штамм а/бак/россия/05 вируса птичьего гриппа, подтип h5n1, предназначенный для разработки средств и методов биологической защиты

Формула изобретения

Штамм вируса птичьего гриппа, подтип H5N1, депонированный в Специализированную коллекцию вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №1141 и предназначенный для приготовления на его основе диагностических тест-систем для специфического выявления РНК вируса птичьего гриппа, подтип H5N1, с помощью полимеразной цепной реакции, определения антигена H5N1, антител к нему с помощью иммуноферментного анализа и вакцины, а также разработки средств и методов биологической защиты в отношении данного возбудителя.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области вирусологии.

Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. В частности, при конструировании вакцин, разработке ОТ-ПЦР тест-системы для выявления РНК вируса птичьего гриппа, подтип H5N1 (далее - H5N1), диагностикумов для определения антигена H5N1 и антител к нему с помощью иммуноферментного анализа, а также разработки средств и методов биологической защиты в отношении данного возбудителя.

Вспышки высокопатогенного гриппа птиц (H5N1) наблюдались среди домашней птицы в 9 странах Азии (Камбодже, Китае, Индонезии, Японии, Лаосе, Южной Корее, Малайзии, Таиланде и Вьетнаме) в конце 2003 г. и начале 2004 г. За данный период более чем 100 миллионов голов птиц погибли от заболевания или были уничтожены [1-4].

В период с 30 декабря 2003 г. по 17 марта 2004 г. зарегистрировано 12 подтвержденных случаев инфицирования гриппом птиц (H5N1) человека в Таиланде, во Вьетнаме - 23, общее число летальных исходов составило 24 случая.

Начиная с конца июня 2004 г. о новых вспышках гриппа птиц (H5N1) среди домашней птицы сообщалось странами Азии: Камбоджей, Китаем, Индонезией, Малайзией, Таиландом и Вьетнамом. В период с августа по октябрь 2004 г. спорадические случаи инфицирования людей вирусом H5N1 наблюдались в Вьетнаме и Таиланде. В феврале 2005 г. сообщалось об инфицировании человека H5N1 в Камбодже, а в июле 2005 г. - в Индонезии.

По состоянию на 21 июля 2005 г. всего зафиксировано 109 случаев инфицирования человека гриппом птиц (H5N1) во Вьетнаме (87), Таиланде (17), Камбодже (4) и Индонезии (1), в 55 случаях заболевание закончилось летальным исходом [1-4].

По данным Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору в июле 2005 г. заболевание птиц "птичьим гриппом" на территории Российской Федерации установлено в 14 населенных пунктах пяти районов Новосибирской области, а также в Алтайском крае, Тюменской, Омской и Курганской областях.

На территорию Российской Федерации возбудитель "птичьего гриппа", предположительно, занесен дикими водоплавающими птицами (утками) из Юго-Восточной Азии.

Так, в конце июля 2005 года при исследовании патологоанатомического материала от больных птиц из Новосибирской области специалистами ВЦ НИИМ МО РФ был выделен и идентифицирован вирус гриппа птиц типа А, подтип H5N1, получивший название штамм А/Бак/Россия/05.

Возможность распространения эпизоотии H5N1, а также возможность инфицирования данным возбудителем людей обуславливает необходимость разработки средств как экстренной профилактики и лечения, так и идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты с использованием выделенного штамма А/Бак/Россия/05.

В практике диагностических исследований для решения этих задач наиболее часто применяют серологические и молекулярно-биологические методы, чувствительность и специфичность которых во многом определяется качеством антигенсодержащего субстрата.

Необходимым элементом при конструировании вакцин, диагностических тест-систем для идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты в отношении H5N1 является наличие культуры штамма иммунологически полноценного антигена биологически активного вируса, обладающего выраженными патогенными, иммуногенными и протективными свойствами. Такого рода исследования предполагают разработку методики выделения возбудителя из клинического материала, выбор оптимального субстрата накопления вируса H5N1, получения культуры штамма и рабочих культур, способа концентрирования и очистки, а также метода щадящей инактивации. Кроме того, необходимо провести выбор животных - продуцентов гипериммунных сывороток по отношению к возбудителю H5N1 и методов получения высокоочищенных препаратов антител к нему. Для оценки эффективности имеющихся и разработки новых неспецифических и специфических медицинских средств защиты необходимо выбрать наиболее чувствительный вид животного к возбудителю H5N1, воспроизводящий основные патогенетические синдромы и симптомы заболевания.

Выделенный штамм А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 не имеет аналогов в Российской Федерации.

Целью настоящего изобретения является получение штамма А/Бак/Россия/05, предназначенного для разработки средств экстренной профилактики и лечения вызываемого им заболевания (вакцин, химиопрепаратов и т.д.); приготовления антигенсодержащего субстрата для идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания в ИФА, а также идентификации РНК вируса H5N1 в ОТ-ПЦР и оценки эффективности средств и методов биологической защиты в отношении возбудителя H5N1.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате вирусологических исследований выделен в июле 2005 г. вирус птичьего гриппа, подтип H5N1, штамм А/Бак/Россия/05 из патологического материала от больных птиц из Новосибирской области. Штамм А/Бак/Россия/05 обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать его при конструировании иммунобиологических препаратов (диагностических тест-систем, иммуноглобулина, вакцины) и оценке их эффективности.

Титр антигена в РГА после проведенного пассажа на РКЭ составил 1:80. Эталонную культуру штамма хранят в виде лиофильно высушенной суспензии аллантоисной жидкости в 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца и антибиотиками при температуре не выше минус (20±2)°С.

