способ повышения оплодотворяющей способности спермы баранов

Формула изобретения

Способ повышения оплодотворяющей способности спермы баранов, включающий введение в среду для криоконсервации спермы барана биологически активного вещества (БАВ), отличающийся тем, что в качестве БАВ используют препарат ФЛПГ (комплекс синтетических аналогов простагландинов F₂ , Е, E₁, Е₂ ) депонированных в растительном масле, в концентрации 125 мкг на 1 мл разбавленной спермы баранов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении овец для улучшения их воспроизводительной функции - повышения суягности и многоплодия.

В настоящее время для искусственного осеменения овцематок используют свежевзятую (нативную), охлажденную или криоконсервированную сперму баранов. В последних двух случаях в процессе технологической обработки нативную сперму разбавляют криозащитными средами в 3-4 раза. Следовательно, содержание биологически активных компонентов, например, таких как простагландинов (ПГ), регулирующих процессы воспроизводства у самок, в одной спермадозе (0,2 мл) станет в 15-20 раз меньше, чем в одном эякуляте барана.

Всего обнаружено 20 видов простагландинов, из них 13 видов в семенной жидкости баранов (около 100 мкг/мл.)

Из вышеизложенного следует, что одной из причин более низкой эффективности искусственного осеменения овцематок криоконсервиро-ванной спермой является незначительное содержание простагландинов (5-6 мкг) в одной спермодозе. Это оказывает отрицательное влияние на продвижение сперматозоидов к месту оплодотворения.

Для повышения эффективности искусственного осеменения овцематок криоконсервированной спермой применяют препарат энзапрост-25 (4). Энзапрост-25 - синтетический лютеолитический препарат, аналог простагландина F₂ , в котором действующим началом является динопрост:

(в виде натриевой соли) 25,0 мг в 5 мл раствора (1). Препарат разрешен Главным ветеринарным управлением для применения в ветеринарной практике с целью индуцирования эструса и отела у коров (телок), для синхронизации эструса у овцематок, а также для индуцирования и синхронизации опоросов у свиноматок.

Однако энзапрост не может способствовать полной реализации воспроизводительной способности овцематок при осеменении их криоконсервированной спермой, так как содержит только один вид простагландина - F ₂ . Кроме того, действующее начало ПГ F ₂ быстро растворяется и выводится из организма животного.

Целью изобретения является повышение сохранности биологической полноценности сперматозоидов барана вне организма после ее разбавления, криоконсервации и дефростации, обеспечивающей повышение процента суягности и многоплодия овцематок при искусственном осеменении.

Цель достигается за счет обогащения синтетической среды биологически активным веществом пролонгированного действия, содержащем несколько видов простагландинов.

Сущность способа заключается в использовании биологически активного препарата ФЛПГ, содержащем в своем составе несколько видов синтетических аналогов простагландинов:

Преимущество настоящего изобретения, в сравнении с прототипом, состоит в том, что препарат ФЛПГ более эффективно повышает оплодотворяющую способность криоконсервированной спермы баранов и стимулирует воспроизводительную функцию овцематок. Вследствие того что предлагаемый препарат включает в себя не только один ПГF₂ , но и ПГЕ, ПГЕ₂ и их производные, он обладает более широким спектром физиологического воздействия не только на спермии, но также на организм овцематок, оказывая положительное влияние на продвижение яйцеклетки и спермиев к месту оплодотворения.

Способ осуществляется следующим образом. Для криоконсервации спермы использовали ГЖУК-трис-буферную среду с масляным раствором препарата ФЛПГ с расчетной активностью 125 мкг на 1 мл разбавленной спермы. Среду готовим согласно "Наставлению по применению ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы баранов-производителей" (3).

В чистую химическую колбу вносят согласно рецепту лактозу, декстрин, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, трилон-Б. Компоненты тчательно перемешивают и заливают прокипяченной дистиллированной водой (80-90°С) в необходимом объеме. Для растворения компонентов колбу плотно закрывают фольгой или полиэтиленовой пленкой, помещают в водяную баню и при температуре 100°С постоянно взбалтывают до полного растворения компонентов, далее стерилизуют кипячением в течение 30 мин. Затем раствор охлаждают до 40°С. Учитывая тот факт, что растительное (рафинированное) масло сильно эмульгирует, препарат ФЛПГ вводим не в готовую среду, а в желток (один из ее компонентов), который после тщательного перемешивания вводим в раствор. После его разбавления вводят санирующий препарат и глицерин, как указано в наставлении по применению ГЖУК-трис-буферной среды.

Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течение 4 часов с момента приготовления. Хранят при температуре 4°С, перед употреблением нагревают до 28-30°С. Оптимальная концентрация опытного препарата ФЛПГ в составе ГЖУК-трис-буферной среды была установлена в лабораторных опытах, проведенных во Всероссийском НИИ племенного дела. Научно-производственные опыты по изучению эффективности действия препарата ФЛПГ на оплодотворяющую способность криоконсервированной спермы были проведены в овцеводческом спецхозе "Страна Советов" Белгородского района, Белгородской области.

Пример 1. Сперму для исследований получали от баранов породы прекос с помощью искусственной вагины. После взятия каждого эякулята определяли его объем и ряд качественных показателей (активность спермиев в баллах, концентрацию в млрд/мл, общее количество сперматозоидов в эякуляте в млрд). Разбавление спермы проводили согласно наставления в 3-4 раза. В опытах использовали эякуляты, отвечавшие требованиям наставления.

Для изучения воздействия препарата ФЛПГ (комплекса простаглан-динов F ₂ , Е, E₁ и E ₂) на сохранение биологической полноценности сперматозоидов барана вне организма после ее криоконсервации были использованы следующие концентрации вещества: 250 мкг, 125 мкг и 60 мкг на 1 мл разбавленной спермы. Для получения таких концентраций в первой опытной группе к 0,25 мл нативной спермы добавляли 0,75 мл среды с 250 мкг препарата, во второй группе - к 0,25 мл спермы добавляли 0,75 мл среды с 125 мкг препарата, в третьей группе - к 0,25 мл спермы также добавляли 0,75 мл среды с 60 мкг препарата. Четвертая группа, используемая как прототип, содержала 0,25 мл спермы и 0,75 мл среды с 125 мкг ПГ F₂ (энзапрост). В контрольной группе нативную сперму барана разбавляли ГЖУК-трис-буферной средой без препаратов ПГ.

Разбавленную сперму баранов расфасовывали в пронумерованные флаконы и вместе с контрольным образцом подвергали эквилибрации (охлаждению) в течение 2-х часов при температуре 2-4°С. Далее сперму замораживали на фторопластовой пластине в парах жидкого азота, в лунках по 0,2 мл, по методике ВНИИплем (2). Для биологического контроля подопытные образцы замороженной спермы оттаивали в 3-процентном растворе цитрата натрия при 42°С, затем определяли подвижность сперматозоидов через каждый час до полной их гибели. Абсолютный показатель выживаемости (Sa сперматозоидов) в подопытных группах определяли при температуре инкубации 38°С. Опыты были проведены в трех повторностях.

Оптимальную концентрацию простагландинов в разбавленной сперме баранов определяли после ее дефростации по лучшим показателям подвижности и выживаемости сперматозоидов (табл.1).

Таблица 1 Влияние ФЛПГ на подвижность сперматозоидов после криоконсервации и дефростации спермы
№ опыта	Подвижность спермиев в баллах при концентрации ПГ
	ФЛПГ в мкг/мл (опыт)				Энзапрост (прототип)
	250	125	60	0 (контроль)	125
I	4,5±0,10	4,5±0,17	4,5±0,10	4,5±0,10	4,5±0,10
II	4,0±0,13	4,4±0,08	4,4±0,07	4,4±0,07	4,3±0,08
III	4,2±0,08	4,3±0,08	4,1±0,07	4,0±0,08	4,0±0,10
В средн.	4,2±0,15	4,4±0,06	4,3±0,12	4,3±0,15	4,2±0,12

Проведенные исследования показали, что при включении экзогенных простагландинов в состав среды активность спермиев изменилась незначительно. Более высокие результаты после дефростации криоконсервированной спермы были получены во второй группе, при содержании 125 мкг препарата ФЛПГ в 1 мл разбавленной спермы - подвижность 4,4 балла. Это выше на 2,3%, чем имели в контрольной группе, и на 4,8% выше аналогичного показателя прототипа.

Абсолютный показатель живучести спермиев в подопытных образцах дефростированной спермы показан в табл.2.

