агонисты а3 рецепторов аденозина

Формула изобретения

1. Соединение формулы

в которой R¹ представляет собой низший алкил или низший алкил, замещенный фенилом;

X представляет собой ковалентную связь;

R ² представляет собой R⁴-Z-Y-C C-, пиразолил, замещенный фенилом, или пиразолил, замещенный гетероарилом;

где Y представляет собой алкилен, Z представляет собой кислород, a R⁴ представляет собой фенил, замещенный галогеном или низшим алкокси из 1-3 атомов углерода;

R³ представляет собой гидроксиметил.

2. Соединение по п.1, в котором R² представляет собой необязательно пиразол-1-ил, замещенный фенилом.

3. Соединение по п.2, в котором R¹ представляет собой метил, a R² представляет собой 4-(4-метоксифенил)пиразол-1-ил, т.е. (4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-метоксифенил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол.

4. Соединение по п.2, в котором R¹ представляет собой н-пропил, a R² представляет собой 4-(4-метоксифенил)пиразол-1-ил, именно, (4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-метоксифенил)пиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил} оксолан-3,4-диол.

5. Соединение по п.2, в котором R ¹ представляет собой метил, a R² представляет собой 4-(4-хлорбензиламинокарбонил)пиразол-1-ил, т.е. (1-{9-[(4S,2R,3R,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-6-(метиламино)пурин-2ил}пиразол-4-ил)-N-(4-хлорфенил)карбоксамид.

6. Соединение по п.2, в котором R¹ представляет собой метил, a R² представляет собой 4-(4-хлорбензиламинокарбонил)пиразол-1-ил, а именно, (1-{9-(4S,2R,3R,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-6-(метиламино)пурин-2ил}пиразол-4-ил)-N-(4-хлорфенил)карбоксамид.

7. Соединение по п.4, в котором R представляет собой пиразол-1-ил, замещенный гетероарилом.

8. Соединение по п.7, в котором R¹ представляет собой н-пропил, a R ² представляет собой 4-(пирид-2-ил)пиразол-1-ил, а именно, (4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиридин-2-ил)пиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол.

9. Содинение по п.1, в котором R¹ представляет собой низший алкил, замещенный фенилом.

10. Соединение по п.9, в котором R¹ представляет собой 3-иодбензил, a R² представляет собой 4-(4-метоксифенил)пиразол-1-ил, т.е. (4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил))пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол.

11. Соединение по п.1, в котором R² представляет собой замещенный пиразол-4-ил.

12. Соединение по п.11, в котором R¹ представляет собой метил, R² представляет собой 1-бензилпиразол-4-ил, R³ представляет собой гидроксиметил, а X представляет собой ковалентную связь, т.е. (4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[1-бензилпиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол.

13. Соединение по п.11, в котором R¹ представляет собой н-пропил, R² представляет собой 1-бензилпиразол-4-ил, R³ представляет собой гидроксиметил, а X представляет собой ковалентную связь, а именно, (4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[1-бензилпиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол.

14. Соединение по п.1, в котором R² представляет собой R⁴-Z-Y-C C-.

15. Соединение по п.14, в котором R ⁴ представляет собой фенил, замещенный галогеном или низшим алкокси из 1-3 атомов углерода, a Y представляет собой алкилен из 1-3 углеродных атомов.

16. Соединение по п.15, в котором R⁴ представляет собой фенил, замещенный метокси или хлором, a Y представляет собой метилен.

17. Соединение по п.16, в котором R¹ представляет собой метил, R⁴ представляет собой фенил, a Z представляет собой кислород, т.е. 2-гидроксиметил-5-[6-метиламино-2-(3-феноксипропин-1-ил)пурин-9-ил]-тетрагидрофуран-3,4-диол.

18. Фармацевтическая композиция, обладающая действием агониста А₃ рецептора аденозина, содержащая, по меньшей мере, один фармацевтически применимый наполнитель и терапевтически эффективное количество соединения по п.1.

19. Способ получения соединения формулы I

в которой R¹ представляет собой низший алкил или низший алкил, замещенный фенилом;

X представляет собой ковалентную связь;

R ² представляет собой пиразолил, замещенный фенилом, или пиразолил, замещенный гетероарилом;

R³ представляет собой гидроксиметил;

включающий взаимодействие соединения формулы

с соединением формулы

20. Способ по п.19, в котором реакцию проводят в среде инертного растворителя, выбранного из метанола, этанола, н-пропанола, изопропанола и трет-бутанола.

21. Способ получения соединения формулы I

в которой R¹ представляет собой низший алкил, замещенный фенилом;

X представляет собой ковалентную связь; и

R² представляет собой пиразолил, замещенный фенилом или пиразолил, замещенный гетероарилом; и

R³ представляет собой гидроксиметил,

включающий взаимодействие соединения формулы

с соединением формулы

в присутствии палладиевого комплекса и соли меди в среде инертного растворителя и контактирования полученного продукта со слабой кислотой.

22. Способ по п.21, в котором комплекс палладия представляет собой Pd(PPh₃ )₄, соль меди представляет собой CuI, инертный растворитель представляет собой N,N-диметилформамид, а слабая кислота представляет собой фтористый аммоний.

23. Способ получения соединения формулы I

в котором R¹ представляет собой низший алкил или низший алкил, замещенный фенилом;

R² представляет собой R ⁴-Z-Y-C C-, где Y представляет собой алкилен, Z представляет собой кислород и R⁴ представляет собой фенил, замещенный галогеном или низшим алкокси из 1-3 атомов углерода;

R³ представляет собой гидроксиметил;

X представляет собой ковалентную связь,

включающий взаимодействие в среде инертного растворителя соединения формулы

с соединением формулы

в присутствии слабого основания, соли меди и катализатора палладия.

24. Способ по п.23, в котором инертный растворитель представляет собой N,N-диметилформамид, основание представляет собой триэтиламин, соль меди представляет собой иодистую медь, а палладиевый катализатор представляет собой дихлорбис(трифенилфосфин)палладий (II).

Описание изобретения к патенту

Заявляется приоритет на U.S. Provisional Patent Application Serial № 60/311069, поданную 8 августа 2001 г., на полное содержание которой ссылаются в настоящем документе. Настоящее изобретение относится к новым агонистам А₃ рецепторов аденозина, пригодным для лечения неврологических, кардиотонических и других клеточных пролиферативных заболеваний. Настоящее изобретение также относится к способам получения таких соединений и фармацевтическим композициям на их основе.

Аденозин представляет собой нуклеозид природного происхождения, проявляющий свое биологическое действие путем взаимодействия с семейством аденозиновых рецепторов, известных как А₁, А_2а, A _2b и А₃, которые модулируют важные физиологические процессы. Так, например, стимуляция А ₁ аденозиновых рецепторов уменьшает длительность и понижает амплитуду потенциала действия AV (атриовентрикулярных) узловых клеток и, следовательно, пролонгирует рефракционный период AV узловых клеток. Таким образом, стимуляция А₁ рецепторов обеспечивает способ лечения суправентрикулярной тахикардии, включая прерывание узловой переходящей тахикардии и регулирует желудочковый ритм в ходе фибрилляции и трепетания предсердий. А_2а аденозиновые рецепторы модулируют расширение коронарных сосудов, действие А_2В рецепторов связано с активацией тучных клеток, астмой, расширением сосудов, регуляцией клеточного роста, функциями кишечника, и модуляцией нейросекреции (см. Adenosine A_2B Reseptors as Therapeutic Targets, Drug Dev Res 45:198; Feoktistov et al., Trends Pharmacol Sci 19:148-153). А₃ аденозиновые рецепторы модулируют процессы пролиферации клеток. В частности, соединения, являющиеся ангонистами А₃ рецепторов находят применение в терапии и/или профилактике рака, кардиологических заболеваний, бесплодия, заболеваний почек, и нарушений центральной нервной системы (CNS). Кроме этого агонисты А ₃ рецепторов стимулируют пролиферацию клеток костного мозга и таким образом индуцируют секрецию G-CSF в организме. Соответственно, агонисты А₃ рецепторов являются ценными веществами, противодействующими таким токсичным побочным эффектам некоторых лекарственных средств, в частности хемотерапевтических лекарств, как лейкопения и нейтропения.

Ранее уже сообщалось о немногочисленных лигандах для А₃ аденозинового рецептора. Сообщалось, что агонистами А₃ рецептора являются некоторые неселективные N ⁶- замещенные производные аденозина, например, APNEA (N ⁶-2-(4-аминофенил)этиладенозин), иодированная форма которого была успешно использована в качестве радиолиганда (Zhou et al.). Однако типичные ксантиновые и нексантиновые антагонисты А ₁ и А₂ рецепторов, по-видимому, не связываются с такими рецепторами (Zhou et al.).

В соответствие со сказанным, желательно разработать соединения, являющиеся агонистами А₃ рецептора. Предпочтительно, чтобы такие соединения обладали селективностью в отношении А ₃ рецептора, что позволит исключить побочные эффекты, связанные с взаимодействием с другими аденозиновыми рецепторами.

Целью настоящего изобретения является разработка агонистов А ₃ рецептора. Соответственно, первый аспект настоящего изобретения относится к соединениям Формулы I:

в которой:

R¹ представляет собой необязательно замещенный низший алкил, необязательно замещенный циклоалкил, необязательно замещенный арил, или необязательно замещенный гетероарил;

Х представляет собой ковалентную связь или необязательно замещенный алкилен;

R ² представляет собой R⁴-Z-Y-C C- или необязательно замещенный пиразолил;

где Y представляет собой необязательно замещенный алкилен, Z представляет собой кислород, серу или -NH-, а R⁴ представляет собой необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил; а

R³ представляет собой гидроксиметил или -С(О)-NR⁵R ⁶;

где R⁵ и R ⁶, независимо друг от друга, представляют собой водород или низший алкил;

а также к их фармацевтически применимым солям, сложным эфирам и пролекарствам.

Второй аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим рецептурам, включающим терапевтически эффективное количество соединения Формулы I и, по меньшей мере, один фармацевтически применимый наполнитель.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу лечения заболеваний или болезненных состояний у млекопитающих, которые могут успешно лечиться агонистами А₃ рецептора с помощью соединений формулы I, причем такой способ заключается в введении млекопитающему, нуждающемся в лечении, терапевтически эффективной дозы соединения формулы I. Такие заболевания, без конкретных ограничений, включают рак, ишемию почек и сердца, нейродегенеративные нарушения, бесплодие, нейтропению, болезни почек и заболевания центральной нервной системы (CNS).

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способам получения соединений Формулы I.

