рекомбинантный плацентарный фактор роста и способ его получения

Формула изобретения

1. Способ получения рекомбинантного белка плацентарного фактора роста (PLGF) в активной форме путем экспрессии белка PLGF в индуцибельной системе экспрессии в модифицированных прокариотических клетках, предусматривающий следующие стадии:

I) культивирование прокариотических клеток до достижения оптической плотности культуральной среды от 14 до 50 при 600 нм (OD⁶⁰⁰ 14-50); затем индукция экспрессии;

II) экстракция телец включения путем лизиса клеток культуры, разрушение ДНК, выделение и очистка телец включения;

III) ренатурация экспрессированного белка PLGF, по меньшей мере, частично в димерной форме путем солюбилизации телец включения в денатурирующем буфере;

IV) обогащение смеси со стадии III димерной и мультимерной формой экспрессированного белка путем анионообменной хроматографии солюбилизированного белка;

V) дальнейшее отделение и окончательное выделение димерной формы экспрессированного белка путем обращенно-фазовой хроматографии с первой стадией элюции возрастающим градиентом органического растворителя в водно-органическом растворе до появления пика элюции, соответствующего мономерной форме белка, с последующей стадией элюцией при изократических условиях до истощения пика элюции мономерной формы и со второй стадией элюции дополнительным возрастающим градиентом органического растворителя в водно-органическом растворе до достижения полной элюции белка преимущественно в димерной форме.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что плацентарный фактор роста (PLGF) является PLGF-1 человека или животного.

3. Способ по п.1 или 2, характеризующийся тем, что прокариотические клетки являются бактериальными клетками.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию I проводят в среде, позволяющей получать высокую плотность бактерий на ферментационной стадии и не содержащей никакого материала животного или человеческого происхождения.

5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что стадию I проводят в среде, содержащей один или более селективных агентов, дрожжевой экстракт, глицерин и соли аммония.

6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что индуцибельной системой экспрессии является система экспрессии Т7.

7. Способ по п.3, характеризующийся тем, что бактериальные клетки являются штаммом, происходящим из Е. coli.

8. Способ по п.7, характеризующийся тем, что бактериальный штамм является штаммом Е. coli {BL21(DE3)pLysS}.

9. Способ по п.6, характеризующийся тем, что экспрессию индуцируют с использованием лактозы, изопропил- -D-тиогалактопиранозида (IPTG) или функционально эквивалентных аналогов.

10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что оптическая плотность культуры в момент индукции равна 14-30 OD при 600 нм (14-30 OD⁶⁰⁰), предпочтительно 16-20 (16-20 OD⁶⁰⁰).

11. Способ по п.1, характеризующийся тем, что стадия I предусматривает предварительную стадию прединокуляции.

12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии II лизис клеток осуществляют посредством замораживания/оттаивания с использованием пресса Френча или других эквивалентных способов.

13. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии II разрушение ДНК проводят с использованием ДНКазы, полученной экстрагированием или рекомбинантного происхождения, предпочтительно бензоназы, или химико-механическим воздействием.

14. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии II разрушение ДНК проводят с использованием миксера.

15. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии II тельца включения выделяют с использованием, по меньшей мере, двух циклов центрифугирования и промывания в подходящем буфере.

16. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии III тельца включения солюбилизируют в денатурирующем буфере, содержащем мочевину, изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина или любой другой денатурирующий агент, и при необходимости гомогенизируют или обрабатывают ультразвуком.

17. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии III после солюбилизации телец включения раствор разбавляют и белковый материал ренатурируют добавлением к этому раствору окислительных/восстановительных агентов и инкубированием в течение 10-30 ч, предпочтительно 18-20 ч, при температуре 10-30°C, предпочтительно 20°С, при перемешивании.

18. Способ по п.17, характеризующийся тем, что раствор разбавляют до получения оптической плотности при 280 нм (OD²⁸⁰) от 0,01 до 2, предпочтительно 0,5; тем, что окислительными/восстановительными агентами являются восстановленный глутатион и окисленный глутатион в таких соотношениях и концентрациях, которые делают возможным максимальное образование димерной формы.

19. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии IV раствор, полученный на предыдущей стадии, наносят на анионообменную колонку при соотношении нанесенный объем/объем колонки 1:1-10:1.

20. Способ по п.19, характеризующийся тем, что соотношение нанесенный объем/объем колонки равно 10:1.

21. Способ по п.19, характеризующийся тем, что белок элюируют буфером этаноламин-HCl с NaCl и что белок в мономерной форме содержится в основном во фракциях, содержащих материал, не связанный со смолой, тогда как этот белок в димерной форме содержится в основном в последующих фракциях, элюируемых при концентрации NaCl 150-250 мМ.

22. Способ по п.21, характеризующийся тем, что на стадии V раствор, элюированный на предыдущей стадии при концентрации NaCl 150-250 нМ, разбавляют и наносят на обращенно-фазовую хроматографическую колонку в количестве, соответствующем оптической плотности 4,4-5,5 OD при 280 нм на 1 мл смолы.

23. Способ по п.22, характеризующийся тем, что буфер для элюции содержит этанол, метанол или ацетонитрил.

24. Способ по п.22, характеризующийся тем, что буфер для элюции является водно-спиртовым раствором, содержащим увеличивающееся процентное количество этанола.

25. Способ по п.22, характеризующийся тем, что обращенно-фазовую хроматографию проводят на смоле, имеющей частицы со средним диаметром 30 мкм.

26. Способ по п.1, предусматривающий дополнительную стадию ультрафильтрации с последующей лиофилизацией в присутствии или в отсутствие подходящих добавок.

27. Плацентарный фактор роста в активной форме, получаемый при помощи способа по любому из пп.1-26, характеризующийся тем, что он является очищенным, и что он находится преимущественно в димерной форме, и что он находится в мономерной форме, составляющей не более 1,5%.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способу экстракции и очистки рекомбинантного плацентарного фактора роста из генетически модифицированных клеток.

