конформационно аномальные формы белков тау и специфические антитела к ним

Формула изобретения

1. Антитело со специфичностью к укороченным формам белка тау человека, которые укорочены либо по N-концу, либо по С-концу, либо по обоим концам, причем указанные укороченные формы конформационно отличны от нормального белка тау человека, и указанные укороченные формы включают аминокислотные остатки, по меньшей мере, от аминокислотного остатка 300 до аминокислотного остатка 400 самой длинной изоформы тау человека, содержащей 441 аминокислотный остаток, при этом указанное антитело неспецифично для нормального белка тау и продуцируется депонированными линиями гибридомных клеток DC-11 или DC-11/I, находящимися на хранении в ЕСАСС под номерами 00082215 и 00082216, или обладает специфичностью, составляющей по меньшей мере, 50% к указанным укороченным формам белка тау человека по сравнению с антителом, продуцируемым депонированными линиями гибридомных клеток DC-11 или DC-11/I, находящимися на хранении в ЕСАСС под номерами 00082215 и 00082216.

2. Антитело по п.1, которое обладает специфичностью, составляющей по меньшей мере, 90% к указанным укороченным формам белка тау человека по сравнению с антителом, продуцируемым депонированными линиями гибридомных клеток DC-11 или DC-11/1, находящимися на хранении в ЕСАСС под номерами 00082215 и 00082216.

3. Гибридомная клетка, продуцирующая антитело, охарактеризованное в п.1.

4. Гибридомная клетка по п.3, принадлежащая линии гибридомных клеток DC-11, депонированной в ЕСАСС под номером 00082215.

5. Гибридомная клетка по п.3, принадлежащая линии гибридомных клеток DC-11/1, депонированной в ЕСАСС под номером 00082216.

6. Укороченные формы белка тау человека, которые укорочены по N-или С-концу, или по обоим концам, причем указанные укороченные формы конформационно отличны от нормального белка тау человека, и эти укороченные формы включают аминокислотные остатки, по меньшей мере, от аминокислотного остатка 300 до аминокислотного остатка 400 самой длинной изоформы белка тау человека, содержащей 441 аминокислотный остаток, при этом указанные укороченные формы белка тау человека обладают способностью специфически распознаваться антителом по п.1.

7. Набор для определения или выделения укороченных форм белка тау человека по п.6 в образце ткани мозга или жидкости тела, включающий антитело по п.1 и подходящий контейнер для образца.

8. Набор по п.7, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит средства для определения наличия связывания указанного антитела с укороченными формами белка тау человека, предпочтительно, вторичные антитела, в частности, специфически меченные вторичные антитела.

9. Набор по любому из п.7 или 8, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит средства для количественного определения указанных укороченных форм белка тау человека, в частности, стандартный препарат указанных укороченных форм белка тау человека.

10. Способ определения укороченных форм белка тау человека по п.6 в ткани мозга или жидкости тела пациента, включающий смешивание указанной жидкости тела с антителом по п.1, определение наличия связывания между антителом и укороченной формой белка тау человека, и необязательно, измерение количества укороченной формы белка тау человека, связавшейся с указанным антителом.

11. Применение антитела по п.1 для получения лекарственного средства для лечения больных болезнью Альцгеймера.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к болезни Альцгеймера и другим таупатиям.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) является одним наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, которые клинически характеризуются прогрессирующей и необратимой потерей функций узнавания и поведенческих функций. Заболевание может протекать более 10 лет, развиваясь от умеренных симптомов до экстремально тяжелых проявлений. От БА страдает приблизительно 10% населения возрастом выше 65 лет и 20% населения возрастом выше 80 лет. Результатом развития западного общества является то, что количество пораженных заболеванием растет: на конец 2000 года имеется уже 5 миллионов больных только в США и, приблизительно, будет 18 миллионов людей со старческим слабоумием (деменцией) в мире. Предполагается, что среди них две трети случаев, то есть 12 миллионов, будут представлять собой болезнь Альцгеймера. Это четвертый крупнейший убийца в западном мире после сердечных заболеваний, рака и инфарктов. Количество людей с деменцией быстро растет. В развитых странах к 2025 году предполагается двукратное увеличение количества людей с деменцией по сравнению с 1980 годом. Затраты на уход за заболевшими для общества являются огромными. Например, социальные затраты в США на диагностику и уход за больными АД, преимущественно на опекунство, в настоящее время оцениваются в 80 миллиардов американских долларов ежегодно. В настоящее время не имеется ни пресимптоматического диагностического теста, ни лечения БА. Заболевание, таким образом, клинически диагностируется после появления первичных симптомов путем исключения других форм деменции. Накопление классических клейм, сенильных (невротических) бляшек, нейрофибриллярных узелков (НФУ) в мозге больных БА, описанных баварским психиатром Алоизом Альцгеймером в 1907 году, остается нейропатологической характеристикой БА.

Общими для всех внутриклеточных нейрофибриллярных структур (нейрофибриллярные узелки, дистрофические нейриты и нейропильные нити) являются парные спиральные филаменты (ПСФ). Главной белковой субъединицей ПСФ является ассоциированный с микротрубочками белок тау, в ненормально гиперфосфорилированной форме (Grundke-Iqbal et al., 1986; Wischik et al., 1988 a, b). Нейроны с нейрофибриллярными изменениями дегенерируют, и степень этой дегенерации прямо коррелирует со степенью деменции у пораженных индивидуумов (Blessed et al., 1968).

Нормальный тау является ассоциированным с микротрубочками белком, который распределяется, главным образом, в аксонах. Белок тау принимает участие в модуляции сборки, пространственной организации и поведении микротрубочек (МТ) в нейронах и, по-видимому, в телах глиальных клеток (Drewes et al., 1998; Durbin and Kirschner, 1986; Lo-Presti et al., 1995). Белки тау кодируются одним геном, локализованным в хромосоме 17, но обнаруживаются во множественных изоформах в тканевых экстрактах из мозга взрослых (Goedert et al., 1989; Himmler A., 1989; Kosik et al., 1989). Гетерогенность белков тау частично является результатом альтернативного сплайсинга, приводящего к образованию до шести изоформ в мозге взрослых людей. Эти различные изоформы отличаются друг от друга присутствием или отсутствием 29- или 58-аминокислотной инсерции в аминоконцевой области, а также добавлением или делецией тандемного повтора (который может быть повторен 3 или 4 раза) в карбоксиконцевой области тау, называемой связывающим микротрубочки (МТ) доменом. Эта область состоит из неполных повторов из 31 или 32 аминокислотных остатков. У человека наименьшая изоформа тау содержит 352 аминокислотных остатка с тремя тандемными повторами в МТ-связывающем домене и не содержит ни одной аминоконцевой вставки, а наибольшая изоформа содержит 441 аминокислотный остаток с четырьмя повторами и обе аминоконцевых вставки. Для простоты вся нумерация в настоящем описании относится к самой длинной изоформе белка тау человека, htau40, содержащей все вставки (длиной в 441 аминокислотный остаток), согласно Goedert et al. (1989).