Один из предпочтительных классов соединений Формулы I включает такие соединения, в которых R² представляет собой необязательно замещенный пиразол-1-ил, особенно в том случае, когда R¹ представляет собой необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный арил, R³ представляет собой гидроксиметил, а Х представляет собой ковалентную связь. Предпочтительная группа таких веществ включает соединения, в которых R ² представляет собой пиразол-1-ил, замещенный необязательно замещенным низшим алкилом, сложным эфиром, аминокарбонилом, необязательно замещенным арилом, или необязательно замещенным гетероарилом.

Предпочтительная подгруппа включает такие соединения, в которых R² представляет собой пиразол-1-ил, замещенный необязательно замещенным фенилом или необязательно замещенным алкилом, а R¹ представляет собой необязательно замещенный алкил. Более предпочтительными соединениями являются соединения, в которых R¹ представляет собой низший алкил, содержащий 1-3 углеродных атома, а R ² представляет собой пиразол-1-ил, замещенный фенилом или бензилом, содержащим в качестве заместителя метокси группу или атом хлора.

Вторая предпочтительная подгруппа включает такие соединения, в которых R² представляет собой пиразол-1-ил, замещенный необязательно замещенным гетероарилом, а R¹ представляет собой необязательно замещенный алкил. В более предпочтительных соединениях R ¹ представляет собой низший алкил из 1-3 углеродных атомов, а R² представляет собой пиразол-1-ил, замещенный пиридином.

Третья предпочтительная подгруппа включает соединения, в которых R² представляет собой пиразол-1-ил, замещенный необязательно замещенным фенилом, R ¹ представляет собой необязательно замещенный фенил, а Х представляет собой алкилен. В более предпочтительных соединениях R¹ представляет собой 3-иодфенил, особенно в том случае, когда Х представляет собой метилен.

Второй предпочтительный класс включает соединения, в которых R ² представляет собой пиразол-4-ил необязательно замещенный необязательно замещенным фенилом или необязательно замещенным алкилом, особенно в том случае, когда R¹ представляет собой необязательно замещенный алкил, а Х представляет собой ковалентную связь. В более предпочтительных соединениях R¹ представляет собой низший алкил.

Третий предпочтительный класс включает соединения, в которых R² представляет собой R ⁴-Z-Y-C C-, особенно в том случае, когда R⁴ представляет собой необязательно замещенный фенил, а Y представляет собой алкилен, содержащий 1, 2 или 3 углеродных атома. Предпочтительная группа таких соединений включает такие соединения, в которых R⁴ представляет собой фенил, необязательно замещенный метоксигруппой или атомом хлора, а Y представляет собой метилен, R¹ представляет собой необязательно замещенный низший алкил, R³ представляет собой гидрокси, Х представляет собой ковалентную связь, а Z представляет собой атом кислорода.

Используемые в настоящем изобретении следующие слова и фразы обычно имеют указанные ниже значения, за исключением тех случае, когда они употребляются в другом контексте.

Термин «алкил» относится к монорадикальной цепи разветвленного или линейного насыщенного углеводорода, содержащей 1-20 атомов углерода. Примером таких алкильных групп являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, н-гексил, н-децил, тетрадецил и т.п.

Термин «замещенный алкил» относится к:

1) указанной выше алкильной группе, имеющей 1, 2, 3, 4 или 5 заместителей, предпочтительно, 1-3 заместителей, выбранных из группы, состоящей из алкенила, алкинила, алкокси, циклоалкила, циклоалкенила, ацила, ациламино, ацилокси, амино, аминокарбонила, алкоксикарбониламино, азидо, циано, галогена, гидрокси, кето, тиокарбонила, карбокси, карбоксиалкила, арилтио, гетероарилтио, гетероциклилтио, тиольной группы, алкилтио, арила, арилокси, гетероарила, аминосульфонила, аминокарбониламино, гетероарилокси, гетероциклила, гетероциклоокси, гидроксиамино, алкоксиамино, нитро, -SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -SO ₂-алкила, -SO₂-арила, и -SO ₂-гетероарила. Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители могут необязательно быть замещены 1,2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF ₃, амино, замещенной амино, циано, и -S(O) _nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2; или

2) указанной выше алкильной группе, прерванной 1-10 атомами, независимо выбранными из кислорода, серы и NR_a, где R_a выбирают из водорода, алкила, циклоалкила, алкенила, циклоалкенила, алкинила, арила, гетероарила и гетероциклила. Все заместители могут быть необязательно замещены алкилом, алкокси, галогеном, CF₃, амино, замещенной амино, циано, или -S(O)_nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил а n равно 0,1 или 2; или

3) указанной выше алкильной группы, имеющей 1,2,3, 4 или 5 указанных выше заместителей и содержащей 1-10 указанных выше атомов.

Термин «низший алкил» относится к насыщенному монорадикальному углеводороду с разветвленной или линейной цепью, содержащей 1, 2, 3, 4, 5 или 6 углеродных атомов. Примерами групп могут служить метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, третбутил, н-гексил и т.п.

Термин «замещенный низший алкил» относится к указанному выше низшему алкилу, содержащему 1-5 заместителей, предпочтительно 1,2 или 3 заместителя, указанных для замещенного алкила, или указанной выше низшей алкильной группе, включающей 1, 2, 3, 4 или 5 промежуточных атомов, указанных для замещенного алкила, или указанной выше низшей алкильной группе, содержащей 1,2,3,4 или 5 указанных выше заместителей и 1, 2, 3, 4 или 5 указанных выше промежуточных атомов.

Термин «алкилен» относится к насыщенному углеводородному бирадикалу с разветвленной или линейной цепью, предпочтительно содержащему 1-20 углеродных атомов, предпочтительно 1-10 углеродных атомов, более предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 углеродных атомов. Примерами, подпадающими под этот термин, могут служить такие группы, как метилен (-СН₂ -), этилен (-СН₂СН₂ -), пропиленовые изомеры (например, -СН₂ СН₂СН₂- и СН(СН ₃)СН₂-) и т.п.

Термин «низший алкилен» относится к насыщенному углеводородному бирадикалу с разветвленной или линейной цепью, предпочтительно содержащей 1, 2, 3, 4, 5 или 6 углеродных атомов.

Термин «замещенный алкилен» относится к:

(1) указанной выше алкиленовой группе, имеющей 1,2,3,4 или 5 заместителей, выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, циклоалкила, циклоалкенила, ацила, ациламино, ацилокси, амино, аминокарбонила, алкоксикарбониламино, азидо, циано, галогена, гидрокси, кето, тиокарбонила, карбокси, карбоксиалкила, арилтио, гетероарилтио, гетероциклилтио, тиола, алкилтио, арила, арилокси, гетероарила, аминосульфонила, аминокарбониламино, гетероарилокси, гетероциклила, гетероциклоокси, гидроксиамино, алкоксиамино, нитро, -SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -SO₂-алкила, -SO₂ -арила, и -SO₂-гетероарила. Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители могут необязательно быть замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF₃, амино, замещенной амино, циано, и -S(O)_nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2; или

(2) указанной выше алкиленовой группе, в состав которой входят 1-20 промежуточных атомов, независимо выбранных из кислорода, серы и NR_a-, где R_a выбирают из водорода, необязательно замещенного алкила, циклоалкила, циклоалкенила, арила, гетероарила и гетероциклила, или групп, выбранных из карбонила, карбоксисложноэфирной группы, карбоксиамида и сульфонила; или

(3) указанной выше алкиленовой группе, имеющей 1, 2, 3, 4 или 5 указанных выше заместителей и содержащей 1-20 указанных выше промежуточных атомов. Примерами замещенных алкиленов могут служить хлорметилен (-СН(CI)-), аминоэтилен (-СН(NH ₂)CH₂-), метиламиноэтилен (-СН(NHMe)CH ₂-), 2-карбоксипропиленовые изомеры (-СН ₂СН(СО₂Н)СН₂ -), этоксиэтил (-СН₂СН₂ О-СН₂СН₂-), этилметиламиноэтил (-СН₂СН₂N(CH ₃(CH₂CH₂-), 1-этокси-2-(2-этокси-этокси)этан (-СН₂СН ₂О-СН₂СН₂-ОСН ₂СН₂-ОСН₂СН ₂-) и т.д.

Термин «аралкил» относится к арильной группе, ковалентно связанной с алкиленовой группой, где арил и алкилен имеют указанные выше значения. «Необязательно замещенный аралкил» относится к необязательно замещенной арильной группе, ковалентно связанной с необязательно замещенной алкиленовой группой. Примерами таких аралкильных групп могут служить бензил, фенилэтил, 3-(4-метоксифенил)пропил и т.п.

Термин «алкокси» относится к группе R-O-, в которой R необязательно замещен алкилом или необязательно замещенным циклоалкилом, или R представляет собой группу -Y-Z-, в которой Y представляет собой необязательно замещенный алкилен, а Z представляет собой необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил; или необязательно замещенный циклоалкенил, где алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил и циклоалкенил имеют указанные выше значения. Предпочтительные алкокси группы представляют собой группу типа алкил-О- и их примерами могут служить метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, третбутокси, втор.-бутокси, н-пентокси, н-гексокси, 1,2-диметилбутокси и т.п.

Термин «алкилтио» относится к группе R-S-, в которой R имеет значения указанные выше для алкокси.

Термин «алкенил» относится к насыщенному углеводородному монорадикалу с разветвленной или линейной цепью, предпочтительно содержащей 2-20 углеродных атомов, более предпочтительно, 2-10 углеродных атомов и еще более предпочтительно 2-6 углеродных атомов и содержащей 1-6, предпочтительно 1 двойную связь (винил). Предпочтительные алкенильные группы включают этенил или винил (-СН=СН₂), 1-пропилен или аллил (-СН₂СН=СН₂ ), изопропилен (-С(СН₃)=СН ₂), бицикло [2.2.1] гептен и т.п. В том случае, если алкенил присоединен к атому азота, двойная связь не может находиться в альфа положении к азоту.

Термин «низший алкенил» относится к указанному выше алкенилу, содержащему 2-6 углеродных атомов.