Принадлежность к вирусу птичьего гриппа, подтип H5N1, доказана с помощью ОТ-ПЦР тест-системы, а также путем секвенирования фрагмента генома выделенного штамма возбудителя.

Пример выполнения

Полученный штамм А/Бак/Россия/05 вируса птичьего гриппа обладает нижеописанными характеристиками.

1. Родословная штамма А/Бак/Россия/05 вируса птичьего гриппа представлена в соответствии с чертежом.

2. Число пассажей к моменту паспортизации 1.

3. Стандартные условия выращивания in vivo.

Среда культивирования - размножается в развивающихся куриных эмбрионах 9-11-суточного возраста. Температура культивирования вируса H5N1 (36±1)°С.

4. Биологические свойства штамма

Характеристикой вируса H5N1 является высокая репродуктивная способность в развивающихся куриных эмбрионах. Вызывает гибель РКЭ на первые сутки после инфицирования.

5. Устойчивость штамма

Хранение в течение 3 недель (срок наблюдения) лиофилизированной эталонной культуры штамма А/Бак/Россия/05 при температуре минус (20±2,0)°С не вызывает снижения титра антигена в РГА. Хранение в течение двух месяцев (срок наблюдения) жидкой рабочей культуры штамма А/Бак/Россия/05 при температуре минус (20±2)°С также не вызывает снижение титра антигена в РГА.

6. Контроль контаминации культуры штамма

Грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 отсутствуют.

7. Способ лиофилизации

Аллантоисная жидкость на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца.

8. Характеристика эталонного штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 представлена в таблице.

Таблица - Характеристика эталонного штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1
Наименование и обозначение штамма	Место получения штамма	Характеристика штамма				Условия сохранения штамма на предприятии	Условия пассирования штамма	Условия получения маточной культуры (первичный посевной вирус)
		Морфологические свойства	Культуральные свойства	Иммуногенные свойства	Патогенные свойства
Штамм А/Бак/ Россия/05 вируса H5N1	Выделен в июле 2005 г. в Вирусологическом центре НИИ микробиологии МО РФ из патологоанатомического материала от больных птиц из Новосибирской области	Вирионы имеют сферическую форму диаметром 80-100 нм, встречаются нитевидные формы с диаметром 80 нм. Поверхность вириона покрыта шипиками длиной около 10 нм	Размножается в РКЭ	н/д	н/д	Хранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре минус (20±2)°С и ниже в ампулах, запаянных под вакуумом, в виде аллантоисной жидкости на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца	На РКЭ	РКЭ, инфицированные эталонным штаммом на уровне не более 2, 3-го пассажа на РКЭ

Примером наилучшего использования штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 может являться его использование в качестве основы для конструирования различных медицинских иммунобиологических препаратов, вакцины, предназначенной для иммунизации человека (сельскохозяйственных животных), ИФА и ПЦР тест-систем, предназначенных для определения антигена вируса H5N1 в сыворотке крови и аспиратах больных людей и сельскохозяйственных животных, ИФА тест-системы, предназначенной для определения антител к вирусу H5N1 в сыворотке крови людей и сельскохозяйственных животных.

Ампулу с культурой штамма извлекают из холодильника, температура хранения минус (20±2)°С. РКЭ инфицируют вирусом H5N1 в объеме от 0,1 до 0,2 мл вируссодержащей суспензии. Продолжительность культивирования составляет 48 часов при температуре (32,5±0,5)°С.

После инкубации эмбрионы помещают на 12 часов в холодильник при плюс 4°С. Затем вскрывают РКЭ и отбирают аллантоисную жидкость. Вирус концентрируют при использовании системы полиэтиленгликоль-6000-NaCl (7% - 0,3 М) в течение 24 часов при температуре (4±2)°С и осаждают центрифугированием при 2500 об·мин^-1 в течение 20 минут. Осадок ресуспендируют в NTE-буфере и вирус осаждают в линейном градиенте концентрации сахарозы от 10 до 60%. Центрифугирование проводят в роторе SW 27 в течение 2,5 часов при 25000 об·мин^-1 при температуре (4±2)°С.

Культуру штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 извлекают шприцем из опалесцирующего кольца на границе раздела раствора сахарозы от 10 до 60%-ной концентрации и диализуют против NTE-буфера в течение 24 часов при температуре (4±2)°С.

Полученный препарат представляет собой концентрированный очищенный препарат вируса H5N1 штамм А/Бак/Россия/05, который может быть использован:

- в качестве основы при разработке вакцин для человека и сельскохозяйственных животных;

- в качестве диагностикума в ИФА тест-системах для определения антигена к вирусу H5N1 и антител к нему;

- в качестве положительного контрольного образца в ПЦР тест-системе для выявления РНК вируса H5N1.

Штамм А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 депонирован в Специализированную коллекцию вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Вооруженных сил Российской Федерации за №1141.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Centers for Disease Control and Prevention. Cases of influenza A (H5N1)-Thailand, 2004. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep.- 2004. - Vol.53. - P.100-103.

2. Enserink M., Kaiser J. Avian flu finds new mammal hosts. Science. - 2004.-Vol.305. - P.1385.

3. Keawcharoen J., Oraveerakul K., Kuiken T., Fouchier R., Amonsin A., Payungporn S., et al. Avian influenza H5N1 in tigers and leopards. Emerg. Infect. Dis. - 2004. - Vol.10. - P.2189-2191.

4. Cyranoski D. Bird flu data languish in Chinese journals. Nature. - 2004. - Vol.430. P.955.