применение соединений антивирусного класса для получения средства для лечения и профилактики вирусной инфекции дыхательного тракта

Формула изобретения

1. Применение соединений дитиокарбамата структурной формулы R₁R₂NCS ₂H, в которой R₁ и R ₂ означают, независимо друг от друга, неразветвленный или разветвленный (C₁-C₄ ) алкил или образуют с атомом азота алифатическое кольцо с 4-6 атомами углерода, причем R₁, R ₂ или алифатическое кольцо при необходимости замещено одним или несколькими заместителями, выбранными из ОН, NO ₂, NH₂, COOH, SH, F, Cl, Br, I, метила или этила, и окисленных форм этих соединений, в частности, их димеров, а также их фармацевтически совместимых солей для получения средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой РНК вирусами, поражающими дыхательный тракт человека и животных и вызывающими в нем заболевание.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что R₁ и R₂ означают, независимо друг от друга, (C₁ -С₃) алкил или образуют вместе с атомом азота алифатическое кольцо с 4-6 атомами углерода.

3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что соединение дитиокарбамата выбирается из пирролидиндитиокарбамата и N,N-диэтилдитиокарбамата.

4. Применение по п.1, отличающееся тем, что вирусная инфекция представляет собой инфекцию, вызываемую пикорнавирусом, ортомиксовирусом или парамиксовирусом.

5. Применение по п.4, отличающееся тем, что ортомиксовирус представляет собой вирус гриппа человека, в частности, происходящий из группы вирусов А, В и С гриппа, а парамиксовирус представляет собой вирус парагриппа или пневмовирус.

6. Применение по п.4, отличающееся тем, что ортомиксовирус представляет собой вирус А гриппа млекопитающих.

7. Применение по п.4, отличающееся тем, что пикорнавирус представляет собой риновирус, в частности, риновирус человека или лошади, энтеровирус, в частности, энтеровирус 70, 71, или вирус Коксаки или афтовирус, в частности вирус ящура, или вирус А конского ринита.

8. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство содержит соединение дитиокарбамата в концентрации 0,01-5000 мМ, предпочтительно 1-300 мМ, особо предпочтительно 10-100 мМ.

9. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство содержит соединения дитиокарбамата в концентрации 10 мМ-1 М.

10. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство содержит дополнительно фармацевтически совместимый носитель.

11. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство предназначено для применения орально, через нос, внутривенно, ректально, парентерально или в виде капель для глаз или ушей или в виде полоскания для горла или аэрозоли.

12. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство содержит дополнительно антивирусные вещества.

13. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство содержит комбинацию по меньшей мере из двух разных соединений дитиокарбамата.

14. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство содержит дополнительно вещества, выбираемые из антибиотиков, вакцин, иммунных супрессоров, стабилизаторов, иммуностимулирующих веществ, препаратов крови или их смесей.

15. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство используется для ингибирования размножения вирусов.

16. Дезинфицирующее средство, для устранения РНК-вирусов, поражающих дыхательный тракт человека и животных, содержащее, по меньшей мере, одно соединение дитиокарбамата, охарактеризованное в любом из пп.1-15.

17. Дезинфицирующее средство по п.16, отличающееся тем, что оно содержит соединение дитиокарбамата в концентрации 10 мкМ-5 М, в частности, 30 мкМ-1 М.

18. Дезинфицирующее средство по п.16 или 17, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит дезинфицирующие, в частности, антивирусные вещества.

19. Способ дезинфекции поверхностей, сред и культур клеток, отличающийся тем, что дезинфицирующее средство по п.17 или 18 наносится на поверхность или культуру клеток или вводится в среду.

Приоритет по пунктам и признакам:

По пп.1, 4, 7 - в части применения дитиокарбаматов за исключением димеров (окисленных форм) для лечения или профилактики пикорнавирусной инфекции установлен конвенционный приоритет от 16.07.2001 согласно заявке AT 1102/01.

В части применения дитиокарбаматов за исключением димеров (окисленных форм) для лечения или профилактики вирусной инфекции в респираторном тракте по всем пунктам приоритет установлен по дате 16.07.2001 согласно заявке AT 1103/01.

В части применения дитиокарбаматов и в том числе окисленных форм, в частности их димеров для лечения и профилактики вирусной инфекции в респираторном тракте по всем пунктам формулы приоритет установлен по дате 17.12.2001 согласно AT 1973/01.

В части применения дитиокарбаматов, а также их окисленных форм, в частности димеров для лечения или профилактики пикорнавирусной инфекции по всем пунктам формулы приоритет установлен по дате 17.12.2001 согласно заявке AT 1972/01.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к применению соединений дитиокарбамата, дезинфицирующему средству и способу дезинфекции поверхностей, сред и культур клеток.

Уровень техники

Существует множество вирусов, вызывающих заболевания дыхательного тракта человека и млекопитающих. Хотя эти респираторно патогенные вирусы и могут различаться структурно и относятся к разным вирусным семействам, однако общим для них является то, что они способны проникать в организм через дыхательный тракт и поражать, например, специфические клетки этого тракта, такие, как эпителиальный клеточный слой дыхательного тракта, альвеолярные клетки, легочные клетки и пр. Общими являются и классические симптомы инфекции гриппа, характеризующейся местным воспалением и проявлениями болезни в дыхательном тракте (такие, как насморк, охриплость, кашель, везикулы, боль в горле).

Вирусные инфекции, прежде всего в дыхательном тракте, вызывают патологические изменения в соответствующих клетках, в частности, в клетках эпиталия, обусловленные окислительной нагрузкой. Реактивные промежуточные формы кислорода (reactive oxygen intermediates; ROIs), продуцируемые, например, лейкоцитами, легочными эпителиальными клетками или ксантин-оксидазами, выступают в роли посредников при таких клеточных, вызванных вирусами нарушениях. Во время такого окислительного стресса может произойти активация окислителя - специфического транскрипционного фактора NFkB (nuclear factor-kB). Этот фактор NFkB был обнаружен в самых разных типах клетки и была установлена его причинная связь с активацией гена при воспалительных и иммунных реакциях.

Антиоксиданты способны блокировать активацию NFkB, улавливая реактивные промежуточные формы кислорода, вызывающие эту активацию. Поэтому было предложено применять антиоксиданты прежде всего при лечении инфекций с латентными вирусами; однако обнаружилось, что эффективное лечение таких латентных инфекций только одними антиоксидантами невозможно, и что требуется, если вообще проводить, комбинированная терапия с применением смеси разных (т.е. оказывающих разное действие) антиокислителей и других вирусоугнетающих средств (US 5, 686, 436). Однако ингибирования вирусной репликации или даже вирусной инфекции посредством антиоксидантов до настоящего времени достигнуто не было, в частности, ингибирования инфекций, вызываемых вирусами гриппа и пикорнавирусами (Knobil et al., Am. J.Physiol. 274 (1) (1998) (134-142).

С другой же стороны, разные, предложенные для лечения вирусных инфекций антиоксиданты очень отличаются между собой в отношении антиокислительной активности. Так, например, L-аскорбиновая кислота и витамин Е служат для защиты глютатиона; витамины К, А и Е действуют как антагонисты пероксинитрита и других сильных оксидантов в организме. Противовоспалительные стероиды, неглюкокортикоидные лазароиды, дитиокарбаматы и N-ацетил-L-цистеин описаны в качестве ингибиторов активации NFkB.

В зависимости от носителя генетической информации вирусы можно разделить на ДНК вирусы и РНК вирусы, причем нуклеиновая кислота присутствует в виде одной или двойной нити и окружена протеиновой оболочкой.

При этом однонитевая РНК таких РНК вирусов присутствует либо в виде положительной цепи (мРНК), либо в виде отрицательной. Кроме того, генетическая информация вируса может быть также представлена в виде нескольких фрагментов, как это имеет место, например, в вирусе гриппа.

