.
Составы, пригодные для введения путем инъекции (включая внутрибрюшинную, внутримышечную, подкожную, внутривенную инъекции, или непрерывное вливание), могут быть традиционно представлены в форме разовой дозы и могут быть приготовлены традиционными фармацевтическими методами. Такие методы включают стадию внесения в ассоциацию пэгилированных полипептидов Т1249 и фармацевтических носителя (носителей) или эксципиента (эксципиентов). Обычно композиции готовят путем равномерного и однородного внесения в ассоциацию пэгилированных полипептидов Т 1249 с жидкими носителями. Составы, приемлемые для введения путем инъекции, включают: водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, придающие композиции изотоничность с кровью предполагаемого реципиента; водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества и загустители. Составы могут быть представлены в контейнерах, рассчитанных на единственную дозу или на много доз, например, в запаянных ампулах и флаконах, и их можно хранить в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием.
Предпочтительными составами с разовыми дозировками являются те, которые содержат суточную дозу, суточную субдозу, недельную дозу, недельную субдозу, как изложено в настоящем описании выше, или адекватную часть дозы, вводимого ингредиента.
Предпочтительно, когда пэгилированный полипептид Т1249 представлен в форме разовой дозы. В контексте настоящего описания под выражением «форма разовой дозировки» подразумевается, что количество, соответствующее разовой дозе пэгилированного полипептида Т1249, представлено в предварительно рассчитанной и расфасованной форме. Этим обеспечивается удобная подготовка пэгилированного полипептида Т1249 для введения, и даже учитывается возможность самовведения препарата больным. Очевидно, что количество разовой дозировки будет зависеть от количества пэгилированного полипептида Т1249, которое необходимо ввести, и частоты введения.
Пэгилированный полипептид Т1249 может быть также предусмотрен в форме лиофилизированного порошка в количестве разовой дозы, пригодного для разбавления фармацевтически приемлемым эксципиентом непосредственно перед введением.
Одна из фармацевтических композиций изобретения включает в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.
Другая фармацевтическая композиция изобретения является фармацевтической композицией, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (III), в которой n обозначает число от 100 до 1000 и NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно присоединенный к концевой -аминогруппе. В одном из вариантов осуществления изобретения n обозначает число, близкое 225, например 227. В еще одном варианте осуществления изобретения n обозначает число, близкое 450.
Настоящее изобретение также предлагает способы ингибирования ВИЧ инфекции, заключающиеся во введении больному фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R1, m, n, p и NHT1249 имеют указанные выше значения.
Пэгилированные полипептиды Т1249 обычно вводят способом, которым в настоящее время вводят (непэгилированные) полипептиды Т1249. Однако допустимы модификации, позволяющие использовать преимущества улучшенных фармакокинетических показателей пэгилированных полипептидов Т1249.
В способе ингибирования ВИЧ настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить любым приемлемым методом и путем. В предпочтительном способе пэгилированный полипептид Т1249 вводят в форме инъекционного раствора или суспензии. Предпочтительно, когда инъецируемый раствор или суспензию вводят путем подкожной инъекции или внутривенно.
В другом предпочтительном способе пэгилированный полипептид Т1249 вводят посредством трансдермальной системы доставки, например трансдермальной аппликации.
В способе ингибирования ВИЧ настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить в любых приемлемых дозах и режимах. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить в любой форме и любым путем, по желанию. Обычно, однако, пэгилированные полипептиды Т1249 настоящего изобретения вводят парентерально, например в форме инъекционных растворов.
Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах компетентности специалистов в данной области, и терапевтически эффективное количество или доза пэгилированного полипептида Т1249 в соответствии с настоящим изобретением может варьировать и подбирается на основании индивидуальных потребностей в каждом конкретном случае. В общем в случае введения путем инъекции взрослым людям весом около 70 кг должна быть приемлемой суточная доза от приблизительно 5 мг до приблизительно 300 мг, предпочтительно от приблизительно 50 мг до приблизительно 200 мг, хотя верхний предел по показанию можно превышать. Дозировку можно вводить в качестве однократной дозы, разделенной общей дозы, или непрерывного вливания.
Фармацевтическую композицию можно вводить по любой пригодной схеме дозирования. Предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в сутки, два раза в сутки, однократно через сутки, один раз в неделю или два раза в неделю. Более предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю.
Предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю в дозе от приблизительно 300 мг до приблизительно 1500 мг. Более предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю в дозе от приблизительно 400 мг до приблизительно 1000 мг. Особо предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю в дозе от приблизительно 100 мг до приблизительно 200 мг.
Настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся в введении фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.
В рамках изобретения также рассматривается способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся в введении фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (III), в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно присоединенный к концевой -аминогруппе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения n обозначает число, близкое 225, например 227. В другом варианте осуществления изобретения n обозначает число, близкое 450.
Для дополнительной иллюстрации соединений, композиций и способов настоящего изобретения предлагаются следующие примеры. Эти примеры служат только в качестве иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения рамок настоящего изобретения.
