способ получения липополисахаридной композиции, содержащей липид а, липополисахаридная композиция, содержащая липид а, 3-o-дезактивированный 4 -монофосфориллипид а

Формула изобретения

1. Способ получения липополисахаридной композиции, содержащей липид А, включающий

а) выращивание культуры сильно шероховатого мутантного бактериального штамма в среде;

б) выдерживание культуры в стационарной фазе, по крайней мере, около 5 ч;

в) сбор клеток культуры;

с) экстрагирование липополисахаридной композиции, содержащей липид А, из клеток.

2. Способ по п.1, в котором сильно шероховатый мутантный бактериальный штамм принадлежит к роду Salmonella.

3. Способ по п.2, в котором сильно шероховатый мутантный бактериальный штамм из рода Salmonella относится к виду Salmonella minnesota.

4. Способ по п.3, в котором сильно шероховатый мутантный бактериальный штамм из вида Salmonella minnesota представлен штаммом Salmonella minnesota R595.

5. Способ по п.1, в котором среда представляет собой М9.

6. Способ по п.1, в котором выдерживание культуры осуществляют в течение периода времени от около 5 ч до около 6 ч.

7. Липополисахаридная композиция, содержащая липид А, полученная способом по пп.1-6.

8. 3-O-дезактивированный 4'-монофосфориллипид A (3D-MLA), полученный путем последовательного кислотного и щелочного гидролиза липополисахаридной композиции по п.7.

Описание изобретения к патенту

Ссылки на родственные заявки

Данная заявка не является предварительной и пользуется преимуществом предварительной заявки США №60/280089 от 30 марта 2001 г.

Заявление о правах на изобретения, сделанные при исследовательских работах, финансируемых из федеральных средств

Не применимо.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение, в общем, касается биосинтетического получения 3-О-деацилированного 4'-монофосфориллипида А (3D-MLA). В частности, оно касается способов улучшения выхода нужных производных 3D-MLA или сведения к минимуму затрат на очистку липополисахаридных (LPS) предшественников 3D-MLA.

Уровень техники

Давно уже признано, что липополисахариды (LPS) энтеробактерий являются мощными стимуляторами иммунной системы. Субмикрограммовые количества LPS могут вызывать целый ряд реакций, как благоприятных, так и вредных. Тот факт, что некоторые реакции являются вредными, а часть из них могут быть смертельными, препятствует клиническому применению самого LPS. Было обнаружено, что компонентом LPS, наиболее ответственным за эндотоксическую активность, является липид А.

Соответственно прилагалось много усилий для ослабления токсических свойств LPS или липида А без уменьшения полезных иммуностимуляторных свойств этих соединений. Наиболее заметными были усилия Edgar Ribi и его сотрудников, приведшие к получению производного липида А - 3-О-деацилированного 4'-монофосфориллипида А (3D-MLA; композиции, содержащие 3D-MLA, коммерчески доступны под торговой маркой MPL ^® фирмы Corixa Corporation (Seattle, WA). Показано, что 3D-MLA обладает практически теми же иммуностимуляторными свойствами, что и липид А, но меньшей эндотоксичностью (Myers et al., патент США №4912094). Myers et al. также сообщили и способ получения 3D-MLA, состоящий в следующем. Во-первых, LPS или липид А, полученный из сильно шероховатого (deep rough) мутантного штамма deep rough грам-отрицательной бактерии (к примеру, Salmonella minnesota R595), кипятят с обратным холодильником в слабом растворе минеральной кислоты (к примеру, 0,1 N HCl) в течение примерно 30 мин. Это ведет к дефосфорилированию в положении 1 глюкозамина на восстанавливающем конце и декарбогидратации в положении 6' невосстанавливающего глюкозамина липида А. Во-вторых, дефосфорилированный и декарбогидратированный липид А (также известный как монофосфориллипид А или MLA) подвергают щелочному гидролизу, к примеру, путем растворения в органическом растворителе типа смеси хлороформ:метанол (ХМ) 2:1 (об/об), насыщения раствора водным раствором 0,5 М Na ₂СО₃ при рН 10,5 и мгновенного испарения растворителя. Это ведет к избирательному удалению остатка -монофосфориллипид а, патент № 2302463" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксимиристиновой кислоты в положении 3 липида А с образованием 3-O-деацилированного 4'-монофосфориллипида А (3D-MLA).

Качество 3D-MLA, полученного указанным способом, сильно зависит от чистоты и состава LPS, получаемого из грам-отрицательной бактерии. Так, например, компонент LPS, липид А, представляет собой смесь близкородственных молекул, содержащих от 5 до 7 остатков жирных кислот. При образовании 3D-MLA, как следует из предшествующего обсуждения, один остаток жирной кислоты удаляется, что дает 3D-MLA, содержащий от 4 до 6 остатков жирных кислот. Обычно считается, что 3D-MLA как минимум с 6 остатками жирных кислот предпочтителен в смысле комбинации сохраненных или усиленных имуностимуляторных свойств, сниженной токсичности и других желательных свойств (Qureshi and Takayama, in "The Bacteria," Vol. XI (Iglewski and Clark, eds.). Academic Press, 1990, pp.319-338).

С другой стороны, при экстракции LPS из грам-отрицательных бактерий в коммерческом масштабе обычно применяется метод Чена (Chen et al., J.Infect. Dis. 128: 543 (1973), то есть экстракция смесью ХМ, что ведет к получению обогащенной LPS, и фосфолипидами ХМ-фазы, из которой впоследствии можно очистить LPS. Однако очистка LPS из обогащенной LPS и фосфолипидами ХМ-фазы обычно требует нескольких стадий осаждения, чтобы получить достаточно чистый LPS для применения в качестве иммуностимулятора, к примеру, в качестве адъюванта вакцины.