Риновирусы человека (HRV), относящиеся к пикорнавирусам, служат основной причиной встречающейся во всем мире простуды. Частое проявление HRV, опасность тяжелых вторичных инфекций и экономические последствия, выражающиеся в медицинских затратах, врачебных визитах, уровне заболевания работников, делают HRV важным и опасным возбудителем заболеваний. Несмотря на частое проявление, в настоящее время еще не обеспечивается эффективная борьба с этим вирусным заболеванием, не считая лечения симптомов. С другой же стороны, последствия, например, от инфекции, вызванной риновирусом, не являются столь тяжелыми или даже угрожающими для жизни, чтобы следовало мириться с приемом лекарственных средств, характеризующихся большим риском побочного действия. Поэтому средства, которые требуется применять против таких вирусов, должны обладать лишь незначительным побочным действием или совсем его не иметь. К группе пикорнавирусов животных относится вирус А конского ринита (ERAV), который, подобно вирусу ящура, относится к роду афтовирусов.

Другими важными семействами вирусов, ответственными за болезни дыхательного тракта, являются Orthomyxo- и Paramyxoviridae с вирусом гриппа человека в качестве наиболее важного представителя.

Появление новых пандемических штаммов гриппа обычно связывают с новыми подтипами, содержащими новый гемагглютинин или ген нейраминидазы. Такие новые вирусы отличаются иммунологически от ранее существовавших вирусов гриппа. Для того чтобы стать инфекционными, вирусам А и В гриппа требуются 8 сегментов РНК, вирусам С гриппа - только 7. Вирусы А, В и С гриппа могут образовывать in vivo гомотипичные вариететы, но не между типами. Теоретически из соответствующих 8 сегментов двух вирусов А гриппа могут образоваться 256 вариететов. Однако такой случайной сегрегации не происходит, так как на уровне протеина некоторым протеинам требуется партнер, обусловленный его штаммом. Это было специально показано в отношении вируса Avian Influenza-Virus A/chicken/Germany/34 (H7N1) FPV Rostock НА, который кодируется сегментом 4, способным образовывать функциональный вирус лишь специфично со своим специфичным для штамма протеином М2, кодируемым сегментом 7 (Grambas S., Hay A.J.Maturation of Influenza A virus hemagglutinin-estimates of the pH encountered during transport and its regulation by the M2 protein. Virology 1992; 190: 11-18) (Grambas S., Bennet H.S., Hay A.J. Influence of amantadine resistance mutations on the pH regulatory function of the M2 protein of influenza A viruses. Virology 1992; 191: 541-549). Одной из главных стратегических мер в ежегодной борьбе с вирусной инфекцией гриппа среди населения является прививки против гриппа. Однако несмотря на обширные программы проведения прививок грипп остается причиной заболеваемости и смертности во всем мире и основной причиной заболевания и смерти пациентов с ослабленным иммунитетом и пожилых лиц. Антивирусная активность амантадина и римантадина снижает длительность симптомов клинического гриппа, однако описаны важные побочные эффекты и появление устойчивых мутантов (FIELDS et al., Virology, 3. Edition (1995) Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, Vol.1, p.434-436). В настоящее время на рынке появилась новая группа антивирусных средств, которые подавляют нейраминидазу вируса гриппа. Цанамивир и озелтамивир являются, например, ингибиторами нейраминидазы вирусов А и В гриппа; однако эти медикаменты лишь сокращают продолжительность симптомов.

В US 5686436 описан способ подавления размножения ретровирусов и латентных вирусов в людях и животных, таких, как, например, вирус гриппа человека (HIV), при этом вводится лекарство, содержащее в числе прочего антиоксиданты и индукционные ингибиторы фактора NFkB. В противоположность этому для действенного подавления инфекций, вызываемых респираторными вирусами, необходимо эффективно бороться с вирусом уже на острой стадии инфекции; лечение, которое может проводиться только на стадии латентных вирусов, является непригодным для профилактики или лечения острых вирусных инфекций дыхательного тракта.

Таким образом сохраняется потребность в высокоэффективном активном веществе против вирусных инфекций дыхательного тракта, в частности, человека, которое не оказывало бы совсем или только незначительно побочное действие, являлось бы дешевым и могло бы изготавливаться в больших количествах.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения решается за счет применения соединений дитиокарбамата со структурной формулой R ₁R₂NCS₂H, где R₁ и R₂ означают, независимо друг от друга, неразветвленный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода или образуют с атомом азота алифатическое кольцо с 4-6 атомами углерода, причем R₁ , R₂ или алифатическое кольцо при необходимости замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из ОН, NO₂, NH₂, COOH, SH, F, Cl, Br, I, метила или этила, и окисленных форм этих соединений, в частности, их димеров, а также их фармацевтически совместимых солей для получения средства для лечения или предотвращения инфекции, вызываемой вирусами РНК, поражающими дыхательный тракт и вызывающими в нем заболевание. Под "дыхательным трактом" понимаются в контексте изобретения все органы и участки, начиная с отверстий в организме (нос, рот, глаза (включая слезный канадец) и уши) и кончая легочными пузырьками. При этом фармацевтически приемлемыми солями являются, в частности, Na, К, Ca, Mg, NH ₄, Zn. Впервые неожиданно было обнаружено, что соединения дитиокарбамата по изобретению могут эффективно применяться против инфекций, вызываемых РНК вирусами, поражающими дыхательный тракт и вызывающими его заболевание, названными в рамках данной заявки "респираторными РНК вирусами". Вопреки наблюдениям, проведенным Knobel et al. (Am. J.Physiol. (1998), стр.134-142), в рамках настоящего изобретения однозначно показано антивирусное действие соединения дитиокарбамата согласно изобретению против инфекций, вызванных респираторными РНК вирусами, например, HRV (риновирусы человека) и вирусами гриппа. Это тем удивительнее, что другие антиоксиданты таким антивирусным действием по отношению к респираторным РНК вирусам не обладают и что изменение окислительно-восстановительного потенциала не является исключительно ответственным за антивирусное действие соединений дитиокарбамата, согласно изобретению. Например, согласно изобретению можно отчетливо показать, что антиоксиданты: витамины С и Е, 2-меркаптоэтанол и N-ацетил-L-цистеин совершенно не обладают действием против респираторных РНК вирусов. Кроме того эффективность соединений дитиокарбамата по изобретению в отношении инфекций, вызываемых респираторными РНК вирусами, и размножения этих вирусов не объясняется единственно ингибированием активации NFkB, поскольку было установлено, что с помощью соединений дитиокарбамата по изобретению - причем в рамках данной заявки под ними следует также понимать и окисленные формы, в частности, димеры, - целенаправленно прекращается размножение респираторных РНК вирусов.

В DE 1963223 А раскрыто средство для лечения вирусных инфекций мозга, причем в состав этого средства должен входить ингибитор биосинтеза моноаминов норадреналин, допамин и 5-гидрокси-триптамин. Приведенный в этой публикации пример свидетельствует о действии сложного -метилтирозинметилового эфира на мышей с симплексным инфицированием герпесом. Таким образом, описанный в этой публикации механизм ингибирования биосинтеза специальных моноаминов применим только для лечения инфекций, вызываемых ДНК вирусами в мозге. Лечение от респираторных РНК вирусов согласно изобретению проводится по другому принципу и оно не применимо для вирусных инфекций мозга, как об этом свидетельствуют отрицательные примеры в отношении FSME (пример 13) и ЕМС (пример 14). Следовательно, DE 1963223 относится к другой области применения, не может сравниваться с предназначением согласно изобретению и таким образом не является близким аналогом.

В Calvert J.G., Interferon Research 1990 (10), стр.13-23, описано действие диэтилдитиокарбамата (DDTC) на менговирусы, при этом было установлено, что DDTC деактивируют вирионы менговируса. Однако менговирусы являются возбудителями тяжелого энцефаломиокардита, не поражают дыхательный тракт и не провоцируют в нем заболевания.