Таблица 2 Влияние ФЛПГ на живучесть сперматозоидов барана после дефростации
№опыта	Живучесть сперматозоидов (в усл. ед.) при концентрации ПГ
	ФЛПГ в мкг/мл (опыт)				Энзапрост(прототип)
	250	125	60	0(контроль)	125
1	14,3±2,10	24,7±0,58	12,6±2,06	15,4±1,92	16,0±2,03
II	17,2±2,15	19,6±1,94	18,9±1,04	18,8±2,40	19,2±1,70
III	18,3±1,58	14,4±1,47	21,1±1,50	17,4±1,83	17,6±1,60
В средн.	16,6±1,19	19,6±2,80	17,5±1,50	17,2±0,99	17,5±1,80

Из табл.2 следует, что при концентрации ФЛПГ 125 мкг/мл в среде живучесть сперматозоидов по сравнению с контролем была выше на 14%, а по сравнению с прототипом (125 мкг/мл энзапроста) - выше на 10%. Полученная разница в показателях живучести опытной и контрольных групп (14% и 10%) статистически достоверна в первом и втором случаях. При применении других концентраций препарата (250 мкг/мл и 60 мкг/мл) живучесть сперматозоидов опытных и контрольных групп существенно не разнились.

Таким образом, проведенные исследования показали, что комплекс простагландинов (F ₂ , Е, E₁, Е₂ ) в составе препарата ФЛПГ проявил себя в ГЖУК-трис-буферной среде лучше, чем энзапрост, оказывая положительное влияние на сохранение биологической полноценности сперматозоидов барана вне организма после криоконсервации и дефростации: по подвижности на 4,8%, а по абсолютному показателю живучести - на 14%.

Пример 2. Влияние ФЛПГ на процент суягности и многоплодия овцематок изучали в научно-производственном опыте только в концентрации 125 мкг/мл. Поводом для такого решения послужил тот факт, что при этой концентрации препарата в составе ГЖУК-трис-буферной среды были получены самые высокие показатели качества дефростированной спермы баранов. Это было идентифицировано как лучший способ повышения оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы баранов и многоплодия овцематок.

Результаты этих исследований представлены в табл.3.

Таблица 3 Влияние введения препарата ФЛПГ в разбавленную сперму баранов перед ее криоконсервацией на результаты искусственного осеменения овцематок
Доза препарата	Результаты искусственного осеменения
	Осеменено овцематок	Объягнилось		Получено ягнят на 100 маток
		голов	%	гол	%
Без ПГ (контроль)	185	85	46,2±3,6	122	100±0,7
ФЛПГ, 125 (опыт)	150	88	58,8±4,0	138	113±2,9
Энзапрост, 125 (прототип)	145	73	50,7±4,1	127	104±1,4

Полученные данные (табл.3) показывают, что оплодотворяемость овцематок в опытной группе, где использовали оптимальную дозу ФЛПГ (125 мкг/мл), была выше, чем в контрольной группе, на 12,6%, а многоплодие - на 16 голов (138 ягнят на 100 овцематок против 122 голов в контрольной группе). Полученная в пользу опыта разница статистически достоверна при уровне вероятности Р<0,02.

По сравнению с результатами, полученными при использовании энзапроста (прототип), в опытной группе оплодотворяемость овцематок также была выше на 8,1%, а плодовитость - на 11 голов (на 100 маток). Разница в пользу опыта статистически достоверна при степени вероятности Р=0,1.

Таким образом, введение в ГЖУК-трис-буферную среду препарата ФЛПГ (комплекс простагландинов F ₂ , E, E₁, E₂ и их производных) в концентрации 120 мкг/мл непосредственно перед криоконсервацией спермы позволяет значительно улучшить биологическую полноценность спермиев после дефростации (абсолютный показатель выживаемости Sa +14%), а также повысить оплодотворяемость овцематок на 12,6%, их многоплодие - на 16 голов (на каждые 100 маток) по сравнению с контролем (среда без ПГ). По сравнению с прототипом (среда с энзапростом, 125 мкг/мл) эффективность использования была выше соответственно на 8,1% и 11 голов на каждые 100 маток. Полученная в пользу опыта разница статистически достоверна в обоих случаях.

При статистической обработке результатов исследований на предмет определения характера зависимости оплодотворяемости овцематок от числа простагландинов в используемой спермодозе обнаружена прямая достоверная зависимость между этими показателями, коэффициент корреляции - r=0,854.

Источники информации

1. Наставление по применению энзапроста. Хиноин, Фармацевтическое и Химическое предприятие ЛТД. Будапешт, Венгрия.

2. Простагландины. Большая медицинская энциклопедия. Москва, 1985.

3. Наставление по применению ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы баранов-производителей. ВНИИ плем. Лесные Поляны, 1992.

4. Клинский Ю.Д., Павлов В.А., Булынин В.А. Использование простагландинов для регуляции воспроизводительной функции у овец. Животноводство. 1980. №4.