способ получения экстракта ginkgo biloba, высокообогащенного активными ингредиентами

Формула изобретения

1. Способ получения экстракта листьев Ginkgo biloba, включающий следующие последовательные стадии:

i. двойная экстракция высушенных фрагментов листьев Ginkgo biloba в этаноле, содержащем максимум 20 мас.% воды;

ii. фильтрация, промывание и концентрация экстракта под пониженным давлением в присутствии водного раствора хлорида натрия и удаление темного масла из оставшегося прозрачного раствора;

iii. промывание оставшегося водного раствора жидкостной экстракцией с использованием средства, выбранного из группы, состоящей из н-гексана, н-гептана и циклогексана;

iv. жидкостная экстракция водной фазы, промытой этилацетатом;

v. промывание этилацетатной фазы, полученной на стадии iv, насыщенным раствором хлорида натрия, затем выпаривание до сухости промытой этилацетатной фазы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сухие фрагменты листьев Ginkgo biloba стадии i представляют собой сухой порошок листьев Ginkgo biloba.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что экстрагирование на стадии i проводят с использованием этанола, содержащего от 10 до 20 мас.% воды.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что промывание на стадии iii проводят н-гептаном.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что водные растворы хлорида натрия, используемые на стадиях ii и v, имеют концентрацию, по меньшей мере, 10 мас.% хлорида натрия.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что он дополнительно включает после стадии iv следующую стадию vi:

vi. солюбилизация сухого экстракта в этаноле и охлаждение раствора, фильтрация необязательно осажденной соли и выпаривание до сухости полученного раствора.

7. Экстракт листьев Ginkgo biloba, полученный способом по любому из пп.1-6.

8. Экстракт листьев Ginkgo biloba по п.7, отличающийся тем, что способ проводят, начиная с высушенных фрагментов высушенных листьев Ginkgo biloba.

9. Экстракт листьев Ginkgo biloba по п.8, отличающийся тем, что он содержит 34-46 мас.% терпен-лактонов и 18-30 мас.% флавон-гликозидов.

10. Экстракт листьев Ginkgo biloba по п.7, отличающийся тем, что способ проводят, начиная с высушенных фрагментов лиофилизированных листьев Ginkgo biloba.

11. Экстракт листьев Ginkgo biloba по п.10, отличающийся тем, что он содержит приблизительно 52 мас.% флавон-гликозидов и приблизительно 13 мас.% терпен-лактонов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу получения экстракта Ginkgo biloba, высокообогащенного активными ингредиентами.

Определенные стандартизированные препараты на основе экстрактов листьев Ginkgo biloba в настоящее время используются для лечения заболеваний сосудов головного мозга и периферических сосудов, в частности, в Европе, США и Дальнем Востоке.

Экстракт Ginkgo biloba, ниболее широко используемый в настоящее время (Egb 761®), содержит 24% флавон-гликозидов, всего 3% гинкголидов А, В, С и J и 3% билобалида (cf. K.Drieu, La Presse Medicale (1986), 15, 1455-1457). Рекомендуемая суточная доза для пациента составляет 120 мг.

В патенте США №5399348 описан, например, способ получения экстракта Ginkgo biloba, содержащего в среднем 24% флавона-гликозидов, 3% гинкголидов А, В, С и J и 3% билобалида. Указанный способ включает следующие стадии:

i. экстракция высушенного порошка листьев в ацетоне, содержащем 40 мас.% воды;

ii. удаление липидов концентрацией экстракта под пониженным давлением до получения концентрата, содержащего приблизительно 30% твердых веществ для того, чтобы таким образом удалить ацетон, затем разведение водой для получения концентрации 15% твердых веществ, охлаждение полученной суспензии приблизительно до 10°С в течение 1 ч перед удалением липидных преципитатов фильтрацией;

iii. обогащение органической фазы добавлением 30% раствора сульфата аммония в водный фильтрат с последующим экстрагированием жидкости смесью метилэтилкетона и ацетона (от 9:1 до 4:6) и концентрация органической фазы для получения концентрации от 50 до 70% твердых веществ;

iv. удаление таннинов разведением концентрата в смеси 50/50 мас. воды и этанола для получения концентрации 10% твердых веществ, добавление водного раствора соли свинца до тех пор, пока цвет не перейдет из коричневого в янтарный, и фильтрация преципитатов свинца-таннина для получения прозрачного фильтрата;

v. удаление свинца в форме его нерастворимого сульфата концентрацией фильтрата для поддержания максимальной доли 5% этанола, добавление сульфата аммония до концентрации приблизительно 20% с последующей жидкостной экстракцией смесью метилэтилкетона и этанола (от 8:2 до 1:1) и

vi. сушка конечного продукта концентрацией органической фазы для получения концентрации от 50 до 70% твердых веществ и сушка в вакууме в печи при 60-80°С для выделения конечного продукта, содержащего менее 5% воды.

За последние 10 лет предпринимались значительные усилия для обогащения части активных соединений экстрактов Ginkgo biloba, в то же самое время уменьшая часть длинноцепочечных алкилфеноловых аллергенных соединений, таких как гинкголовые кислоты.

Имеется определенное количество патентных заявок и патентов, описывающих способы обеспечения возможности получения экстрактов листьев Ginkgo biloba, обогащенных флавон-гликозидами и терпен-лактонами.

