способ экстрагирования, очистки и ферментативной модификации альфа субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента

Формула изобретения

1. Способ селективного экстрагирования, очистки и ферментативной модификации субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300011/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинина сои, включающий следующие стадии:

a) экстрагирования обезжиренной молотой сои водным раствором бисульфита натрия по объему, в 14-16 раз превышающему массу исходного материала, содержащего 0,98 г/л бисульфита натрия при рН, равном 6,4, с получением обогащенной субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300011/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинином растворимой белковой фракции;

b) осаждения указанной субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300011/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицининовой фракции из стадии а) путем обработки 40% этанолом;

c) очистки осажденной фракции из стадии b) методом аффинной хроматографии с использованием металлов (MAC) на матрице из агарозы, модифицированной иминодиуксусной кислотой, конъюгированной с цинком или никелем в денатурирующих условиях с выделением субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' - субъединицы, при этом денатурирующим агентом является мочевина;

d) осаждения субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' - субъединицы органическими растворителями, которыми является ацетон;

е) ферментативной обработки субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' - субъединицы со стадии с) протеолитическим ферментом химотрипсином с последующей очисткой ее с использованием (MAC);

обогащенную субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300011/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинином фракцию и субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' - субъединицу стабилизируют лиофильной сушкой.

2. Способ по п.1, в котором указанная матрица конъюгирована с цинком.

3. Обогащенная субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300011/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинином фракцию и субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' - субъединица сои, получаемые с помощью способа по пп.1 и 2.

4. Полипептидные фрагменты субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' - субъединицы субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300011/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинина сои, получаемые с помощью способа по пп.1 и 2.

5. Полипептидные фрагменты субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' - субъединицы субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300011/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинина сои по п.4 для использования в качестве лекарственного средства.

6. Аминоконцевой полипептидный фрагмент, получаемый с помощью способа по п.1.

7. Аминоконцевой полипептидный фрагмент по п.6 для использования в качестве лекарственного средства.

8. Применение полипептидных фрагментов субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' - субъединицы субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="/images/patents/163/2300011/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинина из сои по п.4 для получения лекарственных препаратов для лечения гиперлипидемий.

9. Применение полипептидных фрагментов по п.6 для получения лекарственных препаратов для лечения гиперлипидемий.

10. Фармацевтические композиции, содержащие полипептидные фрагменты по п.4 или 6 в чистом виде или в комбинации с другими активными ингредиентами, в смеси с другими приемлемыми носителями.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу экстрагирования, очистки и ферментативной модификации субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинина.

В соответствии с данным изобретением субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинин извлекают методом селективного экстрагирования из молотой обезжиренной сои с последующим осаждением путем обработки экстракта водным раствором этанола; обогащенную фракцию затем подвергают аффинной хроматографии с использованием металлов (MAC) в денатурирующих условиях с получением субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы. Последнюю обрабатывают химотрипсином, после чего подвергают дополнительной стадии аффинной хроматографии с выделением аминоконцевой области указанного полипептида (с молекулярной массой 28000 Да).

Предшествующий уровень техники

Известная холестерин-понижающая способность сои и ее производных обусловлена содержанием в ней изофлавонов (Kirk и др., 1998) и протеинов (Anderson et. al, 1995).

Соевые белки состоят, главным образом, из глицининов (11S фракция) и конглицининов (7S фракция), причем последняя состоит из 3 субъединиц, называемых субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ', субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> и субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -субъединицами (Thanh and Shibasaki, 1976). В ходе исследований, проведенных по изучению белкового состава сои, было установлено, что фракция 7S (Lovati et. al, 1992, 1996), в частности субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединица (Manzoni et. al, 1998) способна активировать рецептор липопротеина низкой плотности (ЛНП), и таким образом, она ответственна, главным образом, за снижение холестерина в плазме крови. Фактически, при обработке линии клеток печени 7S-глобулином происходит индукция экстенсивной деградации субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ' и субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -субъединиц и стимулирование активности ЛНП-рецептора, в то время как субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -субъединицы не деградируют, и стимуляции указанного рецептора не происходит. Более того, соевые мутанты, у которых отсутствует субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -субъединица во фракции 7S, не способны модифицировать активность ЛПН-рецептора даже при высоких концентрациях.