Уровень техники

Плацентарный фактор роста (PLGF) является гомодимерным гликопротеином со структурой, сходной со структурой фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Полная полинуклеотидная последовательность, кодирующая белок PLGF, была описана Maglione and Persico в патенте ЕР-В-550519 (WO-A-92/06194), притязающем на приоритет по итальянской заявке от 27.09.1990 года. Альтернативные процессы сплайсинга РНК PLGF дают три гомологичные формы плацентарного фактора роста, а именно PLGF-1, PLGF-2 и PLGF-3, имеющие различные полипептидные последовательности, и все они описаны в литературе.

Вышеуказанный патент описывает также способ получения фактора PLGF, предусматривающий использование индуцибельной прокариотической системы экспрессии, характеризующейся клетками-хозяевами, модифицированными экспрессирующим вектором, в который встроен ген PLGF человека под контролем индуцибельного (прямо или опосредованно) промотора. После индукции экспрессии PLGF подходящим активатором эти клетки инкубируют, выделяют и подвергают лизису.

Полученный таким образом неочищенный лизат является сложной смесью белков, содержащей низкие количества экспрессированного белка PLGF и имеющей низкую удельную активность. Действительно, в известном способе, экспрессию этого белка индуцируют в культурах, содержащих низкую плотность клеток, как это очевидно из низкой оптической плотности в момент индукции, которая находится между 0,2 и 0,6 OD при 600 нм. Кроме того, способ, описанный в предыдущем документе, не содержит дополнительных стадий очистки экспрессированного белка. По этой причине лизаты, полученные в соответствии с заявкой WO-A-92/06194, являются непригодными, как таковые, для прямого использования в получении лекарственных средств.

Более сложный способ очистки того же самого плацентарного фактора рассматривается Maglione et al. in "Il Farmaco" 55 (2000), pages 165-167. Однако описание способа дает только простое перечисление известных применимых способов без описания их условий и экспериментальных деталей, которые являются существенными для получения белка PLGF с чистотой и в количестве, необходимых для фармацевтического применения.

Целью данного изобретения является обеспечение нового способа экстракции и очистки рекомбинантного PLGF, экспрессируемого в бактериальных клетках, позволяющего получать PLGF высокого уровня чистоты и с выходами, подходящими для промышленного применения в получении лекарственных средств.

Следующей целью данного изобретения является получение белка PLGF по существу в активной форме (с чистотой, большей, чем 98,5%), то есть, состоящего из димерных (не менее чем на 70%) и мультимерных форм и содержащего остаточное количество мономерной формы (малоактивной или неактивной) в количестве, не большем, чем 1,5%.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение основано на идентификации последовательности способов очистки, особенно подходящих для экстракции и очистки PLGF человека, экспрессируемого в бактериальных клетках. Данное изобретение дополнительно основано на определении оптимальных рабочих условий в отношении отдельных способов и в отношении химико-физических свойств вещества, которое должно быть очищено.

Затем, целью данного изобретения является способ экстракции и очистки рекомбинантного плацентарного фактора роста (PLGF), экспрессируемого с использованием индуцибельной прокариотической системы экспрессии, предусматривающей стадии: I) ферментации бактериальных клеток, II) экстракции и очистки телец включения, III) ренатурации экспрессированного белка, IV) ионообменной хроматографии, V) обращенно-фазовой хроматографии и, при необходимости, VI) конечные стадии ультрафильтрации, приготовления готовой формы и лиофилизации. Согласно этому способу, стадию ферментации (стадию I) осуществляют до получения высокой плотности бактерий в среде, как это показывает высокая оптическая плотность в данной среде, перед проведением стадии индукции. Стадия (II) предусматривает лизис бактерий, разрушение ДНК и выделение телец включения. Ренатурацию экспрессированного белка (стадия III) получают солюбилизацией телец включения в денатурирующем буфере и превращением, по меньшей мере, частично, экспрессированного белка в димерную форму. Наконец, в стадии (IV и (V) димерные и мультимерные формы экспрессированного белка отделяют от мономерной формы и выделяют в чистой форме, подлежащей последующей ультрафильтрации и лиофилизации в присутствии обычных добавок для лиофилизации и приготовления готовой формы.

Особой целью данного изобретения является вышеуказанный способ экстракции и очистки белка PLGF человеческого происхождения, но он по существу является также пригодным для PLGF-1 животного происхождения.

Заявленный способ выгодным образом позволяет получать высокие выходы экспрессированного белка, в 30-50 раз более высокие, чем выходы, получаемые в соответствии со способом, описанном в предшествующем уровне техники. Кроме того, заявляемый способ позволяет получать высокоочищенный белок с высокой удельной активностью и в по существу димерной форме.

Следующей целью данного изобретения является активный плацентарный фактор роста, получаемый с использованием способа данного изобретения, не содержащий какого-либо остаточного белка или другого бактериального загрязнителя и содержащий остатки мономерной формы в количестве, не более чем 1,5%.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: Эта фигура показывает результаты, полученные электрофорезом в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях, при мониторинге стадии I. Pre1 и Рre2 представляют прединдукционные контроли, приготовленные следующим образом. Незадолго перед индукцией берут приблизительно 0,064 единиц оптической плотности при 600 нм (OD600) и разбавляют в 5 раз водой. Из этого разведения берут 20 мкл, которые добавляют к 20 мкл восстанавливающего буфера и подвергают кипячению. 20 мкл этого последнего раствора наносят на гель для электрофореза в ДСН-ПААГ. Post1 и Post2 представляют пост-индукционные контроли, приготовленные, как описано выше. М обозначает смесь маркеров молекулярной массы. В пост-индукционных дорожках (Post1 и Post2) отмечена полоса непосредственно над маркером молекулярной массы 14,3, по существу отсутствующая в прединкубационных дорожках (Pre1 и Рre2), соответствующая белку PLGF-1, экспрессируемому и сегрегируемому в составе телец включения.