Известно, что многие нейрологические заболевания характеризуются наличием филаментных клеточных включений, содержащих связанный с микротрубочками белок тау, а именно болезнь Альцгеймера (БА), прогрессирующий супрануклеарный паралич (ПСП), кортикобазальная дегенерация (КБД), болезнь Пика (БП) и группа родственных заболеваний, обобщенно именуемых фронтотемпоральной деменцией с синдромом паркинсонизма, связанных с 17 хромосомой (ФТДП-17), амиотропный латеральный склероз (АЛС), болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ), деменция боксеров (ДБ), болезнь Герстмана-Страусслера-Шейнкера (БГСШ), болезнь тела Леви (БТЛ) и болезнь Хантингтона (Dickinson et al., 1998; DiFiglia et al., 1997; Fomo, 1998; Hirano and Zimmerman, 1962; Nishimura et al., 1995; Prusiner 1996; Reed et al., 1998; Roberts, 1998; Schmidt et al., 1996; Shankar et al., 1989; Spillantini et al., 1998). Хотя этиология, клинические симптомы, патологические показатели и биохимический состав включений при этих заболеваниях различны, появляются доказательства, подтверждающие, что механизмы, участвующие в агрегации нормальных клеточных белков в виде различных филаментных включений, сравнимы. Представляется, что начальное изменение конформации ассоциированного с микротрубочками белка тау, которое инициирует образование ядер или зачатков для сборки филаментов, является ключевым моментом. Этот процесс может зависеть от посттрансляционных модификаций нормальных белков, от мутаций или делеций определенных генов и от факторов, которые связывают нормальные белки и, тем самым, изменяют их конформацию. Белок тау очень гидрофилен. Он может быть легко экстрагирован из ткани мозга или культуры клеток. Для сравнения, филамент тау, экстрагированный из ткани мозга при болезни Альцгеймера, является относительно нерастворимым. Помимо фосфорилирования, нерастворимый и нормально растворимый тау отличаются по степени посттрансляционных модификаций, которые включают гликозилирование, глицирование, убихитинирование и рацемизацию (Kenessey et al., 1995; Ко et al., 1999; Mori et al., 1987; Wang et al., 1996; Yan et al., 1994).

Механизм, благодаря которому белок тау модифицируется, принимая участие в образовании филамента при БА, неизвестен. Тау - один из наиболее растворимых из известных белков (Cleveland 1977; a, b; Lee et al., 1988) и поэтому его агрегация при БА является несколько загадочной. Фосфорилировавние тау влияет на возможность тау образовывать агрегаты, вызывая либо стимуляторные, либо ингибиторные эффекты, преимущественно зависящие от сайта фосфорилирования (Crowther et al., 1994; Schnider et al., 1999). Многочисленные исследования in vitro показали, что в присутствии восстанавливающего агента, дитиотреитола (ДТТ), ненасыщенных свободных жирных кислот, РНК или гликозаминогликанов, нормальный тау может быть трансформирован в филаменты (Goedert et al., 1996; Kampers et al., 1996; Perez et al., 1996; Wilson and Binder, 1997). Более того, процесс образования филамента может также быть ускорен в присутствии перекрестносшитого тау, образованного путем окисления по Цис322 (Schweers et al., 1995). Параметры, которые варьировали в исследованиях различного способа образования филамента, включали концентрацию белка тау, рН и ионную силу при инкубации, во много раз превосходящую существующую в цитоплазме при физиологических условиях. Исследования in vivo образовавшихся филаментов тау путем сканирующей трансмиссионной электронной микроскопии (СТЭМ) показали, что эти филаменты отличаются от нативных парных спиральных филаментов (Ksiezak-Reding, 1998). В отсутствие гликанов или РНК не обнаруживается никаких ПСФ-подобных филаментов в образцах, содержащих нефосфорилированный или фосфорилированный тау дикого типа; нормальный тау. Исследования перекрестносшитого, обработанного гепарином тау, показали, что обработка гепарином индуцирует конформационное изменение белка тау (Paudel and Li, 1999). В совокупности, данные in vitro подтверждают, что: а) связывающий микротрубочки домен является важным для сборки филаментов тау; б) образование филаментов тау требует конформационного (ых) изменения (ий) тау. Одновременно эти исследования показывают, что ни одна из описанных модификаций тау не способна сама по себе индуцировать образование филаментного тау, которое коррелирует с клиническим проявлением болезни Альцгеймера. Идентификация и описание факторов, необходимых для инициации изменений тау, приводящих к образованию филамента в условиях заболевания, были бы важны для разработки маркеров пресимптоматической диагностики и терапевтических агентов, воздействующих на развитие таупатий.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является, таким образом, обеспечение подходящей мишени для лекарственных препаратов раннего терапевтического воздействия при болезни Альцгеймера и других таупатиях. Кроме того, желательно получение специфического моноклонального антитела, способного к распознаванию и взаимодействию с данной мишенью для лекарственных препаратов. Это антитело не только должно быть подходящим для пресимптоматического определения молекул, но также для ингибирования и элиминации этих молекул, следовательно, быть подходящим для пресимптоматической диагностики, лечения и предотвращения болезни Альцгеймера и других таупатий.

Эти цели относятся к данному изобретению, которое в одном аспекте касается антитела, являющегося специфическим к аномальным формам белка тау, которые конформационно отличны от нормального тау, причем указанное антитело является неспецифическим к нормальному белку тау. Подобные аномальные формы белка тау представляют собой новую семью молекул, интра- и экстранейронально локализованных, растворимых и нерастворимых, предпочтительно аномально процессированных, форм белков тау, которые конформационно отличны от нормального тау (Novak et al., 1991, 1993). В настоящем изобретении показано, что эти конформационно отличные формы белков тау, называемые "тауонами", согласно настоящей спецификации, являются зачатками, центрами образования ядер для саморазвивающегося процесса формирования филаментных образований тау, который коррелирует с клиническим проявлением болезни Альйгеймера, и, таким образом, тауоны являются важной терапевтической мишенью при болезни Альцгеймера. Тауоны по настоящему изобретению могут быть аномально процессированными белками тау. Биологическая активность тауонов может быть ингибирована in vitro и внутри нейронов антителами по настоящему изобретению. Эти антитела обладают способностью выявлять наличие тауонов на пресимптоматических стадиях I, II и III БА, что делает их подходящим для пресимптоматической диагностики этого заболевания. Решающим для антитела по настоящему изобретению является то, что только конформационно отличная форма белка тау (то есть "тауон") распознается этим антителом, тогда как нормальные белки тау не связываются с антителами по настоящему изобретению.

При осуществлении настоящего изобретения посттрансляционно модифицированные (процессированные) формы ассоциированного с микротрубочками белка тау при БА были очищены до гомогенного состояния и показано, что они представляют собой основную часть филаментного тау, выделенного из нейронов, пораженных болезнью Альцгеймера. Данные аминокислотной последовательности показывают, что остов тауонов не отличается от остова белка тау, но тауоны можно отличить иммунологически от нормального человеческого тау благодаря различной конформации, что выявляют с помощью конформационно специфических моноклональных антител по настоящему изобретению. Конкретными примерами таких антител являются моноклональное антитело DC-11, которое продуцирует гибридомная клеточная линия, хранящаяся в Европейской коллекции клеточных культур (ЕККК) под депозитарным номером №00082216, и моноклональное антитело DC-11/I, которое продуцируется линией гибридомных клеток DC-11/I, хранящейся в ЕККК под депозитарным номером №00082215. Данное семейство моноклональных антител, которого касается настоящее изобретение, характеризуется распознаванием тауон-специфической конформации при отсутствии распознавания нормального растворимого человеческого тау. Отличающаяся конформация, по сравнению с нормальным тау человека, была в патологии присуща аномально посттрансляционно модифицированной по N-концу или по С-концу, или по обеим концам молекуле тау, в образцах, взятых на исследование у пациентов с болезнью Альцгеймера. Интересно, что различная конформация не зависела от изоформ тау и степени фосфорилирования. Непременными патологическими требованиями тауонов является достижение типичной конформации при наличии богатых пролином и связывающих микротрубочки доменов и посттрансляционно модифицированной фланкирующей области(ей). Кроме того, тауоны могут быть отличимы от нормальных тау человека благодаря их патологической активности, а именно тем, что тауоны представляют собой зачатки, центры образования ядер, которые инициируют агрегацию тау, а тауоны разрушают микротрубочки, собранные из нормальных тау и тубулина. Тауоны, предварительно инкубированные с антителами по настоящему изобретению, в частности с моноклональными антителами семейства DC-11, не проявляли способности к разрушению агрегатов, либо собирали агрегаты из микротрубочек из нормального тау и тубулина. Более того, тауоны при микроинъекции в дифференцированные нейроны человека вызывают заметное вытеснение эндогенного тау из фракции связанного с микротрубочками тау, ретракцию нейрональных процессов и дегенерацию клеток. Если тауоны вводятся при микроинъекции вместе с моноклональными антителами по настоящему изобретению, то никаких нейродегенеративных изменений в дифференцированных нейронах не наблюдается. Это показывает, что антитела по настоящему изобретению, в особенности моноклональные антитела DC-11, ингибируют активность тауонов внутринейтронно и поэтому могут быть использованы в качестве внутриклеточных препаратов (например, в качестве терапевтических внутриклеточных антител, интрател). Иммуногистологически, как это видно на примере с антителами по настоящему изобретению, тауоны наблюдаются уже на пресимптоматических стадиях I, II и III в пре- -нейронах, как в трансэнторинальной, так и в энторинальной областях при БА, поэтому, после подходящего связывания метки, антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для витальной пресимптоматической диагностики БА.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению проявляет специфичность, составляющую по меньшей мере 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 90% к конформационно отличной форме тау ("тауону"), по сравнению с антителом DC-11. Специфичность может быть проверена при помощи любого стандартного теста для определения специфичности антител, например ELISA (ИФА), радиоиммуноисследований, атомно-силовой микроскопии со связывающими партнерами, закрепленными на консоли и т.д.