В WO 95/03792 А1 сообщается о применении соединений тиола для получения фармацевтической композиции для лечения вирусных заболеваний, причем соединение тиола разрушает дисульфидные мостики в протеинах вирусов. В этом документе среди многочисленных вирусов упоминаются также РНК вирусы, в частности, Picornaviridae. Кроме того, приводится много примеров на тиольные соединения, в частности, упоминается в совершенно общем виде дитиокарбамат. Из множества разных комбинационных возможностей приведены лишь следующие примеры: в качестве тиольных соединений: N-ацетилцистеин (NAC), цистеин, цистеингидрохлорид и сложный N,S-диацетилцистеин-этиловый эфир (DACEE), в качестве вирусных заболеваний приведены только гепатит В и вирус оспы кролика.

Следовательно не только не были приведены примеры для большей части соединений и вирусных болезней, но и обнаружилось, что раскрытое в этой публикации лечение в действительности не соответствует в полном объеме своему описанию: некоторые пикорнавирусы (те из них, которые поражают не дыхательный тракт, а нервные клетки) посредством PDTC не угнетаются и их размножение не снижается. Следовательно, не все комбинации спровоцированных вирусами заболеваний и тиольных соединений обеспечивают достижение цели, и применение выбранных согласно изобретению соединений дитиокарбамата, которые в WO 95/03792 А1 не раскрыты, при лечении или профилактике инфекции, вызванной респираторными РНК вирусами, не является очевидным.

В GB 861043 А сообщается о композициях, применяемых в числе прочего для защиты от вирусов. Эти композиции содержат в себе, например, дитиокарбаматы, однако специфичные вирусы здесь не раскрыты.

Knobil et al., Am. J.Physiol. (1998), стр.134-142, сообщают об исследовании оксидантов и их воздействия на экспрессию гена, вызванную вирусом. Было однозначно установлено, что ни NAC, ни PDTC не подавляют инфекцию, вызванную вирусом гриппа, или репликацию.

В DE 2555730 А описано противомикробное средство, содержащее соединение диметилдитиокарбамата, причем это соединение представляет собой комплекс 8-оксихинолинат-металл-N,N-диметилдитиокарбамат. Но в этой публикации сообщается только о противогрибковом и антибактериальном действиях.

В WO 99/66918 A1 речь идет о применении дисульфидных производных дитиокарбаматов для восстановления окислов азота у пациента и для ингибирования NFkB. Однако в этой публикации приводится чрезвычайно обширный перечень болезней без подробного описания вирусных болезней.

Flory et al., J. Biol. Chem., 24.03.2000, 275 (12), стр.8307-8314, сообщают об исследовании влияния разных протеинов вируса А гриппа на активацию зависящей от NFkB экспрессии.

Tai D.I. et al., Hepatology, март 2000, 31 (3), стр.785-787, сообщают об исследовании ингибирования активации NFkB с помощью PDTC, причем предполагалось, что инфекция, вызванная вирусом HCV, могла вызвать антиапоптоз вследствие активации NFkB.

Schwarz et al., 1998 (J.Virol; Vol.72 (7), стр.5654-5660), исследовали влияние NFkB на размножение вируса энцефаломиокардита (EMCV), родственного риновирусу человека. В клетках без NFkB (ударная сепарация (knockout) p50-/- или р65-/-), которые инфицировали вирусом EMCV, размножение вируса хотя и снизилось, но произошла повышенная гибель клеток от апоптоза. Это находится в резком противоречии с изложенными здесь данными: эти примеры четко показывают, что соединения дитиокарбамата согласно изобретению не только препятствуют репликации родственного риновируса, но и предотвращают вызываемую вирусом гибель клеток. Поэтому ингибирование NFkB не является решающим фактором эффективности соединений дитиокарбамата согласно изобретению.

Согласно изобретению антивирусное действие соединений дитиокарбамата также не зависит от комбинации определенных веществ. Соединения дитиокарбамата согласно изобретению могут применяться полностью самостоятельно, независимо от других добавок, в частности, от антиоксидантов, что является абсолютно необходимым в US 5686436 для достижения противоретровирусного действия ингибиторов активации NFkB, так как неожиданно оказалось, что антивирусное действие не только способствовало преодолению окислительного стресса, но и благодаря соединениям дитиокарбамата согласно изобретению стало возможным подавлять инфекцию/репликацию.

Было показано, что соединения дитиокарбамата согласно изобретению индуцируют гены, которые действуют в качестве транскрипционных факторов, индуцирующих антиоксиданты (Meyer et al., EMBO J. 12, 2005-2015, 1993). Можно индуцировать гетеродимерный транскрипционный фактор API с помощью N-ацилцистеина (NAC) и соединений дитиокарбамата согласно изобретению, что приводит к привязке ДНК и трансактивации. Активация AP1 соединениями дитиокарбамата согласно изобретению зависит от синтеза протеина и включает в себя транскрипцию генов c-jun и c-fos. Однако только активация AP1 не обеспечивает надежного ингибирования вирусов согласно изобретению.

Пирролидин-дитиокарбамат (PDTC) уже известен в качестве про- и антиоксиданта, ингибитора активации транскрипционного фактора NFkB, цинкового ионофора и металло-хелирующего агента. Sherman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 191 (3): 1301-1308, 1993, описали PDTC в качестве ингибитора активации фактора NFkB и синтеза NO. В WO 01/00193 А2 сообщается о композициях с содержанием диэтилдитиокарбамата в пико- и наномолярном диапазоне, характеризующихся сильновыраженным действием против апоптоза.

Было показано, что соединения дитиокарбамата по изобретению обладают сильновыраженным действием против РНК вирусов - респираторных РНК вирусов, поражающих дыхательный тракт и провоцирующих в нем болезнь, как in vitro, так и in vivo.

Таким образом, согласно изобретению, инфекция предупреждается уже на очень ранней стадии, еще до того, как произойдет значительное разрушение клеток или даже их гибель.

В рамках настоящего изобретения под респираторными РНК вирусами понимаются любые вирусы человека и млекопитающих, поражающие организм через дыхательный тракт, т.е. дыхательные пути и легкие, и проникающие в него, при этом они вызывают в дыхательном тракте заболевание. Очевидно биологические процессы, протекающие при такой инфекции, настолько схожи между собой, что действие соединений дитиокарбамата согласно изобретению является одинаково эффективным несмотря на биологическую неоднородность этой группы вирусов. Однако был отмечен и обратный результат, согласно которому при других вирусах, проникших в организм другими инфекционными путями и прошедших другие биологические циклы (например, способных интегрироваться в геном хозяина в виде латентного вируса) или вызвавших заболевание в других органах, например, в мозгу, действие только одних соединений дитиокарбамата по изобретению оказывается недостаточным для лечения вирусной инфекции.

Между тем в этом отношении было показано, что при лечении пациентов, страдающих СПИДом, дитиокарбаматами улучшение состояния пациентов или их излечение не достигается (Multicenter, randomized, placebo-controlled study of dithiocarb (Imuthiol) in human immunodeficienty virus-infected asymptomatic and minimally syptomatic patients. The HIV87 Study Group. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1993 Jan.; 9(1): 83-9). На основании этих результатов последующие клинические исследования латентных вырусов не проводились (см. US 5686436).

Свое особое действие соединения дитиокарбамата согласно изобретению проявляют прежде всего на ранней стадии вирусной инфекции или, если их прием проводится до начала инфекции. Таким образом, соединения дитиокарбамата могут предупредить начало вирусной инфекции, если проводится их профилактический прием, например, в местностях и в периоды, когда существует риск или даже повышенный риск респираторных вирусных инфекций, например, в районах, в которых имеются эпидемии или удерживаются продолжительные холода. Предпочтительно применять при этом соединения дитиокарбамата согласно изобретению для профилактики вирусной инфекции.