Фиг.2: Эта фигура показывает хроматограмму мониторинга анионообменной хроматографии на смоле Q-Sepharose Fast Flow. Х-ось показывает объем элюции (мл), у-ось показывает единицы оптической плотности (OD). Первый пик элюции, полученный элюцией при 20% буфера В (200 мМ NaCl), соответствует белку PLGF-1 в по существу димерной форме, но он содержит примеси и мономерную форму. Следующий пик, элюируемый при 100% буфера В (1М NaCl), содержит удаляемые примеси.

Фиг.3: Эта фигура показывает хроматограмму мониторинга первой стадии элюции при обращенно-фазовой хроматографии на смоле RP Source 30. Х-ось показывает объем элюции (мл), у-ось показывает единицы оптической плотности (OD). Первый относительно высокий пик соответствует различным примесям, которые не связываются со смолой. Второй пик элюции соответствует белку PLGF в мономерной форме, элюированному при изократических условиях (экспериментально обнаруживаемый при приблизительно 10-15% буфера В).

Фиг.4: Эта фигура показывает хроматограмму мониторинга второй стадии элюции при обращенно-фазовой хроматографии на смоле RP Source 30. Х-ось показывает объем элюции (мл), у-ось показывает единицы оптической плотности (OD). Пик элюции соответствует белку PLGF в димерной-мультимерной форме.

Фигура 5: Эта фигура показывает результаты, полученные при электрофорезе в ДСН-ПААГ, при конечном мониторинге всего процесса. Prerefol и Postrefol представляют контроли перед ренатурацией и после ренатурации экспрессированного белка (стадия III). QFF представляет пик, элюированный со смолы Q-Sepharose Fast Flow, содержащий этот белок в основном в димерной форме. Mon представляет пик, соответствующий мономерной форме. Dim представляет пик, элюированный на второй подстадии обращенно-фазовой хроматографии на смоле RP Source 30. Обращается внимание на то, что перед ренатурацией экспрессируемый белок находится в основном в мономерной форме. После ренатурации часть белка находится в димерной форме. Последующая очистка при помощи хроматографии на QFF и RF 30 позволяет получить белок PLGF с высокой степенью чистоты.

Осуществление изобретения

Генетическая модификация бактериальных клеток-хозяев описана Maglione et al. в предыдущем патенте ЕР-В-0050519 (WO-A-92/06194). Для этой цели бактериальные клетки трансформируют введением экспрессирующего вектора, содержащего вставку, соответствующую гену человека, кодирующему фактор PLGF-1. Полная последовательность этого гена известна в литературе, и она является легко доступной. Плазмида, содержащая такую последовательность, депонирована в АТСС под инвентарным номером АТСС №40892. Экспрессию осуществляют под контролем системы РНК-полимеразы фага Т7 и ее индуцируют IPTG (изопропил- -D-тиогалактопиранозидом).

Тем не менее, могут быть использованы другие индуцируемые прокариотические системы экспрессии. Примеры таких систем, доступных в продаже, представлены ниже.

1) Системой экспрессии pBAD (In vitrogen BV), где синтез белка ставят под контроль промотора araBAD, и синтез может быть индуцирован в различных штаммах Е.coli арабинозой.

2) Системой экспрессии Т7 (In vitrogen BV или Promega), где синтез белка регулируется промотором РНК-полимеразы фага Т7 и синтез может быть индуцирован лактозой или ее аналогами (IPTG). В этом случае требуется использование производных Е.coli типа DE3 (B121(DE3) или JM109(DE3)), а именно содержащих копию гена РНК-полимеразы фага Т7, помещенной под контроль индуцируемого лактозой промотора.

3) Системой экспрессии trc (In vitrogen BV), где синтез белка помещают под контроль гибридного промотора trp. Такой промотор был получен слиянием промотора trp и промотора lac, и синтез может быть индуцирован в различных штаммах Е.coli лактозой или ее аналогами (IPTG).

4) Системой экспрессии tac (Amersham biosciences), где синтез белка помещают под контроль промотора tac. В этой системе синтез белка индуцируют в штаммах Е.coli lacIq (типа JM105) лактозой или ее аналогами (IPTG).

5) Системой экспрессии P _L, где синтез белка помещают под контроль промотора PL, и синтез может быть индуцирован добавлением триптофана. В этом случае требуется использование производных Е.coli (GI724), содержащих копию кодирующего гена для cI-репрессора фага лямбда, помещенного под контроль индуцируемого триптофаном промотора.

Стадия I: Ферментация и индукция

Первая стадия заявленного способа состоит в ферментации функционально-модифицированного бактериального штамма, эквивалентного штамму, описанному в предыдущем Европейском патенте (см. выше). В предпочтительном варианте этот микроорганизм является производным Escherichia coli, модифицированным экспрессионной плазмидой, содержащей ген PLGF человека. Предпочтительным является микроорганизм, названный [B12(DE3)pLysS PLGF-1], полученный интеграцией в коммерчески доступный штамм [B12(DE3)pLysS] (Promega Corporation USA) гена PLGF-1 человека. Однако данное изобретение не ограничивается фактором PLGF-1 человека, но относится также к фактору животного происхождения (обезьяны, мыши, кролика и т.д.). Данное изобретение не ограничивается также использованием производного Е.coli, a включает в себя использование любого прокариотического микроорганизма, восприимчивого к генетической модификации и способного экспрессировать гетерологичные белки в форме телец включения.

Штаммы, используемые в качестве инокулята в способе данного изобретения, хранят перед их использованием в лиофилизированной форме для сохранения их экспрессионной способности. При использовании этот лиофилизированный материал переводят опять в форму раствора с использованием подходящего буфера.