В общем, все антитела, которые являются специфически реактивными по отношению к конформационно отличному белку тау, в частности к его аномально процессированным формам, но не нормально растворимым тау, также включаются в объем настоящего изобретения.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению является "специфически реактивным" по отношению к молекуле, если оно способно связываться с молекулой посредством сцепления молекулы с антителом. Термин "эпитоп" относится к той части антигена, которая может распознаваться и связываться антителом. Антиген может иметь один или более эпитопов. "Антиген" способен индуцировать у животного выработку антитела, способного к связыванию эпитопа данного антигена. Специфическая реакция, указанная выше, показывает, что антиген высокоспецифически иммунореактивен по отношению к соответствующему антителу, но не к множеству других антител, которые могут вырабатываться в ответ на другие антигены.

Особенно предпочтительными антителами по настоящему изобретению являются антитела, производные от депонированной гибридомной линии клеток DC-11 (ЕККК, депозитарный №00082216) и DC-11/I (ЕККК, депозитарный №00082215), проявляющие высокую специфичность и избирательность и реагирующие с конформационно отличной формой тау ("тауоном"), но не с нормальным растворимым тау. Специфичность может быть определена путем любого стандартного доступного теста на определение специфичности антител, например ELISA, радиоиммуноопределение и т.д.

Термин "антитело", используемый здесь, включает интактные молекулы и их фрагменты, а также их синтетические и биологические производные, такие как, например, фрагменты, свободные от Fab, F(ab )₂ и F_v, или экспрессированные, например, на поверхности филаментного фага на pIII или pVIII, или другие белки поверхности, или на поверхности бактерий, которые способны связывать антиген. Фрагменты Fab, F(ab )₂ и F_v, лишенные F_c фрагмента интактного антитела, более быстро выходят из кровообращения и могут иметь меньшее неспецифическое тканевое связывание антител. Кроме того, F_v антитело (часто называемое как миниантитело) может быть более легко сконструировано для переноса на его С-конце специфической метки и использоваться для ранней витальной пресимптоматической диагностики БА, включая стадии I, II и III БА, не связанные со снижением интеллекта, которые распознаются антителами согласно изобретению.

В рамках настоящего изобретения, предпочтительными являются моноклональные антитела или фрагменты моноклональных антител. Таким образом, согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится также к линиям гибридомных клеток, продуцирующим моноклональные антитела, согласно настоящему изобретению.

Термин "тау", как он используется в настоящем описании, относится к наиболее длинной изоформе ассоциированного с микротрубочками человеческого белка тау, содержащего все альтернативно сплайсированные вставки, как это описано М. Goedert et al., 1989.

Согласно другому аспекту настоящей заявки, изобретение относится к аномально процессированной форме белка тау, которая конформационно отлична от белка тау, причем указанная конформационно отличная форма белка тау специфически распознается антителом по настоящему изобретению.

В соответствии с этим настоящее изобретение касается нового семейства интра- и экстранейронально локализованных молекул, растворимых и нерастворимых, аномально посттрансляционно модифицированной формы белков тау, которые конформационно отличны от нормального тау и называются "тауонами".

"Тауоны", таким образом, являются конформационно отличными формами белков тау, которые специфически распознаются антителами по настоящему изобретению. Тауоны, используемые в настоящем изобретении, включают последовательность, согласно Посл. №1, и могут быть фланкированы в дальнейшем аминокислотами (См. Посл. №2, 3). Тауоны содержат от 100 до 400 аминокислот и представляют в этом интервале посттрансляционно модифицированные формы белка тау. Тауоны по настоящему изобретению могут быть аномально посттрансляционно модифицированы по N- и С-концу, или по обоим концам (см. Фиг.2-13). Термин "аномально посттрансляционно модифицированные (аномально процессированные)", как он здесь используется, относится к пептидам тау ("тауонам"), идентифицированным в пораженных нейронах при БА, при помощи специфических моноклональных антител, разработанных согласно настоящему изобретению.

Аномально процессированные формы белков тау человека - тауоны - могут быть получены при помощи любого из многочисленных хорошо известных синтетических рекомбинантных способов. Вкратце, большинство способов, которые используются для трансформации клеток, конструирования векторов, экстрагирования матричной РНК, получения библиотек кДНК и т.п., широко используются в данной области техники, и большинство практиков знакомы со стандартными материалами, которые описывают конкретные условия и процедуры. Однако, для удобства в качестве руководства может служить нижеследующее описание.

Наиболее широко используемой прокариотической системой для получения рекомбинантных белков остается Е. coli, однако штаммы других микроорганизмов могут использоваться, например Bacillus subtilis, различные виды Pseudomonas или штаммы других бактерий. В таких прокариотических системах используются плазмидные векторы, которые содержат сайты репликации и контрольные последовательности, происходящие от вида, совместимого с хозяином. Обычно используемые прокариотические контрольные последовательности включают промоторы для инициации транскрипции, необязательно с оператором, на ряду с последовательностями, содержащими сайт связывания рибосомы.

В настоящее время доступно также широкое разнообразие эукариотических хозяев для продуцирования рекомбинантных чужеродных белков. Как и бактерии, эукариотические хозяева могут быть трансформированы системами экспрессии, которые непосредственно продуцируют желаемый белок, но более распространено, когда обеспечиваются сигнальные последовательности влияющие на секрецию белка. Эукариотические системы имеют дополнительное преимущество, поскольку они способны процессировать интроны, которые могут встречаться в геномных последовательностях кодирующих белков высших организмов. Эукариотические системы также обеспечивают разнообразие механизмов процессинга, которые приводят, например, к гликозилированию, окислению или дериватизации определенных аминокислотных остатков, конформационный контроль и так далее.

Обычно используемые эукариотические системы включают дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих, клетки птиц и клетки высших растений. Этот перечень не исчерпывающий. Имеются подходящие промоторы, которые совместимы и операбельны для использования в каждом из этих типов хозяев, а также концевые последовательности и энхансеры, как например, промотор бакуловируса полигедрона. Как указано выше, промоторы могут быть как коститутивные, так и идуцируемые. Например, в системе млекопитающих промотор MTII может быть индуцирован путем добавления ионов тяжелых металлов.

Специалистам в данной области техники известны детали конструирования систем экспрессии, подходящих для желаемых хозяев. Для рекомбинантной продукции белка, кодирующую ДНК должным образом лигируют в систему экспрессии по выбору, а затем систему трансформируют в клетки совместимого хозяина, которые затем культивируют и поддерживают в условиях, где происходит экспрессия чужеродного гена. Тауоны по настоящему изобретению, полученные таким способом, выделяют из культуры, либо путем лизирования клеток, либо из культуральной среды, в зависимости от того, что является более подходящим для конкретного случая и известно специалистам в данной области техники.