Например, патент США №5389370 относится к способам получения экстрактов, концентрированных по активным соединениям. Используемая в данном случае стратегия заключается в смешивании фракции, обогащенной флавон-гликозидами, полученной жидкостной экстракцией, билобалидом и гинкголидами, выделенными с использованием колоночного хроматографического разделения для получения желательных композиций, которые обычно содержат 50% флавон-гликозидов и 6% билобалида, 50% флавон-гликозидов и 7% гинкголидов или 50% флавон-гликозидов, 6% билобалида и 7% гинкголидов. Описанный способ занимает две стадии, раскрытые в упомянутом ранее патенте США №5399348 (которые здесь обозначены, как стадии 1 и 2), к которому добавлены следующие последовательные стадии:

3. обогащение органических фаз: жидкостная экстракция смесью этилацетата и гексана (9:1), причем водную фазу повторно экстрагируют н-бутанолом, и полученную н-бутаноловую фазу концентрируют до сухости для получения фракции, богатой флавон-гликозидами;

4. обработка активированным углем: промывание ацетат-гексанэтиловой фазы водой, причем промытую ацетат-гексанэтиловую фазу затем обрабатывают активированным углем, фильтруют и концентрируют до сухости;

5. перекристаллизация: растворение твердого остатка в смеси 50/50 мас. этанола и воды, охлаждение для кристаллизации и фильтрация для выделения гинкголидов;

6. колоночная хроматография: концентрация до сухости надосадка стадии 5 и хроматографическое разделение на силикагелевой колонке для получения фракций, обогащенных билобалидом и гинкголидами, и

7. смешивание фракций: смешивание фракций, обогащенных флавон-гликозидами со стадии 3, с гинкголидами, полученными на этадии 5 или 6, и/или с билобалидом, полученным на стадии 6.

В соответствии с вариантом указанного выше способа стадии 4 и 5 можно заменить колоночной хроматографией.

Кроме того, в патенте США №6030621 описан способ получения экстрактов Ginkgo biloba, обогащенных флавон-гликозидами и терпен-лактонами. Используемая стратегия аналогична стратегии патента США №5389370: фракцию, обогащенную флавон-гликозидами, смешивают с фракциями, обогащенными терпен-лактонами, причем последние получают колоночной хроматографией. Обычно полученные экстракты содержат 47,2% флавон-гликозидов и 6,3% терпен-лактонов или 70% флавон-гликозидов и 10% терпен-лактонов. Данный способ включает следующие стадии:

а) экстракция высушенного порошка листьев в этаноле, содержащем 50 мас.% воды;

b) удаление липидов концентрацией экстракта под пониженным давлением до удаления этанола, разведение концентрата водой, оставление смеси на 48 ч и фильтрация липидных преципитатов;

с) улавливание активных соединений пропусканием водного фильтрата через смолу, состоящую из смеси смолы XAD-4 (смесь пористых полимеров) и полиамида;

d) элюирование активных соединений с использованием последовательных этанолово-водных смесей, содержащих 30, 60 и 90 мас.% этанола, и

е) объединение всех фракций, полученных на стадии d), выпаривание этанола, промывание водного концентрата гексаном и выпаривание до сухости промытой водной фазы для получения экстракта, содержащего 47,2% флавон-гликозидов и 6,3% терпен-лактонов.

В одном варианте указанного выше способа фракцию, полученную из этанолово-водной смеси, содержащей 30% этанола, подвергают испарительной хроматографии для получения фракции, содержащей, по меньшей мере, 80% терпен-лактонов. Таким же образом фракции, полученные из этанолово-водных смесей, содержащих 60 и 90% этанола, объединяют и подвергают испарительной хроматографии для получения фракции, содержащей, по меньшей мере, 80% флавон-гликозидов. Фракцию, содержащую, по меньшей мере, 80% флавон-гликозидов, и фракцию, содержащую, по меньшей мере, 80% терпен-лактонов, смешивают в различных пропорциях и обеспечивают возможность получить экстракты, содержащие до 70% флавон-гликозидов и 10% терпен-лактонов.

Ввиду все более жестких требований безопасности для здоровья, становится предпочтительным использовать все более чистые активные ингредиенты. Поэтому тенденция в отношении экстрактов Ginkgo biloba такова, что однажды от таких экстрактов, как EGb 761 ^®, откажутся в пользу экстрактов, еще более богатых активными ингредиентами. Типичной была бы возможность поставить цель получения экстрактов, содержащих, по меньшей мере, 50 мас.% флавон-гликозидов и 12 мас.% терпен-лактонов или экстрактов, содержащих, по меньшей мере, 30 мас.% терпен-лактонов и, по меньшей мере, 15 мас.% флавон-гликозидов. Способы патентов США №5389370 или №6030621 могли бы обеспечить возможность получения такого экстракта, но, однако, могли бы оказаться обременительными при использовании в промышленном масштабе, главным образом, ввиду присутствия стадий разделения хроматографией.

Авторы изобретения разработали способ обеспечения возможности получения экстрактов листьев Ginkgo biloba, соответствующих указанным требованиям, без использования какой-либо стадии разделения хроматографией.