Пример 1
Приготовление мПЭГ10к -бутаноальдегида
мПЭГ с молекулярным весом 10000 (30,0 г, 3 ммоль) в 240 мл толуола азеотропно сушат нагреванием с обратным холодильником в течение 2 ч с удалением 120 мл толуола. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, затем к раствору ПЭГ добавляют трет-бутоксид калия (0,68 г, 6 ммоль) в 20 мл абсолютного трет-бутанола и 20 мл толуола. Полученную смесь перемешивают в течение двух ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. К реакционной смеси с помощью шприца добавляют трет-бутилбромацетат (1,00 мл, 6,75 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем реакционный раствор конденсируют роторным упариванием. Осаждают добавлением диэтилового простого эфира. Осажденный продукт, мПЭГ 10к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир, фильтруют и сушат в вакууме. Выход: 28 г. ЯМР (d6 -ДМСО):1,40 част./млн (t, 9H, -СН3); 3,21 част./млн (s, -ОСН3); 3,50 част./млн (s, -О-СН2СН2-О-); 3,96 част./млн (s, 2H, -О-CH2-СОО-).
Затем мПЭГ10к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир (26,5 г) растворяют в 350 мл 1н. гидроксида натрия и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Доводят рН смеси до 2,5, добавляя 6н. соляную кислоту, и смесь экстрагируют дихлорметаном. Высушивают органический слой над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют и осаждают диэтиловым простым эфиром. Продукт мПЭГ10к-карбоксиметиловую кислоту собирают фильтрацией и сушат в вакууме. Выход: 24 г. ЯМР (d 6-ДМСО): 3,21 част./млн (s, -ОСН3 ); 3,5 част./млн (s, -О-CH2СН 2-О-); 3,99 част./млн (s, 2H, -O-СН2 -СООН).
После этого мПЭГ10к-карбоксиметиловую кислоту (6 г, 0,6 ммоль) растворяют в безводном дихлорметане (30 мл) с последующим добавлением диэтилацеталя 4-аминобутиральдегида (140 мл, 0,9 ммоль), 1-гидроксибензотриазола (80 мг, 0,6 ммоль) и дициклогексилкарбодиимида (160 мг, 0,78 ммолей). Смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную смесь фильтруют, концентрируют и осаждают смесью 2-пропанола и диэтилового простого эфира (1:1). Продукт мПЭГ 10к-бутаноацеталь сушат в вакууме в течение ночи. Выход:
5,4 г. ЯМР (d6-ДМСО): 1,07-1,12 част./млн (t, 6H, (-O-СН2-СН3 )2); 1,46 част./млн (m, 4H, -NHCH 2CH2CH2-CH-); 3,08-3,11 част./млн (q, 2H, -NHCH2CH 2CH2-CH-); 3,21 част./млн (s, -ОСН 3); 3,5 част./млн (s, -O-CH2CH 2-O-); 3,85 част./млн (s, 2H, -O-CH2 -CO-NH-); 4,44 част./млн (t, 1H, -NHCH2 CH2CH2-CH-); 7,67 част./млн (-NH-).
Затем мПЭГ10к-бутаноацеталь (2 г, 0,2 ммоль) растворяют в 20 мл 80% CF3 СООН и перемешивают раствор в течение ночи при комнатной температуре. Доводят рН смеси до 6,0, добавляя 1н. раствор NaOH, добавляют хлорид натрия (10 мас.%) и затем доводят рН раствора до 7,0 добавлением 1н. NaOH. Смесь экстрагируют дихлорметаном. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют и осаждают диэтиловым простым эфиром. Продукт мПЭГ10к -бутаноальдегид собирают фильтрацией и сушат в вакууме. Выход: 1,7 г. ЯМР (d6-ДМСО): 3,21 част./млн (s, -ОСН3); 3,5 част./млн (s, -O-СН 2СН2-O-); 3,85 част./млн (s, 2H, -O-CH2-CO-NH-); 7,67 част./млн (-NH-); 9,66 част./млн (-СНО-).
Пример 2
Пэгилирование Т 1249 мПЭГ10к-бутаноальдегидом
Бутаноальдегид ПЭГ 10кДа (мПЭГ10к-СМАВ), приготовленный в соответствии с примером 1, добавляют к 20 мг Т 1249 (93,7% чистого вещества) в 1,0 мл буфера (50 мМ фосфат калия, рН 6,5) в молярном отношении 5 молекул реагента на одну молекулу Т1249. Полипептид Т1249 деацилируют по -аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH2. К реакционной смеси добавляют 10% (об./об.) 0,5 М раствора цианоборогидрида натрия в воде и перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре. Пэгилированный Т1249 очищают от реакционной смеси с помощью ионообменной хроматографии (QA). Для разделения пэгилированного Т 1249 и немодифицированного Т 1249 используют ступенчатый градиент с увеличивающимися концентрациями соли от 65 мМ до 1 М NaCl в 20 мМ трис, рН 7,5.
Пример 3
Приготовление мПЭГ20к-бутаноальдегида
м-ПЭГ с молекулярным весом 20000 (60,0 г, 3 ммоль) в 800 мл толуола азеотропно сушат нагреванием с обратным холодильником в течение 2 ч с удалением 200 мл толуола. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, затем к раствору ПЭГ добавляют трет-бутоксид калия (0,68 г, 6 ммоль) в 20 мл абсолютного трет-бутанола и 20 мл толуола. Полученную смесь перемешивают в течение двух ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. К реакционной смеси с помощью шприц-пипетки добавляют трет-бутилбром ацетат (1,00 мл, 6,75 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем реакционный раствор конденсируют роторным упариванием. Осаждают добавлением диэтилового простого эфира. Осажденный продукт, мПЭГ 20к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир, фильтруют и сушат под вакуумом. Выход: 56 г. ЯМР (d6 -ДМСО): 1,42 част./млн (t, 9H, -СН3); 3,21 част./млн (s, -ОСН3); 3,50 част./млн (s, -О-СН2СН2-О-); 3,98 част./млн (s, 2H, -O-CH2-COO-).