Таким образом, желательно иметь способы удобного получения высокоочищенных композиций LPS. Кроме того, желательно иметь способы получения композиций LPS, содержащих 3D-MLA с повышенным содержанием гексаацильных вариантов.

Для получения культур грам-отрицательных бактерий, содержащих готовый к очистке LPS, применялись известные методы ферментации. Такие известные методы обычно включают получение бактериальных культур в начале стационарной фазы, что соответствует стандартной практике в бактериологии. Однако было замечено, что степень ацилирования LPS варьирует при получении в известных условиях. Так, содержание гексаацильного варианта в липиде А из S. minnesota R595 колеблется от 20% до 80% в зависимости от партии (Rietschel et al., Rev. Infect. Dis. 9: 527 (1987). Такие колебания в содержании гексаацильного варианта могут привести к значительным различиям в содержании гексаацильного варианта в 3D-MLA, полученном из этих партий LPS.

Сущность изобретения

В одном из воплощений настоящее изобретение касается способа получения липополисахарида (LPS), включающего:

a) выращивание культуры мутантного бактериального штамма deep rough в среде;

b) выдерживание культуры в стационарной фазе, по крайней мере, около 5 ч;

c) сбор клеток из культуры;

d) экстрагирование LPS из клеток.

Способ позволяет получать такой LPS, который дает 3D-MLA с относительно высоким содержанием (не менее 20 мол.%) вариантов, содержащих 6 остатков жирных кислот.

В другом воплощении настоящее изобретение касается способа экстракции липополисахарида (LPS) из культуры клеток мутантного бактериального штамма deep rough, включающего:

a) экстрагирование клеток раствором, в основном состоящим, по меньшей мере, на 75% (мас.) из алифатического спирта, содержащего от 1 до 4 атомов углерода, остальное - вода, в результате чего получают клетки с пониженным содержанием фосфолипидов;

b) экстрагирование клеток с пониженным содержанием фосфолипидов раствором, включающим хлороформ и метанол (ХМ), в результате чего образуется раствор LPS в ХМ.

Этот способ обеспечивает растворы LPS в ХМ, которые имеют пониженное содержание фосфолипидов и поэтому пригодны для дальнейшей модификации и очистки до 3D-MLA. Способ включает относительно простые и недорогие стадии.

Перечень фигур чертежей

Нижеследующие чертежи входят в состав настоящей заявки и включены для дальнейшего раскрытия определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято при обращении к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием представленных в описании конкретных воплощений.

На фиг.1 представлены пластинки после тонкослойной хроматографии (ТСХ) этанольных экстрактов и образцов LPS, полученных при различных температурах при экстракции этанолом. На пластинке слева представлены, слева направо, этанольные экстракты при температурах 22°С, 37°С и 50°С. Крайний справа образец на этой пластинке является образцом подлинного LPS. На пластинке справа представлены образцы LPS, полученные из каждого из препаратов. Образцы в дорожках 3, 4 и 5 соответствуют LPS из клеток, подвергнутых предварительной экстракции этанолом при 22°С, 37°С и 50°С соответственно. Жирные полосы с R_f˜0,6 соответствуют примесям фосфолипидов и жирных кислот. Содержание этих примесей снижается при повышении температуры экстракции этанолом, и оно очень низкое в образце, который был предварительно экстрагирован при 50°С.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В одном из воплощений настоящее изобретение касается способа получения липополисахарида (LPS), включающего:

a) выращивание культуры мутантного бактериального штамма deep rough в среде;

b) выдерживание культуры в стационарной фазе, по крайней мере, около 5 ч;

c) сбор клеток из культуры;

d) экстрагирование LPS из клеток.

Липополисахариды являются основными липидными компонентами наружного слоя внешней мембраны грам-отрицательных бактерий. Фракция липополисахаридов у грам-отрицательных бактерий содержит наряду с другими компонентами липид А. Как описано выше, липид А может быть декарбогидратирован и дефосфорилирован с образованием монофосфориллипида A (MLA), a MLA может быть избирательно деацилирован в положении 3 с образованием 3-O-деацилированного 4'-монофосфориллипида A (3D-MLA).

Однако липид А, продуцируемый грам-отрицательными бактериями, обычно состоит из нескольких вариантов, имеющих в целом одинаковую структуру липида А, но отличающихся числом содержащихся в них остатков жирных кислот. Группы разновидностей молекулы липида А с одинаковым числом остатков жирных кислот именуются в настоящем изобретении "вариантами" (congeners). Варианты липида А, имеющие от 4 до 7 остатков жирных кислот, получают при стандартном выращивании в коммерческом масштабе таких грам-отрицательных бактерий, как S. minnesota R595. В результате этого 3D-MLA, полученный, к примеру, из липида А S. minnesota R595, имеет состав вариантов, который обычно варьирует от 3 до 6 остатков жирных кислот (так как 3D-MLA подвергался удалению одного остатка жирной кислоты).

Гетерогенность состава вариантов 3D-MLA (через липид А и MLA) может происходить из двух источников: 1) биосинтетической вариабельности при сборке липида А и 2) потери остатков жирных кислот из каркаса липида А при процессинге до 3D-MLA. Не ограничиваясь одной теорией, считается, что биосинтетическая вариабельность имеет место вследствие неабсолютной субстратной специфичности ацилтрансфераз, принимающих участие в заключительных стадиях биосинтеза липида А, наряду с другими объяснениями. Потеря остатков жирных кислот из каркаса липида А также может происходить при кислотном и щелочном гидролизах, обычно применяющихся при получении 3D-MLA.