Поэтому предметом изобретения является способ получения экстракта листьев Ginkgo biloba, который включает следующие последовательные стадии:

i. экстракция высушенных фрагментов листьев Ginkgo biloba в этаноле, содержащем максимум 20 мас.% воды;

ii. концентрация экстракта под пониженным давлением в присутствии водного раствора хлорида натрия и удаления темного масла из остающегося прозрачного раствора;

iii. промывание оставшегося водного раствора экстрагированием жидкости жидкостью н-гексаном, н-гептаном или циклогексаном;

iv. жидкостная экстракция водной фазы, промытой этилацетатом;

v. промывание этилацетатной фазы, полученной на стадии iv, раствором хлорида натрия, затем выпаривание до сухости промытой этилацетатной фазы.

Под высушенными фрагментами листьев Ginkgo biloba в настоящей заявке подразумеваются сухие фрагменты, размер частиц которых не превышает 5 мм.

Предпочтительно в соответствии с изобретением высушенные фрагменты листьев Ginkgo biloba представлены в виде высушенного порошка. Под порошком в настоящей заявке подразумевается порошок, размеры частиц которого не превышают 1 мм (а предпочтительно, не превышают 5 мм).

Способ в соответствии с изобретением можно применять:

- или к лиофилизированным фрагментам (предпочтительно порошку) листьев Ginkgo biloba, и в данном случае получают экстракты, содержащие, по меньшей мере, 50 мас.% флавон-гликозидов и 12 мас.% терпен-лактонов;

- или к высушенным фрагментам (предпочтительно порошку) листьев Ginkgo biloba, и в данном случае получают экстракты - далее именуемые «основные экстракты», содержащие 30 мас.% терпен-лактонов и, по меньшей мере, 15 мас.% флавон-гликозидов (указанный способ в данном случае обеспечивает возможность получения, кроме того, в качестве родственного продукта экстрактов - далее именуемых «родственные экстракты» - аналоги экстрактов, описанных в патентной заявке РСТ WO 96/33728, а именно экстрактов, содержащих приблизительно от 30 до 35 мас.% флавон-гликозидов и приблизительно 1 мас.% терпен-лактонов).

В соответствии с одним вариантом изобретения описанный выше способ применяют к лиофилизированным фрагментам (или порошку) листьев Ginkgo biloba, и полученный экстракт предпочтительно таков, что он содержит приблизительно 52 мас.% флавон-гликозидов и приблизительно 13 мас.% терпен-лактонов.

В соответствии с предпочтительным вариантом изобретения описанный выше способ применяют к высушенным фрагментам (или к порошку) листьев Ginkgo biloba, и полученный основной экстракт предпочтительно таков, что он содержит от 34 до 46 мас.% терпен-лактонов и от 18 до 30 мас.% флавон-гликозидов. Предпочтительнее описанный выше способ применяют к высушенным фрагментам (или к порошку) листьев Ginkgo biloba, и полученный основной экстракт предпочтительно таков, что он содержит от 36 до 44 мас.% терпен-лактонов и от 18 до 30 мас.% флавон-гликозидов. В частности, описанный выше способ применяют к высушенным фрагментам (или к порошку) листьев Ginkgo biloba, и полученный основной экстракт будет содержать приблизительно 40 мас.% терпен-лактонов (из которых приблизительно 24,5 мас.% гинкголидов А, В и С и приблизительно 15,5 мас.% билобалида) и приблизительно 24 мас.% флавон-гликозидов.

Предпочтительно экстрагирование этапа i проводят с использованием этанола, содержащего от 10 до 20 мас.% воды и предпочтительнее от 15 до 20 мас.% воды.

Также предпочтительно смесь, полученную после концентрации экстракта под пониженным давлением в присутствии водного раствора хлорида натрия на стадии ii, охлаждают, например, до температуры приблизительно 10°С, предпочтительно в течение периода времени от 10 или 15 мин до 1 или 2 ч перед проведением удаления темного масла из прозрачного раствора. Еще предпочтительнее смесь, полученную после концентрации экстракта под пониженным давлением в присутствии водного раствора хлорида натрия на стадии ii, и весь этанол, присутствующий в указанной смеси, выпаривают перед охлаждением указанной смеси.

Также предпочтительно стадию промывания iii проводят н-гептаном.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом способа изобретения последний применяют к высушенным фрагментам (или к порошку) листьев Ginkgo biloba, объем остаточного водного раствора, промытого на стадии iii, и количество хлорида натрия в растворе заранее корригируют таким образом, чтобы, с одной стороны, содержание растворимых в воде твердых веществ составляло приблизительно 8 мас.% относительно общей массы раствора, а с другой стороны, содержание хлорида натрия составляло приблизительно 16 мас.% относительно общей массы раствора. Содержание растворимых в воде твердых веществ оценивают взятием образца этанолового раствора, который выпаривают для удаления этанола, и затем экстрагируют дихлорметаном, затем остаточную водную фазу выпаривают до сухости и взвешивают; содержание растворимых в воде твердых веществ можно затем вычесть из массы полученного твердого остатка.

Относительно стадии iv, метилэтилкетон, содержащий от 2 до 10 об.% ацетона или этанола, может необязательно заменить этилацетат.

Относительно водных растворов хлорида натрия, используемого на стадиях ii и v, они предпочтительно будут иметь концентрацию, по меньшей мере, 10 мас.% хлорида натрия, хотя они предпочтительно будут насыщены хлоридом натрия на стадии v.

