криоконсервант для лейкоцитов
Классы МПК: | A01N1/02 консервирование живых тканей или органов |
Автор(ы): | Сведенцов Евгений Павлович (RU), Туманова Татьяна Витальевна (RU), Оводова Раиса Григорьевна (RU), Оводов Юрий Семенович (RU), Головченко Виктория Владимировна (RU), Соломина Ольга Нурзадиновна (RU), Щеглова Оксана Олеговна (RU), Утемов Сергей Вячеславович (RU), Костяев Андрей Александрович (RU) |
Патентообладатель(и): | Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (RU), ФГУ "Кировский НИИ гематологии и переливания крови" Росздрава" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2006-01-10 публикация патента:
27.06.2007 |
Изобретение относится к области медицины и физиологии. Криоконсервант содержит в оптимальном соотношении лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат, воду для инъекций и гидроксид натрия (для доведения рН раствора до 7,0-7,4). Экспозиция лейкоконцентрата с криоконсервантом в течение 18 мин, охлаждение по экспоненциальной программе до -10°С. Изобретение обеспечивает при быстром отогреве сохранить 99,75±0,71% физиологически полноценных лейкоцитов нейтрофильных клеток. 3 табл.
Формула изобретения
Криоконсервант для лейкоцитов, характеризующийся тем, что он содержит лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат и воду для инъекций при следующем соотношении ингредиентов, %:
Лемнан | 0,2-0,4 |
Глицерин | 7,0 |
Оксиметилэтилпиридина сукцинат | 0,3-0,4 |
Вода для инъекций | До 100 мл |
Гидроксид натрия 1 М раствор | До рН 7,0-7,4 |
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине и физиологии и касается создания криоконсерванта для лейкоцитов.
В качестве прототипа нами выбран протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С (Патент на изобретение №2261595), который включает модежель, глицерин и оксиметилэтилпиридина сукцинат.
Существенным недостатком прототипа является то, что данный раствор не может быть реализован, т.к. модежель, входящий в него, перестал выпускаться промышленностью, кроме того, модежель не обладает стимулирующим действием на фагоциты, в частности, на нейтрофилы.
Техническим результатом настоящего изобретения является создание криоконсерванта для лейкоцитов, позволяющего сохранить лейкоциты в физиологически полноценном состоянии при температуре -10°С.
Технический результат достигается тем, что в предложенный криоконсервант для лейкоцитов включены следующие ингредиенты: растительный полисахарид - лемнан, обладающий как полисахарид (пектин) экзоцеллюлярным криопротекторным действием, что гармонично дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние глицерина на клетки и делает комбинированный криоконсервант более полноценным, дающим при охлаждении лейкоцитов до -10°С выраженный криобиологический (технический) эффект и оказывающий стимулирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов: под действием лемнана увеличивается способность нейтрофилов поглощать частицы латекса на 20-50% (Ovodov Yu.S. et.al. // XIX Intern. Carbohydr. Symp. August 9-14, 1998, San Diego, 1998 - P.DPO 41; Попов С.В. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: Автореф....дис. канд. биол. наук; Сыктывкар, 1999-19 с.), поэтому включение лемнана в криоконсервант, не требующий отмывания после выхода нейтрофильных клеток из криогипобиоза, усиливает и активизирует их фагоцитарную способность и способствует 100% их морфологической сохранности; глицерин высшего сорта - криопротектор эндоцеллюлярного действия (Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы: Киев: Наукова думка, 1978. - с.5-64) и производное янтарной кислоты оксиметилэтилпиридина сукцинат (кратко ОМЭПС), обладающий антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием, восстанавливает нарушенные функции мембран клеток, тормозит перекисное окисление липидов. Сукцинат участвует в энергетическом обмене клетки (Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. - М.: Мир, 1980. - с.317-319 и с.321-322).
Криоконсервант имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации.
Пример использования средства
Консервант, содержащий лемнан в концентрации 0,3%, глицерин - 7%, оксиметилэтилпиридина сукцинат - 0,3%, воду для инъекций до 100 мл и 4 М. раствор гидроксид натрия (1-2 кап.) до рН раствора 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». Смесь, выдержав 18 мин при комнатной температуре, помещают на 24 часа в электрический морозильник (в 3-литровую ванну с этиловым 96° спиртом, охлажденным до -10°С). Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 2-3 секунд при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в сек). Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2÷+4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N 9. - с.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.
Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава».
Изучены три варианта консерванта для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов представлен в таблице 1.
Таблица 1 | ||||
Характеристика состава различных вариантов криоконсерванта для сохранения лейкоцитов при температуре -10°С в расчете на 100 г сухого вещества (в г) | ||||
Номер варианта криоконсерванта | Состав хладоограждающего раствора | |||
Лемнан, в% | Глицерин, в% | ОМЭПС, в% | Вода для инъекций, в мл. | |
1 | 0,20 | 7,0 | 0,30 | До 100 |
2 | 0,30 | 7,0 | 0,30 | До 100 |
3 | 0,40 | 7,0 | 0,40 | До 100 |
Конечная концентрация веществ, входящих в состав вариантов криоконсерванта N1, N2 и N3, после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.
Таблица 2. | ||||
Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейкоцитным концентратом | ||||
Номер варианта криоконсерванта | Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейковзвесью | |||
Лемнан, в% | Глицерин, в% | ОМЭПС, в% | Вода для инъекций, в мл. | |
1 | 0,10 | 0,35 | 0,15 | До 200 |
2 | 0,15 | 0,35 | 0,15 | До 200 |
3 | 0,20 | 0,35 | 0,20 | До 200 |
Исследования лейкоцитов производили на морфологическую сохранность и функциональную активность (табл.3).
Таблица 3. | |||
Результаты после замораживания до -10°С и оттаивания лейкоцитов с различными вариантами предложенного криоконсерванта | |||
Вариант консервирующего раствора | Показатели, в % к исходному уровню. n=7 | ||
Жизнеспособность лейкоцитов | Морфологическая сохранность гранулоцитов | Фагоцитарная активность нейтрофилов | |
Верхний предел дозировок ингредиентов раствора | 83,50±12,15* | 95,50±5,75 | 98,75±2,99 |
Оптимальное соотношение ингредиентов раствора | 97,58±1,73 | 100,00±0,00 | 99,75±0,71 |
Нижний предел дозировок ингредиентов раствора | 81,62±15,96* | 78,86±10,54* | 86,14±5,61* |
* - различие достоверное (р<0,05) |
Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения - отогрева при использовании криконсерванта с оптимальным соотношением ингредиентов.
Готовый оптимальный вариант криоконсерванта прозрачен, с желтоватым оттенком, без запаха, рН 7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Криоконсервант проявляет выраженное хладоограждающее свойство при охлаждении лейкоцитов до -10°С.
Таким образом, разработанный криоконсервант при замораживании лейкоконцентрата до -10°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных лейкоцитарных клеток. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля.
Класс A01N1/02 консервирование живых тканей или органов