Затем мПЭГ20к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир (28 г) растворяют в 750 мл 1н. гидроксида натрия, и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Доводят рН смеси до 2,5, добавляя 6н. соляную кислоту, и смесь экстрагируют дихлорметаном. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют и осаждают диэтиловым простым эфиром. Продукт, мПЭГ20к-карбоксиметиловую кислоту, собирают фильтрацией и сушат под вакуумом. Выход: 25 г. ЯМР (d 6-ДМСО): 3,21 част./млн (s, -ОСН3 ); 3,5 част./млн (s, -О-СН2СН 2-О-); 4,01 част./млн (s, 2H, -O-СН2 -СООН).
Затем мПЭГ20к-карбоксиметиловую кислоту (20 г, 1,6 ммоль) растворяют в безводном дихлорметане (100 мл) с последующим добавлением диэтилацеталя 4-аминобутиральдегида (0,77 мл, 4 ммоль), 1-гидроксибензотриазола (270 мг, 2,0 ммоль) и дициклогексилкарбодиимида (620 мг, 3,0 ммоль). Смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную смесь фильтруют, концентрируют и осаждают смесью 2-пропанола и диэтилового эфира (1:1). Продукт мПЭГ 20к-бутаноацеталь сушат под вакуумом в течение ночи. Выход: 18,6 г. ЯМР (d6-ДМСО): 1,07-1,12 част./млн (t, 6H, (-O-СН2-СН3 )2); 1,46 част./млн (m, 4H, -NHCH 2CH2CH2-CH-); 3,08-3,11 част./млн (q, 2H, -NHCH2CH 2CH2-CH-); 3,21 част./млн (s, -ОСН 3); 3,5 част./млн (s, -O-CH2CH 2-О-); 3,85 част./млн (s, 2H, -O-CH2 -CO-NH-); 4,44 част./млн (t, 1H, -NHCH2 CH2CH2-CH-); 7,67 част./млн (-NH-).
Затем мПЭГ20к-бутаноацеталь (14,7 г, 0,73 ммоль) растворяют в 200 мл 10% CF 3СООН и перемешивают раствор в течение ночи при комнатной температуре. Доводят рН смеси до 6,0, добавляя 1н. раствор NaOH, добавляют хлорид натрия (10 мас.%) и затем доводят рН раствора до 7,0 добавлением 1н. NaOH. Смесь экстрагируют дихлорметаном. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют и осаждают диэтиловым простым эфиром. Продукт мПЭГ 20к-бутаноальдегид собирают фильтрацией и сушат под вакуумом. Выход: 13,1 г. ЯМР (d6-ДМСО): 3,21 част./млн (s, -ОСН3); 3,5 част./млн (s, -O-CH 2CH2-O-); 3,85 част./млн (s, 2H, -O-CH2-CO-NH-); 7,67 част./млн (-NH-); 9,65 част./млн (-СНО-).
Пример 4
Пэгилирование Т 1249 мПЭГ20к-бутаноальдегидом
Бутаноальдегид ПЭГ 20кДа, приготовленный в соответствии с примером 3, добавляют к 20 мг Т 1249 (93,7% чистого вещества), который растворяют в 0,4 мл 50 мМ бората, рН буфера 9,5, и затем разбавляют в десять раз 100 мМ фосфатом калия, рН 6,5, в молярном отношении 10 моль реагента на один моль Т1249. Полипептид Т1249 деацилируют по -аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH2. К реакционной смеси добавляют 0,4 мл (10%, об./об.) 0,5 М раствора цианоборгидрида натрия (NaBH 3CN) в воде и перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь разбавляют в 10 раз уравновешивающим буфером (20 мМ трис, рН 7,5) и фильтруют через фильтр, диаметр пор 0,45 мкм. Пэгилированный Т1249 очищают от реакционной смеси с помощью анионообменной хроматографии (Q-сефароза). Для отделения дипэгилированного, монопэгилированного и немодифицированного Т1249 друг от друга соответственно используют ступенчатый градиент с увеличивающимися концентрациями соли от 75 мМ, 200 мМ до 1 М NaCl в уравновешивающем буфере. Описанный выше эксперимент повторяют начиная с 70 мг Т1249, в молярном отношении к ПЭГ 20к-бутаноальдегиду 1:10, и проводят очистку, как описано ранее. Совокупность монопэгилированных Т1249 (200 мМ NaCl элюат), полученных в обоих экспериментах, объединяют, концентрируют до приблизительно 2 мг/мл, отфильтровывают в буфер для хранения (ФСБ буфер, рН 7,3) и хранят при -20°С до последующего использования. Аликвоту вещества используют для анализа антивирусной активности.
Пример 5
Процентное содержание моно-, ди- и трипэгилированного мПЭГ20к-бутаноальдегидом Т1249
Процентное содержание моно-, ди- и трипэгилированного мПЭГ 20к-бутаноальдегидом Т1249 определяют посредством серии экспериментов, в которых меняют молярное отношение Т1249:ПЭГ, рН реакционного раствора и время реакции, как видно ниже из табл.1, 2 и 3. Цель этих экспериментов заключается в оптимизации параметров пэгилирования.
