способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии

Формула изобретения

Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии путем введения препарата, отличающийся тем, что энцефалопатию моделируют гипоксией или внутрибрюшинным введением раствора солянокислого фенилгидразина, а для коррекции нарушений эритропоэза в качестве препарата используют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, который вводят подкожно после моделирования энцефалопатии в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день в течение 1-5 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается способа коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии.

Известны способы коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при моделировании гипоксии, сопровождающейся развитием энцефалопатии, с помощью оксибутирата натрия, вводимого сразу после воздействия в наркотической дозе 750 мг/кг [1] и с помощью неселективного бета-адреноблокатора - пропранолола [2].

Недостатком способа коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при моделировании гипоксической энцефалопатии, с помощью оксибутирата натрия является его низкая эффективность в случае отсроченного применения данного препарата, когда развитие гипоксической энцефалопатии (а нарушения в системе крови связаны именно с энцефалопатией [1]) предотвратить уже невозможно, а в клинической практике далеко не всегда является возможным проведение лечебных мероприятий сразу после гипоксической травмы [3].

Недостатком способа коррекции нарушений эритропоэза, сопровождающих энцефалопатию, с помощью пропранолола является факт отсутствия значимого влияния данного препарата на непосредственную причину развития нарушений в системе крови - поражение структур ЦНС. В связи с чем способ эффективен только при постоянном приеме препарата.

Данный способ (с помощью пропранолола) является наиболее близким к заявляемому по достигаемому результату и выбран в качестве способа прототипа.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности предлагаемого способа.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой коррекцию нарушений эритропоэза, заключающимся в подкожном введении лабораторным животным (мыши) после моделирования энцефалопатии препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день, в течение 1-5 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, вводимого в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день, в течение 1-5 дней.

Повреждение головного мозга при воздействии различных болезнетворных факторов зачастую сопровождается расстройствами функционирования органов и систем, подчиненных регуляторному влиянию тех структур центральной нервной системы, которые ответственны за их деятельность и которые существенно "пострадали" в результате воздействия. Таким образом, поражение структур ЦНС, ответственных за управление деятельностью внутренних органов и систем, способно приводить к развитию дизрегуляторной патологии висцеральных органов после воздействия [4].

Система крови играет одну из ключевых ролей в поддержании гомеостаза и формировании адекватных компенсаторно-приспособительных реакций организма при воздействии болезнетворных факторов. В то же время известно, что развитие энцефалопатии при гипоксических воздействиях вызывает дизадаптацию гемопоэтической ткани, проявляющуюся в повреждении кроветворных прекурсоров, снижении уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и продукции патологических форм эритроцитов, что существенно ухудшает окислительное обеспечение тканей организма, перенесшего терминальное состояние [1, 5].

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) является линейно рестриктивным гемопоэтическим фактором с его основным специфическим гранулоцитопоэз-стимулирующим действием [6]. При этом сведений о существенном стимулирующем влиянии данного цитокина на эритропоэз нет. В то же время известно, что Г-КСФ обладает выраженным нейропротективным действием и способен положительно влиять на психоневрологический статус при энцефалопатии различного генеза [7]. Однако факт применения препарата Г-КСФ с целью коррекции нарушений эритропоэза для специалиста не является очевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты. При этом в предварительных экспериментах было выявлено, что доза 125 мкг/кг гранулоцитарного колониестимулирующего фактора является оптимальной и эффективна даже при однократном введении препарата. В то же время увеличение кратности введения Г-КСФ до 5 раз (1 раз в день, 5 дней) повышает эффективность способа максимально.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют эффективно коррегировать нарушения эритропоэза при энцефалопатии, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: "Новизна", "Изобретательский уровень", "Промышленная применимость".

Способ осуществляют следующим образом.

Лабораторному животному (мыши) после моделирования энцефалопатии 1 раз в день подкожно вводили по 125 мкг/кг в течение 1-5 дней препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рч Г-КСФ).

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 278 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

На 3, 5, 7, 10-е сут определяли показатели периферической крови с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS (Diatron, Австрия) в ветеринарном режиме, костномозгового кроветворения стандартными гематологическими методами, содержание эритроидных клеток-предшественников (КОЕ-Э) в костном мозге, их пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки [8]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

Гипоксическая энцефалопатия моделировалась с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания) [5]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа однократно подкожно на 2-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneimittelwerk", Германия) в дозе 5 мг/кг. Опытным животным на 2-е сут после моделирования гипоксии подкожно однократно вводили 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffinan-la Roche", Швейцария) - в эквивалентном объеме растворителя (0,2 мл).

В ходе эксперимента введение пропранолола на 2-е сут после воздействия приводило к увеличению в периферической крови числа эритроцитов (7-е сут), содержания гемоглобина (5-е сут) и отмене развития гипохромной анемии. Указанные изменения со стороны периферической крови явились закономерным отражением динамики костномозгового эритропоэза. Отмечалось увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5-е сут опыта, связанное с повышением содержания эритроидных прекурсоров (5-е сут) в гемопоэтической ткани, и ускорение темпа их деления на 3-е сут исследования.

Назначение рчГ-КСФ в те же сроки после воздействия сопровождалось значительно более существенным и продолжительным увеличением количества эритроцитов (7, 10-е сут), содержания гемоглобина (5, 7, 10-е сут) в периферической крови, числа эритроидных ядросодержащих клеток (5, 10-е сут) и КОЕ-Э в костном мозге (5, 7, 10-е сут) на фоне ускорения деления прекурсоров эритропоэза на 3, 5, 7-е сут опыта (табл.1).