В соответствии с предпочтительным вариантом указанного выше способа, применяемого к высушенным фрагментам (или к порошку) листьев Ginkgo biloba, солевую водную, выделенную в конце экстрагирования жидкости жидкость стадии iv можно повторно обработать способом, включающим следующие стадии:

а) жидкостная экстракция с использованием смеси приблизительно 1:1 этилацетата и этанола; и

b) выпаривание до сухости органической фазы, выделенной в конце стадии а);

с) растворение остатка, полученного на стадии b) в чистом этаноле, для получения концентрации приблизительно от 5 до 10 мас.% твердых веществ относительно массы раствора этанола;

d) охлаждение смеси до температуры предпочтительно ниже или равной 10°С (например, до температуры от 2 до 8°С), предпочтительно в течение периода времени от 30 мин до 12 ч;

е) фильтрация и выпаривание этанола из выделенного фильтрата для получения сухого экстракта.

Указанный дополнительный способ обеспечивает выделение дополнительного экстракта, который в целом содержит приблизительно от 30 до 35 мас.% флавон-гликозидов и приблизительно 1 мас.% терпен-лактонов.

Необязательно, описанный выше способ может включать после стадии i-v следующую стадию vi:

vi. солюбилизация сухого экстракта в этаноле и охлаждение раствора до температуры, предпочтительно ниже или равной 10°С (например, до температуры от 2 до 8°С), фильтрация необязательно осажденной соли и выпаривание до сухости полученного раствора.

В данном случае, когда способ изобретения используют в промышленном масштабе, предпочтительно, чтобы на стадии v просто концентрировали органическую фазу до тех пор, пока не будет получена концентрация приблизительно от 50 до 70 мас.% твердых веществ (и не выпаривать его до сухости) и добавление этанола для получения композиции, содержащей от 5 до 20 мас.% воды, от 5 до 20 мас.% твердых веществ и остаточный этанол перед проведением стадии vi. Проведение процедуры таким образом исключает стадии сушки.

Основные экстракты, полученные в соответствии с изобретением, можно использовать в фармации или в пищевой промышленности (например, в качестве ингредиентов питательных добавок), поскольку, с одной стороны, они содержат менее чем 5 м.д. алкилфенолов (измерение, проведенное анализом ВЭЖХ), а с другой стороны, они содержат менее чем 0,3% проделфинидинов (предпочтительно менее чем 0,25%, а в целом от 0,05 до 0,25% проделфинидинов). Кроме того, они также содержат несколько липофильных примесей и несколько полисахаридов, проантоцианидов, отличных от проделфинидинов и белков с высокой молекулярной массой.

В частности, благодаря низкому содержанию в них проделфинидина, основные экстракты в соответствии с изобретением больше подходят для введения пациентам внутривенным путем. Путем сравнения имеющийся в продаже экстракт, такой как EGb 761 ^®, может содержать до 1,5% проделфинидинов.

Кроме того, основные экстракты изобретения предпочтительно таковы, что пики, соответствующие О-рамнопиранозил-4-О-D-(транс-пара-кумароил-6''')глюкопиранозилокси-3-тетрагидрокси-3',4',5,7-флавонолу (или кверцетин 3-(6'''-транс-пара-кумароил)-глюкорамнозиду) и О-рамнопиранозил-4-О-D-(транс-пара-кумароил-6''')глюкопиранозилокси-3-тригидрокси-4',5,7-флавонолу (или кемпферол 3-(6'''-транс-пара-кумароил)-глюкорамнозиду) вместе представляют приблизительно 39% общей поверхности пиков хроматограммы. В частности, основные экстракты изобретения предпочтительно будут таковыми, что пик, соответствующий О-рамнопиранозил-4-О-D-(транс-пара-кумароил-6''') глюкопиранозилокси-3-тетрагидрокси-3',4',5,7-флавонолу (или кверцетин 3-(6'''-транс-пара-кумароил)-глюкорамнозиду), представляет приблизительно 20% общей поверхности пиков хроматограммы. Аналогичным образом, основные экстракты изобретения предпочтительно будут таковыми, что пик, соответствующий О-рамнопиранозил-4-О-D-(транс-пара-кумароил-6''')глюкопиранозилокси-3-тригидрокси-4',5,7-флавонолу (или кемпферол 3-(6'''-транс-пара-кумароил)-глюкорамнозиду), представляет приблизительно 19% общей поверхности пиков хроматограммы.

Кроме того, родственные экстракты, полученные с использованием способа в соответствие с изобретением, будут содержать менее чем 0,5% проделфинидинов (предпочтительно менее чем 0,40% и в целом от 0,15 до 0,40% проделфинидинов).

Еще одним предметом изобретения являются основные экстракты, которые можно получить способом в соответствии с изобретением. Предметом изобретения также являются указанные основные экстракты в качестве лекарственных препаратов, фармацевтические композиции, включающие указанные основные экстракты в качестве активного ингредиента, и применение указанных основных экстрактов для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения заболеваний/расстройств, выбранных из следующих заболеваний/расстройств: заболевания сосудов головного мозга и периферических сосудов (такие как шум в ушах сосудистого происхождения, атеросклероз, ишемия, тромбозы, симптомы, связанные с венозной недостаточностью, острые воспалительные венозные проявления и симптомы, связанные с геморроидальным кризом), нейродегенеративные заболевания (такие как, например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Хантингтона или боковой амиотрофический склероз) и хроническая нейросенсорная и когнитивная патологическая недостаточность у пожилых людей (в частности, потеря памяти, наблюдаемая у пожилых пациентов, которые не страдают болезнью Альцгеймера или другой деменцией). Наконец, предметом изобретения является применение указанных основных экстрактов для получения лекарственных средств, предназначенных для адъювантной терапии для лечения пролиферативных заболеваний (в частности, рака).