Неожиданно было открыто, что состав вариантов 3D-MLA может быть изменен путем изменения параметров процесса культивирования мутантного бактериального штамма deep rough, продуцирующего липид А. В частности, было открыто, что выдерживание культуры мутантного бактериального штамма deep rough в стационарной фазе, по крайней мере, около 5 ч перед сбором клеток приводит к изменению соотношения вариантов получаемого при этом липида А таким образом, что в типичном случае, по меньшей мере, 20 мол.% 3D-MLA, получаемого впоследствии из липида А, содержат 6 остатков жирных кислот. Предпочтительно по меньшей мере 50 мол.% 3D-MLA содержат 6 остатков жирных кислот. Продолжительность выдерживания в стационарной фазе около 5,5 ч оказалась особенно эффективной. Это отличается от обычных способов культивирования, известных в данной области, при которых выделение клеток происходит почти сразу после вхождения культуры в стационарную фазу; в известном способе содержание вариантов LPS очень вариабельно и приводит к получению 3D-MLA с вариабельным содержанием гексаацильного варианта.

Под "сильно шероховатым (deep roudh) мутантным бактериальным штаммом" подразумевается штамм грам-отрицательных бактерий, имеющий сильно шероховатый (deep roudh) фенотип. Фенотип "deep rough" означает, что полисахаридная часть, присоединенная к липиду А, состоит только из 2-3 остатков 2-кето-3-дезокси-D-маннооктулоновой кислоты (KDO). Предпочтительно мутантный бактериальный штамм deep rough выбирают из рода Salmonella. Более предпочтительно, если мутантный бактериальный штамм deep rough принадлежит к роду Salmonella, то он относится к виду Salmonella minnesota, и еще более предпочтительно он представлен штаммом Salmonella minnesota R595. Можно использовать другие бактериальные штаммы мутантов deep rough, например штаммы Proteus mirabilis, среди прочих.

Для выращивания мутантного бактериального штамма deep rough можно применять любые подходящие методы. Обычно это включает использование, по меньшей мере, одного биореактора промышленного масштаба. В одном из воплощений метод включает инокулирование относительно небольшого (к примеру, на 15 л) биореактора клетками мутантного бактериального штамма deep rough, культивирование этого штамма до стационарной фазы, а затем асептический перенос всех 15 л клеток в большой (например, на 750 л) биореактор.

Культивирование можно проводить в любой среде, которая, как это известно или установлено, позволяет выращивать мутантный бактериальный штамм deep rough. В одном из предпочтительных воплощений среда представляет собой М9, смесь из неорганических солей с добавлением глюкозы и казаминовых кислот. Состав М9 хорошо известен специалистам в этой области.

После выдерживания мутантного бактериального штамма deep rough в стационарной фазе, по меньшей мере, 5 ч из культуры можно собрать клетки и из них экстрагировать LPS. Для выделения клеток из культуры и экстракции из них LPS можно применять известные методы, однако предпочтительный метод экстракции LPS из клеток описан ниже.

Сбор клеток можно проводить любым известным способом. В одном из предпочтительных воплощений после выдерживания культуры клеток в стационарной фазе, по меньшей мере, 5 ч, содержимое биореактора закачивают в аппарат для тангенциальной фильтрации для отделения использованной среды от клеток.

Затем из клеток экстрагируют LPS любым подходящим способом. К известным способам относятся метод Галаноса, который включает экстракцию LPS смесью фенола, хлороформа и петролейного эфира (ФХП) с последующим испарением хлороформа и петролейного эфира, добавление ацетона и воды для осаждения LPS и извлечение LPS путем центрифугирования или фильтрования (Galanos et al., Eur. J.Biochem. 9: 245 (1969), и метод Чена, указанный выше, который включает экстракцию LPS смесью хлороформа и метанола (ХМ) с последующей серией осаждений метанолом.

Улучшенный вариант метода Чена описан ниже - он предпочтителен для получения LPS и его производных в коммерческих целях.

Независимо от метода экстракции результатом является практически чистый высушенный LPS, который можно далее обработать последовательно путем кислотного гидролиза и щелочного гидролиза с образованием 3D-MLA, как предусмотрено Ribi, патент США №4436727, и Myers et al., патент США №4912094, которые включены в настоящее изобретение путем отсылки. Суммируя основные положения этих ссылок в качестве предпочтительного воплощения для получения 3D-MLA, LPS подвергают реакции с органической или неорганической кислотой, а затем лиофилизируют для получения MLA. Неорганическая кислота предпочтительно представлена соляной кислотой, серной кислотой или фосфорной кислотой. Органическая кислота предпочтительно представлена толуолсульфоновой кислотой или трихлоруксусной кислотой. Реакция может проводиться при температуре от 90°С до 130°С в течение времени, достаточного для полного гидролиза, обычно от 15 мин до 60 мин. MLA можно обработать растворителем, предпочтительно ацетоном, для растворения жирных кислот и других загрязнений, а затем удалить обогащенный загрязнениями растворитель для жирных кислот.

После этого MLA подвергают мягкой обработке щелочью для избирательного удаления -монофосфориллипид а, патент № 2302463" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксимиристиновой кислоты в положении 3 MLA (в слабощелочных условиях лабильна только -монофосфориллипид а, патент № 2302463" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксимиристиновая кислота в положении 3). Обработка слабой щелочью может проводиться в водной или органической среде. К подходящим органическим растворителям относятся метанол и другие спирты, диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), хлороформ, дихлорметан или их смеси наряду с другими. Также можно использовать смеси воды с органическими растворителями, смешивающимися с водой.

Основание для проведения щелочного гидролиза предпочтительно выбирают из гидроксидов, карбонатов, фосфатов или аминов. Примеры неорганических оснований включают гидроокись натрия, гидроокись калия, карбонат натрия, карбонат калия, бикарбонат натрия и бикарбонат калия наряду с другими. Примеры органических оснований наряду с другими включают алкиламины (типа диэтиламина и триэтиламина наряду с другими).

В водных средах величина рН обычно составляет от около 10 до около 14, предпочтительно от около 10 до около 12. Реакция гидролиза обычно проводится при температуре от около 20°С до около 80°С, предпочтительно от около 50°С до около 60°С, в течение времени от около 10 мин до около 48 ч.