Правильное лигирование плазмидной конструкции может быть подтверждено при первичной трансформации клеток подходящего хозяина в лигирующей смеси. Успешные трансформанты отбираются по устойчивости к ампициллину, тетрациклину или другому антибиотику, или используя другие маркеры, в зависимости от способа конструирования плазмиды, как это известно в данной области техники.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к получению тауонов, в частности, из исходных материалов, происходящих от человека или из рекомбинантных источников, по существу свободных от других белков, в частности от нормальных белков тау. Такое получение может обеспечиваться способами, включающими иммуноаффинную стадию с использованием антител по настоящему изобретению. Предпочтительно, препарат по настоящему изобретению содержит более чем 80% тауонов, в частности более чем 95% тауонов, от общего белка.

Далее, настоящее изобретение относится также к набору для определения тауонов, аномально процессированных форм белка тау, которые являются конформационно отличными от нормального тау, в образце ткани мозга при болезни Альцгеймера или в образце жидкости тела, содержащей антитело по настоящему изобретению, а также подходящий контейнер для образцов. В набор могут быть включены антитела для определения или выделения тауонов. При помощи антител по настоящему изобретению тауоновые белки могут быть определены и выделены из различных источников, включая нейроны при болезни Альцгеймера, из трансэнторинальной и энторинальной областей и гиппокампа. Тауоны, выделенные подобным образом, могут быть далее использованы в качестве иммуногена для иммунизации, например, мышей для конструирования гибридом, продуцирующих специфические моноклональные антитела против тауонов, не распознающие нормальные полноразмерные тау. Этот способ включает идентификацию и выделение нейронов из трансэнторинальной и энторинальной областей и гиппокампа из ткани мозга больных болезнью Альцгеймера в раствор, сохраняющий аномальную конформацию тауонов.

После выделения и очистки тауоны используют в качестве иммуногенов и вводят подкожно мышам с месячными интервалами. Для конструирования гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против тауонов используют селезенки данных мышей. Их можно получить при использовании хорошо известных гибридомных методик, впервые предложенных Kohler and Milstein (см. М.Kohler and С.Milstein, "Continuous Cultures of Fused Cell Secreting Antibody of Pre-Defined Specificity", Nature, 256, pp. 495-497, 1975). После достаточно длительной иммунизации как из селезенки, так и из лимфатических узлов или периферической крови животных получают лимфоциты, продуцирующие антитела. Предпочтительно, лимфоциты получают из селезенки. Затем лимфоциты селезенки сливают с линией клеток миеломы, обычно в присутствии способствующего слиянию агента, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Любая из многочисленных линий миеломных клеток может быть использована в качестве партнера для слияния в соответствии со стандартными методиками, например, линии миелом Р3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653. Затем полученные клетки, которые включают желаемые гибридомы, выращивают на селективной среде, такой как среда HAT, в которой неслившиеся клетки родительской миеломы или клетки лимфоцитов в конце концов погибают. Выживают только гибридомные клетки, которые могут быть использованы в определенных лимитирующих условиях для получения изолированных клонов. Супернатанты гибридом проверяют на наличие антитела желаемой специфичности, например, методом иммунологического анализа, используя антиген, который применялся для иммунизации. Затем положительные клоны можно субклонировать при лимитирующих условиях разбавления или на мягком агаре, а полученные моноклональные антитела можно выделить. Гибридомы, полученные при помощи этих способов, можно размножить in vitro или in vivo (в асцитной жидкости), используя способы, известные в данной области техники. Обычно используемые способы очистки моноклональных антител включают осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию (см., например, Н. Zola et al., "Techniques for the Production and Characterization of Monoclonal Antibodies", in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, J.G.R. Hurrel (ed.), pp. 51-52 (CRC Press 1982)).

Далее, предпочтительно, набор по настоящему изобретению содержит средства для определения наличия связывания указанных антител с конформационно отличными белками тау. Предпочтительны вторичные антитела, в частности вторичные антитела, являющиеся специфически меченными. В рамках настоящего изобретения также может быть использована технология с использованием магнитных шариков, а также и другие способы определения белков, использующие антитела. Данный способ включает определение тауона, который является аномально процессированным белком тау, в испытуемом образце от пациента. Термин "испытуемый (тестируемый) образец", как он используется здесь, относится к биологическому образцу от пациента, который подозревается на наличие тауонов. Испытуемый образец может включать ткань мозга, имеющую аномально процессированные белки тау, такую как ткань гиппокампа или ткань передней коры, или испытуемый образец может включать цереброспинальную жидкость (ЦСЖ). В предпочтительном варианте осуществления изобретения испытуемый образец включает ЦСЖ, а идентифицируемый белок представляет собой ЦСЖ-тауон. Определение аномально процессированных белков тау - тауонов - включает определение в испытуемом образце антигенов, способных к связыванию с антителами, специфически реактивными по отношению к аномально процессированным белкам тау - тауонам, включающим последовательность (Посл. №1) и фланкированным аминокислотными остатками, таким как тауоны длиной в интервале от около 100 до 400 аминокислот и характеризующиеся тауон-специфической конформацией, отличающейся от нормальных растворимых белков тау, или с антителами, специфически реагирующими с аномально процессированными белками тау - тауонами, включающими последовательность (Посл. №1) и фланкированными аминокислотами, такими как тауоны длиной в интервале от около 100 до 400 аминокислот и характеризующиеся тауон-специфической конформацией, отличной от нормального растворимого белка тау. Наличие белка тау свидетельствует о заболевании, связанном с накоплением тауонов у пациентов с БА и у других больных с таупатиями.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способу определения аномально процессированной формы белка тау, которая конформационно отлична от нормального тау, в жидкости тела пациента, включающему смешивание указанной жидкости тела с антителом по настоящему изобретению, определение наличия связывания между антителом и конформационно отличным белком тау (тауоном) и, необязательно, измерение количества конформационно отличного белка тау, связавшегося с указанным антителом. Присутствие тауона указывает на наличие заболевания, связанного с накоплением тауонов у людей, включая БА и другие таупатии. Жидкость тела пациента может представлять любой биологический испытуемый образец от человека, который подозревается на наличие тауонов. Эта жидкость тела может включать ткань мозга, такую как ткань гиппокампа или фронтальная ткань, или ткань коры, или цереброспинальную жидкость (ЦСЖ). В предпочтительном варианте осуществления изобретения тканевая жидкость включает ЦСЖ, а идентифицируемый белок представляет собой ЦСЖ-тауоны.

Настоящее определение тауонов может быть удобно дополнено биохимическими или цитохимическими методами, или ферментными иммунологическими анализами, такими как описываемые во многих руководствах производителей наборов для иммунологических анализов, как это известно в данной области техники. Если используют биохимические способы, то предпочтительно используют от 0,01 до 10 г, обычно от 0,5 до 1 г, ткани, содержащей пораженный болезнью белок тау, прогоняют на геле или производят определение путем Вестерн-блотинга. Такой способ считают пригодным в отсутствие возрастных контролей, которые, как было показано, являются нереактивными к антителам по настоящему изобретению. Цитохимические методы, окрашивание, как было показано, не реактивны по отношению к нормальной ткани.

ЦСЖ от пациентов с БА и пациентов с неврологическим заболеваниями, не связанными с БА, а также от здоровых субъектов, были исследованы при помощи ELISA для количественного определения тауонов. Уровень тауонов в ЦСЖ был значительно повышен у пациентов с БА по сравнению с пациентами с другими неврологическим заболеваниями, не являющимися БА, и с контролями. При БА было обнаружено значительное его увеличение, независимо от возраста генотипа аполипопротеина Е и клинической стадии. Вестерн-блоттинг ЦСЖ при БА показал несколько иммунореактивных полос с видимым молекулярным весом между 50 и 15 кД, содержащих аномально процессированные белки тау. Эти данные показывают, что ЦСЖ-тауоны отражают прогрессирующее накопление пораженных болезнью тау в результате развития БА.

