способ ранней диагностики факта потребления наркотических веществ в отсутствие клинических признаков состояния зависимости от наркотиков

Формула изобретения

Способ ранней диагностики факта потребления наркотических веществ в отсутствие клинических признаков состояния зависимости от наркотиков с помощью определения наличия антител к производным метаболитов анализируемых наркотических веществ в сыворотке крови, включающий инкубацию анализируемой пробы с иммобилизованным на твердой фазе конъюгатом, в котором гаптен является производным метаболита анализируемого наркотического вещества, а макромолекулярный носитель выбран из ряда поли- или олигоакрилатов, овальбумина и лизоцима, при соотношении гаптен: макромолекулярный носитель в мол.% (3-12):1, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом, и выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотке крови, и установление факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробах, отличающийся тем, что инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека проводят в две стадии, сначала перемешивают со скоростью 50-70 об./мин в течение 30-40 мин, а затем выдерживают в «состоянии покоя» в течение 20-30 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности наркологии, и может найти применение в диагностике ранних стадиий употребления наркотических и психотропных веществ, относящихся к классам: опиаты, эфедрины, барбитураты, каннабиноиды, амфетамины, кокаин, бензодиазепины и др., в отсутствии клинических признаков состояния зависимости.

Известен способ диагностики факта потребления наркотических веществ - опиатов в сыворотке крови по определению содержания иммуноглобулинов класса М против морфина твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА), в котором образцы сыворотки больных и доноров инкубируют с конъюгатом гаптен: макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердую фазу. В качестве макромолекулярного носителя используют лизоцим, а в качестве гаптена - морфин, а конъюгированный антиген имеет соотношение гаптен:макромолекулярный носитель, равное (14:1). При увеличении показателя оптической плотности OD492 относительно нормы диагностируют факт злоупотребления опиатами. Однако недостатком указанного выше способа является то, что в нем отсутствует выявление антител класса G, а также недостаточный процент выявления лиц, злоупотребляющих опиатами (Гамалея Н.Б., Елагина Э.Н., Леви М.И., Паршин А.Н. Вопросы наркологии, 1991, №3, с.10-13).

Известен способ выявления антител против эфедрина в сыворотке крови больных эфедроновой наркоманией, основанный на использовании ИФА, в котором образцы сыворотки больных и доноров инкубируют с конъюгатом гаптен:макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердую фазу. В качестве макромолекулярного носителя используют бычий сывороточный альбумин, в качестве гаптена - модифицированную молекулу эфедрина, имеющую карбоксипропильный заместитель у атома азота в роли спейсера, формулы

а конъюгированный антиген имеет соотношение гаптен:макромолекулярный носитель, равное 12:1. Уровень специфических антител против эфедрина определяют с помощью антивидовых антител к иммуноглобулинам класса М и G человека, меченых ферментом (пероксидазой хрена), измеряя величину оптической плотности ОД492 и по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб, содержащих сыворотки крови с наличием и без наркотиков, и устанавливают факт потребления последних в случае, если определяемое значение ОД492 превышает сумму среднего значения ОД492 сывороток группы доноров и двух стандартных отклонений (Мягкова М.А., Лушникова М.В., Полевая О.Ю., Гамалея Н.Б. «Антитела к эфедрину у больных эфедроновой наркомании», Вопросы наркологии, 1991, №2, с.10-13).

Однако указанный выше способ приводит к ложноположительным результатам, что снижает процент выявления лиц, употребляющих наркотические вещества.

Известен, принятый за прототип, способ ранней диагностики факта потребления наркотических веществ в отсутствии клинических признаков состояния зависимости от наркотиков методом твердофазного иммуноферментного анализа определения наличия антител к производным метаболитов анализируемых наркотических веществ в сыворотки крови, включающий инкубацию анализируемой пробы с иммобилизованным на твердой фазе конъюгатом, в котором гаптен является производным метаболита анализируемого наркотического вещества, а макромолекулярный носитель выбран из ряда поли- или олигоакрилатов, овальбумина и лизоцима при соотношении гаптен:макромолекулярный носитель в мол.% (3-12):1, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченых ферментом, и выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотке крови, и установления факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе. При этом инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека поводят в одну стадию, выдерживая образовавшийся комплекс в течение 45 минут при температуре 37°С. (RU С1, МКИ G 01 N 33/547, №2250467, опуб. 2005.04.20). Однако процент выявления лиц, употребляющих наркотические вещества, не является удовлетворительным.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является дальнейшее совершенствование установления факта потребления наркотических веществ в отдаленные сроки при отсутствии следов метаболитов употребляемых наркотических веществ.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является повышение процента выявления лиц, употребляющих наркотические вещества.