Один из предпочтительных методов щелочного гидролиза включает растворение MLA в ХМ 2:1 (об/об), насыщение раствора водным буфером 0,5 М Na₂CO ₃ при рН 10,5, а затем мгновенное испарение растворителя при 45-50°С в вакуумном вытяжном устройстве (приблизительно 100 мм Hg).

В другом воплощении настоящее изобретение касается способа экстракции липополисахарида (LPS) из культуры клеток мутантного бактериального штамма deep rough, включающего:

a) экстрагирование клеток раствором, в основном состоящим, по меньшей мере, на 75% (мас.) из алифатического спирта, содержащего от 1 до 4 атомов углерода, остальное - вода, в результате чего получают клетки с пониженным содержанием фосфолипидов;

b) экстрагирование клеток с пониженным содержанием фосфолипидов раствором, содержащим хлороформ и метанол (ХМ), в результате чего образуется раствор LPS в хлороформе и метаноле.

Клетки мутантного бактериального штамма deep rough, их культура и способы получения культуры описаны выше. Предпочтительно мутантный бактериальный штамм deep rough выбирают из родов Salmonella или Escherichia. Более предпочтительно, если мутантный бактериальный штамм deep rough принадлежит к роду Salmonella, то он относится к виду Salmonella minnesota, и еще более предпочтительно он представлен штаммом Salmonella minnesota R595. Если мутантный бактериальный штамм deep rough принадлежит к роду Escherichia, то предпочтительно он относится к виду Escherichia coli, и еще более предпочтительно он представлен штаммом Escherichia coli D31m4.

Первая стадия экстракции может проводиться с помощью любого короткоцепочечного алифатического спирта. Алифатический спирт может быть линейным, разветвленным или циклическим. Предпочтительно алифатический спирт имеет от 2 до 4 атомов углерода и смешивается с водой. Более предпочтительно алифатический спирт представлен этанолом.

Содержащий алифатический спирт раствор может содержать любое количество алифатического спирта от 75% (мас.) и выше. Предпочтительно раствор содержит от около 85% до около 95% алифатического спирта. Остаток раствора в основном представлен водой. Могут присутствовать примеси других соединений в результате неполной очистки или других загрязнений в алифатическом спиртовом или водном компонентах раствора.

Температура, при которой проводится стадия первой экстракции, может быть любой, которая эффективна в обеспечении достаточной экстракции фосфолипидов из культуры клеток. Предпочтительно температура составляет от около 35°С до около 65°С. Более предпочтительно температура составляет от около 45°С до около 55°С.

Другие параметры стадии первой экстракции, такие как скорость добавления раствора алифатического спирта, продолжительность контакта раствора с клетками и перемешивание или его отсутствие, среди прочего, могут рутинно изменяться средним специалистом в этой области.

Стадия первой экстракции приводит к получению: (i) обогащенной фосфолипидами фазы раствора алифатического спирта и (ii) клеток с пониженным содержанием фосфолипидов. Входящий в состав клеточных мембран LPS отделяется практически полностью от клеток с пониженным содержанием фосфолипидов.

Стадия второй экстракции включает экстрагирование клеток с пониженным содержанием фосфолипидов раствором хлороформа:метанола (ХМ).

Можно использовать любое соотношение хлороформа и метанола, пригодное для экстракции LPS из клеточных мембран (как в методе Чена), на стадии второй экстракции. Обычно соотношение хлороформа и метанола составляет от около 2:1 до около 9:1. Также можно использовать смеси растворителей со свойствами, эквивалентными свойствам ХМ, для получения LPS из клеток с пониженным содержанием фосфолипидов.

Преимущество настоящего способа над методом Чена заключается в удалении фосфолипидов на стадии первой экстракции. В то время, как экстракция по методу Чена ведет к получению раствора LPS, содержащего значительное количество фосфолипидов, стадия второй экстракции по настоящему изобретению, которая осуществляется на клетках с пониженным содержанием фосфолипидов, дает обогащенный LPS раствор, практически лишенный фосфолипидов. Альтернативные способы получения препаратов LPS, относительно свободных от фосфолипидов, такие как метод Галаноса (см. выше), менее желательны, так как они не пригодны для крупномасштабного производства, в них применяются смеси растворителей, представляющих опасность для здоровья и безопасности (фенол : хлороформ : петролейный эфир), или по обеим причинам.

При практическом отсутствии фосфолипидов в растворе LPS дальнейшая очистка LPS по настоящему способу, в общем, является более простой и менее дорогостоящей, чем по методу Чена. Оказалось, что сухой остаток LPS достаточной степени чистоты можно получить при испарении хлороформа и метанола из раствора LPS.

При необходимости LPS может подвергаться дальнейшей обработке типа кислотного или щелочного гидролиза, как описано выше, для получения MLA или 3D-MLA.

3D-MLA, полученный описанными выше способами, может применяться для разных целей. Одним из предпочтительных является применение в качестве иммуностимулятора или адъюванта для фармацевтических композиций, содержащих иммуногенный полинуклеотид, полипептид, антитело, Т-клетки или антигенпрезентирующие клетки (АРС). Иммуностимулятор или адъювант означает практически любое вещество, повышающее или усиливающее иммунный ответ (антительный или клеточный) на экзогенный антиген.