В соответствии с дальнейшим аспектом, антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для получения лекарственных препаратов для лечения пациентов с болезнью Альцгеймера. Антитела могут быть модифицированы биотехнологическими способами в молекулы с одной цепью, снабженные последовательностью-мишенью, способной доставлять их в клетки нейробластомы, экспрессирующие тауоны. В рамках настоящей клеточной модели БА антитела связывают тауоны, воздействуют на их патологические эффекты (секвестрация нормальных тау) и увеличивают деградацию аномально процессированных форм белка тау. При исследованиях in vitro (секвестрация белка тау, сборка филаментов, разрушение микротрубочек) с аномально процессированными белками тау была показана их корреляция со степенью тяжести болезни Альцгеймера и показано, что они являются важными мишенями для лекарств.

Настоящее изобретение будет более детально описано с помощью следующих примеров и чертежей, которыми изобретение не ограничивается:

фиг.1 показывает общую схему получения тауона;

фиг.2 показывает обобщенное схематическое представление аминокислотных последовательностей тауонов;

фиг.3 показывает минимальный тауон;

фиг.4 показывает посттрансляционно модифицированный по С-концу тауон;

фиг.5 показывает посттрансляционно модифицированный по N-концу тауон;

фиг.6 показывает схематическое изображение белка тау;

фиг.7 показывает тау 37 человека;

фиг.8 показывает тау 39 человека;

фиг.9 показывает тау 40 человека;

фиг.10 показывает тау 43 человека;

фиг.11 показывает тау 44 человека;

фиг.12 показывает тау 46 человека;

фиг.13 показывает большой тау крысы.

Примеры

ПРИМЕР 1

Получение моноклональных антител семейства DC 11, специфических к тауонам.

Получение растворимых и нерастворимых тауонов в качестве антигенов для иммунизации (Фиг.1)

Для выделения тауонов из мозга людей, больных БА, был разработан новый подход, который частично основан на методах, описанных Kopke et al. (1993) и Greenberg и Davies (1990). Мозг человека, имеющий изменения, характерные для стадий I-III БА, описанным Braak, отбирали с короткой постмортальной задержкой (ПМЗ). Выделяли блоки темпоральной лобной доли, включающие энторальную и трансэнторальную области, миндалину и гиппокамп. Ткань препарировали и немедленно помещали в минимально достаточную среду (Gibco). Ткань тонко измельчали и пропускали через сито с порами 150 мкм. На данной стадии образец мозга разделяли на две аликвоты: образец А и образец В.

Образец А далее обрабатывали в 20 мМ ТРИС, рН 8, 0,32 М сахарозе, 10 мМ -меркаптоэтаноле, 5 мМ ЭГТА, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgSO ₄, 5 мМ бензамидине, 10 мМ глицерофосфате, 6 мМ фенилметилсульфонилфториде, 50 мМ фториде натрия, 5 мкг/мл лейпептине, 1,5 мкг/мл пепстатине и 2 мкг/мл апротинине и центрифугировали при 25000×g в течение 35 мин при 4°С для удаления клеточных остатков. Супернатант затем центрифугировали при 200000×g в течение 40 мин. Полученный осадок экстрагировали в 8 М мочевине при комнатной температуре в течение 70 мин и затем центрифугировали при 300000×g в течение 45 мин при комнатной температуре. Супернатант диализовали в течение 24 часов против 10 мМ ТРИС рН 7,6 с частыми сменами, а затем диализовали в течение 24 часов против 100 мМ MES, 0,5 мМ MgCl₂ 1 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА, 1 мМ дитиотреитола, 0,75 мМ NaCl, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида и 50 мМ NaF, рН 2,7. Осадившиеся белки удаляли путем центрифугирования при 200000×g в течение 40 мин. Супернатант после 200000×g диализовали против 25 мМ MES, рН 6,4, 0,5 мМ MgCl ₂, 0,1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитола и последовательно фракционировали на колонке с фосфат-целлюлозой, которая была уравновешена тем же самым буфером. Колонку нагружали белками 2 мг/мл и промывали 20 мл линейного градиента NaCl (0-1М) в уравновешивающем буфере. Белки, элюированные при 0,1-0,8 М NaCl, оценивали с помощью Вестерн-блоттинга анализом и концентрировали на скоростном вакуумном аппарате.

Образец В вносили в 10 объемов холодного буфера (10 мМ ТРИС, 1 мМ ЭГТА, 0,8 мМ NaCl, 10% сахароза, рН 7,4) в стеклянном гомогенизаторе. После центрифугирования при 27000×g в течение 30 мин при 4°С супернатант сохраняли, а осадок гомогенизировали в буфере и центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин. Супернатанты после обоих центрифугирований при 27000×g объединяли, доводили до 1% (вес/объем) N-лауроилсаркозином и 1% (объем/объем) -меркаптоэтанолом и инкубировали при 37°С в течение 3 часов на шейкере. После центрифугирования при 35000 об/мин в течение 30 мин осадок гомогенизировали в 5 мл буфера гомогенизации, дополненного 1% меркаптоэтанола, и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Фильтрат центрифугировали при 35000 об/мин в течение 1 часа. Осадок ресуспендировали в 50 мМ Трис, рН 6,8 и экстрагировали 2,5% муравьиной кислотой в течение 2 мин и затем центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин для осаждения нерастворимого материала. Супернатант диализовали в течение ночи при 4°С против 10 мМ Трис, рН 7,4 и центрифугировали, как ранее. Полученный супернатант (фракция II) концентрировали, используя скоростной вакуумный аппарат, и определяли с помощью SDS-PAGE с последующим Вестерн-блоттинг анализом. Осадок образца В после экстракции 2,5% муравьиной кислотой, содержащий нерастворимые тауоны (фракция III), сохраняли и использовали для иммунизации и дот-анализа. Тауоны из фракций (I, II и III) объединяли и использовали в качестве антигенов (Фиг.1) для иммунизации мышей.

Получение гибридом, продуцирующих семейство моноклональных антител DC-11.

Мышей Balb/c шестинедельного возраста разделяли на три группы (А, В и С). Первые две группы (А, В) первично иммунизировали 50 мкг антигена в полном адъюванте Фрейда (Сигма) и затем вторично иммунизировали 50 мкг того же антигена (Аг) в неполном адъюванте Фрейда 5 раз с трехнедельными интервалами. В группе А все дозы вводили в подошвы лап, а в группе В дозы Аг вводили подкожно. В третьей группе мышей делали инъекцию только одной дозой непосредственно в селезенку в растворе PBS (внутриселезеночная иммунизация) и через одну неделю после такого примирования селезенки использовали для слияния. За три дня до слияния мышам из групп А и В внутривенно вводили по 50 мкг иммуногена в PBS. Клетки селезенки иммунизированных мышей использовали для слияния с клетками миеломы NS/0 по методу Konteskova et al., 1988. Спленоциты в количестве 10 ⁸ смешивали с 2×10⁷ клеток миеломы NS/0 (в соотношении 5:1) и сливали в течение 1 минуты в 1 мл 50 PEG 1550 (Serva) в модифицированной среде Дульбекко-Игла (DMEM), свободной от сыворотки, дополненной 10% диметилсульфоксидом. Слившиеся клетки ресуспендировали в среде DMEM, содержащей 20% сыворотки лошади, L-глютамин (2 мМ), гипоксантин (0,1 мМ), аминоптерин (0,004 мМ), тимидин (0,016 мМ) и гентамицин (40 Ед/мл) при плотности 2,5×10⁵ клеток селезенки на лунку в 96-луночных планшетах. Клетки инкубировали в течение 10 дней при 37°С и растущие гибридомы отбирали по продукции антитауон-специфических моноклональных антител методом ELISA и при помощи иммуногистохимии.

Скрининг антитауоновых антител при помощи ELISA.