Хотя имеется большой диапазон культуральных сред, доступных на рынке, которые могут эффективно использоваться, стадию ферментации в соответствии с данным изобретением предпочтительно проводят в среде, не содержащей какого-либо материала животного или человеческого происхождения во избежание любого риска инфекции. Дрожжевые экстракты (Difco), добавляемые с одним или несколькими подходящими антибиотиками, представляют наиболее подходящее средство для этого способа. В предпочтительном варианте используют среду, которая была получена смешиванием в стерильных условиях первого раствора (А), содержащего дрожжевые экстракты, глицерин и сульфат аммония, со вторым раствором (В), содержащим фосфатный буфер. Затем эту смесь объединяют с ампициллином и хлорамфениколом или эквивалентными антибиотиками. Подходящие концентрации антибиотиков равны 50-300 мкг/мл ампициллина, предпочтительно 100-200 мкг/мл, и 10-100 мкг/мл хлорамфеникола, предпочтительно 30-40 мкг/мл.

Стадии ферментации может предшествовать стадия прединокулята, где лиофилизированный микроорганизм суспендируют в среде и подвергают последовательным стадиям инкубирования и разбавления, нацеленным на то, чтобы иметь в культуре оптимальное количество клеток микроорганизма. Предпочтительно, микроорганизм инкубируют в течение одной ночи при 37°С, затем разбавляют и снова инкубируют в течение нескольких часов. Затем выбранный объем прединокулята центрифугируют, суспендируют снова в культуральном растворе, обогащенном ампициллином, и инокулируют в ферментационный сосуд для стадии ферментации.

Ферментацию проводят в описанной выше среде, дополненной ампициллином и хлорамфениколом, при температуре, подходящей для данного микроорганизма, обычно при приблизительно 37°С, в присутствии процентного содержания растворенного O₂, относительно насыщения воздухом, от 20% до 40%, предпочтительно 30%. рН во время ферментации поддерживают при нейтральной или слабокислой величинах (6,4-7,4). Кроме того, поскольку процесс ферментации протекает при перемешивании, предпочтительно должны использоваться противовспенивающие средства (пеногасители).

Протекание ферментации сопровождается увеличением оптической плотности среды. По этой причине оптическая плотность является параметром, используемым в соответствии с данным изобретением для мониторинга степени протекания ферментации. Особенно подходящим является снятие показаний при 600 нм.

Существенным признаком данного изобретения является высокая плотность клеток, достигаемая в культуре в момент индукции экспрессии. Оптические плотности при 600 нм (OD600) 1-50 могут достигаться благодаря использованию культуральной среды данного изобретения. Однако предпочтительными являются плотности, более высокие, чем 18, для получения высоких уровней продуктивности, типичных для заявленного способа. Плотности между 16 и 20 являются особенно предпочтительными для индукции продуцирующего бактериального штамма и получения оптимальных результатов. Таким образом, ферментацию поддерживают при вышеуказанных условиях, пока не будут достигнуты такие величины оптической плотности, затем приступают к индукции экспрессии белка.

Любой агент или любое химико-физическое условие, способные индуцировать в клетках используемого микроорганизма аппарат экспрессии гетерологичного белка, могут быть использованы выгодным образом. В конкретном случае, когда используют бактериальный штамм BL21(DE3)pLysS, модифицированный экспрессионной плазмидой, содержащей промотор фага Т7, экспрессию индуцируют лактозой или ее производными, такими как изопропил- -тиогалактопиранозид (IPTG), в подходящей концентрации, а именно, приблизительно 1 мМ. Продолжительность индукции может варьироваться по необходимости. Хорошие результаты получают в течение периодов нескольких часов, предпочтительно 3-4 ч; в оптимальном процессе индукцию поддерживают в течение 3 ч и 20 мин с использованием процентного содержания растворенного О₂ приблизительно 10%.

Пробы клеток берут до и после индукции и подвергают аналитическим способам контроля, таким как электрофорез в ДСН-ПААГ, для определения результата индукции.

Когда экспрессия белка достигает желаемых уровней, культуру центрифугируют и клетки перемещают на следующую стадию.

Стадия II: Экстракция и очистка

Экспрессируемый гетерологичный белок в бактериальной клетке сегрегирует внутри самой клетки в форме телец включения. Таким образом, способ данного изобретения обеспечивает проведение лизиса этих клеток, разрушения экстрагированного материала нуклеиновых кислот (ДНК) и извлечения и промывания этих телец включения.

Клетки промывают, хотя это и не является обязательным, и суспендируют в растворах, содержащих эмульгирующие агенты в подходящей концентрации, предпочтительно Тритон Х100 в концентрациях 0,5-1%, затем их подвергают лизису клеточной мембраны. Процесс лизиса может осуществляться посредством замораживания/оттаивания, с использованием пресса Френча, обработки ультразвуком или других подобных известных способов. Однако предпочтительным способом для бактериального штамма BL21(DE3)pLysS является способ замораживания/оттаивания, который в наиболее предпочтительном варианте повторяют, по меньшей мере, в течение двух последовательных циклов. После механического лизиса стадию лизиса продолжают в течение нескольких минут в лизирующем растворе при комнатной температуре при перемешивании.

Высвобождение в среду для лизиса телец включения сопровождается высвобождением различных компонентов и клеточных веществ микроорганизма, прежде всего нуклеиновых материалов. Эти вещества могли бы мешать последующему процессу очистки белка или подвергнуть его риску. Таким образом, суспензию/раствор, полученные посредством лизиса, подвергают разрушению такого нуклеинового материала, в частности ДНК, с использованием ферментативных агентов, таких как ДНКаза (природная или рекомбинантная, такая как бензоназа), химических агентов, таких как дезоксихолевая кислота, или физико-механических агентов, таких как обработка ультразвуком или интенсивное перемешивание посредством лопастей (ножей), например, в миксере. Разрушение ДНК, проводимое, например, в миксере, проводят на лизированных клетках, ресуспендированных в подходящих объемах промывочных растворов, содержащих хелатообразователи и детергенты, например ЭДТА и Тритон X100. Предпочтительно, его повторяют в течение нескольких циклов, предпочтительно 2, чередующихся со стадиями разбавления в промывочном растворе, центрифугирования и отбрасывания супернатанта для удаления компонентов и клеточных веществ из фракции, содержащей тельца включения.