Термин «замещенный алкенил» относится к указанной выше алкенильной группе, содержащей 1, 2, 3, 4 или 5 заместителей, предпочтительно 1, 2 или 3 заместителя, выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, циклоалкила, циклоалкенила, ацила, ациламино, ацилокси, амино, аминокарбонила, алкоксикарбониламино, азидо, циано, галогена, гидрокси, кето, тиокарбонила, карбокси, карбоксиалкила, арилтио, гетероарилтио, гетероциклилтио, тиола, алкилтио, арила, арилокси, гетероарила, аминосульфонила, аминокарбониламино, гетероарилокси, гетероциклила, гетероциклоокси, гидроксиамино, алкоксиамино, нитро, -SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -SO₂-алкила, -SO₂ -арила, и -SO₂-гетероарила. Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители могут необязательно быть замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF₃, амино, замещенной амино, циано, и -S(O)_nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «алкинил» относится к монорадикалу ненасыщенного углеводорода, предпочтительно содержащего 2-20 углеродных атомов, более предпочтительно 2-10 углеродных атомов и еще более предпочтительно 2-6 углеродных атомов, и содержащего, по меньшей мере, 1 и предпочтительно 1-6 участков ацетиленовой (тройная связь) ненасыщенности. Предпочтительные алкинильные группы включают этинил, (-С СН), пропаргил (или пропинил, -С ССН₃) и т.д. В том случае, когда алкинил соединен с атомом азота, тройная связь не может находиться в альфа-положении к азоту.

Термин «замещенный алкинил» относится к указанной выше алкинильной группе, содержащей 1, 2, 3, 4 или 5 заместителей, предпочтительно 1, 2 или 3 заместителя, выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, циклоалкила, циклоалкенила, ацила, ациламино, ацилокси, амино, аминокарбонила, алкоксикарбониламино, азидо, циано, галогена, гидрокси, кето, тиокарбонила, карбокси, карбоксиалкила, арилтио, гетероарилтио, гетероциклилтио, тиола, алкилтио, арила, арилокси, гетероарила, аминосульфонила, аминокарбониламино, гетероарилокси, гетероциклила, гетероциклоокси, гидроксиамино, алкоксиамино, нитро, -SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -SO ₂-алкила, -SO₂-арила, и -SO ₂-гетероарила. Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители могут необязательно быть замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF ₃, амино, замещенной амино, циано, и

-S(O) _nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «аминокарбонил» относится к группе -С(О)NRR, где каждый из R, независимо друг от друга, представляет собой водород, алкил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, или в которой группы R соединены друг с другом с образованием гетероциклической группы (например, морфолино группы). Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители могут быть необязательно замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF₃, амино, замещенной амино, циано, и

-S(O)_n R, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «сложноэфирная группа» или «карбоксисложноэфирная группа» относится к группе -С(О)OR, где R представляет собой алкил, циклоалкил, арил, гетероарил, или гетероциклил, которые могут быть необязательно дополнительно замещены алкилом, алкокси, галогеном, CF₃, амино, замещенной амино, циано, или -S(O)_nR_a , где R_a представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «ациламино» относится к группе -NRC(O)R, где каждый из R, независимо друг от друга, представляет собой водород, алкил, арил, гетероарил или гетероциклил. Все заместители могут быть необязательно замещены алкилом, алкокси, галогеном, CF₃, амино, замещенной амино, циано, или -S(O)_nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «ацилокси» относится к группам -О(О)С-алкил, -О(О)С-циклоалкил, -О(О)С-арил, О(О)С-гетероарил и О(О)С-гетероциклил. Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители могут быть необязательно замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF₃, амино, замещенной амино, циано, и -S(O)_nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «арил» относится к ароматической карбоциклической группе из 6-20 углеродных атомов, содержащей одно кольцо (например, фенил) или несколько колец (например, бифенил), или несколько конденсированных колец (например, нафтил или антрил). Предпочтительные арилы включают фенил, нафтил и т.п. Если не имеется каких-либо иных ограничений, касающихся определения арильного заместителя, то такие арильные группы могут быть необязательно замещены 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, предпочтительно 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, циклоалкила, циклоалкенила, ацила, ациламино, ацилокси, амино, аминокарбонила, алкоксикарбониламино, азидо, циано, галогена, гидрокси, кето, тиокарбонила, карбокси, карбоксиалкила, арилтио, гетероарилтио, гетероциклилтио, тиола, алкилтио, арила, арилокси, гетероарила, аминосульфонила, аминокарбониламино, гетероарилокси, гетероциклила, гетероциклоокси, гидроксиамино, алкоксиамино, нитро, -SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -SO ₂-алкила, -SO₂-арила, и -SO ₂-гетероарила. Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители необязательно могут быть замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF ₃, амино, замещенной амино, циано, и

-S(O) _nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «арилокси» относится к группе арил-О, в которой арильная группа имеет указанные выше значения и включает необязательно замещенные арильные группы, имеющие указанные выше значения. Термин «арилтио» относится к группе R-S-, где R имеет значения указанные для арила.

Термин «амино» относится к группе -NH₂.

Термин «замещенная амино» относится к группе -NRR, в которой каждый из R, независимо друг от друга, выбирают из группы, состоящей из водорода, алкила, циклоалкила, арила, гетероарила, и гетероциклила, при условии, что обе группы R не являются водородом, или группы -Y-Z, в которой Y необязательно замещен алкиленом, а Z представляет собой алкенил, циклоалкенил или алкинил. Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители необязательно могут быть замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF₃, амино, замещенной амино, циано, и -S(O)_nR, в которой R представляет собой алкил, арил, или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «карбоксиалкил» относится к группам -С(О)О-алкил, -С(О)О-циклоалкил, где алкил и циклоалкил имеют указанные выше значения и могут быть необязательно замещены алкилом, алкенилом, алкинилом, алкокси, галогеном, CF₃, амино, замещенной амино, циано, или -S(O)_nR, где R представляет собой алкил, арил, гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «циклоалкил» относится к циклическим алкильным группам из 3-20 углеродных атомов содержащим одно циклическое кольцо или несколько конденсированных колец. Примерами таких циклоалкильных групп могут служить такие однокольцевые структуры, как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклооктил и т.п., или такие структуры с несколькими кольцами, как адамантил и бицикло[2.2.1]гептан, или циклические алкильные группы, с которыми сконденсирована арильная группа, например индан и т.п.

Термин «замещенный циклоалкил» относится к циклоалкильным группам, содержащим 1, 2, 3, 4 или 5 заместителей, и предпочтительно 1, 2 или 3 заместителя, выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, циклоалкила, циклоалкенила, ацила, ациламино, ацилокси, амино, аминокарбонила, алкоксикарбониламино, азидо, циано, галогена, гидрокси, кето, тиокарбонила, карбокси, карбоксиалкила, арилтио, гетероарилтио, гетероциклилтио, тиола, алкилтио, арила, арилокси, гетероарила, аминосульфонила, аминокарбониламино, гетероарилокси, гетероциклила, гетероциклоокси, гидроксиамино, алкоксиамино, нитро, -SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -SO ₂-алкила, -SO₂-арила и -SO ₂-гетероарила. Если не имеется каких-либо иных ограничений, то все заместители необязательно могут быть замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF ₃, амино, замещенной амино, циано, и

-S(O) _nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2.

Термин «галоген» или «гало» относится к фтору, брому, хлору и иоду.

Термин «ацил» обозначает группу -С(О)R, в которой R представляет собой водород, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный циклоалкил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил и необязательно замещенный гетероарил.

Термин «гетероарил» относится к ароматической группе (например, ненасыщенной), включающей 1-15 углеродных атомов и 1-14 гетероатомов, выбранных из кислорода, азота и серы в пределах, по меньшей мере, одного кольца.

Если не имеется каких-либо ограничений, касающихся определения гетероарильных заместителей, такие гетероарильные группы могут быть необязательно замещены 1-5 заместителями, предпочтительно, 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, циклоалкила, циклоалкенила, ацила, ациламино, ацилокси, амино, аминокарбонила, алкоксикарбониламино, азидо, циано, галогена, гидрокси, кето, тиокарбонила, карбокси, карбоксиалкила (алкиловый эфир), арилтио, гетероарила, гетероарилтио, гетероциклилтио, тиола, алкилтио, арила, арилокси, аралкила, гетероарила, аминосульфонила, аминокарбониламино, гетероарилокси, гетероциклила, гетероциклоокси, гидроксиамино, алкоксиамино, нитро, -SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -SO ₂-алкила, -SO₂-арила, и -SO ₂-гетероарила. Если особо не оговорено, то все заместители могут быть необязательно замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF₃, амино, замещенной амино, циано и -S(O)_nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2. Такие гетероарильные группы могут содержать одно кольцо (например, пиридил или фурил) или несколько конденсированных колец (например, индолизинил, бензотиазол, или бензотиенил). Примерами азотных гетероциклов и гетероарилов, без конкретных ограничений, могут служить пиррол, имидазол, пиразол, пиридин, пиразин, пиримидин, пиридазин, индолизин, изоиндол, индол, индазол, пурин, хинолизин, изохинолин, хинолин, фталазин, нафтилпиридин, хиноксалин, хиназолин, циннолин, птеридин, карбазол, карболин, фенантридин, акридин, фенантролин, изотиазол, феназин, изоксазол, феноксазин, фенотиазин, имидазолидин, имидазолин и т.п., а также N-алкоксиазотсодержашие гетероарильные соединения.

Одним из вариантов определения R⁴ в формуле I является гетероарил, например, необязательно замещенный пиразол. Такое определение подразумевает пиразолы, присоединенные:

а) по положению N1 в молекуле пиразола, например, фрагмент пиразол-1-ила формулы:

в которой А обозначает место присоединения к положению 2 соединения формулы I, а R⁵, R⁶ и R⁷, независимо друг от друга, представляют собой водород или те необязательные заместители, что указаны выше для гетероарила; и

b) через любой углеродный атом пиразола, т.е. С-пиразолил формулы:

в которой А обозначает место присоединения к положению 2 соединения формулы I, а R⁸, R⁹ и R¹⁰, независимо друг от друга, представляют собой водород или те необязательные заместители, что указанны выше для гетероарила.

Предпочтительными фрагментами являются необязательно замещенный пиразол-1-ил и необязательно замещенный пиразол-4-ил. Предпочтительными заместителями служат водород, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аралкил, необязательно замещенный гетероарил, и необязательно замещенный гетероаралкил.

Термин «гетероарилокси» относится к группе гетероарил-О-.

Термин «гетероциклил» относится к насыщенному или частично ненасыщенному монорадикалу, содержащему одно или несколько конденсированных колец, состоящему из 1-40 углеродных атомов и 1-10 гетероатомов, предпочтительно, 1-4 гетероатомов, выбранных из азота, серы, фосфора и/или кислорода, входящих в состав кольца.