Метод ELISA использовали для определения моноклональных антител в супернатантах культуры гибридом, которые были направлены непосредственно против тауонов. Использовали твердофазные тауоны, полученные, как описано выше, со следующими модификациями. Пул фракций, полученных при скоростной вакуумной концентрации тауонов, разделяли путем электрофореза на полиакриламидном геле, процессированные формы белка тау выделяли путем электроэлюции по методу Donofrio et al. (1986) и определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Микротитровальные планшеты покрывали в течение ночи аномально модифицированными белками тау (10 мкг/мл, 50 мкг/лунку) при 4°C в PBS. После закрепления 1% обезжиреным сухим молоком для снижения неспецифического связывания, планшеты промывали в PBS-0,05% Твине 20 и инкубировали с 50 мкг/лунку культурального супернатанта в течение 1 часа при 37°С. Связавшиеся моноклональные антитела определяли с помощью овечьего антимышиного Ig, конъюгированного с пероксидазой хрена (DAKO). Реакцию проводили с раствором о-фенилендиаминсульфата в качестве субстрата пероксидазы и останавливали с помощью 50 мкл 2 М H₂ SO₄. Поглощение измеряли при 492 нм на планшет-ридере Multiscan MCC/340 ELISA (Labsystems). Значения, по меньшей мере вдвое превышающие негативные контроли, считали положительными.

Положительные культуры в дальнейшем субклонировали на мягком агаре, согласно процедуре Konteskova et al., 1991. Выделенные субклоны были подвергнуты повторному скринингу на продукцию специфических антитауоновых моноклональных антител.

Иммуногистохимический скрининг антитауоновых антител.

Моноклональные тела, идентифицированные как положительные при антитауоновом ELISA и как негативные по отношению к нормальным тау, были повторно отобраны по их специфичности к ткани мозга больных БА, как описано ниже.

Мозг пациентов с БА, удаленный при аутопсии, разрезали с интервалами в 1 см на корональной пластинке и хранили при -20°С. Блоки гиппокампа, энторинальной, фронтальной, окципитальной и париетальной коры фиксировали в 4% буферном растворе формальдегида в течение более 4 дней. На вибратоме нарезали фронтальные срезы (50 мкм) и хранили в PBS (рН 7,0) при 4°С. Свободно плавающие на поверхности вибратомные срезы предварительно обрабатывали в течение 2-3 мин 98% холодной муравьиной кислотой, инкубировали в преиммунной сыворотке в PBS/Тритон Х 100. Использованная сыворотка была от того же вида животных, что и вторичное антитело. Инкубацию срезов проводили с моноклональным антителом, положительным при анализе методом ELISA (как описано выше), в течение 60 мин при 37°С.

Инкубацию со вторым биотинилированным антителом (Vectastain Elite kit. Vector) проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. Иммунореактивные участки визуализировали авидин-биотин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite kit. Vector) и 6 мг 3-3-диаминобензидин-4 HCl (SIGMA), 250 мг NiCl ₂ (MERCK) в 10 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 6) со 100 мкл Н₂O₂. Реакцию останавливали путем промывания срезов в PBS/Тритоне (Kiss et al., 1988; Cuello et al., 1993; Thorpe and Kerr, 1994).

ПРИМЕР 2

Количественное определение аномально процессированных белков тау (тауонов) с использованием семейства моноклональных антител DC-11

Тауоны выделяли, как описано выше. Комбинация моноклонального антитела DC 30 (распознающего как нормальный, так и патологический тау) и семейства моноклональных антител DC-11 (специфических к аномально процессированному тау) позволяет проводить количественное определение тауонов в испытуемых образцах, полученных из мозга больных БА. Антитела выделяли из свободной от сыворотки среды путем колоночной хроматографии на белке А. Микротитровальные планшеты (Nunc) с лунками с высоким связыванием покрывали смесью моноклональных антител DC-11 в концентрации 10 мкг/мл (50 мкл/лунку) в PBS в течение ночи при 4°С. Неспецифическое связывание в лунках насыщали добавлением 200 мкл 1% обезжиренного сухого молока в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в течение 60 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза в PBS-0,05 Твине 20 (об./об.). Добавляли серийно разведенные стандарты, содержащие рекомбинантные тауоны в концентрациях в интервале 100-1000 пг/мл в PBS, а также испытуемые образцы, содержащие БА-тауоны в количестве 50 мкл. После инкубации в течение 60 мин при 37°С планшеты промывали и добавляли антитело DC 30, конъюгированное с пероксидазой хрена, разведенное 1/5000 в PBS (50 мкл/лунку) на 30 минут при 37°С. После конечной промывки добавляли в лунки по 50 мкл раствора ортофенилендиамина и 0,003% Н₂O₂ и планшеты инкубировали в темноте 20 мин. Реакцию останавливали с помощью 50 мкл 2 М Н₂SO₄. Поглощение при 492 нм считывали планшетным ридером ELISA Multiscan МС 344 (Labsystems, Finland).

Из полученных значений строили стандартную кривую для рекомбинантных тауонов и определяли соответствующие концентрации в испытуемых образцах на основе стандартной кривой.

ПРИМЕР 3

Определение тауонов путем Вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела DC-11

Очищенные рекомбинантные полноразмерные тау человека и аномально процессированные белки тау - тауоны наносили на SDS-полиакриламидные гели с градиентом 5-20% и разгоняли при денатурирующих условиях, согласно Laemmli (1970). После SDS-PAGE производили перенос в течение 1 часа на поливинилдифторидную мембрану (Millipore) в буфере 10 мМ CAPS, pH 12, при 350 мА, при охлаждении. После блоттинга мембрану промывали в PBS и закрепляли в 1% сухом обезжиренном молоке на PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Перенесенные белки инкубировали в течение ночи при 4°С с моноклональным антителом DC-11. После промывания в PBS-0,05% Твином 20 (об./об.) наносили крысиный антимышиный иммуноглбулин, меченный пероксидазой хрена, при разведении 1/1000, и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Затем мембрану промывали четыре раза в PBS-Твине 20, проявляли раствором субстрата (12 мг 4-хлор-1-нафтол, 4 мл метанол, 16 РВ, 0,03% об./об. Н₂O₂), и реакцию останавливали в H₂O. Результаты показали, что антитело DC-11 распознает только аномально процессированные тау - тауоны; напротив, моноклональное антитело DC 30, является антителом для всех тау, распознавая универсально все известные изоформы тау от многих видов (человека, обезьяны, коровы, свиньи, крысы, мыши), независимо от состояния посттрансляционных модификаций.

ПРИМЕР 4

Иммуногистохимическая идентификация тауонов

Семейство моноклональных антител DC-11 пригодно для визуализации таунов мозга при БА при различных видах иммуногистохимических процедур.

Мечение для световой микроскопии

Мозг пациентов с БА, удаленный при аутопсии, разделяли на секции с интервалом в 1 см на корональной пластинке и хранили при -20°С. Блоки гиппокампа, энторинальной, темпоральной, фронтальной, окципитальной и париетальной коры фиксировали в 4% буферном растворе формальдегида при 4°С в течение более 4 дней. Серии фронтальных срезов (50 мкм) нарезали на вибратоме и хранили в PBS (рН 7) при 4°С. Свободно плавающие на поверхности вибратомные срезы обрабатывали в течение 2 мин 98% холодной муравьиной кислотой, инкубировали с преиммунной сывороткой в PBS/Тритоне Х 100. Использованная сыворотка было от того же вида животного, что и вторичное антитело. Инкубацию срезов с моноклональным антителом DC-11 проводили в течение 60 мин при 37°С. Инкубацию со вторичным биотинилированным антителом (Vectastain Elite kit, Vector) проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. Иммунореакции визуализировали с помощью авидин-биотин-пероксидазного комплекса (Vectastain Elite kit, Vector) и 6 мг 3-3-диаминобензидин-4 HCl (SIGMA), 250 мг NiCl₂ (MERCK) в 10 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 6) со 100 мкл Н₂O ₂. Реакцию останавливали путем промывания секций в PBS/Тритоне (Kiss et al., 1988; Cuello et al., 1993, Thorpe and Kerr", 1994).