Например, в табл.1 бутаноальдегид ПЭГ 20кДа (мПЭГ20к-СМАВ), полученный в соответствии с примером 3, добавляют к 5 мг Т1249 (93,7% чистого вещества) в 50 мМ фосфате калия, рН 6,5. Полипептид Т1249 деацилируют по -аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH2. Молярное отношение ПЭГ-реагента к Т1249 составляет 1:1, 1:2 и 1:5. К реакционной смеси добавляют 10% (об./об.) раствора 0,5 М цианоборгидрида натрия в воде. Аликвотную пробу отбирают через заданный промежуток времени 2, 4, 6 и 24 ч при комнатной температуре.
Таблица 1. Фосфатно-калиевый буфер, рН 6,5 | |||||
Т1249: ПЭГ, молярное отношение | Момент времени | Монопэгилированный,% | Дипэгилированный, % | Трипэгилированный, % | Т1249,% |
1:1 | 2 ч | 14 | 0,1 | 0 | 84 |
1:1 | 4 ч | 18 | 0,19 | 0 | 81 |
1:1 | 6 ч | 21 | 0,21 | 0 | 78 |
1:1 | 24 ч | 25 | 0,91 | 0 | 72 |
1:2 | 2 ч | 29 | 0,69 | 0 | 68 |
1:2 | 4 ч | 34 | 1,14 | 0 | 63 |
1:2 | 6 ч | 37 | 1,55 | 0 | 59 |
1:2 | 24 ч | 39 | 3,16 | 0 | 54 |
1:5 | 2 ч | 53 | 5 | 0 | 39 |
1:5 | 4 ч | 59 | 9 | 0 | 26 |
1:5 | 6 ч | 61 | 12 | 0 | 20 |
1:5 | 24 ч | 55 | 23 | 0 | 15 |
В исследовании, результаты которого представлены в табл.2, ПЭГ 20кДа (мПЭГ20к-СМАВ), полученный в соответствии с примером 3, добавляют к 5 мг Т1249 (93,7% чистого вещества) в 50 мМ фосфате калия, рН 6,0, в молярном отношении десять моль ПЭГ-реагента к одному моль Т 1249. Полипептид Т1249 деацитилируют по -аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH2. К реакционной смеси добавляют 10% (об./об.) раствора 0,5 М цианоборогидрида натрия в воде. Аликвоту отбирают через заданный промежуток времени 2, 4, 6 и 24 ч при комнатной температуре.
Таблица 2. Фосфатно-калиевый буфер, рН 6,0 | |||||
Т1249: ПЭГ, молярное отношение | Момент времени | Монопэгилированный, % | Дипэгилированный, % | Трипэгилированный, % | Т1249, % |
1:10 | 2 ч | 60 | 11 | 0 | 22 |
1:10 | 4 ч | 61 | 23 | 0 | 10 |
1:10 | 6 ч | 59 | 24 | 5 | 7 |
1:10 | 24 ч | 38 | 38 | 18 | 4 |
В исследовании, результаты которого представлены в табл.3, ПЭГ 20кДа (мПЭГ 20к-СМАВ), полученный в соответствии с примером 3, добавляют к 5 мг Т1249 (93,7% чистого вещества) в 50 мМ фосфате калия, рН 5,5 в молярном отношении десять моль ПЭГ-реагента к одному моль Т1249. Полипептид Т 1249 деацитилируют по -аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH2. К реакционной смеси добавляют 10% (об./об.) раствора 0,5 М цианоборгидрида натрия в воде. Аликвоту отбирают через заданный промежуток времени 2, 4, 6 и 24 ч при комнатной температуре.
Таблица 3. Фосфатно-калиевый буфер, рН 5,5 | |||||
Т1249: ПЭГ, молярное отношение | Момент времени | Монопэгилированный,% | Дипэгилированный, % | Трипэгилированный,% | Т1249,% |
1:10 | 2 ч | 47 | 7 | 0 | 41 |
1:10 | 4 ч | 58 | 16 | 0 | 20 |
1:10 | 6 ч | 60 | 22 | 3 | 10 |
1:10 | 24 ч | 32 | 38 | 25 | 3 |
Процентное отношение моно-, ди- и трипэгилированного Т1249 устанавливают посредством ВЭЖХ с обращенной фазой для каждой реакционной смеси. Данные, представленные выше в табл.1, 2 и 3, показывают переменные условия молярного отношения Т1249 : ПЭГ, рН и времени реакции, при которых получают оптимальные количества монопэгилированного Т1249. Например, в условиях, показанных в таблице 1, оптимальное монопэгилирование, 61%, происходит при 1:5 молярном отношении Т1249:ПЭГ через 6 ч В условиях, показанных в таблице 2, оптимальное монопэгилирование, 61%, происходит при 1:10 молярном отношении Т1249:ПЭГ через 4 ч. В условиях, показанных в таблице 3, оптимальное монопэгилирование, 60%, происходит при 1:10 молярном отношении Т1249:ПЭГ через 6 ч.
Пример 6
Определение участков пэгилирования
Чтобы установить участок присоединения ПЭГ к Т1249, была проведена серия экспериментов. Результаты показывают, что >95% модификаций локализовано у N-концевого триптофанового остатка. В меньшей степени (<5%) могут иметь место дополнительные участки модификаций, но их локализация точно не установлена.
Чтобы определить участок ПЭГ-модификации, образец гидролизуют Lys-C-эндопротеиназой и пептиды разделяют посредством ВЭЖХ с обращенной фазой. Затем индивидуальные пептидные пики анализируют с помощью наноспрей-ESI (ионизация в электроспрее)-масс-спектрометрии, MALDI TOF (времяпролетной с лазерной десорбцией/ионизацией с матрицы масс-спектрометрии) и N-концевого секвенирования (по Эдману). Эти методы приведены ниже.