Однако наиболее предпочтительно проводить ингибирование вируса согласно изобретению прежде всего на ранней стадии уже начавшейся инфекции, вызванной респираторным РНК вирусом. При этом соединения дитиокарбамата согласно изобретению целенаправленно применяются для ингибирования репликации вирусов, т.е. в момент, когда у инфицированного индивидуума еще не произошли значительные повреждения. В результате могут быть предотвращены не только последствия прогрессирующей вирусной инфекции у самого индивидуума, но и последующее распространение инфекционных вирусов среди других индивидуумов; опасность дальнейшего заражения сводится к минимуму, что имеет большой общеоздоравительный эффект и большое значение особенно в отношении вируса гриппа человека.

В частности, респираторными РНК вирусами в рамках настоящего изобретения считаются: риновирусы, вирусы Коксаки, эховирусы, коронавирусы, энтеровирусы, ортомиксовирусы человека (например, вирус гриппа (А, В и С), парамиксовирусы (например, вирус парагриппа и пневмовирус), респираторный вирус синтиция (RSV) и другие РНК вирусы, пока они способны вызывать заболевание (по меньшей мере) в дыхательном тракте. Вирусы или их штаммы, вызывающие заболевание не в дыхательном тракте, а в другом органе, например, в мозгу, например вирусы минингита, энцефаломиокардита, поливирус, кардиовирус и др., предметом настоящей заявки не являются. Респираторным РНК вирусам согласно изобретению присуща инфекция эпителиальных клеток верхней и нижней частей дыхательного тракта. Кроме того, могут дополнительно поражаться и другие органы. Обусловленное этим локальное воспаление дыхательного тракта является основной причиной появления типичных симптомов инфекции гриппа, таких, как, насморк, боли в горле, хриплость, кашель, везикулы и часто жар. Также и частому проявлению вторичных инфекций у иммунно ослабленного индивидуума способствует инфекция, вызванная указанными респираторными вирусами.

В рамках настоящего изобретения под пикорнавирусами понимаются любые «настоящие» пикорнавирусы в соответствии с принятой в настоящее время классификацией Picornaviridae на основе King et al. («Picornaviridae» in «Vims Taxonomy, Seventh Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses» (2000), Eds. Van Regenmortel et al., Academic Press 657-673), если они поражают дыхательный тракт и вызывают в нем заболевание, т.е. род: энтеровирус, риновирус, афтовирус, пареховирус, эрбовирус, кобувирус и тешовирус. Эти вирусы семейства Picornaviridae отличают: схожие генетическая структура, состав протеина, особенности культивирования и устойчивость к температуре и антивирусным средствам.

Выяснилось, что настоящее изобретение особенно применимо для поражения патогенных для человека и животных представителей подлинных респираторных Picornaviridae, в частности, из семейства энтевируса (энтевирус 70, 71, вирус Коксаки), риновируса (например, риновируса человека) и афтовируса (например, вирус ящура), напротив для других вирусов, включая пикорнавирусы, вызывающих латентные инфекции, как, например, HAV, присущие изобретению преимущества подтверждены не были. Вероятно это объясняется тем, что группа «настоящих» респираторных вирусов является сама по себе столь однородной и патофизиологические процессы при инфекциях столь похожи, что соединения дитиокарбамата проявляют свое действие аналогичным образом.

Под «вирусной инфекцией» в рамках настоящей заявки понимается любая атака респираторного вируса на клетки, содержащая, например, одно из следующих действий: закрепление вирусной частицы на клетке, введение на последующей стадии генетической информации вируса в клетку, продуцирование новых вирусных частиц и экспрессия инфекционных вирусных частиц.

Кроме того возможно также применение окисленных форм таких соединений, в частности, их димеров, так как последние, как известно, быстро преобразуются при обмене веществ в организме с образованием восстановленных форм. В рамках настоящей заявки такие соединения следует понимать как "окисленные формы", остаток S которых окислен. Предпочтительный пример такой окисленной димерной формы представляет дисульфирам-тетраэтилтиурамдисульфид (C₁₀ H₂₀N₂S ₄), известный также под названием «Антабус» или «Абстинил». Тетраэтилтиурамдисульфид сам по себе известен, причем он применяется в частности при лечения алкоголизма: он служит посредником при окислениях-восстановлениях и деактивирует альдегид-дегидрогеназу. При приеме этанола происходит концентрация ацетальдегида в организме, что оказывает исключительно отрицательное воздействие на общее самочувствие: при одновременном приеме дисульфирама и спирта появляются страхи, возникает тошнота, происходит потеря зрения, появляются боли в груди, голове и пр., причем эти симптомы удерживаются в течение 3-4 дней и даже недели. Поэтому дисульфирам назначается алкоголикам в качестве терапевтического средства, так как любое последующее пьянство должно предупреждаться такими сильными отрицательными эффектами.

Другими известными действиями дисульфирама являются ингибирование ферментов, таких, как, например, фруктозо, 1,6-дифосфат-дегидрогеназа, ксантин-оксидаза, гексокиназа, альдегид-оксидаза и допамин- -гидроксилаза.

Кроме того дисульфирам применяется при лечении педикулеза, чесотки и «никелевого» дерматита.

Метаболизм дисульфирама уже подробно проанализирован, см. например, Dollery С., 1999, Therapeutic Drugs, Second Edition, Vol.1, Churchill Livingstone, Edinburgh. Описано, что диэтилдитиокарбамат представляет собой основной метаболит тетраэтилтиурамдисульфида в организме, причем такое превращение происходит очень быстро.

Окисленная форма соединения дитиокарбамата по изобретению хорошо растворима в масле и может применяться, например, в качестве средства для орального приема, причем в желудке соединения всасываются. При этом соединения могут применяться, в частности, в виде порошковой аэрозоли. Кроме того окисленные формы соединения согласно изобретению могут быть снабжены гидроксильными группами для повышения водорастворимости и получения аэрозольной формы. Если соединения дитиокарбамата согласно изобретению приготовлены в виде окисленного, в частности, димерного, препарата, то такое средство будет обладать эффектом депо, т.е. соединения дитиокарбамата согласно изобретению будут откладываться постепенно в организме в течение определенного времени и потом из него всасываться. Для получения такого депо окисленные соединения дитиокарбамата могут имплантироваться известным образом в организм, подлежащий лечению.

Предпочтительное соединение согласно изобретению отличается тем, что R ₁ и R₂ представляют собой, независимо друг от друга, алкил с 1-3 атомами углерода или образуют вместе с атомом азота алифатическое кольцо с 4-6 атомами углерода. Оно зарекомендовало себя особо положительно при лечении и профилактике инфекции, вызываемой респираторным РНК вирусом.

Предпочтительно выбирать соединение дитиокарбамата из пирролидин-дитиокарбамата (PDTC) и N,N-диэтилдитиокарбамата (DDTC). Эти соединения характеризуются ярко выраженной активностью по отношению к инфекциям, вызываемым респираторными РНК вирусами.

Особенно предпочтительна для этого инфекция, вызываемая пикорнавирусом, ортомиксовирусом или пармиксовирусом. Соединения дитиокарбамата согласно изобретению являются особенно активными по отношению к инфекциям, вызываемым этими вирусами.

Предпочтительно, чтобы ортомиксовирус представлял собой вирус гриппа человека, происходящий, в частности, из группы, состоящей из вирусов А, В, С гриппа, парамиксовируса, вируса парагриппа или пневмовируса. Предпочтительно, чтобы ортомиксовирус представлял собой вирус А гриппа млекопитающих, а пикорнавирус - риновирус, в частности, риновирус человека или лошади, энтеровирус, в частности, энтеровирус 70, 71 или вирус Коксаки или афтовирус, в частности, вирус ящура или вирус А конского ринита. При этом, как уже пояснялось выше, исключаются такие вирусы и их штаммы, которые вызывают заболевания не в дыхательном тракте, а, например, в мозгу или в нервных клетках, например, кардиовирусы или полиовирусы, относящиеся к пикорнавирусам. Такие вирусные инфекции особенно эффективно излечиваются или предупреждаются соединением согласно изобретению.