Двойное мечение для световой микроскопии

Вибратомные срезы, свободно плавающие на поверхности, обрабатывали в течение 2-3 мин 98% холодной муравьиной кислотой, инкубировали с преиммунной сывороткой в PBS/Тритоне Х 100. Использованная сыворотка было от того же вида животного, что и вторичное антитело. Срезы инкубировали с первым моноклональным антителом DC-11, конюгированным с пероксидазой, в разведении 1:1000, в закрепляющем растворе (5% лошадиная сыворотка, PBS, 0,1% Тритон) в течение 60 мин при 37°С, проявляли в 0,06% DAB, 0,01% Н₂О₂ в PBS (рН 7,2). Реакцию останавливали путем промывания срезов в PBS/Тритоне. Инкубацию тех же срезов со вторичным моноклональным антителом проводили в течение 60 мин при 37°С. Инкубацию с биотинилированным антителом (Vectastain Elite kit. Vector) проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакцию визуализировали с помощью авидин-биотин-пероксидазного комплекса (Vectastain Elite kit, Vector) и 0,06% 3-3-диаминобензидин-4 HCl (SIGMA), 0,01% H₂O₂ , 2,5% мг NiCl₂ (MERCK) в 0,1 М ацетатном буфере и останавливали путем промывания секций в 0,1 М ацетатном буфере (Kiss et al., 1988; Cuello, 1993).

Контрастное окрашивание быстрым крезиловым фиолетовым

После завершения иммуногистохимического окрашивания срезы помещали на стеклянные пластинки и оставляли в термостате на 60 мин при 56°С. После выдерживания пластинки помещали в дистиллированную воду на 5 мин, окрашивали раствором быстрого крезилового фиолетового в течение 5-10 мин при 4°С, промывали водой, затем переносили в 96% этанол до тех пор, пока на отмоется большая часть крезилового фиолетового, ополаскивали в ксилоле и заливали в Entellan.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Вибратомные срезы (30 мкм), свободно плавающие на поверхности, обрабатывали в течение 2 мин 98% холодной муравьиной кислотой, инкубировали с преиммунной сывороткой в PBS/Тритоне Х 100. Секции инкубировали с первичным моноклональным антителом DC-11 в течение 60 мин при 37°С, а затем инкубировали в течение 30 мин со вторичным меченным флуоресцином антимышиным антителом козы (Immunotech), разведенным 1:500 в PBS/Тритоне при комнатной температуре, согласно стандартным методикам, используемым в данной области. После промывания PBS срезы инкубировали с меченным TRITS первичным антителом в течение 60 мин при 37°С и заливали 0,1% раствором парафенилендиамина на глицерине.

ПРИМЕР 5

Сборка микротрубочек и определение связывания микротрубочек с тауонами

Выделение тубулина

Тубулин выделяли из свежего мозга свиней, полученного на местной бойне, путем температурно-зависимых циклов полимеризации и деполимеризации микротубулина, с последующей ионообменной хроматографией (Valee, 1986) на фосфоцеллюлозе (Watman Р11).

Определение сборки микротрубочек

Очищенные тауоны (5 мМ) смешивали с предварительно осветленным очищенным тубулином (10 мМ) и ГТФ (1 мМ) в буфере сборки (100 мМ PIPES рН 6,9, 2 мМ ЭГТА, 1 мМ MgSO ₄) при +4°С. Эта концентрация тубулина ниже критической концентрации для спонтанной сборки (Black, 1987). Образцы переносили пипеткой в кварцевые кюветы, предварительно нагретые до 37°С. Изменение мутности определяли спектрофотометрически в термостатически контролируемом спектрофотометре (LKB) и записывали изменения при ОП₃₅₀ с 10-секундными интервалами в течение 30 мин.

Определение связывания микротрубочек

Кривые связывания тауонов с микротрубочками измеряли, как это описано ранее (Gustke, 1992). Очищенный тубулин инкубировали при 37°С в присутствии ГТФ (1 мМ) и таксола (20 мкМ) в буфере связывания (100 мМ PIPES рН 6,9,1 мМ ЭГТА, 1 мМ MgSO ₄,1 мМ ДТТ) в течение 10 мин. Микротрубочки стабилизировали таксолом, который не влияет на связывание тауонов или нормальных белков тау и других MAPs, соответственно (Valee, 1986; Wallis, 1993), тем самым элиминируя эффект сборки микротрубочек. Тауоны добавляли в концентрации 2,5 мМ, 5 мМ, 7,5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, соответственно. После центрифугирования в течение 35 мин при 43000×g, при 37°С осадки ресуспендировали в Р-буфере (50 мМ PIPES рН 6,9, 1 мМ ЭГТА, 0,2 мМ MgCl₂ , 5 мМ ДТТ, 500 мМ NaCl). Супернатант и осадки анализировали на SDS-PFGE гелях (Laemmli, 1970), окрашивали серебром (Bloom, 1987). Гели сканировали на сканере HPScanJet (Hewlett-Packard) и проводили анализ на компьютере Макинтош, используя общедоступную программу NIH распознавания образов (разработанную Национальным институтом здоровья США и доступную в Интернете по http://rsb.info.nih.gov/nih-image/). Интенсивность полос переводили в концентрацию, используя метод внутренних стандартов и калибровочные кривые.

ПРИМЕР 6

Получение рекомбинантных тауонов

Рекомбинантные посттрансляционно модифицированные формы тауонов получали, используя "Erase a Base System" (Promega), согласно техническому руководству. Система основана на специфическом расщеплении экзонуклеазой III встроенной ДНК, начинающегося с выступающего конца 5 . Степень расщепления была однородной при постоянной температуре. Ген тау клонировали в вектор рЕТ17b через сайты рестрикции Ndel-EcoRI, продуцирующие рЕТ/Т40. К С-концу гена добавляли сайт рестрикции KpnI и три стоп-кодона во всех трех рамках считывания по ходу транскрипции сайта KpnI. Фермент EcoRI оставляет выступающие концы 5 , субстрат для экзоIII. KnpI оставляет 3 выступающие концы, которые устойчивы к расщеплению экзоIII. 1 мкг вектора рЕТ/Е40 дважды расщепляли EcoRI, KpnI/NEB, этанольный преципитат разбавляли 20 мкл буфера расщепления IxExoIII и расщепляли 80 ед. exoIII при 37°С при скорости расщепления 450 оснований/мин. После добавления ExoIII переносили по 2,5 мкл образцов с 30-секундными интервалами, по одному образцу, в смесь 7,5 мкл S1-нуклеазы, содержащей 1,5 ед. S1-нуклеазы, на льду. Собранные образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин для удаления оставшихся однонитевых хвостов. Для приготовления тупых концов использовали ДНК-полимеразу Кленова. DH5аlfа-компетентные клетки непосредственно трансформировали лигационными смесями образцов. Субклоны подвергали скринингу по PstI-Xhol рестрикции и подходящие конструкции секвенировали, используя Т7-праймер в векторе рЕТ.

Экспрессия, очистка и количественное определение рекомбинантных тауонов

Тауоны экспрессировали в Е. Coli BL21 (DE3) (Studier, 1986). Одиночные бактериальные клоны инокулировали в 500 мл LB АМР (среда LB, 100 мкг/мл ампициллина). Бактериальные культуры выращивали на роторном шейкере до тех пор, пока их ОП₆₀₀ не достигнет 0,6-0,8, а затем индуцировали путем добавления IPTG (конечная концентрация 0,4 мМ). Через 3 часа бактериальные клетки осаждали путем центрифугирования при 5000 g в течение 15 мин при 4°С (SIGMA 6K15, ротор 12 500), а осадок клеток быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С до дальнейшего использования. Для приготовления лизата осадок бактерий ресуспендировали в буфере А (20 мМ PIPES рН 6,9, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ MgSO₄, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ), клетки разрушали путем озвучивания на льду в течение 6 мин, а клеточные остатки удаляли путем центрифугирования при 45 000 об/мин в течение 15 мин при +2°С (ротор TLA-120.2, Bekman Optima TLX). Супернатанты фильтровали через фильтры 0,22 мкм (Millipore) и тауоны немедленно очищали путем ионообменной хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой (фосфат целлюлозы, Whatman P 11). После нанесения образца колонку промывали 10 объемами буферома А. Тауоны элюировали 20 мл линейного градиента NaCL (50 мМ - 0,5 мМ) в буфере А. Фракции по 1 мл собирали, а те, которые содержали белки, идентифицировали на SDS-PAGE. Фракции, содержащие тауоны, объединяли и диализовали против PBS 3×60 мин при 4°С. Аликвоты после диализа высушивали под вакуумом (SpeedVac) и хранили при -20°С. Рекомбинантные тауоны количественно определяли путем PAGE, используя серийно разбавленный бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве стандартного маркера массы. Гель окрашивали Кумасси голубым, высушивали, а интенсивность полос БСА и тау рассчитывали, используя Scion Image (Beta 3b, Scion Corp.). Строили калибровочную кривую по БСА и использовали для ее количественного подсчета тауонов.