Образцы монопэгилированного бутаноальдегида-Т1249 20К (20к мПЭГ-СМАВ-Т1249), полученные в соответствии с примером 4, и Т 1249 (свободный -аминоконец; карбоксиконец защищен -NH2 ), гидролизуют эндопротеазой Lys-C в течение 2 ч при температуре окружающей среды и отношении образца к ферменту 10/1 (мас./мас.). Реакцию останавливают добавлением уксусной кислоты до конечной концентрации 2% (об./об.).
Разделение протеолитических пептидов проводят посредством ВЭЖХ с обращенной фазой с системой ВЭЖХ НР1100, оснащенной колонкой с обращенной фазой Phenomenex Luna (С-18, 3 мкм, 150×200 мм). Система растворителей состоит из воды, ацетонитрила и трифторуксусной кислоты (0,05%). Градиент органического растворителя составляет от 5% до 64% через 50 мин при расходе 0,2 мл/мин. Пики с пептидами собирают для дальнейшего анализа.
Все собранные образцы затем анализируют с помощью наноспрей-ESI-масс-спектрометрии, используя прибор с ионной ловушкой Finnigan LCQ. Индивидуальные пептиды идентифицируют на основе экспериментальных молекулярных масс. ПЭГ-пептидосодержащую фракцию также анализируют MALDI TOF-масс-спектрометрией на приборе Bruker Reflex. В качестве матриц используют транс-3-индолакриловую кислоту и -4-гидроксикоричную кислоту.
Затем фракцию, содержащую пэгилированный пептид, подвергают N-концевому секвенированию (по Эдману) на прецизионном приборе Perkin Elmer (ABI).
Результаты анализа протеолитических фрагментов пэгилированного Т 1249 с использованием ВЭЖХ с обращенной фазой показаны на фиг.1. Фиг.1 показывает УФ-кривую, полученную на основании анализа двух образцов с использованием ВЭЖХ с обращенной фазой. N-концевой пептид, наблюдаемый в контрольном Т 1249 (пик НТ-20 на фиг.1Б), почти полностью отсутствует в ПЭГ-модифицированном Т 1249 (фиг.1А). Вместо него появился новый пик (пик ПЭГ-34 на фиг.1А). Он содержит ПЭГ-модифицированный (модифицированные) пептид (пептиды).
Результаты масс-спектрометрии, полученные на основании анализа индивидуальных ВЭЖХ-фракций, суммированы в табл.4. Все экспериментальные молекулярные массы немодифицированных пептидов сравнимы с таковыми, полученными путем расчета.
Таблица 4. Результаты анализов отобранных ВЭЖХ-фракций (см. также фиг.1). | |||||
ВЭЖХ-пик1 | ММ (вычисл.) 2 Да | MM (экспер.) 3 Да | N-концевая последовательность 4 | Идентификация пептида 5 | SeqID |
ПЭГ-17 | 922,4 | 922,4 | Н.Д. | NEYELQK | Seq ID:2 |
ПЭГ-22 | 1611,9 | 1611,7 | Н.Д. | ITALLEQAQIQQEK | Seq ID:3 |
ПЭГ-34 | Н.Д. | 23082,6 | XQEWEQK | PEG-WQEWEQK | Seq ID:4 |
ПЭГ-37 | 1122,5 | 1122,4 | Н.Д. | WASLWEWF-NH2 | Seq ID:5 |
НТ-17 | 922,4 | 922,4 | Н.Д. | NEYELQK | Seq ID:2 |
НТ-20 | 1032,5 | 1032,4 | Н.Д. | WQEWEQK | Seq |
ID:4 | |||||
НТ-22 | 1611,9 | 1611,7 | Н.Д. | ITALLEQAQIQQEK | Seq ID:3 |
НТ-37 | 1122,5 | 1122,4 | Н.Д. | WASLWEWF-NH2 | Seq ID:5 |
1 - см. также фиг.1; 2 - полученное путем расчета точное значение массы в Да; 3 - измеренная масса в Да, наноспрей-ESI-MC немодифицированных пептитов и MALDI TOF-MC ПЭГ-модифицированных пептидов; 4 - автоматизированное секвенирование по Эдману, Н.Д. = нет данных, х = не идентифицирован; 5 - на основе ММ-сопоставимости и/или секвенирования по Эдману. Последовательность аминокислот немодифицированного образца Т1249: WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH 2. |
На фиг.2А показан MALDI TOF-масс-спектр интактного ПЭГ-модифицированного Т 1249. Измеренная молекулярная масса составляла 26758 Да. Фиксируется присутствие какого-то немодифицированного пептида. Его происхождение в настоящее время не известно, однако потенциально его возникновение может быть вызвано самим измерением в масс-спектрометре. MALDI TOF-масс-спектр фракции ПЭГ-34 (фиг.1) показан на фиг.2Б. Измеренная молекулярная масса составляла 23083 Да. На основании молекулярной массы, а также характера масс-спектра эта ВЭЖХ-фракция ПЭГ-34 идентифицируется как таковая, содержащая ПЭГ-модифицированный(ые) пептид(ы). Присутствие ПЭГ в этой ВЭЖХ-фракции также можно было бы показать наноспрей-ESI-масс-спектрометрией (данные не приведены).