Если не имеется каких-либо ограничений, касающихся определения гетероциклического заместителея, то такие гетероциклические группы могут быть необязательно замещены 1-5, и предпочтительно 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, циклоалкила, циклоалкенила, ацила, ациламино, ацилокси, амино, аминокарбонила, алкоксикарбониламино, азидо, циано, галогена, гидрокси, кето, тиокарбонила, карбокси, карбоксиалкила, арилтио, гетероарилтио, гетероциклилтио, тиола, алкилтио, арила, арилокси, гетероарила, аминосульфонила, аминокарбониламино, гетероарилокси, гетероциклила, гетероциклоокси, гидроксиамино, алкоксиамино, нитро, -SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -SO₂-алкила, -SO₂-арила и -SO₂ -гетероарила. Если особо не оговорено, то все заместители могут быть необязательно замещены 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из алкила, карбокси, карбоксиалкила, аминокарбонила, гидрокси, алкокси, галогена, CF₃, амино, замещенной амино, циано и -S(O)_nR, где R представляет собой алкил, арил или гетероарил, а n равно 0, 1 или 2. Гетероциклические группы могут содержать одно кольцо или несколько конденсированных колец. Предпочтительные гетероциклические группы включают тетрагидрофуранил, морфолино, пиперидинил и т.п.

Термин «тиол» относится к группе -SH.

Термин «замещенная алкилтио» относится к группе -S- замещенный алкил.

Термин «гетероарилтиол» относится к группе -S-гетероарил, в которой гетероарильный фрагмент имеет указанные выше значения, включая необязательно замещенные гетероарильные группы, также имеющие указанные выше значения.

Термин «сульфоксид» относится к группе -S(O)R, в которой R представляет собой алкил, арил или гетероарил. Термин «замещенный сульфоксид» относится к группе -S(O)R, в которой R представляет собой замещенный алкил, замещенный арил, или замещенный гетероарил, имеющие указанные выше значения.

Термин «сульфон» относится к группе -S(O) ₂R, в которой R представляет собой алкил, арил или гетероарил. Термин «замещенный сульфон» относится к группе -S(O) ₂R, в которой R представляет собой замещенный алкил, замещенный арил, или замещенный гетероарил, имеющие указанные выше значения.

Термин «кето» относится к группе -С(О)-. Термин «тиокарбонил» относится к группе -С(S)-. Термин «карбокси» относится к группе -С(О)-ОН.

Термин «необязательный» или «необязательно» означает, что указанное последующее событие или обстоятельство может происходить или может не иметь места и что описание охватывает те случаи, когда указанное событие или обстоятельство имеет место, как и те случаи, когда этого не происходит.

Термин «соединение Формулы I» охватывает соединения изобретения, упомянутые в описании, а также их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтически приемлемые сложные эфиры и пролекарства.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству соединения Формулы I, которое достаточно для проведения лечения, описанного ниже, путем введения млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от типа субъекта лечения и болезненного состояния, подлежащего лечению, веса и возраста пациента, тяжести болезненного состояния, способа применения и т.п., что может быть легко установлено специалистом данной области.

Термин «лечение» или «обработка» обозначает любое лечение заболевания млекопитающего, включающее:

(i) профилактику болезни, другими словами, предотвращение развития клинических симптомов заболевания;

(ii) подавление заболевания, т.е. задерживание развития клинических симптомов; и/или

(iii) облегчение болезненного состояния, т.е. регрессию клинических симптомов.

Во многих случаях соединения настоящего изобретения способны образовывать кислые и/или основные соли за счет наличия амино и/или карбоксильных или подобных групп. Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям, сохраняющим биологическую эффективность и свойства соединений Формулы I, и не являющимися соединениями нежелательными в биологическом или ином отношениях. Фармацевтически приемлемые аддитивные соли основания могут быть получены из неорганических или органических оснований. Соли, полученные с помощью неорганического основания, включают, например, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния. Соли, являющиеся производными органических оснований, без конкретных ограничений, включают соли первичных, вторичных или третичных аминов, например, алкиламинов, диалкиламинов, триалкиламинов, замещенных алкиламинов, ди(замещенный алкил)аминов, три(замещенный алкил)аминов, алкениламинов, диалкениламинов, триалкениламинов, замещенных алкениламинов, ди(замещенный алкенил)аминов, три(замещенный алкенил)аминов, циклоалкиламинов, ди(циклоалкил)аминов, три(циклоалкил)аминов, замещенных циклоалкиламинов, дизамещенных циклоалкиламинов, тризамещенных циклоалкиламинов, циклоалкениламинов, ди(циклоалкенил)аминов, три(циклоалкенил)аминов, замещенных циклоалкениламинов, дизамещенных циклоалкениламинов, тризамещенных циклоалкениламинов, ариламинов, диариламинов, триариламинов, гетероариламинов, дигетероариламинов, тригетероариламинов, гетероциклических аминов, дигетероциклических аминов, тригетероциклических аминов, смешанных ди- и триаминов, где, по меньшей мере, два заместителя в молекуле амина отличаются друг от друга и их выбирают из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, циклоалкенила, замещенного циклоалкенила, арила, гетероарила, гетероциклической группы и т.п. В эту же группу входят амины, два или три заместителя которых, совместно с атомом азота аминогруппы, образуют гетероциклическую или гетероарильную группу.

Конкретными примерами подходящих аминов могут служить изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, три(изо-пропил)амин, три(н-пропил)амин, этаноламин, 2-диметиламиноэтанол, триметамин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, прокаин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, N-алкилглюкамины, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, морфолин, N-этилпиперидин и т.п.

Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических или органических кислот. Соли, являющиеся производными неорганических кислот, включают соли хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты и т.п. Соли, являющиеся производными органических кислот, включают соли уксусной кислоты, пропионовой кислоты, гликолевой кислоты, пировиноградной кислоты, оксалиновой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфокислоты, этансульфокислоты, п-толуолсульфокислоты, салициловой кислоты, и т.п.

Используемый в тексте термин «фармацевтически приемлемый носитель» охватывает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические вещества и агенты, замедляющие всасывание, и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев несовместимости традиционных сред или агентов с активным ингредиентом, предусматривается их применение в терапевтических композициях. В состав композиций также могут вводиться активные дополнительные ингредиенты.

Наименование и нумерация соединений настоящего изобретения проиллюстрирована на репрезентативном соединении Формулы I, в котором R¹ представляет собой метил, R² представляет собой 4-(4-метоксифенил)пиразол-1-ил, R³ представляет собой гидроксиметил, а Х представляет собой ковалентную связь:

имеющим название:

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол.

Пример способа получения соединений Формулы I, в которой R ² представляет собой необязательно замещенный пиразол-1-ил, представлен Реакционной схемой I.

РЕАКЦИОННАЯ СХЕМА I

где Ас представляет собой ацетил, а Х представляет собой ковалентную связь или необязательно замещенный алкилен.

Стадия 1 - Получение соединения формулы (2)

Соединение формулы (2) получают замещением атома хлора в положении 6 соединения формулы (1), которое получено по методике, описанной J.F. Gorster and R.K. Robins, J. Org. Chem. 1966, vol. 31, 3258-62. Соединение формулы (1) в присутствии основания взаимодействует с соединением формулы R¹XNH ₂, в которой Х представляет собой ковалентную связь или необязательно замещенный алкилен. Реакцию проводят в среде инертного протонного растворителя, например метанола, этанола, н-бутанола и т.п., при температуре в интервале от комнатной до температуры дефлегмации, в течение 12-48 часов. После завершения реакции продукт формулы (2) выделяют традиционными методами, например, удалением растворителя при пониженном давлении, с последующей хроматографической очисткой остатка на силикагеле.

Стадия 2 - Получение соединения формулы (3)

Соединение формулы (3) получают путем взаимодействия соединения формулы (2) с гидратом гидразина. Реакцию проводят в отсутствие растворителя или необязательно в протонном растворителе, например в этаноле, при температуре в интервале от комнатной до температуры дефлегмации, в течение 12-48 часов. После завершения реакции продукт формулы (3) выделяют традиционными методами, например удалением растворителя при пониженном давлении и растиранием продукта в эфире. С другой стороны, соединение формулы (3) может использоваться на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 3 - Получение соединения Формулы I

Соединение формулы (1) получают взаимодействием соединения формулы (3) с необязательно замещенным производным 1,3-пропандиона формулы (4). Реакцию проводят суспендированием соединения формулы (3) в протонном растворителе, предпочтительно в этаноле, добавляя в смесь соединение формулы (4) и нагревая ее с обратным холодильником в течение 2-16 часов. После практически полного завершения реакции продукты Формулы I выделяют традиционными методами, например фильтрацией.

Так, например, используя в качестве исходного вещества соединение формулы (4), в которой R⁵ и R ⁷ представляют собой водород, а R⁶ представляет собой 4-метоксифенил, получают соединение Формулы I, в которой R² представляет собой 4-метоксифенилпиразол-1-ил. Используя в качестве исходного вещества соединение формулы (4), в которой R⁵ и R⁷ представляют собой водород, а R⁶ представляет собой -СО₂Et, получали соединение Формулы I, в которой R² представляет собой 4-этоксикарбонилпиразол-1-ил. Сложноэфирная группа может быть подвергнута гидролизу в основных условиях с получением свободной кислоты, которая, в свою очередь, может быть превращена в такие производные кислоты, как необязательно замещенный амид, с использованием методов, хорошо известных специалисту в данной области, или метода, показанного на Реакционной схеме IA.

Реакционная схема IA

Стадия 1 - Защита соединения Формулы I, в которой R⁶ представляет собой этоксикарбонил

Соединение Формулы I, в которой R⁶ представляет собой этоксикарбонил, растворяют в полярном растворителе, предпочтительно, в ДМФ, и в раствор добавляют имидазол и хлористый третичный бутилдиметилсилил. Реакцию проводят при температуре 50-100°С в течение 12-48 часов. После завершения реакции продукт выделяют традиционными методами, например удалением растворителя при пониженном давлении, с последующей очисткой остатка методом тонкослойной хроматографии на силикагеле.

Стадия 2 - Гидролиз этилового эфира с получением карбоновой кислоты

Продукт со стадии 1 суспендировали в смеси воды, спирта и сильного основания, предпочтительно гидроксида калия в метаноле. Реакцию проводили при температуре 0-40°С, предпочтительно, при 25°С, в течение 2-5 дней, предпочтительно 3 дней. После завершения реакции растворитель удаляют при пониженном давлении, остаток подкисляют до рН 5 и продукт выделяют традиционным способом, например фильтрацией.

Стадия 3 - Получение амида

Продукт, полученный на стадии 2, растворяют в инертном растворителе, предпочтительно дихлорметане, и в раствор добавляют HBTU, HOBt, N-метилморфолин, каталитическое количество DMAP, и необязательно замещенный амин формулы HNRR, указанной выше. Реакцию проводят при температуре 0-40°С, предпочтительно при 25°С, в течение 8-48 часов, предпочтительно 24 часов. После завершения реакции продукт выделяют традиционными методами.