В итоге этих экспериментальных наблюдений стало необходимым получение субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинина в чистом виде, а также извлечение и очистка субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы, из которой затем можно получить специфические аминокислотные последовательности посредством ферментативной обработки без использования пептидного синтеза.

Способ, предложенный Than и др., (1975 и 1976), который был модифицирован в дальнейшем O'Keefe и др., (1991) позволяет разделять глицинины и субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинины на основании их различных показателей растворимости при различных pH; однако его недостаток заключается в том, что наличие примесей в образцах все еще высоко, и необходимо для их очистки проводить гель-фильтрацию и аффинную хроматографию, которые дорогостоящи и представляют трудности для их осуществления в промышленном масштабе. Также модификация, предложенная Nagano и др., (1992), хотя и позволяет увеличить чистоту фракций, он остается дорогостоящим способом, который может быть использован только в лабораторной практике.

В последних публикациях Wu и др., (1999) сообщали об осуществлении способа разделения глицининов и конглицининов в масштабе исследований на пилотной установке. В соответствии с этим методом глицинины осаждают путем проведения двух последовательных водных экстракций при pH 8,5 с последующей обработкой супернатанта с помощью бисульфитного раствора при концентрации 0,98 г/л, в то время как конглицинины осаждают путем прибавления 0,25 M NaCl к маточным жидкостям, полученным при осаждении глицининов, с последующим доведением pH до 4,8. Указанный способ позволяет обрабатывать большие количества исходного материала, а также обеспечивает высокие выходы продукции по белку, однако чистота полученных фракций все еще недостаточна; субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинин, в частности претерпевает деградацию, по-видимому, во время диафильтрации водой, но эта обработка необходима для снижения избыточного количества бисульфитных ионов и удаления солей.

Вышеуказанные способы не только не обеспечивают выход чистых субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицининов, но прежде всего не обеспечивают разделение и очистку субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы.

Согласно настоящему изобретению обогащенную субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинином твердую фракцию получают путем экстрагирования обезжиренной молотой сои в водной среде в соответствии со стандартными методами с последующим осаждением супернатанта при использовании водного раствора этанола; полученную фракцию затем очищают методом аффинной хроматографии с использованием металлов (MAC) в денатурирующих условиях, что дает чистую субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицу, которую подвергают ферментативной обработке химотрипсином с получением аминоконцевой области, которая, как оказывается, обладает высокой активностью по активации ЛНП-рецептора.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу селективного экстрагирования, очистки и ферментативной модификации субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы соевого субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинина, характеризующегося тем, что указанный способ включает следующие стадии:

а) экстрагирования обезжиренной молотой сои водным раствором бисульфита натрия при слабокислом pH c получением растворимой белковой фракции, обогащенной субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинином;

b) осаждения указанной субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицининовой фракции из стадии a) путем обработки этанолом;

c) очистки осажденной фракции из стадии b) методом аффинной хроматографии с использованием металлов (MAC) в денатурирующих условиях с выделением субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы;

d) ферментативной обработки полученной из стадии c) субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы протеолитическим ферментом и последующей очистке с помощью МАС хроматографии;

e) осаждения полученной субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы органическими растворителями.

субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинин обогащают по методике, проиллюстрированной на фиг.1. В качестве исходного материала используют соевую муку, обезжиренную путем удаления липидной фракции с помощью растворителей. Этот материал экстрагируют водным раствором бисульфита натрия при слабокислом pH. Используют раствор, который по объему в 14-16 раз больше массы исходного материала, предпочтительно от 14,5 до 15,5 раз. Концентрация бисульфита варьирует в интервале от 0,80 до 1,20 г/л, предпочтительно от 0,90 до 1,10 г/л и более предпочтительно от 0,95 до 1,05 г/л. Экстрагирование осуществляют в течение промежутка времени от 14 до 18 часов при температуре в интервале от -2 до 8°С. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения экстрагирование осуществляют в течение 16 часов с использованием 15 объемов бисульфитного раствора при концентрации бисульфита 0,98 г/л, при pH 6,4 и при температуре в интервале от 0 до 4°С.