Один из иммунных ответов, который может стимулироваться MLA или 3D-MLA, полученным по настоящему изобретению, относится к типу Th1. Комбинация монофосфориллипида А (MLA), предпочтительно 3-О-деацилированного 4'-монофосфориллипида А (3D-MLA), вместе с солью алюминия оказалась эффективной в качестве адъюванта для индукции ответа преимущественно типа Th1. Высокий уровень цитокинов типа Th1 (например, IFN- -монофосфориллипид а, патент № 2302463" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , TNF -монофосфориллипид а, патент № 2302463" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , IL-2, IL-12) имеет тенденцию способствовать индукции клеточных иммунных ответов на введенный антиген. Напротив, высокий уровень цитокинов типа Th2 (например, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) имеет тенденцию способствовать индукции гуморальных иммунных ответов. После применения фармацевтической композиции, содержащей MLA или 3D-MLA, у пациента будет проявляться иммунный ответ, включающий ответы типа Тh1 и типа Th2. Когда ответ относится преимущественно к типу Тh1, уровень цитокинов типа Тh1 повышается в большей степени, чем уровень цитокинов типа Th2. Уровни этих цитокинов можно легко определить стандартными методами. См. обзор по семейству цитокинов: Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989.

В одном из предпочтительных воплощений система адъюванта включает сочетание монофосфориллипида А (MLA), предпочтительно 3D-MLA, с производным сапонина (к примеру, Quil А или его производными, включая QS21 и QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), Escin, дигитонин или сапонины Gypsophila или Chenopodium quinoa), например QS21 в комбинации с адъювантом 3D-MLA, как описано в WO 94/00153, или менее реактогенная композиция, в которой QS21 ослаблен холестерином, как описано в WO 96/33739. Другие предпочтительные рецептуры включают эмульсию масло-в-воде и токоферол. Еще одна особенно предпочтительная формула адъюванта с применением QS21, 3D-MLA и токоферола в эмульсии масло-в-воде описана в WO 95/17210.

Следующие примеры приводятся для раскрытия предпочтительных воплощений изобретения. Специалисты в этой области должны понимать, что методы, раскрытые в нижеследующих примерах, представляют методы, открытые автором изобретения как хорошо работавшие при осуществлении изобретения, поэтому их следует рассматривать как предпочтительные способы его осуществления на практике. Однако специалисты в данной области, в свете настоящего описания, должны понимать, что можно произвести множество изменений раскрытых конкретных воплощений и тем не менее получить сходные или одинаковые результаты, не отходя от духа и рамок изобретения.

Пример 1. Общие методы

А. Приготовление сред

Клетки выращивали в среде М9, которую готовили путем смешивания стерильных растворов неорганических солей, казаминовых кислот и глюкозы. Обычно раствор солей для М9 готовили в ферментере, и он содержал следующие соли: 2,0 г/л NaCl, 0,2 г/л MgSO₄ ·7H₂O, 3,0 г/л КН₂ PO₄, 6,0 г/л Na₂HPO ₄ и 1,0 г/л NH₄Cl. Затем в ферментер асептически добавляли стерильные растворы 20% (вес/об.) казаминовых кислот (20 мл/л) и 50% (вес/об.) глюкозы (32 мл/л), получая полную среду.

В. Выращивание посевного материала

В типичном случае в стерильную коническую колбу на 250 мл вносили 50 мл стерильной среды М9. Оттаивали пузырек с клетками Salmonella minnesota R595 (около 10⁸ к.о.е.) и вносили в колбу, которую закрывали марлевой пробкой. Культуру инкубировали при 37°С в течение 6-8 ч, до появления сильного роста.

С. Культивирование клеток

Культуры Salmonella minnesota R595 культивировали в ферментере BioFlo III (New Brunswick Scientific, Inc.), оснащенном стеклянным сосудом на 2,5 л. В типичном случае в сосуд вносили 2,0 л раствора солей М9, автоклавировали, а затем асептически добавляли стерильные растворы казаминовых кислот и глюкозы. К ферментеру были подсоединены трубки для подачи пеногасителя (0,1% SAG-471, Witco Corp.) и NH₄OH (30%), а также датчики на рН, dO₂ и пену. Среду доводили до рН 6,9 путем подачи NH₄ОН. Затем ферментер инокулировали всем выращенным посевным материалом и инкубировали при 37°С с пропусканием воздуха (обычно 2,0 л/мин) и перемешиванием (обычно 50 об/мин). За ростом культуры следили, измеряя оптическую плотность при 590 нм. Клетки собирали центрифугированием или с помощью тангенциального фильтрования, промывали водой и лиофилизировали.

D. Экстракция липополисахарида (LPS)

LPS выделяли по методу Qureshi et al. (1986) с небольшими модификациями. В типичном случае высушенные клетки сначала помешивали при концентрации 20 мг/мл в 90% этаноле при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем собирали фильтрованием под вакуумом. Клетки подвергали второй экстракции этанолом, а затем последовательно экстрагировали ацетоном и диэтиловым эфиром (по 15 мин при 40 мг/мл в пересчете на исходный вес) и полученный эфирный порошок оставляли сушиться на воздухе в течение ночи.

Тем временем готовили раствор фенола (89%) : хлороформа : петролейного эфира (19:45:72 по объему, сокращенно ФХП) и оставляли на ночь. Эфирный порошок суспендировали в ФХП, с которого сливали излишки воды, при концентрации 70 мг/мл. Раствор перемешивали в течение 30 мин, а затем центрифугировали (3000×g, 15 мин, 0-5°С). Фракцию супернатанта декантировали в круглую колбу, а осадок клеток вторично экстрагировали ФХП. Фракции супернатантов объединяли и упаривали на роторном испарителе при 40°С почти до полного удаления летучих растворителей. Затем измеряли оставшийся объем. По каплям добавляли воду до появления стойкого помутнения, а затем в фенольный раствор последовательно добавляли 5 объемов ацетона и 1 объем диэтилового эфира (оба охлажденные во льду) с быстрым перемешиванием. Раствор помещали в лед на 30 мин, после чего выпавший осадок LPS извлекали центрифугированием (5000×g, 15 мин, 0-5°С). Обычно приходилось фильтровать самотеком фракцию супернатанта, чтобы извлечь LPS, не перешедший в осадок. LPS промывали один раз минимальным объемом холодного ацетона, собирали центрифугированием/фильтрованием, а затем высушивали под вакуумом. Обычно выход составлял 4-5% в пересчете на исходный сухой вес клеток.