Семейство Picornaviridae охватывает ряд небольших РНК вирусов, в том числе риновирусы (например, риновирус человека), энтеровирусы (например, энтеровирус 70, 71, вирус Коксаки, являющийся, например, возбудителем заболевания рук, ног и рта), афтовирусы (например, вирус ящура, причем в этом случае заболевание вызывается во рту, а также вирус А конского ринита). В отношении, например, ящура особенно интересно отметить, что с помощью соединения согласно изобретению необходимо перекрыть промежуток времени между моментом прививки и моментом наступления эффективности вакцины (около 10-12 суток), так как в течение этого времени вакцинированные животные остаются беззащищенными и вероятно после инфекции выделяют большое количество вирусов, сами при этом не заболевая. Следовательно соединение согласно изобретению можно было бы вводить животным одновременно с прививкой и возможно еще на протяжении около 2 недель после этого.

Названия ортомиксо- и парамиксовирусы присвоены после разделения прежнего собирательного обозначения вирусов гриппа и других схожих вирусов. У человека парамиксовирусы вызывают корь, свинку, респираторные и нейрологические заболевания. К парамиксовирусам относятся в числе прочего вирус парагриппа, вирус свинки, вирус псевдочумы птиц, респираторный вирус синцития (RSV), вирус кори и вирус коровьей чумы. К ортомиксовирусам относятся в числе прочего вирусы А, В и С, являющиеся возбудителями гриппа человека.

Вирусы гриппа типа А ответственны за большее число эпидемий гриппа и за все пандемии. Хотя вирусы гриппа А и встречаются среди лошадей и свиней, а также среди птиц, например, в качестве возбудителя классической птичьей чумы, однако только вирусы гриппа человека и млекопитающих, например, лошади, могут считаться респираторными вирусами в прямом смысле этого слова, так как биология вируса гриппа птиц (вирус птичьего гриппа (AI)) полностью отличается от биологии вируса гриппа человека. Поэтому как раз вирус AI не может рассматриваться как респираторный вирус. У уток вирус AI первично размножается в кишечном тракте, чего у человека не происходит. В результате вирусы AI могут быть выделены из фекалий птиц (Hinshaw et al., 1980, Canad. J.Microbiol. 26, 622-9). Кроме того, скорость изменения нуклеотидов вирусов AI ниже той же скорости вирусов, которые могут быть выделены из млекопитающих. Эволюция вирусных протеинов в организмах, иных чем организм птицы, свидетельствует, как правило, о быстром накоплении мутаций, которые в вирусах AI не встречаются (Gorman et al., 1991, J.Virol. 65:3704-14; Ludwig et al., 1995, Virology 212: 555-61). Рецепторная специфичность варьируется между разными вирусами гриппа. Большая часть вирусов AI связана преимущественно с рецептором альфа2-3-галактоза-сиалиновой кислоты. В противоположность этому вирусы гриппа человека первично связаны с рецептором альфа2-6-галактоза-сиалиновой кислоты (Rogers + Paulson, 1983, Virology 127, 361-73; Baum + Paulson, 1990, Acta Histochem. Suppl. 40: 35-8).

Поскольку вирусы согласно изобретению вызывают у человека и млекопитающих ряд широко распространенных заболеваний, то антивирусное действие соединения дитиокарбамата согласно изобретению представляет особую важность в свете этих вирусов. Учитывая, что соединения дитиокарбамата согласно изобретению обладают ярко выраженным действием против указанных вирусов, то эти соединения особенно пригодны для получения целого ряда средств для лечения и профилактики таких вирусных инфекций. Соединения дитиокарбамата согласно изобретению могут изготавливаться в больших количествах легко и дешево и даже в повышенных концентрациях почти не оказывают токсичного действия на подвергаемые лечению клетки.

Согласно предпочтительному варианту выполнения соединения дитиокарбамата согласно изобретению содержатся в средстве в концентрации 0,01-5000 мМ, предпочтительно 1-300 мМ, особо предпочтительно 10-100 мМ. При таких концентрациях соединения дитиокарбамата согласно изобретению особенно эффективны против инфекций, вызываемых респираторными РНК вирусами, и почти или полностью не оказывают побочного действия. Применяемая концентрация выбирается в зависимости от подвергаемой лечению вирусной инфекции, ее интенсивности, подвергаемого лечению организма, например, человек или животное, и возраста.

Особенно оптимально, чтобы концентрация соединений дитиокарбамата согласно изобретению в средстве составила 10 мМ-1 М. В этом случае соединения дитиокарбамата согласно изобретению присутствуют в высококонцентрированном виде, и средство может быть разбавлено перед лечением до требуемой концентрации.

Предпочтительно, чтобы средство содержало в себе кроме того фармацевтически совместимый носитель. При этом может быть использован любой, известный специалисту в области фармации носитель, например, физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) или иначе буферированные растворы поваренной соли или композиции с содержанием липосом, причем и в этом случае носитель выбирается с учетом вида лечения, вирусной инфекции и подлежащего лечению организма.

Предпочтительно, чтобы средство могло вводиться орально, через нос, внутривенно, парентерально, ректально или имело вид глазных или ушных капель, раствора для полоскания или аэрозоли. При этом способ введения зависит в частности от подлежащей лечению вирусной инфекции. Инфекция в дыхательном тракте лечится, например, введением средства через нос, например, в виде аэрозоли, содержащей соединения дитиокарбамата, так как лечение вирусной инфекции проводится по месту атаки вируса. В зависимости от вида применения выбирается определенная концентрация соединений дитиокарбамата или средство содержит дополнительные вещества, эффективные при такой форме применения. Также возможно применять средство в сухом виде, причем перед лечением оно разбавляется соответствующим растворителем.

Особо эффективное применение достигается в том случае, когда в средстве содержатся дополнительные антивирусные вещества. Таким образом становится возможным подавить вирусную инфекцию в дыхательном тракте с нескольких сторон и одновременно можно ослабить или полностью уничтожить целый набор разных вирусов. Такими дополнительными антивирусными веществами служат, например, вещества, подавляющие репликацию, иммуностимулирующие вещества, нейтрализующие антитела и др., а также при необходимости вещества, которые способны стимулировать в целом иммунную систему.

Предпочтительно, чтобы средство содержало комбинацию по меньшей мере из двух разных дитиокарбаматов согласно изобретению, в частности, смесь из пирролидин-дитиокарбамата и N,N-диэтил-дитиокарбамата. Соединения дитиокарбамата согласно изобретению выполняют в клетках функции про- и антиоксидантов. Их антиокислительное действие включает в себя удаление перекиси водорода, супероксидных радикалов, пероксинитритов, гидроксильных радикалов и липидных продуктов перокисления. Благодаря этому удалению происходит окисление дитиокарбаматов в тиурамдисульфид. Тиурамдисульфиды ответственны за проокислительные действия дитиокарбаматов, причем в некоторых случаях образование тиурамов зависит от присутствия металлов. Описано, что антиапоптозная активность дитиокарбаматов вероятно определяется деактивацией каспазов, вызываемой окислением тиола.

Особо предпочтительно, чтобы средство согласно изобретению содержало дополнительно вещества, выбираемые из антибиотиков, вакцин, иммуносупрессоров, стабилизаторов, иммуностимулирующих веществ, препаратов крови или их смесей. Если дополнительно применяются антибиотики, то наряду с респираторными вирусами могут уничтожаться и другие инфекционные бактерии. Если средство дополнительно содержит вакцины, под которыми понимаются как пассивные, так и активные вакцины, то одновременно с лечением или профилактикой вирусной инфекции согласно изобретению предупреждаются и некоторые другие дополнительные вирусные инфекции, способные легко инфицировать ослабленный организм. Для повышения стойкости при хранении или для продления срока применения могут добавляться стабилизаторы. Препаратами крови являются, например, плазма, клетки крови, факторы свертывания и т.д., в зависимости от курса лечения пациента.