Стадия III: Ренатурация (повторная укладка) белка

Затем фракцию, содержащую очищенные тельца включения PLGF-1, солюбилизируют в денатурирующем буфере, содержащем известные денатурирующие агенты, такие как мочевина, изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина. Предпочтительно, раствор денатурирующего агента является раствором мочевины в денатурирующей концентрации, например, 8М. Для ускорения процесса солюбилизации эта фракция может быть подвергнута гомогенизации или обработке ультразвуком. После солюбилизации телец включения раствор разбавляют тем же самым денатурирующим буфером до получения оптической плотности, измеряемой при 280 нм, приблизительно 0,8 (OD280 0,8). Затем этот раствор дополнительно разбавляют буфером для разбавления до OD280 0,5. Подходящие растворы для разбавления содержат соли и полиэтиленгликоль (ПЭГ) и имеют щелочной рН (приблизительно 8). Ренатурацию белка PLGF-1 в разбавленном растворе получают добавлением к этому раствору подходящих концентраций окислительных/восстановительных пар с последующим инкубированием в течение 10-30 ч, предпочтительно 18-20 ч при температуре 10°С-30°С, предпочтительно 20°С, при перемешивании. Примерами таких пар являются: цистин/цистеин, цистамин/цистеамин, 2-гидроксиэтилдисульфид/2-меркаптоэтанол. Предпочтительным примером окислительной/восстановительной пары является глутатион в его окисленной и восстановленной формах, соответственно в концентрациях 0,1 мМ - 2,5 мМ (предпочтительно 0,5 мМ) и 0,25 мМ - 6,25 мМ (предпочтительно 1,25 мМ). Посредством ренатурации белок PLGF-1, экспрессируемый по существу в мономерной форме, частично переводится в димерную форму (фиг.5).

Стадия IV: анионообменная хроматография

Раствор, полученный на предыдущей стадии, предпочтительно прошедший центрифугирование и/или фильтрование и содержащий белок в основном в мономерной и частично димерной форме, наносят на анионообменную смолу для обогащения этой смеси димерной формой и для очистки его от бактериальных примесей. Любой коммерчески доступный носитель, пригодный для анионообменной хроматографии, может быть также использован в той мере, при какой его свойства емкости, нагрузки и скорости тока являются сходными с этими свойствами смолы Q Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences), не говоря уже о его пригодности для промышленного процесса. В предпочтительном варианте используют смолу с высокой скоростью тока, например, Q Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences) или ее эквивалент. Смолу промывают и уравновешивают растворами, имеющими низкую ионную силу. Пример такого раствора включает в себя этаноламин-HCl рН 8,5 с низким содержанием соли или без соли. Тот же самый раствор может быть использован для нанесения абсорбции и промывания белковой смеси, которая должна быть очищена. Применяемые смолы позволяют наносить большие объемы раствора белка с отношениями нанесенный объем/объем колонки, варьирующими от 1:1 до 10:1. Отношения об./об., близкие к 10:1, являются предпочтительными, так как они позволяют оптимизировать использование колонки. Однако следует избегать более высоких отношений, чем 10:1, так как, вследствие насыщения адсорбционной емкости этого матрикса, они приводят к большой потере димерной формы этого белка.

Тогда как белок PLGF-1 в мономерной форме уже фильтруется на стадиях промывания при низкой ионной силе, элюцию димерной и мультимерной форм получают увеличением ионной силы исходного раствора. Такое увеличение получают смешиванием уравновешивающего раствора с увеличивающимися и заранее определенными в процентах количествами второго раствора, содержащего 1М NaCl. В предпочтительном варианте белок в димерной форме элюируют растворами, содержащими 15-25% 1М раствора NaCl, что соответствует концентрации NaCl 150-250 мМ. В наилучшем варианте этот белок элюируют в изократических условиях при концентрации NaCl 200 мМ. Элюцию различных форм автоматически регистрируют путем измерения оптической плотности при 280 нм (фиг. 2). Затем собранные фракции, содержащие белок PLGF-1 в димерной форме, контролируют электрофорезом в ДСН-ПААГ (фиг.5). Предпочтительно, весь процесс хроматографии проводят автоматически с использованием компьютеризованной системы, работающей под контролем подходящей программы, например, Software FPCL Director system (Amersham biosciences).

Стадия V: Обращенно-фазовая хроматография

Фракции, полученные на предыдущей стадии, содержащие белок PLGF-1, обогащенный активными формами, собирают, разбавляют подходящим буфером и наносят на обращенно-фазовую хроматографическую колонку для дополнительной очистки этого белка в активной форме. Количество наносимого раствора соответствует OD280 4,5-5,5 на миллилитр хроматографического матрикса. Такие количества должны рассматриваться как максимальные количества.

Любой коммерчески доступный хроматографический матрикс, подходящий для предполагаемого применения, может быть использован в той мере, в которой его свойства адсорбционной емкости и скорости тока являются совместимыми с требованиями данного процесса. В предпочтительном варианте используют смолу, имеющую такие размеры гранул, которые гарантируют наилучшую эксплуатацию адсорбционной способности вместе с легкостью упаковки самой колонки. Примерами таких матриксов являются смолы RP Source 15 или RP Source 30 (Amersham biosciences). Все растворы для уравновешивания, нанесения, промывания смолы и элюции являются водно-органическими растворами, содержащими различные процентные количества органического растворителя. Примерами таких растворов являются растворы, содержащие этанол, метанол или ацетонитрил. Предпочтительно, используют водно-органические растворы, содержащие увеличивающиеся процентные количества этанола. В варианте данного изобретения смешивают подходящие количества двух буферных растворов, первый из которых содержит буфер А, т.е. 40% этанол и 0,1% ТФУ (трифторуксусную кислоту), а последний содержит буфер В, т.е. 70% этанол и 0,1% ТФУ.