Фармацевтические композиции, содержащие экстракт изобретения, могут быть в твердой форме, такой как, например, порошки, пилюли, гранулы, таблетки, липосомы, желатиновые капсулы или суппозитории. Пилюли, таблетки или желатиновые капсулы могут быть покрыты веществом, способным защитить композицию от действия желудочной кислоты или ферментов в желудке субъекта в течение достаточного периода времени, чтобы дать возможность данной композиции пройти непереваренной в тонкую кишку последнего. Экстракт можно также вводить местно, например, в действительный участок опухоли. Экстракт можно также вводить в соответствии со способом пролонгированного высвобождения (например, используя композицию пролонгированного высвобождения или перфузионного насоса). Соответствующие твердые основы могут, например, представлять собой фосфат кальция, стеарат магния, карбонат магния, тальк, сахара, лактозу, декстрин, крахмал, желатин, целлюлозу, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, поливинилпирролидин и воск.

Фармацевтические композиции, содержащие экстракт изобретения, могут быть также представлены в жидкой форме, такой как, например, растворы, эмульсии, суспензии или композиция пролонгированного высвобождения. Соответствующие жидкие основы могут представлять собой, например, воду, органические растворители, такие как глицерин или гликоли, такие как полиэтиленгликоль, аналогичным образом их смеси в различных пропорциях в воде.

Введение лекарственного средства в соответствии с изобретением можно проводить местным, оральным, парентеральным путем, внутримышечной инъекцией и т.д.

Доза экстракта в соответствии с настоящим изобретением, предоставленного для лечения упомянутых выше заболеваний или расстройств, варьирует в соответствии со способом введения, возрастом и массой тела субъекта, которого предстоит лечить, а также от состояния последнего, и ее окончательно определяет лечащий врач или ветеринар. Такое количество, которое определяет лечащий врач или ветеринар, здесь называется «терапевтически эффективным количеством».

Не предрешая мнение лечащего врача и учитывая содержание активных ингредиентов основных экстрактов в соответствии с изобретением, можно, например, предусмотреть введение человеку суточной дозы указанных основных экстрактов от 5 до 150 мг, а предпочтительно дозы от 10 до 100 мг (в частности, дозы от 40 до 80 мг, например от 50 до 70 мг).

В настоящей заявке термин «приблизительно» относится к интервалу около рассматриваемой величины. Используемый в настоящей заявке термин «приблизительно Х» обозначает интервал от Х минус 10% до Х плюс 10%, а предпочтительно интервал от Х минус 5% до Х плюс 5%.

При отсутствии других определений все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, как то, которое обычно понимает средний специалист в области, к которой относится изобретение. Аналогичным образом, все публикации, патентные заявки, все патенты и все другие ссылки, упомянутые здесь, включены в качестве ссылки.

Следующие примеры представлены для иллюстрации указанных выше способов, и ни в коем случае не должны рассматриваться как ограничение диапазона изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

100 г лиофилизированных молотых листьев Ginkgo biloba (размер частиц менее 4 мм) экстрагируют дважды, один раз 800 мл, а второй раз 600 мл смеси этанола-воды, содержащей 88 мас.% этанола, каждый раз при 60°С и в течение 1 ч. Экстракты двух стадий экстрагирования фильтруют и остатки листьев выделяют и ополаскивают 200 мл той же смеси растворителей. Объединенные экстракты концентрируют выпариванием до объема 100 мл с содержанием твердого продукта приблизительно 35 г. 350 мл водного раствора 10 мас.% хлорида натрия добавляют в этаноловый концентрат и выпаривание продолжают под пониженным давлением при 50°С для удаления оставшегося этанола. Светло-оранжевый прозрачный солевой раствор отделяют от темного масла декантацией через ватный шарик в фильтровальной воронке, а затем фильтрацией через целит со всасыванием. Экстракт в водном солевом растворе промывают двумя порциями 150 мл н-гептана перед экстракцией дважды каждый раз 150 мл этилацетата. Объединенные этилацетатные фазы промывают 50 мл насыщенного раствора хлорида натрия, затем выпаривают до сухости под пониженным давлением. Сухой экстракт повторно растворяют в 60 мл чистого этанола, оставляют на ночь в холодильнике при 5°С, фильтруют для удаления необязательно осажденной соли и фильтрат выпаривают до сухости для получения 1,42 г экстракта, содержащего 51,7% флавон-гликозидов и 13% терпен-лактонов (6,55% билобалида).