Результаты автоматизированного N-концевого секвенирования (по Эдману) показаны на фиг.3. Наблюдаемая основная последовательность представляла собой N-концевой Lys-C пептид xQEWEQK. За исключением первого аминокислотного остатка все остальные аминокислоты были получены с достаточным выходом. Существенно то, что не удалось выделить триптофан в первом положении аминокислот (фиг.3, цикл 3). УФ-кривые ВЭЖХ, MALDI TOF-масс-спектр, а также результаты N-концевого секвенирования идентифицируют N-концевой триптофан как основной ПЭГ-модифицированный участок.
Представленные выше результаты согласуются с наличием связи между альдегидом полиэтиленгликоля и N-концевым триптофаном Т1249. Хотя нельзя полностью исключить присоединение непосредственно к боковой цепи триптофана, результаты N-концевого секвенирования, по-видимому, отрицают наличие «блокирующей» ПЭГ-части у N-концевой аминогруппы.
Пример 7
Пэгилирование Т 1249 мПЭГ10к -пропиональдегидом
Используют пропиональдегид ПЭГ 10кДа, имеющий следующую структуру:
200 мг мПЭГ10к-пропиональдегида добавляют к 2 мг Т1249 (93,7% чистого вещества) в 1,0 мл буфера (50 мМ фосфат калия, рН 6,5) в молярном отношении 5 моль реагента к одному моль Т1249. Полипептид Т1249 деацилируют по -аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH2. Пэгилированный Т1249 очищают от реакционной смеси с помощью ионообменной хроматографии (QA).
К реакционной смеси добавляют 10% (об./об.) 0,5 М раствора цианоборгидрида натрия в воде и перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре. Пэгилированный Т1249 очищают от реакционной смеси с помощью ионообменной хроматографии (QA). Пэгилированный Т1249 имеет следующую структуру:
Для разделения пэгилированного Т 1249 и немодифицированного Т 1249 используют линейный градиент с увеличивающимися концентрациями соли от 65 мМ до 1 М NaCl в 20 мМ Трис, рН 7,5. Затем с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой определяют процентное отношение монопэгилированного Т 1249 и непрореагировавшего свободного Т1249, и, как было установлено, оно составило 31,7%.
Пример 8
Анализы противовирусного действия с использованием cMAGI/MAGI
В этих исследованиях оценивают снижение инфекционного вирусного титра с использованием индикаторных клеточных линий MAGI (многоядерная активация галактозидазного индикатора) или производной, CCR5-экспрессирующей, cMAGI. Клеточная линия MAGI была выведена от родительских клеток HeLa путем введения генов CD4 и ВИЧ-1-LTR-управляемого репортера b-gal с использованием амфотропного ретровирусного вектора (J.Kimpton, М.Emerman в J.ViroL, 66, 1992, сс.2232-9). Клеточная линия cMAGI была выведена от клеточной линии MAGI путем введения гена CCR5, используя амфотропный ретровирусный вектор РАЗ 17 (В.Chackerian, Е.М.Long, P.A.Luciw, J.Overbaugh в J.Virol., 71, 1997, сс.3932-9). Клетки cMAGI поддерживают репликацию первичных изолятов NSI (R5) и адаптированных к лабораторным условиям вирусов Х4, в то время как клетки MAGI поддерживают репликацию только вирусов Х4. В обеих клеточных линиях используется способность tat ВИЧ-1 к трансактивации экспрессии гена-репортера b-галактозидазы, управляемого ВИЧ-LTR. Была проведена модификация репортера b-gal для того, чтобы локализовать его в ядре и дать возможность определять с использованием X-gal-субстрата по интенсивному ядерному окрашиванию в пределах нескольких дней после инфицирования. Количество окрашенных ядер можно, таким образом, интерпретировать как равное количеству инфекционных вирионов во вносимом инокулюме при условии, что перед окрашиванием имеет место только один цикл инфицирования.
Через 24 ч после инфицирования добавляют ингибитор инфицирования и межклеточного слияния, например, Т1249 (С.Wild, T.Greenwell, T.Matthews в AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 1993, cc.1051-3), чтобы дать возможность снятия показаний, доверительно представляющих единственный цикл инфицирования. Используя ПЗС-прибор для визуализации изображений, был проведен подсчет инфицированных клеток, и оба, первичный и адаптированный к лабораторным условиям, изолята показали линейное соотношение между количеством вводимых вирусов и количеством инфицированных клеток, визуализированных с помощью прибора. В анализах с использованием MAGI и cMAGI значимым является 50% снижение инфекционного титра (Vn/Vo=0.5), которое служит первичным предельным значением оценки антивирусной активности. 90% снижение инфекционного титра (Vn/V o) используют как дополнительное предельное значение оценки антивирусной активности.
Разведение каждого из тест-соединений испытывают в двух повторностях в отношении вирусного инокулята с титром приблизительно 1500-2000 инфекционных клеток на лунку в 48-луночных планшетах для микротитрования. К клеткам cMAGI или MAGI добавляют тест-соединения, затем вносят вирусный инокулят и спустя 24 ч добавляют ингибитор инфицирования и межклеточного слияния (С.Wild, T.Greenwell, T.Matthews, AIDS Res.Hum.Retroviruses, 9, 1993, cc.1051-1053) для предотвращения вторичных циклов инфицирования и распространения вируса от клетки к клетке. С целью определения инфицированных клеток клетки культивируют более 2 суток, фиксируют и окрашивают с помощью X-gal-субстрата. Количество инфицированных клеток для каждого разведения контрольного и тест-соединения устанавливают с помощью ПЗС-прибора для визуализации изображений. IC50 определяют как разведение тест-соединения, вызывающее 50% снижение инфекционного вирусного титра. IC90 определяют как разведение, приводящее к 90% снижению инфекционного титра.