Е. Получение 4'-монофосфориллипида A (MLA)

LPS суспендировали в воде при концентрации 10 мг/мл путем обработки ультразвуком при 45-55°С для лучшего диспергирования твердого вещества. Полученный раствор должен быть слегка мутным, без твердых частиц, видимых невооруженным глазом. В этот раствор добавляли 1 объем 0,2 N HCl и помещали в кипящую водяную баню на 15 мин. Реакцию останавливали на льду, а затем экстрагировали 5 объемами (относительно исходного раствора LPS) смеси хлороформ:метанол (по объему) 2:1. Двухфазный раствор перемешивали на вибромешалке и разделяли фазы низкоскоростным центрифугированием (500-1000×g). Нижнюю фазу извлекали и упаривали под азотом, получая неочищенный MLA.

F. Получение 3-O-деацилированного 4'-монофосфориллипида A (3D-MLA)

Неочищенный MLA растворяли в смеси хлороформ: метанол 2:1 (по объему) при концентрации примерно 1-5 мг/мл и 3,0 мл этого раствора переносили в пробирку 16×100 мм. В пробирку дополнительно добавляли 0,4 мл метанола и помещали в водяную баню при 50°С на 10 мин. Реакцию запускали добавлением 40 мкл 0,5 М КНСО₃, рН 10,5, и инкубировали раствор при 50°С в течение 20 мин. По окончании этого времени пробирку вынимали из бани и останавливали реакцию добавлением 2,0 мл 0,1 N HCl (охлажденного), а затем перемешивали на вибромешалке. 3D-MLA получали добавлением 1,0 мл метанола с перемешиванием на вибромешалке, центрифугированием (500-1000×g) и упариванием нижней (органической) фазы досуха под азотом.

Пример 2. Аналитические методы

А. Тонкослойная хроматография (ТСХ) MLA и подобных препаратов

Все анализы методом ТСХ проводили, используя пластинки 5×10 см, покрытые силикагелем 60 (Е. Merck). Образцы обычно наносили на пластинки для ТСХ в виде растворов 10 мг/мл в смеси хлороформ: метанол 4:1 (по объему), нанося по 3 мкл раствора (30 мкг препарата) маленькими точками на линию в 5 мм с помощью капиллярной пипетки. Пластинки разгоняли в системе растворителей хлороформ/метанол/вода/гидроокись аммония 50:31:6:2 (по объему). Пятна на разогнанных пластинках проявляли, опрыскивая их раствором 10% фосфомолибденовой кислоты в этаноле и нагревая при 150-160°С. В некоторых случаях относительную интенсивность пятен измеряли на сканирующем денситометре Shimadzu CS9000U Dual Wavelength Flying Spot Scanner (Shimadzu Corp.) при длине волны сканера 520 нм.

В. Анализ MLA/3D-MLA методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Образцы для анализа сначала переводили в форму свободной кислоты путем промывки 3-5 мг образца, растворенного в 5 мл смеси хлороформ:метанол 2:1 (по объему), с помощью 2 мл 0,1 N HCl. Двухфазную систему перемешивали на вибромешалке, центрифугировали, переносили нижнюю (органическую) фазу в пробирку и упаривали под струей азота. После этого остаток метилировали путем обработки диазометаном. Вкратце, готовили эфирный раствор диазометана, помещая 60-100 мг 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидина (MNNG; Aldrich) в пузырек на 2 драхмы, добавляя 60 мкл диэтилового эфира на 1 мг MNNG, а затем 9 мкл 5 N NaOH на 1 мг MNNG, с перемешиванием раствора при < -10°С. После завершения реакции лимонно-желтую эфирную фазу высушивали, перенося ее во второй пузырек, содержащий несколько кусочков NaOH, и вращая круговыми движениями, причем все это при < -10°С. Промытый кислотой образец растворяли в 1 мл смеси хлороформ:метанол 4:1 (по объему), помещали в баню при < -10°С и по каплям добавляли раствор диазометана с перемешиванием до получения устойчивого слабо-желтого оттенка. После этого испаряли растворитель при комнатной температуре под струей азота и дополнительно высушивали под вакуумом не менее 30 мин.

Хроматографический анализ проводили на колонке с обращенной фазой C₁₈ (Nova-Pak, размер частиц 4 мкм, 8 мм × 10 см, фирма Waters). Метилированные образцы растворяли в смеси хлороформ: метанол 4:1 (по объему) при концентрации 100 мкг/мл и пропускали через шприц-фильтр PTFE с размером пор 0,45 мкм. Обычно вводили 20-25 мкл, а затем элюировали линейным градиентом от 20 до 80% изопропанола в ацетонитриле в течение 60 мин со скоростью 2 мл/мин при детекции при 210 нм.

С. Анализ содержания вариантов LPS методом ВЭЖХ

LPS имеет тенденцию к сильной гетерогенности вследствие вариабельности: 1) по числу углеводных остатков в области O-антигена и ядра, 2) полярным замещениям в области ядра и по фосфатам липида А, 3) по числу и расположению жирных кислот, присоединенных к каркасу липида А. Именно последний источник вариабельности представляет интерес в отношении содержания вариантов 3D-MLA (mpl ^®). Гидролиз LPS до MLA и 3D-MLA устраняет вариабельность в области O-антигена и ядра, однако он вводит дополнительную гетерогенность из-за бесконтрольной потери O-связанных жирных кислот. Это препятствует точному установлению профиля ацилирования в интактном LPS. Чтобы обойти это, был разработан метод, в котором фосфаты и область ядра удаляют в мягких условиях, не вызывающих потери O-связанных жирных кислот. Образующийся дефосфорилированный липид А (бесфосфорильный липид А, или ZPL) можно затем анализировать методом ВЭЖХ, получая точное отражение профиля ацилирования в исходном LPS.