Поставленную задачу решает способ ранней диагностики факта потребления наркотических веществ в отсутствии клинических признаков состояния зависимости от наркотиков методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью определения наличия антител к производным метаболитов анализируемых наркотических веществ в сыворотке крови, включающий инкубацию анализируемой пробы с иммобилизованным на твердой фазе конъюгатом, в котором гаптен является производным метаболита анализируемого наркотического вещества, а макромолекулярный носитель выбран из ряда поли- или олигоакрилатов, овальбумина и лизоцима, при соотношении гаптен:макромолекулярный носитель в мол.% (3-12):1, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченых ферментом, и выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотке крови, и установления факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе, в котором новым является то, что инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека проводят в две стадии, сначала перемешивают со скоростью 50-70 оборотов в минуту в течение 30-40 минут, а затем выдерживают в «состоянии покоя» в течение 20-30 минут.

В качестве гаптена могут быть использованы любые гаптены, являющиеся производными метаболитов определяемого наркотика как производные эфедрина, так и производные морфина.

Получение гаптена известно из прототипа. Конъюгаты гаптен:макромолекулярный носитель получают известными способами, также описанными в прототипе.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения и получением технического результата подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

Пример 1. Получение конъюгата эфедрон-овальбумин с соотношением гаптен:макромолекулярный носитель 3:1 (А).

В качестве исходного реагента для синтеза конъюгата А берут натриевую соль d,1-эфедрин-N-3-пропионовой кислоты, добавляют ее в количестве 2 мг при охлаждении и перемешивании к 15 мг овальбумина, растворенного в 5 мл дистиллированной воды, и 3 мг водорастворимого карбодиимида (КДИ). Смесь выдерживают 5 часов при 4°С. Полученный конъюгат выделяют гельхроматографией на сефадексе G-25. Количество молей эфедрина, связанных с одним молем белка-носителя, определяют с поиощью тринитробензолсульфокислоты по разнице свободных аминогрупп в исходном белке и полученном конъюгированном антигене. По данным УФ-спектров в конъюгате эфедрон-овальбумин содержится 3 моля эфедрона на 1 моль овальбумина.

Пример 2. ИФА выявление антител к производным эфедрина в сыворотке крови человека.

Предлагаемый способ осуществляют на 96 луночных полистирольных планшетах. На твердую фазу иммобилизируют конъюгат А, полученный в примере 1, для чего вносят в лунки по 100 мл его раствора в концентрации 5 мкг/мл в 0,2 М карбоматном буфере рН 9,5 и выдерживают 18 часов при 4°С Затем планшеты трижды отмывают забуференным физраствором (3ФР) рН 7,2, содержащим 0,05%-твин-20 и проводят инкубацию с анализируемыми образцами биологических сред, в качестве которой взята сыворотка крови, в разведении 1:200 в ЗФР, содержащим 0,1% твин-20. Процесс инкубации проводят сначала при перемешивании со скоростью 50 об/мин в течение 30 мин, при 37°С, а затем, выдерживая в состоянии покоя, в течение 20 минут. Затем отмывают, как описано выше. Далее в лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгатов антител против иммуноглобулинов класса М и G человека в разведении 1:2000 в 3ФР с 0,1%-твин-20, меченых ферментом (пероксидазой хрена). Затем проводят двухстадийную инкубацию полученного комплекса, как описано выше, отмывают его и дополняют лунки субстратной смесью, содержащей 0,4% O-фенилендиамин и 0,2% раствором перекиси водорода в 0,05 М фосфатно-цитратном буфере. Выдерживают 10-15 мин в темноте и останавливают ферментативную реакцию добавлением 50 мкл 10% серной кислоты. Измерение оптической плотности (ОД) проводят на спектрофотометре "Multiskan" при 492 нм. Уровень специфических антител выявляют по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков. Предлагаемый способ выявления антител против производных эфедрина был апробирован в сыворотках крови, 38 больных эфедроновой наркоманией. В качестве контроля использовали сыворотки 20 практически здоровых людей (доноров), 10 больных опиатной наркоманией и 10 больных алкоголизмом. Предварительно на основе статистического анализа было установлено, что достоверное увеличение уровня антител в группе эфедроновых наркоманов составляет в ИФА величину большую, чем сумма среднего значения оптической плотности (OD492) в контрольной группе и 2 стандартных отклонения.