Целесообразно применять средство для ингибирования размножения вирусов. Таким образом, обеспечивается нераспространение уже происшедшей инфекции или, в противном случае, ее очень быстрое лечение.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения последнее относится к дезинфицирующему средству, содержащему по меньшей мере одно соединение дитиокарбамата по изобретению, как описано выше. Под «дезинфицирующим средством» в рамках настоящего изобретения понимается любое средство, используемое вне организма человека или животного для борьбы с вирусами, например, на поверхностях, внутри средств, в частности, в средах, или для культур клеток. Такие дезинфицирующие средства могут применяться, в частности, в том случае, когда обрабатываемый материал обладает чувствительностью по отношению к другим агрессивным антивирусным веществам. Например, дезинфицирующее средство, содержащее соединения дитиокарбамата согласно изобретению, может применяться в качестве добавки к средам или для обработки клеток или культур клеток, которые чувствительны к действию других, более агрессивных дезинфицирующих средств или антивирусных веществ. Соединения дитиокарбамата согласно изобретению проявили себя особо эффективными при лечении и профилактике инфекций респираторных клеток и культур клеток, вызываемых респираторными РНК вирусами.

Особо эффективным является дезинфицирующее средство в том случае, когда оно содержит соединения дитиокарбамата согласно изобретению в концентрации 10 мкМ-5 М, в частности, 30 мкМ-1 М. Такие концентрации эффективны, с одной стороны, против инфекций, вызываемых респираторными РНК вирусами, и, с другой стороны, такое дезинфицирующее средство является чрезвычайно щадящим, например, в том случае, когда оно применяется в качестве антивирусного вещества для культур клеток. При этом концентрация определяется видом и стадией развития вирусной инфекции, применяемого при лечении вещества, например, от вида и чувствительности клеток. Само собой разумеется, что также возможно приготовить децинфицирующее средство в виде концентрата, причем перед применением его доводят соответствующим растворителем до требуемой концентрации соединения дитиокарбамата согласно изобретению.

Предпочтительно, чтобы дезинфицирующее средство содержало в себе дополнительные дезинфицирующие, в частности, антивирусные вещества. Такие вещества, известные любому специалисту в области микробиологии, добавляются в том случае, когда необходимо одновременно уничтожить и другие вирусы, например, ДНК вирусы. Само собой разумеется, что могут добавляться кроме того антибактериальные вещества, в частности, антибиотики.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ дезинфекции поверхностей, сред и культур клеток, причем дезинфицирующее средство согласно изобретению, как оно описано выше, наносится на поверхность или на культуру клеток или вводится в среду. Для дезинфекции поверхности оказывается достаточным, например, ее очистка с применением дезинфицирующего средства. В случае со средами и культурами клеток дезинфицирующим средством можно воздействовать в течение более длительного времени, причем, как описано выше, концентрация дезинфицирующего средства может варьироваться в зависимости от назначения.

Согласно другому аспекту изобретения последнее касается лечения и профилактики инфекции, вызванной респираторными РНК вирусами, с применением соединений дитиокарбамата по изобретению. При этом средство, содержащее соединения дитиокарбамата согласно изобретению, как описано выше, вводится пациенту или животному в соответствующем виде и концентрации.

Подробнее настоящее изобретение поясняется ниже с помощью примеров и чертежей, которыми оно не ограничивается.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 в графическом виде представляет угнетающее действие пирролидин-дитиокарбамата (PDTC) на репликацию риновируса человека в культуре клеток;

Фиг.2 представляет ингибирование пирролидин-дитиокарбаматом цитопатических действий, индуцированных риновирусами;

Фиг.3 показывает повышение жизнеспособности клеток с помощью пирролидин-дитиокарбамата и N,N-диэтил-дитиокарбамата (DDTC);

Фиг.4 показывает действие пирролидин-дитиокарбамата при лечении в зависимости от продолжительности применения;

Фиг.5 показывает расщепление eIF4GI;

Фиг.6 поясняет анализ «Western Blot» для определения экспрессии капзидпротеинов риновируса;

Фиг.7 показывает влияние других антиоксидантов на инфекцию, вызванную риновирусом человека (HRV);

Фигуры 8 и 9 показывают влияние пирролидин-дитиокарбамата на репликацию вируса гриппа;

Фиг.10 иллюстрирует зависимость действия пирролидин-дитиокарбамата на клетки Vero, инфицированные вирусами гриппа, от его концентрации;

Фиг.11А и 11В иллюстрируют действие пирролидин-дитиокарбамата на мышей, инфицированных вирусом гриппа;

Фиг.12 показывает эффективность пирролидин-дитиокарбамата против вируса А конского ринита (ERAV);

Фиг.13А и 13В иллюстрирует эффективность пирролидин-дитиокарбамата против MKS;

Фиг.14 показывает отсутствие действия пирролидин-дитиокарбамата на вирус энцефаломиокардита (EMCV).

Примеры

Пример 1. Снижение продуцирования инфекционных частиц риновируса с помощью пирролидин-дитиокарбамата (PDTC)

Для определения эффективности при инфекциях, вызванных риновирусом человека (HRV), после инфекции клеток разными серотипами HRV вводили добавку PDTC.

Клетки HeLa инфицировали серотипами 1А, 2, 14 и 16 вируса HRV при TCID₅₀ (доза 50% инфицирования тканевой культуры) на одну клетку. Одновременно к среде был добавлен PDTC в концентрации 125 мкМ. Через 4 ч инфицирования удалили избыточный вирус и снова добавили PDTC в свежую среду. Через 24 часа (фиг.1, вверху) и 48 часов (фиг.1, внизу) после инфекции (р.I.) собрали надосадочную жидкость и определили количество вирусного потомства с помощью тестов TCID₅₀ . Обработка клеток с помощью PDTC уменьшила через 24 ч титр вируса на 10³ (фиг.1, вверху). Надосадочная жидкость обработанных с помощью PDTC клеток, которую собирали в течение 48 ч после инфекции, также показала значительное уменьшение титра вируса (фиг.1, внизу). Эти тесты свидетельствуют о том, что PDTC оказывает сильное антивирусное действие на разные серотипы HRV.

Пример 2. Ингибирование цитопатических действий, индуцированных вирусом HRV, и повышение жизнеспособности инфицированных клеток с помощью PDTC

На поздних стадиях риновирусной инфекции проявляются морфологические изменения клеток, известные как «цитопатические действия» (СРЕ). Эти индуцированные с помощью HRV «цитопатические действия» характеризуются закруглением клетки, сморщиванием, деформацией ядра и конденсацией хроматина. При инфекции клеток HeLa, вызванной вирусами HRV2, HRV14, HRV1A и HRV16, при 100 TCID₅₀ на одну клетку наблюдалось однозначное цитопатическое действие через 8 ч после инфекции. Добавка PDTC во время инфекции ингибировала появление этих цитопатических действий. На фиг.2 показано, что морфология клеток через 8 ч после инфекции в присутствии 125 мкМ PDTC (см. правую нижнюю фиг.) не отличалась от морфологии неинфицированных клеток (см. две верхние фигуры).

Таким образом, применение PDTC ведет к излечению вирусной инфекции на очень ранней стадии, в результате чего предупреждаются значительные разрушения клеток.

Пример 3. Повышение жизнеспособности инфицированных клеток с помощью пирролидин-дитиокарбамата (PDTC) и N,N-диэтил-дитиокарбамата (DDTC)

Проводился опыт на быстрое размножение клеток с целью проверки действия PDTC и DDTC на жизнеспособность клеток во время вирусной инфекции.