Пример 9.
IC50/IC90 пэгилированного Т 1249
Результаты исследований IC50 и IC90 Т 1249 и пэгилированного мПЭГ20г -бутаноальдегидом Т 1249 (пример 4), обозначаемого здесь и в последующем описании как «мПЭГ20к-СМАВ-Т1249», представлены ниже в табл.5. Значения IC50 и IC90 устанавливают в соответствии с примером 8.
Таблица 5. Результаты исследований IC50 и IC90 | ||
Пептид | IC50 (мг/мл) | IC90 (мг/мл) |
Т1249 | 0,003 | 0,023 |
мПЭГ20к -СМАВ-Т1249 | 0,041 (партия 1) | 0,206 (партия 1) |
0,170 (партия 2) | 0,835 (партия 2) |
В случае мПЭГ20к-СМАВ-Т1249 наблюдалось уменьшение противовирусной активности in vitro по сравнению с исходной молекулой Т1249 (IC50, 13,7-кратное и IC90, 9-кратное для партии 1). Однако, как показывают результаты, представленные в примере 12 (см. фиг.6), эта потеря активности in vitro не предопределяет уменьшение биологической активности in vivo.
Пример 10
Фармакокинетика пэгилированного мПЭГ20к -пропиональдегидом Т 1249
Схема исследования
9 самцов крыс Wistar (Charles River Laboratories, Уилмингтон, Делавэр) (n=3/момент времени) получают однократную подкожную дозу Т 1249, пэгилированного мПЭГ20к-пропиональдегидом (пример 4).
мПЭГ20к-СМАВ-Т1249 суспендируют в воде и, добавляя NaOH, доводят рН до 6,8. Затем суспензию мПЭГ 20к-СМАВ-Т1249 растворяют в минимальном объеме карбонатно-натриевого буфера и разбавляют ФСБ-буфером до рН 7,3 - 7,4. Количество используемого ПЭГ - Т 1249 должно быть достаточным, чтобы обеспечить конечную концентрацию 150 мг/мл мПЭГ20к-СМАВ-Т1249. Крысам вводят по 8 мг действующего вещества/кг веса. После введения дозы в каждый момент времени из ретроорбитального синуса отбирают около 1 мл крови. Моменты времени составляют 0,5, 1, 3, 6, 8, 16, 24, 32, 48, 72 и 96 ч после введения. Все образцы крови выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре и проводят отделение сыворотки путем центрифугирования с охлаждением.
Биоаналитический метод
Все образцы крови разделяют на колонке С 18 ВЭЖХ с обращенной фазой с применением линейного градиента, состоящего из 0,05 М ацетата аммония и ацетонитрила. Поглощение наблюдают при 280 нм. Концентрации экстраполируют на основании графика (область под кривой v. [мПЭГ20к-СМАВ-Т1249]), используя пики мПЭГ20к-СМАВ-Т1249 сывороточных экстрактов в качестве калибровочных стандартов.
Описанные фармакокинетические параметры выведены на основании объединенных показателей концентраций в сыворотке мПЭГ20к -СМАВ-Т1249, его метаболита, и их комбинации с применением некомпартментного анализа посредством WinNonlin версии 3.3 (Pharsight Corporation, Mountain View, Калифорния), коммерческого комплекта программного обеспечения для кинетического анализа.
Результаты
Фиг.4 показывает зависимость концентрация-время мПЭГ 20к-СМАВ-Т1249 у крыс после подкожного введения однократной дозы. В момент времени 0,5 ч отмечен неопределяемый уровень мПЭГ 20к-СМАВ-Т1249 или метаболита, указывая на медленный процесс всасывания из участка инъекции. Для метаболита начальная определяемая концентрация обнаружена через 6 ч после введения дозы, что указывает на медленный процесс образования метаболита. Наиболее низкие сывороточные концентрации мПЭГ20к-СМАВ-Т1249 и его метаболита обнаружены через 48 и 72 ч после введения дозы соответственно.
Системные Cl/F и Vd /F, AUC (0-48 ч или 0-72 ч). Смакс, Т макс, и полупериод представлены в табл.6 ниже.
Таблица 6. Фармакокинетические параметры мПЭГ20к-СМАВ-Т1249 у крыс. | ||||
Параметр | мПЭГ 20к-СМАВ- | мПЭГ 20к-СМАВ- | Исходное | |
(единица) | Т1249 | Т1249-Метаболит | соединение и метаболит | |
AUC (мкг ч/мл) | 279а | 508 б | 766б | |
Смакс (мкг/мл) | 14,8 | 13,9 | 27,2 | |
T1/2 конечн. (ч) | 8,9 | 15,7 | 13,8 | |
Cl/F (мл/ч/кг) | 27,4 | 14,6 | 10,0 | |
V d/F (мл/кг) | 353 | 330 | 199 | |
Т макс (ч) | 16 | 24 | 16 | |
aAUC0-48ч; бAUC0-72ч |
Пример 11
Фармакокинетика Т1249
Схема исследования
Каждая опытная группа состоит из 9 крыс Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Уилмингтон, штат Делавэр) одного пола. Каждый член группы получает однократную подкожную или внутривенную дозу Т 1249 (партия 2, упоминаемая в примере 9/табл.5). Крысам вводят либо 1,2, либо 15 мг действующего вещества/кг веса.