В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антител наблюдалось как для иммуноглобулинов класса М человека (IgM), так и для иммуноглобулинов класса G (IgG) и составило по сравнению с контрольной группой 50% (19 чел., в способе-прототипе 15 чел) для IgG и 80% (30 человек в способе-прототипе 27 чел) для IgM.

В таблице приведены значения установления факта потребления наркотических веществ в % в зависимости от условий проведения инкубации образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса G человека (IgG).

Таблица.
Скорость перемешивания, об/мин	Время перемешивания	Время проведен второй стадии	% установления факта потребления наркотиков
50	20	20	40
50	30	10	39
40	30	20	41
50	30	20	50
70	40	30	52
80	40	30	42
70	50	30	41
70	40	40	40

Таким образом проведение стадии инкубации, образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека при заявляемых условиях позволяет повысить % установления факта потребления наркотиков в заявляемом способе примерно на 25%.

Пример 3. Получение конъюгата эфедрин-овальбумин с соотношением гаптен:макромолекулярный носитель 12:1 (Б)

В качестве исходного реагента для синтеза конъюгата Б используют натриевую соль d,l-эфедрин-N-3-пропионовой кислоты. Далее, как в примере 2, при содержании исходных реагентов: 5 мг натриевой соли d,l-эфедрин-N-3-пропионовой кислоты, 20 мг овальбумина, 8 мг водорастворимого карбодиимида (КДИ). По данным УФ-спектров в конъюгате эфедрин-овальбумин содержится 12 молей эфедрина на 1 моль овальбумина.

Пример 4. ИФА выявление антител к производным эфедрина.

То же, что в примере 2, только в качестве конъюгата был взят конъюгат Б, полученный в примере 3. В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антител наблюдалось как для иммуноглобулинов класса М человека (IgM), так и для иммуноглобулинов класса G (IgG) и составило по сравнению с контрольной группой 10% (4 чел., в способе-прототипе 3 чел.) для IgG и 63% (24 человек, в способе-прототипе 27 чел.) для IgM.

Пример 5. Получение конъюгата морфина с лизоцимом 6-M-Lys с соотношением гаптен-макромолекулярный носитель 6:1 (С).

То же, что в примере 1, только в качестве исходного соединения берут 15 мг лизоцима, 2 мг 3-(С(O)(СН ₂)С(O)N(Н)(СН₂)₆ NH₂)-морфина и 4 мг водорастворимого карбодиимида. В результате получают конъюгат морфина с лизоцимом с соотношением гаптен-макромолекулярный носитель 6:1.

Пример 6. ИФА выявление антител к производным опиатов с помощью конъюгата 6-M-Lys.

То же, что в примере 2, только в качестве конъюгата был взят конъюгат (С), полученный в примере 5. Процесс инкубации проводят сначала при перемешивании со скоростью 60 об/мин в течение 30 мин, при 37°С, а затем, выдерживая в состоянии покоя, в течение 20 минут. Было исследовано 30 образцов сывороток крови больных опиатной наркоманией и 22 образца сывороток доноров. В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антител наблюдалось в 24 образце и составило 80%.

Пример 7. Получение конъюгата 6-М-П с соотношением гаптен-макромолекулярный носитель 10:1 (D).

К раствору 6 мг поли (4-нитрофенил)акрилата (м.в. 40000) в 1,5 мл диметилформамида (ДМФ) добавляют 3,8 м г6-(3-(аминогексиламинокарбонил)-пропионат)морфин 6(С(O)(СН₂)₂С(O)]N(Н)(СН ₂)₆NH₂)-морфин и выдерживают реакционную смесь в течение суток при 20°С, а затем добавляют 200 мкл 25% аммиака. Растворитель упаривают в вакууме. Оставшееся масло многократно промывают эфиром, получают конъюгат 6-М-П, имеющий 15% замещение полимерной матрицы производным морфина со спейсером по 6-му положению молекулы морфина.

Контроль за степенью замещения полимерной матрицы производным морфина осуществляют спектрофотометрически по количеству образовавшегося в процессе реакции п-нитробензола.

Пример 8. Получение конъюгата 3-М-П с соотношением гаптен-макромолекулярный носитель 5:1 (Е).

То же, что в примере 7, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли-(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 40000) в 1 мл ДМФ и 2 мг 3-(СН₂С(O)N(Н)(СН ₂)₆NH₂)-морфина. Получаемый конъюгат 3-М-П имеет 10% замещение полимерной матрицы производным морфина со спейсером по 3-му положению молекулы морфина.