Затем белковый материал, нанесенный на смолу и должным образом промытый, элюируют с использованием процесса элюции, включающего в себя две последовательные стадии, в которых используют элюирующие растворы, содержащие увеличивающийся градиент органического растворителя. Первую стадию выполняют в условиях возрастающего градиента органического растворителя до получения пика элюции мономерной формы. Такой градиент получают добавлением буфера В к буферу А в процентах от 4% до 40%, с увеличением доли буфера В на 3% на каждый элюированный колоночный объем. Как только появляется пик элюции, соответствующий мономерной форме белка, элюцию продолжают в изократических условиях до истощения пика элюции мономерной формы. Установленные таким образом изократические условия делают возможным наибольшее возможное разделение хроматографических пиков, соответствующих двум мономерной и димерной формам, и далее наилучшее получаемое разделение для процесса промышленного, а не аналитического типа. Вторую стадию проводят снова в условиях увеличивающегося градиента органического растворителя до полной элюции белка в основном в димерной форме. На этой второй стадии градиент получают добавлением буфера В к буферу А в процентном количестве от 10% до 100%, с увеличением доли буфера В на 40,9% на каждый элюированный колоночный объем. Элюцию различных форм белка PLGF-1 регистрируют автоматически путем измерения оптической плотности при 280 нм (фиг.3 и фиг.4). Затем собранные фракции, содержащие белок PLGF-1 в основном в димерной форме, контролируют электрофорезом в ДСН-ПААГ (фигура 5). Предпочтительно, весь процесс обращенно-фазовой хроматографии проводят автоматически с использованием компьютеризованной системы, работающей под контролем подходящей программы, например, Software FPCL Director system (Amersham biosciences).

Результаты электрофореза показывают, что белок PLGF-1, полученный на второй стадии обращенно-фазовой хроматографии, является высокоочищенной активной формой, а именно, он содержит белок в димерной и частично мультимерной форме, но по существу не содержит какого-либо загрязнения мономерной формой. Полученный таким образом продукт содержит не менее, чем 98,5%, активной формы, предпочтительно не менее, чем 99,5%, где не менее чем 70%, находится в димерной форме. Остаток мономерной формы составляет не более чем 1,5%. Этот белок в активной форме получают в средних количествах 160 мг на литр бактериальной культуры. Чистый белок, полученный в соответствии с описанным выше способом, может быть подвергнут дополнительным стадиям обработки, таким как ультрафильтрация на мембране. В этом случае продукт фильтруют на мембране, имеющей предел пропускания по молекулярной массе более низкий, чем 30 кДа, или равный 30 кДа, и его подвергают диафильтрации против подкисленной ТФУ воды до получения коэффициента разбавления 1:106. Полученный таким образом конечный продукт может быть должным образом составлен в смесь с добавками для лиофилизации и лиофилизирован для сохранения его наилучшей биологической активности.

Далее данное изобретение описывается с использованием примеров, имеющих, однако, только иллюстративные, а не ограничительные цели.

Пример 1: Ферментация

Следующая процедура относится к способу ферментации и индукции генетически модифицированного микроорганизма (MOGM) [B12(DE3)pLysS PLGF-1] в ферментационном сосуде с использованием 1 мМ IPTG.

Материалы:

Раствор SBM, содержащий:

Раствор А (на 1 л)

Бакто-дрожжевой экстракт (Difco)	34 г
Сульфат аммония	2,5 г
Глицерин	100 мл
H2O	q.s. до 900 мл

Раствор В (10 X) (на 100 мл)

КН2PO 4	1,7 г
К2HPO4-3Н 2O	20 г или
К2HPO4	15,26 г
Н2О	q.s. до 100 мл

Растворы А и В автоклавируют по отдельности и смешивают перед использованием в стерильных условиях. Альтернативно, растворы А и В смешивают и фильтруют в стерильных условиях.

200 мМ IPTG (200X) получают растворением 5 г чистого вещества в 100 мл дистиллированной воды. Раствор фильтруют с использованием фильтров 0,22 мкм, делят на аликвоты и замораживают при -20°С.

Используемым пеногасителем является Antifoam 0-10 (несиликоновый) фирмы Sigma, Cat A-8207.

Используемым бактериальным штаммом является [B12(DE3)pLysS PLGF-1 WCB] (working cell bank).

Прединокулят: Берут пробирку с лифилизированным генетически модифицированным микроорганизмом (MOGM) и суспендируют в 1 мл SBM +100 мкг/мл ампициллина +34 мкг/мл хлорамфеникола.

Эту суспензию разбавляют в 30 мл SBM +100 мкг/мл ампициллина +34 мкг/мл хлорамфеникола.

Суспензию инкубируют при 37°С в течение одной ночи (O/N). На следующий день 30 мл ночной (O/N) культуры разбавляют в 800 мл SBM +100 мкг/мл ампициллина +34 мкг/мл хлорамфеникола и этот объем разделяют на 4 колбы Эрленмейера на 1 л, причем каждая содержит 200 мл.

Содержимое каждой колбы инкубируют при 37°С в течение 24 ч. Содержимое 4 колб смешивают и снимают показатели OD600 после разбавления 1/20 в воде (50 мкл +950 мкл воды).

Затем установленный объем прединокулята центрифугируют в течение 10 минут при 7500×g при 4°С в стерильных пробирках.

Затем бактерии ресуспендируют в 20 мл SBM +200 мкг/мл ампициллина +10 мкг/мл хлорамфеникола на каждый литр ферментации путем перемешивания при 420 об/мин при комнатной температуре в течение 20 мин. Одновременно готовят ферментационный сосуд и калибруют кислородные датчики.