У тест-животных в течение двенадцатичасового периода времени отбирают образцы крови, у трех крыс одного пола на группу в каждый момент времени. Моменты времени составляют 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 и 12 ч после введения дозы.
Биоаналитический метод
Образцы крови исследуют, используя ECLIA-анализ PcAb к Т1249. ECLIA PcAb к Т 1249 представляет собой бесконкурентный двухстадийный иммуноанализ, в котором используются два различных препарата кроличьих PcAb, специфических к Т1249. В этом анализе определение Т1249 проводят путем предварительного инкубирования разбавленного тест-образца в пробирке, в которой также содержится антитело, меченное биотином (препарат А), и антитело, меченное рутением (препарат В). После этого в пробирку добавляют покрытые стрептавидином магнитные бусины, для того чтобы захватить сформировавшиеся антитело-пептит-антитело иммунные комплексы (сэндвичи). Затем смесь прокачивают через проточную кювету в анализаторе, после чего к магниту, смежному с проточной кюветой, применяют электрический ток. Благодаря циклическим окислительно-восстановительным реакциям между ионами металла рутения, которые конъюгированы с индикаторными антитетелами, и ионами трипропиламина, которые в избытке присутствуют в аналитическом буфере, возникает световое излучение. Эта световая энергия является измеряемым опорным показателем. Образец, содержащий ощутимое количество Т 1249, дает более высокий сигнал по сравнению с образцом, содержащим маленькое количество или не содежащим Т 1249.
Результаты
Фиг.5 показывает зависимость концентрация-время Т 1249 у крыс после подкожного или внутривенного введения однократной дозы.
В табл.7 ниже представлены Тмакс период полувыведения, AUC (0-12 ч и 0- ч), и Смакс.
Таблица 7. Фармакокинетические параметры Т 1249 у крыс. | ||||
Параметр (единица) | 1,2 мг/кг(ПК) | Группы 15 мг/кг(ПК) | Доз 1,5 мг/кг(ВВ) | 5,0 мг/кг (ВВ) |
Т1/2 конечн (ч) | 2,02 | 2,00 | 2,46 | 1,86 |
Tмакс(ч) | 1,09 | 1,88 | - | - |
С макс (мкг/мл) | 6,37 | 21,5 | 15,7 | 46,3 |
AUC(0-12ч) (мкг ч/мл) | 27,0 | 107 | 45,6 | 118 |
AUC(0- | 27,6 | 110 | 47,1 | 120 |
На основании фармакокинетических данных мПЭГ 20к-СМАВ-Т1249 (табл.6) и результатов подкожного введения дозы 15 мг/кг Т1249 (табл.7) видно, что мПЭГ20к -СМАВ-Т1249 проявляет 4,5-кратное увеличение конечного периода полувыведения. Более высокое значение Тмакс отражает более медленный клиренс мПЭГ20к -СМАВ-Т1249 по сравнению с Т1249 при близких значениях С макс. Кроме того, если данные, представленные в табл.7, нормализовать с учетом различий в дозе (15 мг/кг нормализовать к 8 мг/кг в примере 10), наблюдается пятикратное увеличение значения AUC для мПЭГ20к-СМАВ-Т1249 по сравнению с таковым для Т 1249 (57,1 мкг ч/мл (нормализованные) для Т 1249 против 279 мкг ч/мл для мПЭГ20к-СМАВ-Т1249).
Пример 12
Влияние Т 1249 и мПЭГ20к -СМАВ-Т1249 на ВИЧ-1-вирусную нагрузку у мышей
Используют по 9 мышей HuPBMC-SCID на экспериментальную группу (за исключением ПЭГ-контроля, в котором используют 6 мышей). В 0 сутки каждую экспериментальную группу обрабатывают вечером после инфицирования ВИЧ-штаммом. После этого с 1 по 6 сутки каждую экспериментальную группу обрабатывают 2 раза в сутки (утром и вечером). На 7 сутки мышей забивают. Подробные описания дозирования см. в табл.8. Образцы плазмы для анализа Т1249 отбирают приблизительно спустя 14 ч после введения последней дозы.
ВИЧ-1 в плазме определяют с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для определения количества соединения Т1249 получают плазму. Затем проводят анализ смеси в замороженных образцах плазмы.
Фиг.6 показывает влияние дозирования Т 1249 и мПЭГ20к-СМАВ-Т1249 на количество вирусов ВИЧ-1 у мышей SCID.
Т1249 и мПЭГ 20к-СМАВ-Т1249 проявляют одинаковую активность in vivo. Результаты не показывают заметных различий в активности подавления вируса in vivo, при пересчете на концентрацию испытываемого соединения в плазме.
Представленные выше результаты показывают преимущества настоящего изобретения, равноценную биологическую активность мПЭГ20к-СМАВ-Т1249 и Т1249 in vivo при равных концентрациях в плазме (пример 12), и гораздо лучшие фармакокинетические показатели мПЭГ20к-СМАВ-Т1249, что видно при сравнении примеров 10 и 11.
При подобном описании изобретения становится очевидным, что одно и то же можно варьировать во многих отношениях. Такие вариации не должны расцениваться как отступление за пределы существа и объема изобретения и все подобные модификации предполагается включить в рамках следующих пунктов патентной формулы.
Класс A61K38/16 пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные
Класс A61P31/18 против вируса иммунодефицита