При таких значениях pH и температуры растворимость глицининов очень низка, и поэтому они осаждаются вместе с другим нерастворимым материалом. Преципитат затем отделяют центрифугированием и растворимую фракцию обрабатывают 35-60% (об./об.) водным этанолом, предпочтительно 40% водным этанолом при температуре в интервале от 20 до 30°С, предпочтительно при комнатной температуре, равной 25°С. Супернатант центрифугируют и отделяют, и затем образовавшийся преципитат, главным образом, состоящий из субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинина, лиофилизируют. Полученный порошок подвергают следующей стадии обработки, показанной на фиг.2.

Выбор для разделения и очистки субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы с помощью MAC (Ostrove и Weiss, 1990) зависит от ее способности образовывать координационную связь с ионами металлов, таких как Zn²⁺ и Ni ²⁺, вследствие того, что эта субъединица имеет более высокое содержание гистидина, чем субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> - и субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -субъединицы (Thanh и Shibasaki, 1978).

Используют матрицу, конъюгированную с цинком или никелем, предпочтительно с цинком. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения матрица состоит из агарозы, модифицированной иминодиуксусной кислотой. Лиофилизированный белковый материал суспендируют в денатурирующем буфере, состоящем из 50 мМ Трис, 0,5 M NaCl, pH 7,2 и содержащего от 5 до 8 M мочевины, предпочтительно 5 M мочевины. В этих условиях субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединица избирательно связывается с указанной матрицей, а субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> - и субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -субъединицы могут быть отделены путем элюирования с использованием вышеуказанного буферного раствора; субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицу затем элюируют с помощью 0,1 M имидазола в том же самом буфере или в дистиллированной воде.

Белковую фракцию, обогащенную по субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединице, собирают и обрабатывают органическими растворителями, используемыми для осаждения белков, предпочтительно холодным ацетоном. Ацетон используют в объеме, варьирующем от 2 до 5 раз, большем чем объем белковой фракции, предпочтительно от 3 до 4 объемов, при температуре в интервале от -10 до -30°С, предпочтительно в интервале от -15 до -25°С. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения используют 3 объема ацетона при температуре -20°С. Полученный преципитат отделяют методом центрифугирования, затем ресуспендируют в этаноле, предпочтительно в 95% этаноле, затем опять центрифугируют и сушат методом лиофилизации. Полученный лиофилизат содержит 94% белкового материала, который в 10 раз более обогащен по сравнению с исходным материалом по содержанию субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы.

В таблице 1 приведены выходы по субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинину и субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединице в результате экстракции из соевой муки.

Таблица 1
Белковая фракция	Исходный материал	Выход (мас.%) в результате экстракции
субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Конглицинин	Обезжиренная мука	18,7
субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-Субъединица	субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Конглицинин	11,0
субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-Субъединица	Обезжиренная мука	2,1

Пептидные фрагменты субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы получают из лиофилизата, полученного на предыдущей стадии, который подвергают ферментативному превращению с использованием протеолитического фермента. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения в качестве протеолитического фермента используют химотрипсин, и полученный фрагмент состоит, главным образом, из аминоконцевого участка, который имеет молекулярную массу 28000 Да.

Методика заключается в следующем: лиофилизат, полученный на предыдущей стадии, растворяют при концентрации 5 мг/мл в 0,2 М растворе NH₄ HCO₃, содержащем 1,6 M мочевины при pH в интервале от 7,5 до 8,5. К субстрату прибавляют химотрипсин из расчета от 1:10 до 1: 50, предпочтительно 1:25 мас./мас., и инкубируют при температуре 37°С при перемешивании в течение 24 часов. После этого осуществляют стадию МАС по методике, описанной выше.

Полученный продукт после элюирования имидазолом содержит три полипептидных фрагмента, причем основной фрагмент имеет молекулярную массу 28000 Да, и составляет N-концевую область субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы.

При введении субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы и химотрипсинового фрагмента крысам (Таблица 2) оказалось, что оба способны заметно снижать уровни холестерина и суммарных триглицеридов в плазме крови. В частности, химотрипсиновый фрагмент, как оказалось, не только более эффективен в снижении уровней холестерина в плазме крови, чем другие компоненты сои, но также по сравнению с клофибратом, причем он позволяет получить сопоставимые результаты по триглицеридам.