Стадия 4 - Снятие защитной группы

Продукт со стадии 2 обрабатывают раствором фтористого аммония в метаноле. Реакцию проводят при температуре, близкой к температуре дефлегмации, в течение 8-48 часов, предпочтительно 24 часов. После завершения реакции растворитель удаляют при пониженном давлении, остаток подкисляют до рН примерно 5 и продукт выделяют традиционными способами, например методом препаративной ТСХ.

Пример способа получения соединений Формулы I, в которой R² представляет собой необязательно замещенный пиразол-4-ил, проиллюстрирован Реакционной схемой II. Рассматриваемый способ и другие общие методики получения производных пиразол-4-ила описаны в U.S. Patent № 6214807, на полное содержание которого ссылаются в настоящем описании.

РЕАКЦИОННАЯ СХЕМА II

Исходное соединение формулы (5) получают способами, хорошо известными в данной области. Получение промежуточного соединения формулы (9) показано на следующей схеме:

В результате конденсации 1,3-диона формулы (а) с гидразином в среде подходящего растворителя, получают пиразол формулы (b), который подвергают N-алкилированию с использованием подходящего галогенида формулы R⁸Hal, с получением соединения формулы (с). В результате образования аниона в положении 4 с участием сильного основания, с последующим гашением реакции с помощью иода, получают 4-иод производное формулы (9) (F. Effenberger et.al. J. Org. Chem. (1984), 49, 4687).

Иодпиразол формулы (9) превращают в соответствующее соединение формулы (10) в результате палладий опосредованного сочетания с соединением формулы (8) в присутствии или отсутствие солей меди (K. Kato et.al. J. Org. Chem. 1997, 62, 6833-6841; Palladium Reagents and Catalysts-Innovations in Organic Synthesis, Tsuji, John Willey and Sons, 1995). Синтез производного на основе трибутилолова формулы (7) был описан ранее (K. Kato et.al. J. Org. Chem. 1997, 62, 6833-6841) и отображен на Реакционной схеме II.

Пример способа получения соединений Формулы I, в которой R ² представляет собой производное этинила, представлен на Реакционной схеме III.

РЕАКЦИОННАЯ СХЕМА III

где R⁸ представляет собой необязательно замещенный арил или аралкил, а Z представляет собой кислород, серу или -NH-.

Стадия 1 - Получение соединения формулы (12)

Исходное соединение формулы (11) (2-иодаденозин) получают в четыре стадии из гуанозина, следуя известной методике (M.J.Robins et.al. Can. J. Chem. (1981), 59, 2601-2607; J. F. Cerster et.al. Org. Synthesis, 242-243; V. Nair et.al, J.Org. Chem., (1988), 53, 3051-3057).

Соединение формула (12) получают замещением 6-хлор заместителя в соединении формулы (11) по реакции с соединением формулы R ¹XNH₂, в которой Х представляет собой ковалентную связь или необязательно замещенный алкилен, в присутствии основания, следуя той же методике, что описана выше для получения соединения формулы (2).

Стадия 2 - Получение соединения Формулы I

Соединение Формулы I, в которой R² представляет собой производное этинила, получают взаимодействием соединения формулы (12) с соответствующим образом замещенным этинильным производным формулы (13). Реакцию проводят в среде полярного растворителя, предпочтительно ДМФ, в присутствии иодистой меди и дихлорбис(трифенилфосфин)палладия (II) в качестве катализатора, при температуре 50-100°С, предпочтительно в герметичной трубке, в течение 2-16 часов. После завершения реакции продукт Формулы I выделяют традиционными способами, например методом тонкослойной хроматографии.

Предпочтительный способ и окончательные стадии

Соединения настоящего изобретения могут быть получены в соответствии со следующими окончательными стадиями:

1. Взаимодействием соединения формулы:

с соединением формулы:

2. Взаимодействием соединения формулы:

с соединением формулы:

и взаимодействием полученного продукта со слабой кислотой, например фтористым аммонием, с целью удаления защитных групп.

3. Взаимодействием соединения формулы:

с соединением формулы:

в присутствии медной соли и катализатора.

Соединения Формулы I являются эффективными для лечения болезненных состояний, о которых известно, что они реагируют на введение агонистов А₃ аденозиновых рецепторов. Такие состояния, без конкретных ограничений, включают модуляцию процессов пролиферации клеток. В частности, соединения, являющиеся агонистами А₃ рецепторов, находят применение в терапевтическом лечении и/или профилактике рака, сердечных заболеваний (включая применение в качестве ишемически-реперфузионного агента), бесплодия, болезней почек и заболеваний центральной нервной системы (CNS). Кроме этого рассматриваемые соединения обладают ценными свойствами, относящимися к противодействию токсичных побочных эффектов лекарственных средств, в особенности хемотерапевтических агентов, таких как лейкопения и нейтропения.

Тестирование

Тесты на активность проводили в соответствии с методиками, раскрытыми в цитированных выше патентах и заявках на патенты, и описанными в следующих ниже примерах, а также с использованием методов, известных специалисту в данной области.

Фармацевтические композиции

Соединения Формулы I обычно применяют в виде фармацевтических композиций. Вследствие этого, настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента, одно или более соединений Формулы I, или их фармацевтически применимые соли или сложные эфиры, а также один или более фармацевтически применимых наполнителей, носителей, включающих инертные твердые разбавители и заполнители, разбавителей, включающих стерильный водный раствор и различные органические растворители, усилителей проникновения, солюбилизаторов и вспомогательных веществ. Соединения Формулы I могут применяться индивидуально или в комбинации с другими терапевтическими агентами. Такие композиции готовят способами, хорошо известными в области фармацевтики (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 17^th Ed. (1985) and "Modern Pharmaceutics", Marcel Dekker, Inc. 3^rd Ed. (G,S. Banker & C.T. Rhodes, Eds.)

Лечебное применение

Соединения Формулы I могут вводиться в виде однократной или множественной дозы любым из принятых методов применения агентов аналогичного назначения, например, описанных в цитированных патентах или заявках на патенты, включающих ректальное, защечное, интраназальное и трансдермальное применение, с помощью внутриартериальных инъекций, введение лекарственного средства внутривенно, внутрибрюшинно, парентерально, внутримышечно, подкожно, орально, местное применение, применение ингаляцией, или с использованием такого импрегнированного или покрытого лекарством устройства, как стент, или цилиндрический полимер, вставленный в артерию.

Один из способов лечения предусматривает парентеральное введение лекарственного средства, особенно путем инъекции. Формы, в которые могут вводиться новые композиции настоящего изобретения для применения путем инъекций, включают водные или масляные суспензии, или эмульсии, на основе сезамового масла, кукурузного масла, хлопкового масла или арахисового масла, а также эликсиры, манит, декстрозу или стерильный водный раствор и аналогичные фармацевтические носители. Водные растворы в физиологическом растворе также традиционно используются для инъекций, однако такое применение менее предпочтительно в контексте настоящего изобретения. Также могут использоваться этанол, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п. (а также их подходящие смеси), производные циклодекстрина и растительные масла. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, в результате использования покрытий, например из лецитина, сохранением требуемого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может обеспечиваться использованием различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросаля и т.п.

Стерильные растворы для инъекций готовили введением требуемого количества соединения Формулы I в соответствующий растворитель, если требуется, то в присутствии других перечисленных выше ингредиентов, после чего проводили стерилизацию с фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем введения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются сушка в вакууме и лиофилизация, в результате осуществления которых получают порошок активного ингредиента плюс дополнительное количество желательного ингредиента из его стерильно отфильтрованного раствора.

Соединения формулы I могут вводиться перорально. Такое применение может осуществляться с использованием капсулы или таблеток с энтеросолюбильной оболочкой и т.п. При получении фармацевтических композиций, включающих, по меньшей мере, одно соединение Формулы I, активный ингредиент обычно разбавляют инертным наполнителем и/или помещают в носитель, имеющий форму капсул, саше, бумажных и других контейнеров. В том случае, когда инертный наполнитель служит разбавителем, он может представлять собой твердый, полутвердый или жидкий материал (как отмечено выше), выполняющий функции наполнителя, носителя или среды для активного ингредиента. Таким образом, рассматриваемые композиции могут применяться в виде таблеток, пилюль, порошков, лепешек, саше, каше, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердого вещества в жидкой среде), мазей, содержащих, например, до 10 мас.% активного соединения, мягких и твердых желатиновых капсул, стерильных растворов для инъекций, а также стерильно упакованных порошков.

Примерами подходящих инертных наполнителей могут служить лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, манит, крахмалы, аравийская камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатина, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, целлюлоза, стерильная вода, сироп и метилцеллюлоза. Такие рецептуры могут дополнительно включать: такие замасливатели, как тальк, стеарат магния и минеральное масло; смачивающие вещества; эмульгаторы и суспендирующие агенты; такие консерванты, как метил- и пропилгидроксибензоаты; подслащивающие агенты; и вкусовые добавки.

Композиции настоящего изобретения могут формироваться таким образом, чтобы обеспечить быстрое, пролонгированное или замедленное выделение активного ингредиента после введения в организм пациента с использованием методов, известных в данной области. Системы доставки с регулируемым высвобождением лекарства, предназначенные для перорального применения, включают осмотические перекачивающие системы и растворительные системы, содержащие резервуары с полимерным покрытием или рецептуры матриц типа лекарство-полимер. Примеры систем для регулируемого выделения лекарственного средства приведены в U.S. Patent №№ 3845770, 4326525, 4902514 и 5616345. Для другой рецептуры, используемой в способах настоящего изобретения, применяются устройства трансдермальной доставки (типа «пластырь»). Такие трансдермальные пластыри могут использоваться для непрерывного или периодического вливания регулируемых количеств соединений настоящего изобретения. Конструкция и применение трансдермальных пластырей для доставки фармацевтических агентов хорошо известна в данной области. См., например, U.S.Patent №№ 5023252, 4992445 и 5001139. Конструкция таких пластырей может обеспечивать непрерывную, пульсирующую и другую необходимую доставку фармацевтических агентов.

Композиции предпочтительно формировать в виде стандарных лекарственных форм. Термин «стандартные лекарственные формы» относится к физически дискретным блокам, используемым в качестве унифицированных доз для людей и других млекопитающих, причем каждая такая доза содержит определенное количество активного материала, рассчитанное для обеспечения желаемого терапевтического эффекта, совместно с подходящим фармацевтическим наполнителем (например, таблетка, капсула, ампула). Соединения Формулы I обладают эффективностью в широком интервале дозировок и обычно вводятся в фармацевтически эффективном количестве. Для орального применения предпочтительно, чтобы каждая стандартная доза содержала от 10 мг до 2 г соединения Формулы I, более предпочтительно 10-700 мг, а для парентерального применения предпочтительно 10-700 мг соединения Формулы I, более предпочтительно 50-200 мг. Однако следует иметь в виду, что фактически применяемое количество соединения Формулы I определяется терапевтом исходя из релевантных обстоятельств, включающих природу болезненного состояния, подлежащего лечению, выбранный маршрут введения лекарства, природу применяемого соединения и его относительную активность, возраст, вес и реакцию конкретного пациента, тяжесть симптомов заболевания и т.д.