Пример 2

100 г листьев Ginkgo biloba, полученных после сушки в промышленной роторной печи и размолотых (размер частиц менее 4 мм; содержание 1,8 мас.% флавон-гликозидов и 0,12 мас.% гинкголидов), экстрагируют дважды, один раз 800 мл, а второй раз 600 мл смеси этанола-воды, содержащей 80 мас.% этанола, каждый раз при 60°С и в течение 1 ч. Экстракты двух этапов экстрагирования фильтруют и остатки листьев выделяют и ополаскивают 200 мл той же смеси растворителей. Объединенные экстракты концентрируют выпариванием до объема 800 мл с содержанием твердого продукта приблизительно 33 г. 60 г хлорида натрия, 100 мл воды и 22 г целита добавляют в этаноловый концентрат и выпаривание продолжают под пониженным давлением (ниже 100 миллибар) при 50°С для удаления оставшегося этанола. Водный концентрат охлаждают до 10°С в течение 1 ч и светло-оранжевый прозрачный солевой раствор отделяют от темного масла декантацией через ватный шарик в фильтровальной воронке, а затем фильтрацией со всасыванием на фритте, покрытой слоем целита. Экстракт в водном солевом растворе ( 300 мл) промывают двумя порциями 125 мл н-гептана перед экстракцией дважды каждый раз 125 мл этилацетата. Объединенные этилацетатные фазы промывают 50 мл насыщенного раствора хлорида натрия, затем выпаривают до сухости под пониженным давлением. Сухой экстракт повторно растворяют в 23 мл чистого этанола, оставляют на ночь в холодильнике при 4°С, фильтруют для удаления необязательно осажденной соли и фильтрат выпаривают до сухости для получения 1,06 г экстракта, содержащего 23,6% флавон-гликозидов, 39,2% терпен-лактонов (включая 24,6% гинкголидов А, В и С и 14,5% билобалида) и приблизительно 0,14% проделфинидинов.

Пример 3

Солевой раствор водной фазы, который выделяют после последовательных стадий промывания н-гептаном и экстрагирования этилацетатом способа получения экстракта примера 2, подвергают жидкостной экстракции с использованием двух порций по 125 мл смеси этилацетата-этанола 1:1. Выделенную органическую фазу выпаривают до сухости. Сухой экстракт помещают в чистый этанол для получения концентрации 5 мас.% сухого экстракта относительно общей массы раствора. Смесь оставляют на ночь в холодильнике при 4°С перед фильтрацией на бумаге (твердые вещества ополаскивают чистым этанолом при 4°С). После выпаривания до сухости получают экстракт, содержащий 31,88% флавон-гликозидов и 0,67% терпенов (включая 0,50% гинкголидов А, В и С и 0,17% билобалида) и приблизительно 0,21% проделфинидинов.

Характеристика экстрактов в соответствии с изобретением

А) ВЭЖХ:

Экстракты в соответствии с изобретением можно охарактеризовать с использованием способа высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с описанными ниже градиентами элюирования.

Оборудование

- Жидкофазный хроматограф и оборудование, адаптированное к определенным ниже условиям

- Лабораторная стеклянная посуда

- Весы с точностью до 0,1 мг.

Реагенты

- Чистая вода (качества ВЭЖХ)

- Ацетонитрил (качества ВЭЖХ)

- Изопропанол (качества ВЭЖХ)

- Лимонная кислота (качества ВЭЖХ)

- Метанол R

- Контрольный стандартный экстракт Ginkgo biloba

Процедура

Раствор экстракта, подлежащего тестированию, готовят растворением 200 мг экстракта, анализ которого предстоит провести, в 10 мл метанола. Параллельно 200 мг контрольного стандартного экстракта Ginkgo biloba (EGb 761®) растворяют в 10 мл метанола и составляют контрольный раствор.

Используют следующие условия хроматографии:

- Тип градиента:	линейный от 0% до 100% вторичной подвижной фазы в течение 15 мин, затем 5 мин вторичной подвижной фазой. Повторное уравновешивание колонки в течение 10 мин первичной подвижной фазой перед следующей инъекцией
- Первичная подвижная фаза:	Очищенная вода Ацетонитрил	1000 мл 200 мл
	Изопропанол	30 мл
	Лимонная кислота	4,92 г
- Вторичная подвижная фаза:	Очищенная вода Ацетонитрил	1000 мл 470 мл
	Изопропанол	50 мл
	Лимонная кислота	6,08 г
- Скорость потока:	1,5 мл/мин
- Выявление:	УФ 360 нм
- Колонка:	Нержавеющая сталь, 15 см, диаметр 4,6 мм; заполненная силикагелем для хроматографии Macherey-Nagel R Nucleosil 5C18 или эквивалентная (5 мкм)
- Инъецируемый объем:	5 мкл

Результаты

Интегрирования, определенные для различных пиков, воспроизведены ниже в табл.I (экстракт примера 2) и II (экстракт примера 3). Главные пики, имеющие время удерживания приблизительно от 13 до 15 мин в описанных выше условиях, характеризуют соответственно О-рамнопиранозил-4-О-D-(транс-пара-кумароил-6''') глюкопиранозилокси-3-тетрагидрокси-3',4',5,7-флавонол (или кверцетин 3-(6'''-транс-пара-кумароил)-глюкорамнозид) и О-рамнопиранозил-4-О-D-(транс-пара-кумароил-6''') глюкопиранозилокси-3-тригидрокси-4',5,7-флавонол (или кемпферол 3-(6'''-транс-пара-кумароил)-глюкорамнозид).