На основе результатов биологических экспериментов можно сделать предположение о том, что продукты, получаемые в соответствии со способом настоящего изобретения, в частности субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединица и ее фрагменты, могут быть использованы в качестве лекарственных средств, в особенности для лечения патологий, которые требуют снижения уровней холестерина и/или триглицеридов в плазме крови. Указанные соединения можно использовать в чистом виде, или в комбинации с другими активными средствами и в смеси с подходящими носителями, которые используют для получения фармацевтических композиций, в частности для лечения гиперлипидемий. Более того, их можно использовать для получения добавок или пищевых продуктов в схемах диетического питания, назначаемых при вышеуказанных состояниях.

Примеры

Первая стадия. Очистка 7S-глобулина из сои

В качестве исходного материала использовали размолотую сою, обезжиренную в соответствии с методом Soxhlet, используя пентан в качестве растворителя.

Белки экстрагировали с использованием раствора NaHSO₃ при концентрации 0,98 г/л в количествах, в 15 раз превышающих объем обезжиренной размолотой сои, в течение 16 часов при температуре в интервале от 0 до 4°С, поддерживая pH при 6,4. После центрифугирования супернатант обрабатывают 40% этанолом (об./об.) при комнатной температуре. Полученный преципитат, обогащенный по субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинину и содержащий субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицу при концентрации, которая в два раза выше, чем у исходного материала, лиофилизируют.

Вторая стадия. Очистка субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы

Обогащенную субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинином фракцию ресуспендируют в денатурирующем буфере (50 мМ Трис, 0,5M NaCl, pH 7,2), содержащем 5 M мочевины и очищают при помощи MAC на матрице из агарозы, модифицированной иминодиуксусной кислотой (фирмы Sigma), конъюгированной с ионами цинка. Несвязанный белковый материал элюируют с помощью того же самого буфера, приведенного выше, в то время как связанный белковый материал, состоящий главным образом из субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы, элюируют с помощью 0,1 M имидазола в том же самом буфере или в дистиллированной воде.

Обогащенные субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицей фракции обрабатывают 3-4 объемами ацетона при температуре -20°С. Полученный преципитат суспендируют в 40% этаноле при комнатной температуре, затем центрифугируют и сушат методом лиофилизации. Полученный порошок содержит 94% белков и представляет собой в 10 раз более обогащенный продукт по сравнению с исходным материалом по содержанию субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы.

Третья стадия. Ферментативная обработка субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы

Лиофилизат, полученный на предыдущей стадии, растворяют при концентрации 5 мг/мл в 0,2 М растворе NH₄HCO₃, содержащем 1,6 M мочевины при pH в интервале от 7,5 до 8,5. Полученный раствор затем обрабатывают химотрипсином в соотношении 1:25 мас./мас. к белковому субстрату и инкубируют при перемешивании при температуре 37°С в течение 24 часов, после этого осуществляют очистку с использованием МАС по методике, описанной выше. Продукт, оставшийся на смоле и элюированный 0,1М имидазолом, содержит три полипептидных фрагмента, причем основной фрагмент из них имеет молекулярную массу 28000 Да и составляет N-концевую область субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы.

Биологические эксперименты

Животные

В экспериментах использовали самцов крыс CD SPF/VAF весом 75-100 г. Животных содержали в макролоновых клетках (по 4-5 животных на клетку) в условиях с автоматическим регулированием света (циклы по 12 часов света и 12 часов темноты) при температуре (21±1°С) и относительной влажности (60±5%).

Протокол экспериментов

Через 7 дней содержания животных разделяли рандомизированным методом на семь групп по 20 крыс в каждой группе (Таблица 2). В течение 28 дней одна группа получала обычный пищевой рацион (код 014RF25C; от Mucedola S.r.l., Settimo Milanese, MI, Италия), в то время как другие получали рацион с гипохолестеринемическим действием, содержащим 1% холестерина, 0,5% холевой кислоты и 25% гидрогенизированного кокосового масла (партия 332000, изготовленная 01.09. 2000 в Laboratorio Dottori Piccioni, Gessate, MI, Италия), при этом животные имели доступ к воде без ограничения. Этот рацион крысы получали ежедневно (по 40 г в 09.00 утра), при этом непотребленный остаток пищи взвешивали. Лечение осуществляли по следующей методике.