ПРИМЕР 7

Выделение тауонов из мозга людей с БА

Для выделения тауонов из мозга людей с БА был разработан новый подход, частично основанный на методах, описанных Kopke et al. (1993) и Greenber и Davies (1990). Отбирали мозг людей, имеющий изменения, характерные для стадий БА I-III по Braak, с небольшой постмортальной задержкой (ПМЗ). Отбирали блоки темпоральной доли, включая энторинальную и трансэнторинальную области, миндалину и область гиппокампа. Ткань препарировали и немедленно помещали в минимально достаточную среду (Gibco). Ткань тонко измельчали и пропускали через проволочное сито с ячейками в 150 мкм. На этой стадии образцы мозга разделяли на две аликвоты: образец А и образец В.

Образец А далее обрабатывали в 20 мМ ТРИС, рН 8, 0,32 М сахарозе, 10 мМ -меркаптоэтаноле, 5 мМ ЭГТА, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgSO ₄, 5 мМ бензамидине, 10 мМ глицерофосфате, 6 мМ фенилметилсульфонилфториде, 50 мМ фториде натрия, 5 мкг/мл лейпептине, 1,5 мкг/мл пепстатине и 2 мкг/мл апротинине и центрифугировали при 25000×g в течение 35 мин при 4°С для удаления клеточных остатков. Супернатант затем осаждали при 200000×g в течение 40 мин. Конечный осадок экстрагировали 8 М мочевиной при комнатной температуре в течение 70 мин и затем центрифугировали при 300000×g в течение 45 мин при комнатной температуре. Супернатант диализовали в течение 24 часов против 10 мМ ТРИС рН 7,6 с частыми сменами, а затем диализовали в течение 24 часов против 100 мМ MES, 0,5 мМ MgCl ₂, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА, 1 мМ дитиотреитола, 0,75 мМ NaCl, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида и 50 мМ NaF, рН 2,7. Осадившиеся белки удаляли путем центрифугирования при 200000×g в течение 40 мин. Супернатант после 200000×g диализовали против 25 мМ MES, рН 6,4, 0,5 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитола, а затем фракционировали на колонке с фосфат-целлюлозой, которая была уравновешена тем же самым буфером. Колонку нагружали 2 мг белков и элюировали 20 мл линейного градиента NaCl (0-1 М) в уравновешивающем буфере. Белки, элюированные при 0,1-0,8 М NaCl, оценивали Вестерн-блот анализом и концентрировали на скоростном вакуумном аппарате.

Образец В вносили в 10 объемов холодного буфера (10 мМ ТРИС, 1 мМ ЭГТА, 0,8 мМ NaCl, 10% сахарозы, рН 7,4) в стеклянном гомогенизаторе. После центрифугирования при 27000×g в течение 30 мин при 4°С Супернатант сохраняли, а осадок гомогенизировали в буфере и центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин. Супернатанты после обеих центрифугирований при 27000×g объединяли, доводили до 1% (вес/объем) N-лауроилсаркозином и 1% (объем/объем) -меркаптоэтанолом и инкубировали при 37°С в течение 3 часов при встряхивании на шейкере. После центрифугирования при 35000 об/мин в течение 30 мин, осадок гомогенизировали в 5 мл буфера гомогенизации, дополненного 1% меркаптоэтанолом, и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Фильтрат центрифугировали при 35000 об/мин в течение 1 часа. Осадок ресуспендировали в 50 мМ Трис, рН 6,8 и экстрагировали 2,5% муравьиной кислотой в течение 2 мин и затем центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин для осаждения нерастворимого материала. Супернатант диализовали в течение ночи при 4°С против 10 мМ Трис, рН 7,4 и центрифугировали, как ранее. Конечный супернатант концентрировали, используя скоростной вакуумный аппарат, и оценивали на SDS-PAGE с последующим Вестерн-блот анализом.

ПРИМЕР 8

Очистка нормального тау из мозговых тканей человека, свиней и коров

Тау очищали по методу Lindwall и Cole., 1984 с модификациями. Ткань мозга гомогенизировали (1 мг/мл) в 0,1 мМ MES, 0,5 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭГТА, 1 М NaCl рН 6,5 и центрифугировали при 100000×g при 4°С в течение 90 мин. Супернатант доводили до 0,5% (об./об.) 2-меркаптоэтанолом, нагревали при 100°С в течение 5 мин и центрифугировали при 20000×g при 4°С в течение 30 мин. Этот второй супернатант доводили до 45% насыщения (NH ₄)₂SO₄ и центрифугировали при 20000×g, как описано выше, а конечный осадок ресуспендировали в буфере MES без NaCl. После преципитации 2,5% (об./об.) перхлорной кислотой и дальнейшего центрифугирования при 20000×g конечный супернатант диализовали против 5 мМ Трис, рН 7,4 в течение ночи при 4°С.

ПРИМЕР 9

Секвестрация и агрегация нормального тау в узлы филаментов под действием тауонов

Увеличивающиеся количества нормального тау (5-100 мкг/100 мкл) смешивали с фиксированным количеством тауонов, выделенных из фракции I (10 мкг/100 мкл). Реакцию проводили в конечном объеме 100 мкл буфера связывания (100 мМ MES рН 7,6, содержащего 2 мМ ЭГТА, 2% бычьего сывороточного альбумина, 0,5 мМ MgCl₂, 1 мкг апротинина и 20 мкг лейпептина). Смесь оставляли реагировать на 45 мин при комнатной температуре, затем наносили на 150 мкл 80% сахарозы в буфере связывания и центрифугировали в течение 1 часа при 100000×g. Верхние 150 мкл удаляли, а оставшиеся озвучивали для определения взаимодействия между тауонами и нормальными тау путем радиоиммуно-дот-блот-анализа. Наличие тау в слое сахарозы свидетельствует о доле высвобожденных здоровых тау под действием тауонов.

ПРИМЕР 10

Ингибирование дегенерации нейронов семейством моноклональных антител DC-11

Клетки нейробластомы вместе с фактором роста высевали в трехкратной повторности в чашки Петри. Первая группа получала только тауоны, вторая группа получала тауоны и смесь моноклональных антител DC-11.

Обнаружение трансфектных тауонов путем иммунофлуоресценции

Клетки делали проницаемыми, выдерживая в 0,2% Тритоне Х 100, содержащем 80 мМ PIPES, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭГТА, рН 6,6 в течение 5 мин при комнатной температуре. Фиксацию клеток производили в 2% параформальдегиде в том же буфере в течение 15 мин на льду. Тауоны определяли путем обнаружения непрямой иммунофлуоресценции системы детекции авидин родамин (SIGMA).

Определение раннего ингибирования нейрональной дифференциации

Клетки выращивали вместе с факторами, индуцирующими дифференциацию. Оценивали уровень дифференциации. Группа клеток, содержащих тауоны в отсутствие антител, имела значительно ослабленную способность к дифференциации. Однако группа, обработанная смесью тауонов и антител, дифференцировала до уровня, сравнимого с клетками из контрольной группы, обработанной не родственными белками.