Таблица I
№пика	Время удерживания (мин)			Тип интегрирования		Поверхность		% поверхности
1	5,66			BV		323169,34		1,63
2	6,09			VV		40920,21		0,21
3	7,12			VV		69832,25		0,35
4	7,53			VV		335574,32		1,69
5	7,86			VV		1197971,71		0,60
6	8,42			VV		2633527,95		13,25
7	9,38			VV		272916,32		1,37
8	9,76			VV		1226466,81		6,17
9	10,04			VV		72124,84		0,36
10	10,29			Vv		97259,69		0,49
11	10,61			vv		2967432,21		14,93
12	10,88			vV		34065,16		1,73
13	11,25			VV		61980,66		0,31
14	11,58			VV		405705,79		2,04
15	12,02			VV		193158,96		0,97
16	12,32			VV		295426,85		1,49
17	12,66			VV		139571,25		0,70
18	13,25			VV		39600621,99		19,93
19	13,79			Vv		145778,77		0,73
20	13,99			vV		38952,25		0,20
21	14,26			VV		39634,91		0,20
22	14,67			VV		119350,40		0,60
23	14,87			VV		85122,51		0,43
24	15,18			VV		3789171,34		19,07
25	15,67			VV		60575,37		0,30
26	15,94			VV		118616,10		0,60
27	16,51			VV		208977,01		1,05
28	16,69			VV		345205,90		1,74
29	17,13			VV		206765,44		1,04
30	17,32			VV		241246,27		1,21
31	17,68			Vv		95087,16		0,48
32	17,80			vV		311413,97		1,57
33	18,08			VV		108167,40		0,54
34	18,40			VV		103158,38		0,52
35	18,88			VV		19884,37		0,10
36	19,15			VV		9701,13		0,05
37	19,35			VV		18389,23		0,09
38	19,75			VV		109237,26		0,55
39	20,42			VV		21754,52		0,11
40	20,82			VV		13348,93		0,07
41	21,35			VV		26491,23		0,13
42	21,82			VV		55867,45		0,28
43	22,18			VV		14634,07		0,07
44	22,58			VB		7095,01		0,04
Всего						19872178,50
Таблица II
№ пика		Время удерживания (мин)	Тип интегрирования		Поверхность		% поверхности
1		4,25	BV		1082912,49		3,74
2		4,84	VV		853793,45		2,95
3		5,52	VV		767098,18		2,65
4		6,06	VV		1634400,29		5,68
5		6,59	VV		53647,35		0,19
6		6,91	VV		127266,30		0,44
7		7,37	VV		5275614,83		18,22
8		7,69	VV		1062334,77		3,67
9		8,28	VV		1918663,93		6,63
10		8,95	Vv		103523,93		0,36
11		9,23	vV		1390204,37		4,80
12		9,63	VV		3866788,04		13,35
13		9,87	VV		2102182,30		7,26
14		10,48	VV		968935,87		3,35
15		10,97	VV		314304,16		1,0
16		11,46	VV		1167341,28		4,03
17		11,86	VV		143179,61		0,49
18		12,20	VV		193515,76		0,67
19		12,56	Vv		91823,99		0,32
20		13,13	vV		1197144,99		4,13
21		13,62	VV		94540,18		0,33
22		13,99	VV		33698,24		0,12
23		14,34	VV		78763,83		0,27
24		14,59	VV		334542,58		1,16
25		15,19	VV		944041,64		3,26
26		15,45	VV		244838,93		0,85
27		15,84	VV		473019,80		1,51
28		16,39	VV		569694,64		1,97
29		16,55	Vv		323620,29		1,12
30		16,72	vV		255311,37		0,88
31		17,02	VV		370249,91		1,28
32		17,55	Vv		106207,91		0,37
33		17,69	vV		338307,55		1,17
34		17,97	VV		134115,60		0,46
35		18,33	VV		148609,32		0,51
36		18,78	Vv		31564,17		0,11
37		18,91	vV		17047,61		0,06
38		19,20	VV		25147,79		0,09
39		19,64	VV		67214,23		0,23
40		20,06	VV		16329,48		0,06
41		20,65	VV		11266,06		0,04
42		21,23	VV		10502,29		0,04
43		21,62	VV		40624,23		0,14
Всего					28956906,57

В) Определение содержания проделфинидина:

Содержание проделфинидина в экстрактах изобретения оценивают, как раскрыто ниже.

Приблизительно 50 мг экстракта растворяют в 25 мл смеси изопропанола и 3N растворе хлористоводородной кислоты (5/1 об./об.). 5 мл полученной смеси переносят в колбу емкостью 10 мл, укупоренную герметичной для жидкости пробкой, и затем колбу погружают в кипящую воды на 45 мин. После охлаждения до 20°С объем увеличивают до 10 мл добавлением смеси изопропанола и 3N раствора хлористоводородной кислоты. Оптическую плотность измеряют при 556 нм и процентную долю проделфинидинов получают проведением следующего расчета:

% проделфинидинов = А×86,206897/В

А: оптическая плотность при 556 нм

В: мг образца

Для уменьшения неопределенности результата эксперимент повторяют 3 раза и среднюю величину рассчитывают по полученным результатам.

Фармакологические свойства экстрактов в соответствии с изобретением

Для демонстрации фармакологических свойств экстрактов в соответствии с изобретением можно провести следующие тесты.

1) Клеточная пролиферация

Клеточные линии

Линии клеток рака молочной железы MDA-231 приобретали в Lombardi Cancer Center (Georgetown University Medical Center). Данные линии клеток культивировали в полистироловых культуральных чашках (Corning) и размножали в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавкой 10% плодной бычьей сыворотки (FBS).