Для этого определяли титр клетки с помощью прибора 96^® Aq _ueous для не радиоактивного испытания на быстрое размножение клеток (Promega; Madison, Wisconsin, USA) в соответствии с инструкцией изготовителя. За сутки до инфекции клетки были размещены на пластинах с 96 гофрами. Эти клетки инфицировали разными серотипами HRV при 20 TCID₅₀/клетка. Жизнеспособность клеток определяли путем добавки тетразолия, проводили инкубацию в течение 2 ч при 37°С и замеряли абсорбцию при 492 нм.

Через 24 ч после инфекции, вызванной HRV2, клетки ZeLa обнаружили по сравнению с неинфицированными клетками HeLa (mock infection medium = MIM-ложная инфекционная среда) полную потерю своей метаболической активности. На фиг.3 (сверху: DDTC; внизу: PDTC) можно видеть, что жизнеспособность самих клеток значительно возросла после добавки PDTC или DDTC в незначительных концентрациях. Только PDTC или только DDTC влияет на неинфицированные клетки лишь незначительно. Однако концентрации, применявшиеся для ингибирования вирусных инфекций, токсичности не вызвали («-» означает «без»).

Пример 4. Эффективность PDTC в зависимости от времени действия

Для определения стадии в жизненном цикле вируса, на которой начинает действовать PDTC, последний добавляли в разные моменты времени после вирусной инфекции при 20 TCID₅₀ /клетка и проводили испытания на пролиферацию. Удалось установить, что добавка PDTC (125 мкМ) в течение первых шести часов после инфекции («-» означает «без») обеспечивает наилучшую защиту от индуцируемой вирусами потери пролиферации (фиг.4А). Этот эффект не является типичным для одного серотипа, так как также применялись серотипы 1А, 2, 14 и 16 вируса HRV. Лишь обработка клеток с помощью PDTC (25 мкМ) более чем через 8 часов после инфекции снизила защитное действие.

Схожие результаты были получены и в том случае, когда определяли титры вируса в надосадочной жидкости инфицированных и обработанных с помощью PDTC клеток (см. фиг.4В). Добавка PDTC в течение до четырех часов после инфекции уменьшили титры продуцированного HRV2 на 10³. Даже если обработка с помощью PDTC начиналась через 6 часов после инфекции, продуцированные титры вируса оказывались значительно заниженными. Эти результаты свидетельствуют о том, что добавка PDTC оказывает антивирусное действие и в том случае, когда это происходит на слишком поздней стадии инфекции, причем повышается жизнеспособность клеток и резко снижается количество инфекционных вирусов.

Это свидетельствует о том, что антивирусное действие проявляется не только на ранних стадиях жизненного цикла вируса, например, во время сцепления рецептора или его внедрения в клетку.

Пример 5. Исследование процесса протекания инфекции, вызванной HRV, в присутствии PDTC

Для исследования процесса протекания риновирусной инфекции в присутствии и отсутствие PDTC анализировали разные протеолитические активности. Характерной протеолитической активностью, проявляющейся во время инфекций, вызванных рино- и энтеровирусами, является ферментативное расщепление клеточных трансляционно-инициирующих факторов 4GI (eIF4GI) и 4GII вирусной 2А-протеиназой, в результате чего завершается синтез протеина клеток хозяина. В зависимости от серотипа HRV протеины eIF4G расщепляются уже на ранней стадии инфекции. Дополнительной, лишь кратко описанной расщепляющей активностью при риновирусной инфекции является расщепление интермедиатного филамент-протеина цитокератин 8. Также и это расщепление зависит от 2А-протеазы, но происходит на поздней стадии инфекции. Для определения влияния обработки с помощью PDTC на протекание вирусной инфекции проводили анализ "Western Blot", при котором анализировали субстраты 2А-протеазы.

При анализе «Western Blot» в соответствующие моменты времени удаляют среду. Клетки лизировали добавлением 100 мкл протеинового буфера (8% додецилсульфата натрия, 20% -меркаптоэтанола, 20% глицерина, 0,04% бромфенолового синего). 20 мкл экстракта протеина разделяют в расчете на один след с помощью SDS-PAGE и проводят блоттинг на мембране PVDF. Инкубацию антителами проводят при 0,1% Tween 20 и 5% порошка обезжиренного молока в TBS. При определении иммунитета использовали поликлональные антитела кролика против eIF4GI. В качестве вторичных антител применяли антииммуноглобулин кролика, сопряженный со щелочной фосфатазой. Окрашивание по щелочной фосфатазе, размеры молекул определяли с помощью предварительно окрашенного маркера SDS-7B (Sigma).

В клетках HeLa, инфицированных посредством HRV2 (100 TCID₅₀ на клетку), расщепление eIF4GI было обнаружено через 4 часа после инфекции («ср» означает продукт расщепления, «cleavige product»), полное расщепление произошло через 8 часов после инфекции (фиг.5). К этому моменту в инфицированных клетках в присутствии PDTC расщепления eIF4GI отмечено не было. В более поздние периоды, приблизительно через 24 часа после инфекции, можно было видеть и в клетках, обработанных с помощью PDTC, незначительное расщепление eIF4GI.

Это говорит о том, что либо функция протеазы была блокирована, либо количество вирусного протеина резко уменьшилось.

Пример 6. Выявление покровных протеинов вирусов

Для определения влияния PDTC на экспрессию протеинов вирусов определяли капсид-протеины HRV2 в экстрактах протеина клеток HeLa, инфицированных вирусом HRV2 (100 TCID ₅₀), посредством анализа «Western Blot» (см. фиг.6). Анализ «Western Blot» проводили, как описано выше в примере 5, при этом применяли поликлональную антисыворотку кролика против HRV2. В необработанных клетках через 6 часов после инфекции были обнаружены значительные количества протеинов риновирусов VP1, VP2 и VP3. Обработка с помощью PDTC предотвращает экспрессию указанных капсид-протеинов в течение первых 8 часов после инфекции. Слабая экспрессия VP1, VP2 и VP3 была обнаружена лишь позже, приблизительно через 24 часа после инфекции.

В результате было показано, что PDTC вызывает запоздалое продуцирование протеинов вирусов, чем и объясняется анти-риновирусное действие PDTC и его защита клеток.

Пример 7. Определение зависимости антивирусного действия окислительно-восстановительного потенциала

Было исследовано ингибирующее действие других антиоксидантов во время инфекции клеток HeLa, вызванной вирусом HRV2 (фиг.7). Клетки HeLa были инфицированы на 6-луночном планшете вирусом HVR2 (100 TCID₅₀/клетка) (n. i. означает «не инфицировано»). Через 1 ч после инфекции среду убирают и добавляют свежую среду или среду с PDTC или NAC в разной концентрации. Через 24 часа слой клеток промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS) и окрашивают кристаллическим фиолетовым. На фиг.7А можно видеть, что слой клеток оказался разрушенным инфекцией, вызванной вирусом HRV2, этот эффект может быть предотвращен с помощью PDTC, но не NAC. Механизм действия витамина С, Тролокса и -меркаптоэтанола (2-МЕ) определяют, как описано в примере 3 (фигуры 7В, С, D). Неожиданно было обнаружено, что все эти антиокислительные вещества не оказывали никакого защитного действия при размножении вирусов. В целях контроля были проверены токсичные действия веществ в отсутствие вирусов. Большая доза витамина С (100 мкг/мл) сильно угнетала рост клеток.

Таким образом, было показано, что антивирусное действие PDTC не объясняется его антиокислительным действием, а очевидно связано с другими свойствами.