Для приготовления твердых композиций, например, в виде таблеток, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим наполнителем с образованием твердого предсформированного состава, содержащего гомогенную смесь, включающую соединение настоящего изобретения. При упоминании гомогенности предсформированной композиции подразумевается, что активный ингредиент равномерно диспергирован в композиции, вследствие чего такая композиция может быть легко подразделена на стандартные лекарственные формы одинаковой эффективности, например, в виде таблеток, пилюль и капсул.

Таблетки или пилюли настоящего изобретения могут иметь покрытие или как-либо иначе компаундироваться с целью получения стандартной лекарственной формы, преимущество которой состоит в пролонгированном действии, или для защиты от кислотного воздействия в желудке. Так, например, таблетка или пилюля может включать внутренней и внешний компоненты дозировки, причем последний из них представляет собой оболочку первого. Два таких компонента могут быть разделены энтеросолюбильным слоем, который препятствует дезинтеграции в желудке и обеспечивает проход внутреннего компонента без его нарушения в двенадцатиперстную кишку или замедляет его высвобождение. Для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий может использоваться большое число материалов, причем такие материалы включают ряд полимерных кислот и смеси полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Композиции для ингаляции или инсуфляции включают растворы и суспензии в фармацевтически применимых, водных или органических растворителях, их смеси или порошки. Жидкая или твердая композиция может содержать подходящие фармацевтически применимые наполнители, описанные выше. Предпочтительно, чтобы такие композиции применяли пероральным или назально-респираторным методом с целью достижения местного и системного эффекта. Композиции в фармацевтически применимых растворителях могут распыляться с использованием инертных газов. Распыленные растворы могут вдыхаться непосредственно из распыляющего устройства или такое устройство может быть присоединено к лицевой маске или к дыхательному устройству с избыточным давлением. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка могут применяться, предпочтительно перорально или назально, из устройств, обеспечивающих соответствующую доставку рецептуры.

Следующие ниже примеры представлены для демонстрации предпочтительных воплощений изобретения. Для специалиста в данной области должно быть понятно, что методики, раскрытые в следующих примерах, разработаны авторами изобретения для хорошей работы в условиях практической эксплуатации и, таким образом, могут рассматриваться, как предпочтительные способы практической реализации изобретения. Вместе с тем, исходя из приведенного описания, специалисту в данной области нетрудно понять, что, не нарушая сущность и область настоящего изобретения, в раскрытых конкретных воплощениях могут быть произведены многочисленные изменения, все еще обеспечивающие близкие или аналогичные результаты.

ПРИМЕР 1

Получение соединения формулы (2)

А. Получение соединения формулы (2), в которой R ¹ представляет собой метил, а Х представляет собой ковалентную связь

3,4-диацетилокси-2-(2,6-дихлорпурин-9-ил)-5-(2-оксопропокси)-тетрагидрофуран, соединение формулы (1) (1 ммоль), суспендируют в смеси метиламин/МеОН в соотношении 1:1, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. Растворители удаляют при пониженном давлении и остаток растирают в эфире с получением (4S, 2R, 3R, 5R)-2-[2-хлор-6-(метиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диола, соединения формулы (2), в виде белого твердого вещества.

B. Получение соединения формулы (2) с различными R ¹ и Х

Аналогичным образом, следуя описанной выше методике А1, но заменяя метиламин на пропиламин и 3-иодбензиламин, получают следующие вещества формулы (2): (4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(пропиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол; и (4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(3-иодбензиламино)-пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол.

С. Получение соединения формулы (2) с различными R¹ и Х

Аналогичным образом, следуя методике описанной выше в А1, но заменяя метиламин на соединения формулы R¹XNH ₂, получают следующие вещества формулы (2):

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(этиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил]-5-гидроксиметил)-оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(циклопропиламино)пурин-9-ил]-5-гидроксиметил)-оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(циклопропилметиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)-оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(циклопентиламино)пурин-9-ил]-5-гидроксиметил)-оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(анилинопурин-9-ил)]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(4-хлорбензиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(бензиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(2-фторбензиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(пирид-2-иламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол; и

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(пиррол-3-иламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол.

D. Получение соединения формулы (2) с различными R¹ и Х

Аналогичным образом, следуя методике описанной выше в А1, но заменяя метиламин на другие соединения формулы R¹XNH ₂, получают другие вещества формулы (2).

ПРИМЕР 2

Получение соединения формулы (3)

А. Получение соединения Формулы (3), в которой R¹ представляет собой метил, а Х представляет собой ковалентную связь

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-хлор-6-(пропиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)-оксолан-3,4-диол, соединение формулы (2) (0,5 ммоля), суспендируют в гидрате гидразина (5 мл) и полученную смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 24 часов. Гидразин удаляют при пониженном давлении и остаток растирают в эфире и фильтруют с получением (4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразино-6-(метиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диола, соединения формулы (3, в виде белого твердого вещества.

В. Получение соединения формулы (3) с различными R ¹ и X

Аналогичным образом, следуя методике, описанной выше в 2А, но заменяя 2-(2-хлор-6-метиламинопурин-9-ил)-5-гидроксиметилтетрагидрофуран-3,4-диол на пропиламиновый и 3-иодбензиламиновый аналоги формулы (2), получают следующие соединения формулы (3):

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил) оксолан-3,4-диол; и

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол.

С. Получение соединения формулы (3) с различными R¹ и X

Аналогичным образом, следуя методике, описанной выше в 2А, но, заменяя 2-(2-хлор-6-метиламинопурин-9-ил)-5-гидроксиметилтетрагидрофуран-3,4-диол на другие соединения формулы (2), получают следующие соединения формулы (3):

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(этиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(циклопропиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(циклопропилметиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(циклопентиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(анилинопурин-9-ил)]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(4-хлорбензиламино)пурин-9-ил)]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-(бензиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(2-фторбензиламино)пурин-9-ил)]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(пирид-2-иламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол; и

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразин-6-(пиррол-3-иламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол.

D. Получение соединения формулы (3) с различными R¹ и X

Аналогичным образом, следуя методике, описанной выше в 2А, но, заменяя 2-(2-хлор-6-метиламинопурин-9-ил)-5-гидроксиметилтетрагидрофуран-3,4-диол на другие соединения формулы (2), получают другие соединения формулы (3).

ПРИМЕР 3

Получение соединения Формулы I

А. Получение соединения Формулы I, в которой R¹ представляет собой метил, R² представляет собой 4-(4-метоксифенил)пиразол-1-ил, а Х представляет собой ковалентную связь.

(4S,2R,3R,5R)-2-[2-гидразино-6-(метиламино)пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол суспендируют в 3 мл этанола и к полученной суспензии добавляют 2-(4-метоксифенил)малоновый альдегид, соединение формулы (4). Полученную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 5 часов и образовавшийся осадок собирают фильтрацией и промывают этанолом и эфиром с получением (4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}-оксолан-3,4-диола, соединения Формулы I, MS, 455,43 (М+1).

В. Получение соединения Формулы I, с различными R¹ , R² и Х

Аналогичным образом, следуя методике, описанной выше для пункта 3А, но необязательно заменяя 2-(2-гидразино-6-метиламинопурин-9-ил)-5-гидроксиметилтетрагидрофуран-3,4-диол другими соединениями формулы (3), и необязательно заменяя 2-(4-метоксифенил)малоновый альдегид другими соединениями формулы (4), получают следующие соединения Формулы I:

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-этоксикарбонил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-этоксикарбонил)пиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-этоксикарбонил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(3-этоксикарбонил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-этоксикарбонил)пиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(3-этоксикарбонил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(амидо)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(метиламидо)пиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(этиламидо)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пропиламидо)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(циклопентиламидо)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(этиламидо)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метилфенил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метилфенил)пиразолил]-6-(циклопентиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-хлорфенил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиримидин-бил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиримидин-5-ил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиридин-2-ил)пиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиридин-2-ил)пиразолил]-6-(3-иодобензиламин)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиридин-4-ил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиридин-4-ил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиридин-2-ил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(бензоксазол-2-ил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(бензоксазол-2-ил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(пиридин-2-ил)пиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(хинолин-2-ил)пиразолил]-6-(3-метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(изохинолин-1-ил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[3,5-диметилпиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-н-бутил-3,5-диметилпиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол; и

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-н-пропил-3,5-диметилпиразолил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол.

С. Получение соединения Формулы I, с различными R ¹, R² и X

Аналогичным образом, следуя методике, описанной выше в 3А, но необязательно заменяя 2-(2-гидразино-6-метиламинопурин-9-ил)-5-гидроксиметилтетрагидрофуран-3,4-диол другими соединениями формулы (3), и необязательно заменяя 2-(4-метоксифенил)малоновый альдегид другими соединениями формулы (4), получают следующие соединения Формулы I:

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(этиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-этоксикарбонил)пиразолил]-6-(этиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(н-пропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(циклопропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(циклопропилметиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-пропиламидо)пиразолил]-6-(циклопропиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(анилинопурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[пиридин-4-ил)пиразолил]-6-(3-иодбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(бензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(2-фторбензиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(пирид-2-иламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол; и

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[4-(4-метоксифенил)пиразолил]-6-(пиррол-3-илметиламино)пурин-9-ил}оксолан-3,4-диол.

D. Получение соединения формулы (I) с различными R¹, R ² и Х

Аналогичным образом, следуя методике, описанной выше в 3А, но необязательно, заменяя 2-(2-гидрозино-6-метиламинопурин-9-ил)-5-гидроксиметилтетрагидрофуран-3,4-диол на другие соединения формулы (3), и необязательно, заменяя 2-(4-метоксифенил)малоновый альдегид соединениями формулы (4), получают другие соединения формулы (I).

ПРИМЕР 4

Получение соединения формулы (12)

А. Получение соединения формулы (12), в которой R¹ представляет собой метил

Смесь из 40% водного метиламина (1 мл) и 2-иодаденозина (100 мг) в метаноле (2 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 12 часов. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в вакууме с получением 2-иод-6-метиламиноаденозина, соединения формулы (11).

В. Получение соединений формулы (12) с различными R¹

Аналогичным образом, следуя методике, описанной в 4А, но заменяя метиламин другими аминами формулы R¹NH ₂, получают следующие соединения формулы (11):

2-иод-6-н-пропиламиноаденозин; и

2-иод-6-(3-иодбензил)аминоаденозин.