Этот метод обычно осуществляли следующим образом. Образец в 0,5-5,0 мг LPS подвергали гидролизу в 200 мкл концентрированной фтористоводородной кислоты в течение 3-4 ч при 27°С. Эту реакцию необходимо проводить в плотно закрытой тефлоновой пробирке и в вытяжном шкафу с хорошей вентиляцией. HF удаляли испарением под струей азота при комнатной температуре, после чего гидролизат растворяли в смеси хлороформ:метанол 4:1 (по объему), переносили в стеклянную пробирку 16×100 мм и испаряли растворитель под струей азота. Остаток суспендировали в 1,0 мл 0,1% триэтиламина при обработке ультразвуком, добавляли 1,0 мл 40 мМ NaOAc и помещали пробирку в кипящую водяную баню на 30-45 мин. Реакцию останавливали охлаждением во льду и выделяли ZPL путем экстракции 5 мл смеси хлороформ: метанол 2:1 (по объему). Органическую фазу переносили в небольшой пузырек с завинчивающейся крышкой и испаряли растворитель под азотом. Получали производное ZPL, добавляя 200 мкл раствора 10 мг/мл O-(3,5-динитробензил)гидроксиламина-HCl (Regis Technologies, Inc.) в пиридине, плотно закрывая крышку и инкубируя при 60°С в течение 3 ч. Пиридин испаряли под азотом, а остаток дополнительно высушивали под вакуумом в течение >30 мин. Затем остаток суспендировали в 500 мкл смеси хлороформ:метанол 2:1 (по объему) и наносили на колонку с 0,5-1,0 мл носителя Accell-QMA (ацетатная форма; Waters), предварительно уравновешенную в том же растворителе. Колонку промывали общим объемом 5,0 мл смеси хлороформ:метанол 2:1 (по объему) за несколько приемов, а элюат собирали в пробирку 16×100 мм. В элюат добавляли 2,0 мл 0,1 N HCl, двухфазную систему перемешивали на вибромешалке, быстро центрифугировали при 500-1000×g, нижнюю (органическую) фазу переносили в другую пробирку и упаривали под азотом. Остаток растворяли в 100-300 мкл смеси хлороформ: метанол 4:1 (по объему) и фильтровали через шприц-фильтр PTFE с размером пор 0,45 мкм. Фильтр промывали дважды смесью хлороформ:метанол 4:1 (по объему), а фильтрат упаривали под азотом. Наконец, фильтрат растворяли в 50-150 мкл смеси хлороформ:метанол 4:1 (по объему) и переносили во флакон автоинжектора для ВЭЖХ. Условия ВЭЖХ были следующими: обращенно-фазовая колонка C₁₈ (например, Waters), вводимый объем 10 мкл, линейный градиент от 20 до 80% изопропанола в ацетонитриле в течение 60 мин со скоростью 2 мл/мин, детектор на 254 нм.

Пример 3. Сравнение состава вариантов MLA/3D-MLA из культур, собранных через разные промежутки времени

Проводили серию ферментаций со следующими параметрами: 2,0 л среды М9 (исходное значение рН 6,84-6,87), подача воздуха 2 л/мин, перемешивание при 50 об/мин, 37°С, без контроля рН. За ростом культур следили по измерению оптической плотности при 590 нм и останавливали при достижении требуемой стадии роста. Клетки обрабатывали и экстрагировали, как описано выше, получая образцы LPS, которые затем подвергали гидролизу до MLA и 3D-MLA и анализировали методом ВЭЖХ (см. примеры 1 и 2). Результаты приведены в табл.1.

Таблица 1 Состав вариантов MLA и 3D-MLA из клеток, собранных в различном возрасте
Ферментация	Описание	Возраст культуры в момент сбора	Время в стац. фазе	MLA		3D-MLA
				3-O-деацилир. гексаацил	гептаацил	3-O-деацилир. гексаацил
А	Поздняя экспоненциальная фаза	6,75 ч	не прим.	12,4%	12,2%	9,9%
В	Ранняя стационарная фаза	9,5 ч	˜0,5 ч	9,2%	6,8%	9,2%
С	Поздняя стационарной фаза	15 ч	˜6 ч	19,5%	13,2%	21,5%

Эти данные показывают, что в культурах S. minnesota R595 изменяется профиль LPS во время стационарной фазы, что приводит к увеличению общего содержания 3-O-деацилированных гексаацильных плюс гептаацильных форм в MLA, происходящем из этого LPS, а это, в свою очередь, вызывает повышение содержания 3-O-деацилированных гексаацильных форм в 3D-MLA, полученном из этого MLA.

Пример 4. Сравнение состава вариантов LPS из культур, собранных через разные промежутки времени

Проводили серию ферментаций со следующими параметрами: 2,0 л среды М9 (исходное значение рН 6,84-6,87), подача воздуха 2 л/мин, перемешивание при 225 об/мин, 37°С, без контроля рН. За стадиями роста культур следили по измерению оптической плотности при 590 нм. Клетки обрабатывали и экстрагировали, как описано в примере 1, получая образцы LPS. Образцы LPS подвергали гидролизу до ZPL и анализировали методом ВЭЖХ, как описано в примере 2. Результаты приведены в табл.2.