Кислородные датчики калибруют при температуре 37°С при 0% путем насыщения азотом, затем при 100% путем насыщения воздухом без пеногасителя при перемешивании при 600 об/мин.

Ферментацию проводят в следующих экспериментальных условиях:

Среда: SBM +200 мкг/мл ампициллина +10 мкг/мл хлорамфеникола

Температура: 37°С

% растворенного О₂: 30% (относительно насыщения воздухом)

рН: 6,4-7,4

Пеногаситель: разбавленный 1:10 в воде; сильное перемешивание перед его добавлением в количествах 140 мкл на 750 мл среды.

Индукция:

Индукцию проводят в следующих экспериментальных условиях:

OD600 индукции: 16-20.

Индуцирующий агент: IPTG в конечной концентрации 1 мМ.

% растворенного О₂: 10% (относительно насыщения воздухом).

Продолжительность индукции: 3 ч и 20 мин.

Непосредственно перед индукцией отбирают 20 мкл бактерий, добавляют в 80 мкл воды и хранят для контроля прединдукции.

В момент индукции добавляют IPTG до конечной концентрации 1 мМ.

Процентное содержание растворенного O ₂ доводят до 10%.

В конце индукции измеряют конечные показатели OD600 и измеряют общий объем.

Затем отбирают 10 мкл бактерий, добавляют в 90 мкл воды и хранят для постиндукционного контроля.

Индукцию контролируют при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ путем нанесения 20 мкл двух предварительно прокипяченных образцов.

Затем среду, содержащую индуцированные бактерии, центрифугируют при 7500×g в течение 10 мин или при 3000×g в течение 25 мин при 4°С и супернатант отбрасывают.

Результаты: Результаты индукции контролируют электрофорезом в ДСН-ПААГ, как показано на фиг.1.

Пример 2: Экстракция и очистка телец включения.

Следующая процедура относится к получению и повторной укладке (рефолдингу) телец включения PLGF-1. Посредством повторной укладки бактериальный белок PLGF-1 частично возвращают обратно в димерную форму.

Материал:

Миксер с подходящей емкостью.

Лизирующий раствор: 1 мМ MgSO₄+20 мМ Трис-HCl рН 8+1% Тритон X100.

Промывочный раствор: 0,5% Тритон X100+10 мМ ЭДТА рН 8.

BD (денатурирующий буфер): 8 М мочевина, 50 мМ Трис рН 8, 20 мМ этилендиамин.

Растворение и доведение до объема в Н₂О.

Окисленный глутатион 200х: 100 мМ в Н₂O.

Восстановленный глутатион 200х: 250 мМ в Н₂О.

Буфер для разбавления: 600 мкМ (конечная концентрация) ПЭГ 4000 (2,4 г/л), 50 мМ Трис-HCl рН 8, 20 мМ NaCl.

Пеногаситель: Antifoam O-10 (несиликоновый) фирмы Sigma.

Получение телец включения PLGF-1.

Лизирующий и промывочный растворы уравновешивают при комнатной температуре (RT).

Проводят два цикла замораживания/оттаивания при -80/37°С.

Осадок бактерий лизируют в 1 мл лизирующего раствора на каждые 450 OD600 бактерий.

Затем инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин при перемешивании (250 об/мин).

Этот раствор выливают в миксер с подходящей емкостью и добавляют количество промывочного раствора 3 мл на каждые добавленные 450 OD600 бактерий.

Если необходимо, добавляют 0,4 мкл неразбавленного пеногасителя на каждый миллилитр пробы.

Раствор перемешивают при максимальной скорости в течение 1 мин или до тех пор, пока проба не станет гомогенной.

Затем содержимое миксера переносят в контейнер с подходящей емкостью и добавляют 6,5 мл промывочного раствора на каждые 450 OD600 бактерий. Его инкубируют в течение 45 минут при комнатной температуре при перемешивании.

Полученную таким образом суспензию центрифугируют при 13000×g в течение 45 мин при 25°С и супернатант отбрасывают.

Осевший осадок ресуспендируют в 4 мл промывочного раствора на каждые 450 OD600 бактерий и цикл в миксере повторяют второй раз.

Эту суспензию переносят в контейнер с подходящей емкостью, разбавляют 6,5 мл промывочного раствора на каждые 450 OD600 и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при перемешивании.

Затем повторяют центрифугирование при указанных выше условиях и супернатант отбрасывают.

Пример 3: Ренатурация белка

Тельца включения солюбилизируют в 7 мл денатурирующего буфера BD (содержащего 8М мочевину) и дополнительно разбавляют BD до получения OD280 0,8. Затем добавляют 0,6 объема буфера для разбавления для доведения конечной концентрации мочевины до 5М.

После этого добавляют 1/200 объема восстановленного глутатиона 200х (конечная концентрация 1,25 мМ) и 1/200 объема окисленного глутатиона 200х (конечная концентрация 0,5 мМ). Отбирают образец объемом 15 мкл для контроля (Prerefol) и затем этот раствор инкубируют при 20°С в течение 18-20 ч при перемешивании.

В конце инкубирования среду центрифугируют в течение 10 минут при 20°С, 10000×g, фильтруют при помощи фильтров 0,45 или 0,8 мкм и отбирают пробу объемом 15 мкл для контроля (Postrefol).

Результаты: Пробы по 15 мкл растворов перед повторной укладкой и после повторной укладки анализируют электрофорезом в ДСН-ПААГ (фиг.5).

Пример 4: Анионообменная хроматография

Следующая процедура относится к первой стадии очистки белка PLGF-1 после повторной укладки. После нанесения пробы на колонку будет наблюдаться высокая потеря неадсорбированного мономера PLGF-1. Нанесенное количество не должно превышать 10 объемов этой колонки, так как это могло бы вызывать значительную потерю димера PLGF-1.