Тесты связывания

Клетки MDA-231 растирают в порошок и диспергируют в 5 мл раствора фосфатно-солевого буфера (PBSS), затем центрифугируют при 500 g в течение 15 мин. Подвергнутые центрифугированию клетки ресуспендируют в PBSS и тестируют для измерения содержания в них белка. Тесты [³H]PK 11195 можно провести, как описано в публикациях Papadopoulos et al., J. Biol. Chem. (1990), 265, 3772-3779 и Hardwick et al., Cancer Res. (1999), 59, 831-842. [N-метил-[³H]PK 11195 или (1-(2-хлорфенил)-N-метил-N-(1-метил-пропил)-3-изохинолинкарбоксамид получают у Du Pont-New England Nuclear (Wilmington, DE, USA), а РК 11195 - у Research Biochemicals Incorporated (Natick, MA, USA). Полученные результаты анализируют с использованием программы LIGAND (Munson and Robard, Anal. Biochem. (1976), 72, 248-254.

Анализ мРНК нозрерн-блоттингом

Экспрессию мРНК бензодиазепиновых рецепторов периферического типа (PBR) в клетках MDA-231, обработанных экстрактом примера 1 или примера 2 или EGb 761 ^® (контроль), можно оценить с использованием анализа норзерн-блоттинга, как описано в публикации Hardwick et al., Cancer Res. (1999), 59, 831-842. Общее количество клеточной РНК выделяли с использованием реагента RNAzol B (TEL-TEST, Inc., Friendwood, TX, USA) и хлороформа. 20 мкг общего количества РНК пропускают через 1% агарозный гель и переносят в течение ночи на нейлоновые мембраны (S&S Nytran, Scheicher & Schuell, Keene, NH, USA). Фрагмент PBR КДНК человека длиной 0,2 т.п.н. (полученных из плазмидного вектора pCMV5-PBR, содержащего полную последовательность PBR человека), метят с использованием [ -³²P]dCTP с использованием устройства случайной идентификации ДНК-затравок (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Используемые условия гибридизации описаны в ранее упомянутой ссылке. Авторадиографию проводят контактом «блотов» с пленкой X-OMAT AR (Kodak, Rochester, NY, USA) при -70° в течение 4-48 ч. Количественный анализ мРНК PBR проводят с использованием программного обеспечения SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafel, CA, USA).

Пролиферация клеток

Клетки MDA-231 помещали на 96-луночные планшеты (Corning, NJ, USA) в концентрации приблизительно 10000 клеток на лунку (инкубация в течение 24 ч) или 5000 клеток на лунку (инкубация в течение 48 ч) в DMEM с добавкой 0,1% FBS. Затем клетки инкубируют в 10% FBS с меняющейся концентрацией соединения примера или контрольного соединения (EGb 761 ^®) в течение указанных выше периодов. Различия с точки зрения клеточной пролиферации анализируют измерением количества включенного 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU), которое определяют использованием иммуноферментного анализа BrdU (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA). Включение BrdU измеряют при длине волн 450 нм (контроль: 690 нм).

2) Нейротоксичность, вызванная глутаматом

Экстракт в соответствии с изобретением можно тестировать следующим образом: нейроны мозга крыс обрабатывают или не обрабатывают возрастающими концентрациями экстракта описанного выше примера 1 или примера 2, затем через 30 мин на них воздействуют глутаматом в концентрации 250 мкм. Затем можно оценить дозу, ингибирующую 50% токсичности глутамата (обозначенную IC ₅₀), и сравнить с дозой, полученной для такого экстракта как EGb 761^®, менее богатого флавон-гликозидами и терпен-лактонами (а именно 100 мкг EGb 761^® на мл).

3) Клеточная токсичность

Воздействия экстракта в соответствии с изобретением на жизнеспособность клеток можно исследовать на линии клеток НТ 22 (клетки гиппокампа мышей). Жизнеспособность клеток оценивают определением количества лактат-дегидрогеназы (ЛДГ), высвобождаемого клетками, обработанными возрастающими дозами экстракта описанного выше примера 1 или примера 2, и тестом исключения трипана синего.

Линии клеток

Линия клеток НТ-22 получена из Salk Institute for Biological Research (La Jolla, CA, USA). Данную клеточную линию поддерживают при 37°С в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавкой 10% плодной бычьей сыворотки (FBS), далее именуемую полной средой.

Протокол теста

Клетки НТ-22 помещают в 96-луночный планшет в концентрации 5×10³ клеток на лунку в полной среде. Через 24 ч экстракт примера солюбилизируют в DMEM и добавляют в концентрации 10, 25, 50, 100, 250, 500 и 1000 мкг/мл; затем экстракт оставляют в контакте на 24 или 48 ч измерение ЛДГ проводят с использованием аналитического набора Promega в соответствии с инструкциями, предоставленными изготовителем. Величины спектральной поглощательной способности считывают при 470 нм. Максимальное высвобождение ЛДГ получают после полного лизиса клеток с использованием Triton X-100.

Для измерений жизнеспособности, оцениваемой тестом исключения трипана синего, клетки помещают в 6-луночные планшеты и экстракт примера 1 или примера 2 добавляют в концентрации 100 мкг/мл в течение 24 ч.

Затем клетки промывают раствором с фосфатным буфером, лишенным кальция и магния, и подвергают воздействию трипсина в течение 5 мин при 37°С. Реакцию останавливают полной средой и 0,04% трипана синего добавляют в клеточную суспензию. Количество клеток, которые исключают краску (т.е. живые клетки), определяют с использованием гематоцитометра. Процентную долю жизнеспособных клеток рассчитывают следующим образом: количество жизнеспособных клеток (неокрашенных)/общее количество клеток (окрашенных и неокрашенных) ×100.