Таблица 2 Состав вариантов LPS из культур, собранных в различном возрасте
Ферментация	Описание	Возраст культуры в момент сбора	Время в стац. фазе	Содержание вариантов
				3-O-ацилир. гексаацил	3-O-деацилир. гексаацил	гептаацил
А	Ранняя стационарная фаза	9 ч	˜0,5 ч	76%	0%	24%
В	Поздняя стационарная фаза	15 ч	˜6 ч	48%	17%	19%

3-O-деацилированного гексаацильного компонента не было обнаружено в LPS из клеток на ранней стационарной фазе (ферментаиця А). Таким образом, единственным источником гексаацилированного варианта в 3D-MLA, полученном из этого LPS, будет гептаацилированное вещество (24%). Напротив, LPS из клеток, собранных на поздней стационарной фазе, содержал как гептаацильную, так и 3-O-деацилированную гексаацильную формы (19% и 17% соответственно). Обе эти формы будут вносить вклад в содержание гексаацильного варианта в 3D-MLA (MPL ^®), полученном из этого LPS. Неожиданно оказалось, что клетки вырабатывают 3-O-деацилированный гексаацильный вариант LPS при определенных условиях.

Пример 5. Влияние температуры предварительной экстракции на чистоту LPS из S. minnesota R595

Клетки S. minnesota R595 выращивали в ферментере на 80 л (New Brunswick Scientific) практически в тех же условиях, что изложены в примере 1. Клетки концентрировали путем тангенциального фильтрования, но не центрифугировали, и вязкая масса содержала 51,5 мг сухой массы клеток в 1 мл. Приготовили 3 раствора, в которых аликвоты по 150 мл суспензии клеток смешивали с 600 мл этанола. Этанольные растворы перемешивали 1 ч при 22°С, 37°С и 50°С, а затем фильтровали. Клетки подвергали второй экстракции этанолом в тех же условиях, только использовали 95% этанол. Клетки отделяли фильтрованием с отсосом, а затем экстрагировали в течение ночи смесью хлороформ:метанол 4:1 (по объему) при 50°С. Раствор фильтровали, а фильтраты упаривали досуха на роторном испарителе, получая препарат LPS. Образцы фильтратов после первой и второй экстракции, проводившейся при каждой температуре, а также LPS, полученный из предварительно экстрагированных клеток, анализировали методом тонкослойной хроматографии по методике из примера 2. Изображения пластинок после ТСХ представлены на чертеже.

На чертеже представлены пластинки после ТСХ этанольных экстрактов и образцов LPS, полученных при экстракции этанолом при различных температурах. На пластинке слева представлены, слева направо, этанольные экстракты при температурах 22°С, 37°С и 50°С. Крайний справа образец на этой пластинке является образцом подлинного LPS. На пластинке справа представлены образцы LPS, полученные из каждого препарата. Образцы в дорожках 3, 4 и 5 соответствуют LPS из клеток, подвергнутых предварительной экстракции этанолом при 22°С, 37°С и 50°С соответственно. Жирные полосы с R_f˜0,6 соответствуют примесям фосфолипидов и жирных кислот. Содержание этих примесей снижается при повышении температуры экстракции этанолом, и оно очень низкое в образце, который был предварительно экстрагирован при 50°С.

Как видно на пластинках ТСХ на фиг.1, предварительная экстракция при повышенной температуре эффективно удаляет загрязнения, которые в противном случае совместно экстрагируются смесью хлороформ: метанол 4:1 (по объему). Предварительная экстракция при 50°С приводит к получению LPS, в основном лишенного этих примесей.

Пример 6. Сравнение образцов LPS, полученных с предварительной экстракцией этанолом и без нее

Три партии клеток S. minnesota R595 выращивали в ферментере на 750 л (В. Braun) практически при тех же условиях, что изложены в примере 1. Клетки собирали путем тангенциального фильтрования, отбирали образцы суспензии клеток из каждой партии и лиофилизировали. Основную массу клеток подвергали двум предварительным экстракциям 90% этанолом при 50°С в течение 1 ч. Между экстракциями клетки извлекали путем тангенциального фильтрования. После этого клетки экстрагировали в течение ночи смесью хлороформ : метанол 4:1 (по объему) при кипячении с обратным холодильником. Экстракт выделяли путем тангенциального фильтрования и упаривали досуха. Лиофилизированные образцы клеток экстрагировали в течение ночи смесью хлороформ: метанол 4:1 (по объему) при кипячении с обратным холодильником, растворы фильтровали, а фильтраты упаривали досуха. Образцы LPS, полученные с предварительной экстракцией этанолом и без нее, анализировали методом ТСХ, в основном как описано в примере 2. Пластинки ТСХ сканировали от R_f=0,01 до 0,9 и рассчитывали отношение интенсивности в области LPS (R_f от 0,01 до 0,20) к общей интенсивности для каждого образца. Результаты представлены в табл.3.

Таблица 3 Чистота LPS из клеток с предварительной экстракцией этанолом и без нее
Ферментация	Номер партии	Процент от общей интенсивности в области LPS1
		без предварительной экстракции этанолом	с предварительной экстракцией этанолом
А	48020-В2698С	7	86
В	48020-С0598А	11	83
С	48020-С0598В	14	88
1 Процент от общей интенсивности в области LPS=[(интенсивность в области Rf от 0,01 до 0,20)/(интенсивность в области Rf от 0,01 до 0,90)]×100

Результаты в табл.3 показывают, что LPS, полученный после предварительной экстракции клеток S. minnesota R595 с помощью 90% этанола при 50°С, значительно более чист, чем материал, полученный из клеток без предварительной экстракции.

Все способы, раскрытые и заявленные в настоящем изобретении, могут быть осуществлены и исполнены без ненужного экспериментирования в свете настоящего описания. Хотя композиции и способы настоящего изобретения описаны в виде предпочтительных воплощений, однако для специалиста в данной области должно быть ясно, что можно вносить изменения в стадии или в последовательность стадий описанных в нем способов, не отходя от концепции, духа и рамок изобретения. В частности, должно быть ясно, что описанные в нем средства можно заменять определенными средствами, родственными в химическом и физиологическом отношении, получая те же или близкие результаты. Предполагается, что все такие замены и модификации, ясные специалисту в данной области, соответствуют духу, рамкам и концепции изобретения, как оно определяется в прилагаемой формуле изобретения.