Элюцию проводят в изократических условиях при 20% буфера В (см. ниже), что соответствует концентрации NaCl 200 мМ. Элюированный пик все еще содержит глутатион, использованный для повторной укладки, который вносит приблизительно 50% OD280.

Материал и параметры:

Система FPLC (жидкостная экспресс-хроматография белков): применяемая от фирмы Amersham biosciences, управляемая программой, называемой FPLC Director.

Параметры регистрации:

УФ: Длина волны =280 нм; верхнее значение шкалы =2.

Температура: 20°С (минимум 15, максимум 25).

Смола: Q-Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences).

Объем колонки/высота колонки: Объем: 1/10 объема образца, который должен быть нанесен; высота: между 13 и 16 см.

Уравновешивание: 2 колоночных объема (КО) буфера В, затем 1,5 КО буфера А.

Образец: Ренатурированный, центрифугированный и/или отфильтрованный PLGF-1. Нанесение не более чем 10 КО.

Буфер А: 20 мМ этаноламин-HCl рН 8,5. Буфер В: Буфер А+1М NaCl.

Скорость нанесения: 1 см/мин (максимальная скорость, испытанная на малых колонках =1,887 см/мин; минимальная испытанная скорость =0,5 см/мин).

Скорость элюции: 1 см/мин (максимальная скорость, испытанная на малых колонках =1,887 см/мин; минимальная испытанная скорость =0,5 см/мин).

Промывка после нанесения: 1,5 КО с 0% буфера В.

Собранный пик: Пик, элюированный при изократических условиях при 20% буфера В, сходящий приблизительно в 3 КО.

Конечная промывка: 2 КО при 100% В.

Процедура:

Пик, элюированный при изократических условиях при 20% буфера В, собирают, затем к нему добавляют 0,271 объема воды, 0,0045 объема ТФУ и 0,225 объема этанола. Таким путем проба разбавляется в 1,5 раза и содержит 15% этанол и 0,3% ТФУ. Добавление этих двух веществ облегчает связывание PLGF-1 с обращенно-фазовой колонкой (см. пример 5).

Результаты: Стадию хроматографии непрерывно контролируют путем регистрации оптической плотности при 280 нм, как показано на фиг.2.

Чистоту выделенного белкового материала анализируют с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ (фиг.5).

Пример 5: Обращенно-фазовая хроматография

Следующая процедура может быть проведена со смолой RP Source со средним диаметром частиц 15 микрон или 30 микрон. Однако смола RP Source 30 микрон, хотя и не приводит к какому-либо изменению в процессе очистки, делает возможным экономное сбережение самой смолы (приблизительно на 50%), большую легкость процедуры набивки колонки и более низкое противодавление.

Эта процедура относится ко второй фазе очистки белка PLGF-1 после пропускания его через смолу QFF. Во время нанесения пробы наблюдают высокую оптическую плотность, которая соответствует неадсорбируемому пику глутатиона, который не связывается с этой смолой. Эта процедура состоит из двух подстадий, причем первую, называемую RPCmon, используют для удаления большей части мономерного компонента PLGF-1, тогда как последнюю используют для элюции по существу димерного компонента этого белка, и ее называют RPCdim.

Первая подстадия (RPCmon)

Материал и параметры:

Система FPLC: от фирмы Amersham biosciences, управляемая программой, называемой FPLC Director.

Параметры регистрации:

УФ: Длина волны =280 нм; полная шкала =0,05.

Температура: 20°С (минимум 15, максимум 25).

Смола: Reverse Phase Source 30 (Amersham biosciences).

Объем колонки/высота колонки: Объем: 1/5-1/6 общего OD280 образца, который должен быть нанесен; высота: между 27 и 33 см.

Уравновешивание: 2 колоночных объема (КО) буфера В, затем 1,5 КО буфера А.

Образец: PLGF-1, полученный на предыдущей стадии (пример 4), разбавленный в 1,5 раза и содержащий 15% этанол и 0,3% ТФУ. Максимальное нанесение: 4,5-5,5 OD280 на мл смолы.

Буфер А: 40% этанол +0,1% ТФУ.

Буфер В: 70% этанол +0,1% ТФУ.

Скорость нанесения: 1,887 см/мин.

Скорость элюции: 1,887 см/мин.

Промывка после нанесения: 1,5 КО с 4% буфера В.

Пик мономеров: Градиент в пределах от 4 до 40% буфера В в 12 КО (3% буфера В/КО). Непосредственно после начала элюции пика, при достижении OD280 25% от полной шкалы, элюцию продолжают с использованием изократических условий с использованием концентрации буфера В, достигнутой в этот момент до завершения элюции этого пика (приблизительно 2,5-3,5 КО).

Операции

Берут подходящее количество раствора, соответствующего пику "мономера", и концентрируют для контроля (mon на фиг.5).

Вторая подстадия (RPCdim)

Материал и параметры:

Без повторного уравновешивания этой колонки, а с использованием простого изменения диапазона шкалы УФ-монитора до величины 2, пропускают градиент в пределах от 10 до 100% буфера В в 2,2 КО (40,9% буфера В/КО).

Операции:

Берут фракции, соответствующие пику "Dimer". Фиг.4 иллюстрирует этот пример. Фракции собирают и измеряют объем и оптическую плотность при 280 нм.

Общий выход (выраженный в мг), полученный перед лиофилизацией, рассчитывают умножением OD280 на объем и на разбавление. Средняя величина этого выхода равна 164 мг чистого PLGF-1 на литр бактериальной культуры со стандартным отклонением 23,21. Она может быть также выражена в мг на 1000 OD600 ферментированных бактерий, что дает 5,58 мг чистого PLGF-1 на каждые 1000 OD600 ферментированных бактерий со стандартным отклонением 0,8.

Полученный таким образом раствор димера хранят при -20°С до ультрадиафильтрации и лиофилизации. Образец такого раствора подвергают электрофорезу в ДСН-ПААГ, как показано на фиг.5.