С. Получение соединений формулы (12) с различными R ¹

Аналогичным образом, следуя методике, описанной в 4А, но, заменяя метиламин другими аминами формулы HNRR, получали следующие соединения формулы (11):

2-иод-6-этиламиноаденозин;

2-иод-6-изопропиламиноаденозин;

2-иод-6-н-гексиламиноаденозин;

2-иод-6-циклопропиламиноаденозин;

2-иод-6-циклопентиламиноаденозин;

2-иод-6-(3-гидроксициклопентил)аминоаденозин;

2-иод-6-циклопентилметиламиноаденозин;

2-иод-6-фениламиноаденозин;

2-иод-6-бензиламиноаденозин;

2-иод-6-(4-метоксибензил)аминоаденозин;

2-иод-6-(фторбензил)аминоаденозин;

2-иод-6-(пириди-3-ил)аминоаденозин; и

2-иод-6-(фуран-2-ил)аминоаденозин.

D. Получение соединений формулы (12) с различными R¹

Аналогичным образом, следуя методике, описанной в 4А, но, заменяя метиламин другими аминами формулы HNRR, получали другие соединения формулы (11).

ПРИМЕР 5

Получение соединений формулы I

А. Получение соединения формулы I, в которой R¹ представляет собой метил, R² представляет собой 3-феноксипропин-1-ил, а R⁸ представляет собой фенил.

В раствор 2-иод-6-метиламиноаденозина (50 мг) и проп-2-инилоксибензола (0,22 мл, 0,16 ммоля) в N,N-диметилформамиде (1 мл) и триэтиламине (0,21 мл, 0,16 ммоля) при 23°С добавляют иодистую медь (5 мг, 0,026 ммоля) и дихлорбис(трифенилфосфин)палладий (II) (22 мг, 0,031 ммоля) в качестве катализатора. После перемешивания в закрытой реакционной ампуле при 80°С в течение 6 часов, реакционную смесь концентрируют в вакууме, и остаток очищают методом препаративной тонкослойной хроматографии (хлористый метилен: метанол 9:1) с получением (4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(метиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диола, соединения формулы I. MS: 412,1 (M+1).

В. Получение соединения Формулы I с различными R ²

Следуя методике, описанной выше в 5А, но заменяя проп-2-инилоксибензол другими соединениями формулы (7), получают следующие соединения формулы I:

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[2-(3-гидрокси-3-фенилпроп-1-инил)-6-(метиламино)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-2-{2-[3-(4-хлорфенокси)проп-1-инил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол; и

(4S,2R,3R,5R)-2-{2-[3-(2-метоксифенокси)проп-1-инил]-6-(метиламино)пурин-9-ил}-5-(гидроксиметил)оксолан-3,4-диол.

С. Получение соединения Формулы I с различными R ¹, R² и Х

Следуя методике, описанной выше в 5А, но заменяя проп-2-инилоксибензол другими соединениями формулы (7), получают следующие соединения формулы I:

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(этиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(н-пропиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(изопропиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(н-гексиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(циклопропиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(циклопентиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(3-гидроксициклопентиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(циклопентилметиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(фениламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(бензиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(4-метоксибензиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(4-фторбензиламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(пирид-3-иламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-[6-(фуран-2-иламино)-2-(3-феноксипроп-1-инил)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол.

D. Получение соединения формулы I с различными R¹, R ² и Х

Следуя методике, описанной выше в 5А, но, заменяя проп-2-инилоксибензол другими соединениями формулы (7), получают другие соединения формулы I.

ПРИМЕР 6

Следуя методике, изображенной выше на Реакционной схеме II, детали которой приведены в U.S. Patent № 6214807, получают следующие соединения Формулы I, в которой R² представляет собой необязательно замещенный С-пиразол:

(1-{9-[4S,2R,3R,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-6-(метиламино)пурин-2-ил}пиразол-4-ил)-N-(4-хлорфенил)карбоксамид;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[1-бензилпиразол-4-ил]-6-(метиламино)пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[1-бензилпиразол-4-ил]-6-(н-пропиламино)-пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

(4S,2R,3R,5R)-5-(гидроксиметил)-2-{2-[1-бензилпиразол-4-ил]-6-(3-иодофениламино)-пурин-9-ил] оксолан-3,4-диол;

Следующие примеры иллюстрируют получение репрезентативных фармацевтических рецептур, содержащих соединение Формулы I, например то, что получено в соответствии с Примером 1.

ПРИМЕР 7

Твердые желатиновые капсулы, содержащие следующие ингредиенты:

Ингредиент	Количество (мг/капсулу)
Активный ингредиент	30,0
Крахмал	305,0
Стеарат магния	5,0

Изготавливают путем перемешивания перечисленных выше ингредиенты и полученной смесью заполняют желатиновые капсулы.

ПРИМЕР 8

Состав таблеток готовят с использованием указанных ниже ингредиентов:

Ингредиент	Количество (мг/таблетку)
Активный ингредиент	25,0
Микрокристаллическая целлюлоза	200,0
Коллоидный диоксид кремния	10,0
Стеариновая кислота	5,0

Указанные компоненты смешивают и прессуют с получением таблеток.

ПРИМЕР 9

Сухая порошковая рецептура для ингаляции, содержащая следующие компоненты:

Ингредиент	мас.%
Активный ингредиент	5,0
Лактоза	95

Готовят следующим образом: активный ингредиент смешивают с лактозой и полученную смесь помещают в прибор для ингаляции сухого порошка.

ПРИМЕР 10

Таблетки, каждая из которых содержала 30 мг активного ингредиента, готовят следующим образом:

Ингредиент	Количество (мг/таблетку)
Активный ингредиент	30,0 мг
Крахмал	45,0 мг
Микрокристаллическая целлюлоза	35,0 мг
Поливинилпирролидон ( в виде 10% раствора в стерильной воде)	4,0 мг
Крахмал карбоксиметил натрия	4,5 мг
Стеарат магния	0,5 мг
Тальк	1,0 мг
Всего	120 мг

Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито с размером отверстий №20 меш U.S. и полученную смесь тщательно перемешивают. В полученный порошок примешивают раствор поливинилпирролидона и смесь пропускают через сито с размером отверстий 16 меш US. Полученные в результате гранулы сушат при 50-60°С и пропускают через сито с размером отверстий в 16 меш US. Крахмал карбоксиметил натрия, стеарат магния и тальк предварительно пропускают через сито с размером отверстий в 30 меш US и затем добавляют к гранулам, и полученную смесь прессуют на таблеточной машине с получением таблеток, каждая из которых весит 120 мг.

ПРИМЕР 11

Свечи, каждая из которых содержала 25 мг активного ингредиента, получают следующим образом:

Ингредиент	Количество
Активный ингредиент	25,0 мг
Глицериды насыщенных жирных кислот до	2,000 мг

Активный ингредиент пропускают через сито № 60 и суспендируют в глицеридах насыщенных жирных кислот, которые предварительно расплавляют с использованием минимально необходимого количества тепла. Затем полученную смесь переливают в форму для изготовления свечей с номинальной емкостью 2,0 г и оставляют охлаждаться.

ПРИМЕР 12

Суспензии, каждая из которых содержала 50 мг активного ингредиента в расчете на дозу объемом 5 мл, готовят следующим образом:

Ингредиент	Количество
Активный ингредиент	50,0 мг
Ксантановая смола	4,0 мг
Натрий карбоксиметилцеллюлоза (11%) Микрокристаллическая целлюлоза (89%)	50,0 мг
Сахароза	1,75 г
Бензоат натрия	10,0 мг
Вкусовые и цветовые добавки	q.v.
Очищенная вода до	5,0 мл

Активный ингредиент, сахарозу и ксантановую смолу перемешивают, пропускают через сито с размером отверстий №10 меш US, после чего полученную систему смешивают с заранее приготовленным водным раствором микрокристаллической целлюлозы и натрий карбоксиметилцеллюлозы. Бензоат натрия, вкусовые и цветовые добавки разбавляют в небольшом количества воды и при перемешивании добавляют в полученную выше смесь. После этого систему доводят до требуемого объема, добавляя дополнительное количество воды.

ПРИМЕР 13

Рецептура для подкожного введения может быть получена следующим образом:

Ингредиент	Количество
Активный ингредиент	5,0 мг
Кукурузное масло	1,0 мл

ПРИМЕР 14

Препарат для инъекций готовят с использованием следующей композиции:

Ингредиенты	Количество
Активный ингредиент	2,0 мг
Манит, USP	50 мг/мл
Глюконовая кислота, USP	q.s. (рН 5-6)
вода (дистиллированная, стерильная)	q.s. до 1,0 мл
Газообразный азот, NF	q.s

ПРИМЕР 15

Препарат для местного применения готовят с использованием следующего состава:

Ингредиенты	граммы
Активный ингредиент	0,2-10
Span 60	2,0
Tween 60	2,0
Минеральное масло	5,0
Петролатум	0,10
Метил парабен	0,15
Пропил парабен	0,05
ВНА (бутилированный гидроксианизол)	0,01
Вода	q.s. до 100

Все указанные компоненты, кроме воды, объединяют и нагревают до 60°С при перемешивании. После этого, при интенсивном перемешивании, добавляют достаточное количество воды с температурой 60°С для эмульгации ингредиентов и затем количество воды доводят до 100 г.

ПРИМЕР 16

Композиция пролонгированного действия

Ингредиент	Массовый интервал (%)	Предпочтительный интервал (%)	Наиболее предпочтительный интервал
Активный ингредиент	50-95	70-90	75
Микрокристаллическая целлюлоза (наполнитель)	1-35	5-15	10,6
Сополимер метакриловой кислоты	1-35	5-12,5	10,0
Гидроксид натрия	0,1-1,0	0,2-0,6	0,4
Гидроксипропилметил целлюлоза	0,5-5,0	1-3	2,0
Стеарат магния	0,5-5,0	1-3	2,0

Рецептуры пролонгированного действия настоящего изобретения готовят следующим образом: тщательно смешивают активное соединение, рН-чувствительный связующий компонент и необязательные инертные наполнители (смешивание в сухом состоянии). Затем сухую смесь гранулируют в присутствии водного раствора сильного основания, которое распыляют в смешанном порошке. Гранулят сушат, просевают, смешивают с необязательными замасливателями (например, с тальком или стеаратом магния) и прессуют в таблетки. Предпочтительные водные растворы сильных оснований представляют собой растворы таких гидроксидов щелочных металлов, как гидроксид натрия или калия, предпочтительно гидроксид натрия, в воде (необязательно содержащей до 25% таких смешивающихся с водой растворителей, как низшие спирты).