Группа 1 (контрольная): животные получали обычный пищевой рацион и им перорально вводили в течение 28 дней 0,5% раствор карбоксиметилцеллюлозы.

Группа 2: животные получали гиперхолестеринемический пищевой рацион и им перорально вводили в течение 28 дней 0,5% раствор карбоксиметилцеллюлозы.

Группа 3: животные получали гиперхолестеринемический пищевой рацион и им перорально вводили в течение 28 дней клофибрат в дозе 200 мг/кг.

Группа 4: животные получали гиперхолестеринемический пищевой рацион и им перорально вводили в течение 28 дней экстракт общего белка сои (TPE) в дозе 200 мг/кг.

Группа 5: животные получали гиперхолестеринемический пищевой рацион и им перорально вводили в течение 28 дней субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конглицинин в дозе 50 мг/кг.

Группа 6: животные получали гиперхолестеринемический пищевой рацион и им перорально вводили в течение 28 дней субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицу в дозе 10 мг/кг.

Группа 7: животные получали гиперхолестеринемический пищевой рацион и им перорально вводили в течение 28 дней фрагмент субъединицы 7s-глобулина сои для использования в качестве гипохолестеринемического агента, патент № 2300898" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> '-субъединицы, полученный обработкой химотрипсином, в дозе 1 мг/кг.

Суммарное содержание холестерина и триглицеридов в плазме измеряли в конце 28-дневного периода лечения и через 16 часов голодной выдержки. Испытуемых животных усыпляли этиловым эфиром и делали забор крови из нижней полой вены в пробирки с EDTA(1мг/мл). После центрифугирования в течение 15 минут при 4°С при скорости центрифуги 3000 об/мин плазму извлекали, замораживали и хранили при -20°С до определения показателей.

Суммарные концентрации холестерина и триглицеридов в плазме (результаты приведены в Таблице 2) определяли стандарными методами иммуноферментного анализа.

Таблица 2
Лечение	Суммарный холестерин (мг/дл)	Суммарное содержание триглицеридов (мг/дл)
Группа 1	55,4±3	105,1±7,2
Группа 2	284,1±10,3	226,9±12,6
Группа 3	191,2 ±8,0	139,1±5,8
Группа 4	236,1±10,2	176,9±8,1
Группа 5	196,4±7,6	146,7±5,9
Группа 6	182,2±12,1	150,1±9,8
Группа 7	175,8±7,9	140,3±7,4

Источники информации

Anderson J.W., Bryan M.J., Cook-Newall M-E., 1995, N. Engl. J. Med. 333, 276-282.

Kirk E.A., Sutherland P., Wang S.A., Chait A., LeBoeuf R.C., 1998 Journal of Nutrition. 128, 954-959.

Lovati M.R., Manzoni C., Corsini A., Granata A., Frattini R., Fumagalli R., Sirtori C., 1992, J. Nutr. 122, 1971-1978.

Lovati M.R., Manzoni C., Corsini A., Granata A., Fumagalli R., Sirtori C., 1996 J. Nutr. 126, 2831-2842.

Manzoni C., Lovati M.R., Gianazza E., Morita Y., Sirtori C., 1998 J. Agric.Food. Chem. 46,2481-2484.

Nagano T., Hirotsuka M., Mori H., Kohyama K., Nishinari K., 1992 J. Agric. Food Chem. 40,941-944.

O'Keefe S.F., Wilson L.A., Resurreccion A. P., Murphy P.A., 1991 J. Agric. Food. Chem. 39,1022-1027.

Ostrove S., Weiss S., 1990, Methods in Enzimology 182, 371-379.

Thanh V.H., Okubo K., Shibasaki K., 1975 Plant Physiol. 56: 19-22.

Thanh V.H., Shibasaki K., 1976 J. Agric. Food. Chem. 24, 1117-1121.

Thanh V.H., Shibasaki K., 1978 J. Agric. Food Chem. 26, 695-698.

Wu S., Murphy P.A., Johnson L.A., Fratzke A.R., Reuber M.A. 1999 JAOCS 76, 285-293.