Пример 9. ИФА выявление антител к производным опиатов с использованием в качестве макромолекулярного носителя полиакрилатов.

То же, что в примере 2, только в качестве конъюгата были взяты конъюгаты 6-М-Р (D), полученный в примере 7 и конъюгат 3-М-Р (Е), полученный в примере 8. Процесс инкубации проводят сначала при перемешивании со скоростью 70 об/мин в течение 30 мин, при 37°С, а затем, выдерживая в состоянии покоя, в течение 30 минут. В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антиопиатных антител наблюдалось в 27 образцах (90%) при использовании 6-М-Р и в 29 образцах (свыше 90%) при использовании 3-М-Р.

Пример 10. Получение конъюгата 6-М-О с соотношением гаптен-макромолекулярный носитель 3:1 (F).

То же, что в примере 7, только в качестве исходного соединения берут 5 мг олиго(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 8000) в 2 мл ДМФ и 3 мг 6-(С(O)(СН₂)С(O)N(Н)(СН ₂)₆NH₂)-морфина. Получаемый конъюгат 6-М-О имеет 17% замещение полимерной матрицы производным морфина со спейсером по 6-му положению молекулы морфина.

Пример 11. Получение конъюгата 3-М-О с соотношением гаптен-макромолекулярный носитель 5:1 (G).

То же, что в примере 7, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг олиго-(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 8000) в 1 мл ДМФ и 2 мг 3-(СН₂С(O)N(Н)(СН ₂)₆NH₂)-морфина. Получаемый конъюгат 3-М-О имеет 10% замещение полимерной матрицы производным морфина со спейсером по 3-му положению молекулы морфина.

Пример 12. ИФА выявление антител к производным опиатов с использованием в качестве макромолекулярного носителя олигоакрилатов.

То же, что в примере 2, только в качестве конъюгата были взяты конъюгаты 6-М-О (F), полученный в примере 10, и конъюгат 3-М-О (G), полученный в примере 11. Процесс инкубации проводят сначала при перемешивании со скоростью 70 об/мин в течение 40 мин, при 37°С, а затем выдерживая в состоянии покоя в течение 30 минут. В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антиопиатных антител наблюдалось в 27 образцах (90%) при использовании 6-М-О и в 29 образцах (свыше 90%) при использовании 3-М-О.

Пример 13. Получение конъюгата амфетамина с лизоцимом с соотношением гаптен-макромолекулярный носитель 6:1 (Н).

Так же, как в примере 7, к 15 мг амфетамина сульфата и 20 мг лизоцима в 2 мл 0.1 м фосфатного буфера добавили 0.1 мл триэтиламина. К полученной смеси по каплям в течение 30-40 минут добавляли при перемешивании 1.0 мл глуторового альдегида. В результате получают конъюгат амфетамина с лизоцимом с соотношением гаптен-макромолекулярный носитель 6:1.

Пример 14. ИФА выявление антител к производным амфетамина.

То же, что в примере 2, используя сыворотку крови наркоманов, употребляющих амфетамин (20 человек) и сыворотку крови здоровых доноров (20 человек), а в качестве конъюгата, полученный в примере 13, - конъюгат (Н). Процесс инкубации проводят сначала при перемешивании со скоростью 50 об/мин в течение 40 мин при 37°С, а затем, выдерживая в состоянии покоя, в течение 30 минут. В результате в обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антител наблюдалось для иммуноглобулинов класса М человека (IgM) у 80% наркоманов, и для иммуноглобулинов класса G человека (IgG) у 65% наркоманов по сравнению с донорами.

Пример 15. ИФА выявление антител к производным бензодиазепина.

То же, что в примере 2, используя сыворотку крови наркоманов, употребляющих бензодиазепин (20 человек) и сыворотку крови здоровых доноров (20 человек), а в качестве конъюгата, полученный из 12 мг бензодиазепина и 25 мг овальбумина при соотношении последних 10:1. Процесс инкубации проводят сначала при перемешивании со скоростью 70 об/мин в течение 40 мин, при 37°С, а затем, выдерживая в состоянии покоя, в течение 30 минут. Процент выявления IgG и IgM в группе наркоманов составил 60% и 75% соответственно.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет с довольно высокой вероятностью устанавливать факт потребления различных классов наркотиков и психотропных веществ (опиатов, эфедринов, амфетаминов, бензодиазепинов и др.) по наличию антител к производным метаболитов анализируемых веществ, которые сохраняются в организме человека в течение длительного времени (2-4 месяца) после самого факта потребления, что является актуальным в современных условиях для выявления ранней стадии заболевания.