Пример 8. Воздействие PDTC на репликацию вируса гриппа

Вирусом гриппа A/PR8/34 или Vienna/47/96 при 0,01 множественности заражения (m.o.i.=multiplicity of infection) инфицируют 5×10⁵ клеток Vero и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем инокулят удаляют и в инфекционную среду добавляют 5 мкг/мл трипсина и 600 мкМ PDTC. Через 48 ч и 72 ч удаляют надосадочную жидкость и замеряют в ней титр вируса с помощью стандартного исследования на планшете. Как показано на фиг.8, титр вируса A/PR8/34 уменьшился в присутствии PDTC более, чем на 2 логарифмических ступеньки по сравнению с контрольным образцом (с).

Для определения эффективности PDTC проводят испытание TCID₅₀ (50%-ная доза инфекции культуры тканей) с использованием PDTC и без него. TCID₅₀ рассчитывают по методу Кэрбера (Kaerber) для любой концентрации: 96-луночные микропланшеты инфицируют указанным вирусом при двухкратном разбавлении, через 1 час после инфекции удаляют надосадочную жидкость и добавляют среду с содержанием PDTC в указанных концентрациях. Количество инфицированных лунок определяют через 4 суток. На фиг.9 показано, как при концентрации 300 мкМ PDTC TCID₅₀ уменьшился на 76,4% и 82,2% для A/PR8/34 и A/Vienna/47/96.

Ингибирование в размере свыше 99,9% для обоих вирусов было достигнуто при концентрации 1200 мкМ.

Пример 9. Определение эффективной концентрации PDTC

Эффективную концентрацию PDTC определяют анализом снижения цитопатического действия (СРЕ Reduktion-Assay) (СРЕ = cytopathic effect): клетки Vero культивируют на 96-луночных микропланшетах и инфицируют при 5 TCID₅₀ и 50 TCID₅₀ на одну лунку вирусом гриппа A/PR8/34 и при 5 TCID₅₀ на одну лунку вирусом гриппа A/Vienna/47/96. Через 1 ч после инфекции удаляют надосадочную жидкость и добавляют среду с 5 мкг/мл трипсина и двукратно разведенным PDTC, исходная концентрация которого составляла 1200 мкМ. В последующие четверо суток планшеты визуально исследуют на цитопатическое действие. Проявление цитопатического действия рассчитывают в соотношении с контрольным образцом по каждой концентрации. Положительные 100% означают полный лизис во всех лунках. На фиг.10 можно видеть, что уменьшение положительных лунок на 50% было получено при концентрации от 50 до 100 мкМ PDTC, полное прекращение цитопатического действия для всех вирусов наступило при концентрации 600 мкМ PDTC.

Пример 10. Определение действия PDTC in vivo

10 мышей C57/BL6 инокулируют через нос летальной дозой (50 мкл 10 ⁷ pfU) вируса A/PR8/34. Через 1 ч после этого им вводят через нос 25 мкл PDTC 600 мМ и 25 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером. Мышей исследуют и обрабатывают в течение первых 48 часов через каждые 12 ч, затем через каждые 24 ч. Вес мышей измеряют и выражают в % от начального веса (% w, фиг.11А). На фиг.11В можно видеть, что все обработанные с помощью PDTC мыши (квадрат) перенесли вирусную инфекцию и через 7 суток после инфекции прибавили в весе. Все мыши, обработанные физиологическим раствором с фосфатным буфером (ромбы), погибли в течение 12 суток после инфекции (%s = % выживших).

Тем самым было показано, что уже один PDTC обладает сильным действием против инфекций, вызываемых вирусом гриппа, in vitro и in vivo.

Пример 11. Антивирусная активность PDTC против вируса А конского ринита (ERAV)

Снижение размножения вируса А конского ринита добавкой PDTC исследуют следующим образом: клетки Vero инфицируют 10 TCID ₅₀ на клетку вирусом ERAV. Одновременно добавляют PDTC в разных концентрациях (1 мМ-50 мкм). Через 4 часа после инфекции удаляют инокулят и добавляют свежую среду с содержанием PDTC. Через 24 часа после инфекции удаляют надосадочную жидкость и определяют титр вируса с помощью стандартного исследования на планшете.

На фиг.12 показано, как титр вируса (vt) в надосадочной жидкости уменьшается по сравнению с необработанными клетками.

Пример 12. Действие PDTC на размножение вируса ящура (MKS) в культуре клеток

С помощью анализа снижения цитопатического действия (СРЕ Reduktions-Assay) определяли эффективную концентрацию PDTC при воздействии на клетки, разрушенные вирусом ящура.

Клетками IB-RS-2 культивируют микропланшеты с 96 лунками, инфицируют вирусом ящура O-Manisa при 0,1 TCID ₅₀ на клетку и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Затем инокулят удаляют и добавляют инфекционную среду с указанной концентрацией PDTC (10 мкМ-1200 мкМ). Через 24 ч определяют количество инфицированных лунок наблюдением через микроскоп за цитопатическим действием.

На фиг.13А показано, что количество инфицированных лунок (% pos.) через 24 часа зависело от концентрации PDTC. 600 мкМ PDTC защищают клетки на 100% от цитопатического действия, вызываемого вирусами. 50%-ное снижение инфицированных лунок достигается при концентрации в диапазоне 75-150 мкМ.

Для определения воздействия PDTC на репликацию вируса ящура клетки IB-RS-2 инфицируют в склянках Т25 см² вирусом ящура O-Manisa при 0,001 TCID₅₀ на клетку и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Затем удаляют инокулят и добавляют инфекционную среду с содержанием PDTC в указанных концентрациях (0 мкМ-200 мкМ). Через 24 часа после инфекции удаляют надосадочную жидкость и определяют титр вируса (TCID) в стандартном анализе на планшете.

Как показано на фиг.13В, титр вируса 0-Manisa ящура снизился в присутствии PDTC более чем на 2 логарифмических ступеньки по сравнению с контрольным образцом (0). В контрольный образец PDTC не добавлялся.

Пример 13. Воздействие PDTC на размножение вирусов FSME в культуре клеток

Вирусы FSME не относятся к пикорнавирусам и заболевания в дыхательном тракте не вызывают.

Слитные монослои клеток ВНК-21 (АТСС) инфицируют вирусом FSME при 10 pfu/клетка (Neudörfel) в присутствии PDTC в следующих концентрациях: 1000 мкМ, 500 мкМ, 250 мкМ, 125 мкМ, 62,5 мкМ, 31,25 мкМ, 15,6 мкМ, 7,8 мкМ, 3,9 мкМ, 1,95 мкМ, 0,975 мкМ.

Затем клетки инкубируют в течение 4 суток при 37°С и монослой клеток анализируют под микроскопом. Размножение вирусов определяют с помощью иммунноферментного анализа. Микроскопический анализ показал отсутствие признаков токсичного действия PDTC. Количественная оценка размножения вирусов говорит о том, что PDTC в любой (из исследованных) концентрации не способен уменьшить размножение вирусов.

Аналогичное исследование было проведено для выявления влияния PDTC на размножение вируса в клетках в суспензии: проверялись те же концентрации, что и указанные выше. И в этом опыте также не было получено подтверждения снижения размножения вируса под действием PDTC.

Пример 14. Воздействие PDTC на мышей, инфицированных вирусом ЕМС

Мыши С57В16 были инфицированы внутрибрюшинно вирусом ЕМС при 10 TCID ₅₀. Контрольной группе вводят внутрибрюшинно один раз в день 50 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером. Двум другим группам вводят 50 мкл 50 мМ PDTC в день, причем в одной группе лечение начинают одновременно с инфекцией (PDTC), в другой группе через 24 часа после инфекции (PDTC, 24 ч после инфекции).

На фиг.14 показано изменение веса мышей после начала инфекции. Совершенно очевидно, что обработанные и необработанные мыши между собой не различаются. Среди инфицированных мышей всех групп гибель наступала в среднем через 5,5 суток.

Таким образом было показано, что PDTC не оказывает действия на инфекцию, вызываемую вирусом ЕМС, который хотя и относится к пикорнавирусам, однако заболевание вызывает не в дыхательном тракте, а в нервных клетках.