Полученные в результате таблетки могут быть покрыты необязательным пленко-образователем в целях идентификации, маскировки вкуса и для облегчения проглатывания. Пленкообразующий агент обычно присутствует в количестве 2 и 4% в расчете на массу таблетки. Подходящие пленкообразующие агенты хорошо известны в данной области и они включают гидроксипропилметилцеллюлозу, катионные метакрилатные сополимеры (диметиламиноэтилметакрилат/метилбутилметакрилатные сополимеры - Eudragit®E - Rohm. Pharma) и т.п. Такие пленкообразующие агенты могут необязательно содержать пигменты, пластификаторы и другие дополнительные ингредиенты.

Прессованные таблетки предпочтительно обладают твердостью, достаточной для выдерживания сжатия в 8 кПа. Размер таблетки главным образом зависит от количества активного соединения в таблетке. Таблетки обычно содержат 300-1100 мг соединения в виде свободного основания. Предпочтительно, таблетки содержат производное свободного основания в количестве 400-600 мг, 650-850 мг и 900-1100 мг.

С целью влияния на скорость растворения, регулируют время мокрого смешивания порошка, содержащего активное соединение. Предпочтительное общее время перемешивания порошка, т.е. время воздействия на порошок раствора гидроксида натрия, составляет 1-10 минут, предпочтительно 2-5 минут. После грануляции частицы извлекают из гранулятора и помещают в сушилку с псевдоожиженным слоем для проведения сушки при 60°С.

Сокращения

Gpp(NH)p: 5'-гуанилил-имидидодифосфат

R-PLA: фенилизопропиладенозин

TEM буфер: буфер, содержащий 50 мМ Tris, 1мМ EDTA и 10 мМ MgCI₂

Реагенты

Аденозин деаминазу приобретали у Boehringer Mannheim Biochemicals Indianapolis, IN). R-PIA, DMSO и ролипрам получали от Sigma-RBI (Natick, MA).

Анализ на связывание

Клеточная культура

СНО клетки (клетки яичника китайского хомячка), стабильно трансфекцированные А3 рецепторами человеческого аденозина, выращивали в виде монослоев в чашах Петри с использованием модифицированной по способу Дульбеко среде Игла (DMEM), содержащей 2,5 мкг·мл ^-1 амфотерицина В, 100 ед·мл^-1 пенициллина G, 0,1 мг·мл^-1 сульфата стрептомицина и 5% фетальной коровьей сыворотки, в увлажненной атмосфере из 95% воздуха и 5% СО₂. Клетки субкультивировали дважды в неделю путем диспергирования в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) без двухвалентных катионов, содержащем 1 мМ EDTA. Затем клетки высевали на растительной среде с плотностью 1,2х10⁵ клеток на пластину и спустя четыре дня проводили эксперименты примерно за день до слияния.

Мембранные препараты

Присоединенные клетки дважды промывали HBSS (2x 10мл), соскребали с пластины с помощью резинового скребка в 5 мл 50 мМ Tris-HCI буфера с рН 7,4 при 4°С и полученную суспензию гомогенизировали в течение 10 с. Затем суспензию центрифугировали при 27000 х g в течение 10 минут. Дебрис повторно суспендировали и гомогенизирующем буфере в результате интенсивного перемешивания и подвергали центрифугированию при описанных выше условиях. Окончательный дебрис ресуспендировали в 1 объеме 50 мМ Tris-HCI буфера с рН 7,4, содержащем 5 мМ MgCI ₂ для проведения анализа на связывание. Для проведения [³⁵S]GTP S анализа на связывание конечный дебрис ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCI с HCl рН 7,4, содержащем 5 мМ MgCI ₂, 100 мМ NaCI и 1 мМ дитиотреитола. Полученную мембранную суспензию на 10 минут помещали в жидкий азот, оттаивали и использовали для анализа. Содержание белка определяли с помощью набора Bradford ^TM Assay Kit, с использованием в качестве стандарта сывороточного альбумина.

Анализ на конкурентное связывание

Соединения Формулы I анализировали для определения их сродства к А3 рецепторам человеческого аденозина в мембранах экстрагированных из СНО клеток. 0,2 мг клеточных мембран инкубировали в присутствии аденозин деаминазы и 50 мМ Tris буфера (рН 7,4) при постоянном перемешивании системы. Использовали 2 мкл серийно разбавленного DMSO исходного раствора соединений настоящего изобретения с концентрациями в интервале от 0 до 100 мкм - 10 нМ. В качестве контроля использовали 2 мкл одного DMSO, после чего [ ³H] фенилизопропиладенозин (³Н PIA), агонист А3 рецептора, растворяли в Tris буфере (50 мМ, рН 7,4) и добавляли к клеткам (конечная концентрация 2 нМ). После инкубации при 23°С в течение 2 часов, растворы фильтровали и фильтровальные диски помещали в сцинтилляционную среду. Замену [ ³H] фенилизопропиладенозина в результате конкурентного связывания с композициями настоящего изобретения определяли путем подсчета импульсов.

Данные, полученные в экспериментах по замещению, обычно описываются сигмоидальной кривой, называемой кривой замещения, представляющей собой зависимость процентного количества специфически связанного лиганда, меченного радиоактивным изотопом, от log[вытеснитель], в молях. Абсцисса точки изгиба кривой дает значение IC₅₀, т.е. концентрацию вытеснителя, который замещает или ингибирует 50% специфически связанного радиоактивного лиганда. IC₅₀ представляет собой критерий константы ингибирования или сродства (Ki) вытеснителя относительно рецептора. IC₅₀ и Ki связаны следующим уравнением и если замещение относится к конкурентному типу, тогда

Ki = IC₅₀ /(1+[C*]/K_d*)

В приведенном уравнении Cheng-Pursoff (Biochem. Pharmacol, 22:3099 (1973)) [C*] представляет собой концентрацию радиоактивно меченного лиганда, а K _d* прдеставляет собой его константу диссоциации.

ПРИМЕР 17

Анализ [³⁵ S]GTP S связывания

Способность А₃ -агонистов аденозина к стимуляции [³⁵S]GTP S связывания определяли модификацией метода, описанного Lorenzen et.al. (1996 Mol. Pharmacol. 49:915). Мембраны, выделены из СНО клеток (30-50 мкг) инкубировали в объеме 0,1 мл, содержащем 50 мМ Tris -HCI буфера с рН 7,4, 5 мМ MgCI₂ , 100 мМ NaCI, 1 мМ дитиотретиола, 0,2 единицы мл ^-1 аденозин деаминазы, 0,5% BSA, 1мМ EDTA, 10 мМ GDP, и 0,3 нМ [³⁵S]GTP S. Добавляли различные концентрации PIA или предполагаемых А3 агонистов и клетки инкубировали в течение 90 минут при 30°С. Неспецифическое связывание определяли добавлением 10 мкМ GTP S в некоторые мембранные суспензии. К концу инкубации каждую суспензию отфильтровывали и описанным выше способом определяли остаточную радиоактивность.

ПРИМЕР 18

сАМР анализ

Способность соединений к ингибированию форсколин стимулированного накопления сАМР определяли культивацией СНО ₁ клеток в 96-луночных микротитрометрических планшетах с прозрачным днищем при концентрации 10⁴ -10⁶ клеток на лунку в 40 мкл HBSS при 37°С (5% СО₂ и 95% влажность). СНО клетки инкубировали с различными концентрациями предполагаемых агонистов А₃ рецепторов аденозина в присутствии ролипрама (50 мМ) и 5 мкМ форсколина в течение 10 минут при 37°С. Клетки немедленно подвергали лизису путем обработки 5 мкл 10% бромистого додецилтриметиламмония с последующим встряхиванием в устройстве для встряхивания микропланшетов.

Содержание сАМР в суспензии определяли с использованием модификации метода радиоиммунного анализа, описанного Harper and Brooker (1975. J. Cyclic nucleotide Res 1:207). Вкратце, аликвоту супернатанта (0,01 мл) смешивали с 0,04 мл HBSS, 0,05 мл 50 ммоль/л натрий ацетатного буфера (рН 6,2), содержащего 10 ммоль/л CaCI ₂, [¹²⁵I]ScAMP-TME (12500 dpm), и 0,05 мл анти-сАМР антитела (1:2000 разбавление 0,1% альбумином коровьей сыворотки в дистиллированной воде). Затем образцы инкубировали при 4°С в течение 16 часов. К концу инкубации в каждую пробирку добавляли 70 мкл 50% (мас./об.) гидроксиапатитной суспензии. Полученные суспензии осторожно перемешивали и затем инкубировали в течение 10 минут при 4°С. Радиоактивность, связанную антителом, адсорбированным на гидроксиапатите, собирали на стекловолокнистых фильтрах вакуумной фильтрацией с использованием устройства Brandel для сбора клеток. Остаточную радиоактивность на фильтре подсчитывали в гамма-счетчике. Полученные результаты выражали в виде разности между общим количеством связанного [¹²⁵ I]ScAMP и неспецифически связанного [¹²⁵ I]ScAMP-ТМЕ (т.е. количества [¹²⁵I]ScAMP связанного в присутствии 3 мкмоль/л немеченного сАМР).

Хотя настоящее изобретение описано выше со ссылкой на его специальные воплощения, специалисту в данной области должно быть понятно, что могут быть осуществлены различные изменения и произведена эквивалентная замена, не затрагивающие сущность и область настоящего изобретения. Кроме этого могут быть произведены многочисленные модификации с целью адаптации конкретной ситуации, материала, его состава, способа, технологических стадий процесса к целям, сущности и области настоящего изобретения. Предполагается, что все такие модификации охватываются областью формулы изобретения. На все цитированные патенты и публикации ссылаются в настоящем документе.

Таблица 1

Аффинность связывания 2-(N)-пиразолил-N ⁶-замещенных производных аденозина с рецепторами А ₃, A₁ и А_2А

Таблица 2

Аффинность связывания 2-(С)-пиразолил-N ⁶-замещенных производных аденозина с рецепторами A ₃, A₁ и А_2А

Анализы на конкурентность связывания

Аффинность связывания соединений формулы I для рецепторов А ₃, A₁ и А_2A -аденозина оценивали в анализе радиолигандного связывания, используя клетки СНО, стабильно экспрессирующие рекомбинантный рецептор человека A₁, и клетки НЕК, стабильно экспрессирующие рекомбинантный рецептор человека А_2A и А₃. Радиолигандами для А ₃, A₁ и A_2A -AdoR являлись [¹²⁵I] АВ-МЕСА, [ ³Н]ССРА и [³Н] CGS-21680, соответственно.