Пример 2.

Энцефалопатия моделировалась на мышах линии CBA/CaLac, массой 18-20 г путем однократного внутрибрюшинного введения раствора соляно-кислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг [9]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа подкожно на 1-3-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneimittelwerk", Германия) в дозе 5 мг/кг. Опытным животным в те же сроки подкожно вводили в дозе 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffman-la Roche", Швейцария).

Проведенные исследования показали, что введение пропранолола приводило к достоверным, но незначительным изменениям со стороны системы эритрона. Отмечалось повышение количества эритроцитов и гематокрита на 7, 10-е сут наблюдения. Со стороны костномозгового кроветворения имело место повышение уровня гиперплазии эритроидного ростка на 5-е сут опыта в результате повышения содержания колониеобразующих единиц эритропоэза (3-е сут) в костном мозге.

При введении препарата рчГ-КСФ увеличение количества эритроцитов и гематокрита также регистрировалось на 7, 10-е сут, а числа эритрокариоцитов в костном мозге на 5, 7, 10-е сут. При этом имело место возрастание содержания КОЕ-Э в гемопоэтической ткани на 5, 7, 10-е сут эксперимента, связанное с повышением их пролиферативной активности (табл.2).

Пример 3.

Энцефалопатию моделировали у мышей линии CBA/CaLac, массой 18-20 г, путем пункции ретроорбитального синуса и выпускания через промытую раствором гепарина пастеровскую пипетку в течение 3-х часов дробно, за 3 раза, 70% объема циркулирующей крови. Расчет необходимого для забора количества крови производят из предположения, что у грызунов объем циркулирующей крови составляет 1/13 часть от массы тела животного [10]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа подкожно с 1 по 5-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneunittelwerk", Германия) по 5 мг/кг. Опытным животным в те же сроки подкожно вводили в дозе 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffinan-la Roche", Швейцария).

Введение пропранолола повышало количество эритроцитов на 5, 7, 10-е сут и гематокрит на 5-е сут наблюдения. При этом в костном мозге имело место увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5, 7-е сут опыта по сравнению с животными, которым активность адренергических механизмов не коррегировалась. Культуральные методы исследования механизмов развития описанных феноменов выявили возрастание числа КОЕ-Э в костном мозге на 3, 7-е сут наблюдения.

Курсовое введение рчГ-КСФ увеличивало количество эритроцитов и гематокрит на 5, 7, 10-е сут после воздействия. Повышение количества эритрокариоцитов в костном мозге регистрировалось на 5, 7, 10-е сут опыта, причем изменения данного параметра значительно превосходили аналогичные значения в группе животных, леченных по способу-прототипу. Описанные изменения явились следствием возрастания пролиферативной активности КОЕ-Э и увеличения их содержания в костномозговой ткани практически во все сроки наблюдения (табл.3).

Таким образом, введение препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при моделировании энцефалопатии приводило к повышению содержания прекурсоров эритропоэза в гемопоэтической ткани, возрастанию уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и увеличению количества эритроцитов в периферической крови. По всем показателям "положительный" эффект рчГ-КСФ превосходил эффект коррекции нарушений эритропоэза по способу-прототипу. При этом механизмом действия препарата, очевидно, являлось его нейропротективное действие [7] и предотвращение повреждения коммитированных клеток-предшественников эритропоэза в результате отмены дизрегуляции системы крови.

Предлагаемый способ позволяет эффективно проводить коррекцию нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии различного генеза.

Цитируемая литература

1. Зюзьков Г.Н. Механизмы регуляции гемопоэза в постгипоксическом периоде: Дисс... канд. мед. наук. - Томск, 2003. - 158 с.

2. Зюзьков Г.Н., Абрамова Е.В., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д. Роль адренергических механизмов регуляции эритропоэза при гипоксии высокой степени тяжести // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - №7. - С.18-23.

3. Алексеева Г.В., Гурвич А.М., Семченко В.В. Постреанимационная энцефалопатия (патогенез, клиника, профилактика и лечение). - Омск; Омская областная типография, 2003.-152 с.

4. Дизрегуляционная патология. / Под ред. Г.Н.Крыжановского. - М.: Медицина, 2002. - 652 с.

5. Патент РФ на изобретение №2240604 "Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови".

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск, 1999. - 114 с.

7. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Суслов Н.И., Ставрова Л.А., Сотникова Н.В. Психофармакологические эффекты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и их механизмы при гипоксии высокой степени тяжести // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - №4. - С.367-370.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 264 с.

9. Патент РФ на изобретение №2253152 "Способ моделирования гипоксической энцефалопатии".

10. Патент РФ на изобретение №2257620 "Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии".

Таблица 1
Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBACaLac при постгипоксической энцефалопатии (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) после гипоксического воздействия, (Х±m)
Сроки исследования, сутки		Эритроциты, Т/л	Гемоглобин, г/л	Эритрокариоциты, × 10 6/бедро	КОЕ-Э, на 10 5/нуклеаров	КОЕ-Э в S-фазе, %	Интенсивность диф-ки, в усл.ед.
интакт		11,42±0,14	147,72±5,48	1,31±0,06	4,5±0,56	23,19±8,42	13,51±0,49
3-е	1	11,78±10,32	151,12±10,2	6,22±0,59	7,67±0,49	17,84±6,34	24,65±1,75
				*	*		*
	2	11,41±0,12	148,78±6,91	5,87±0,43	7,5±0,98	71,09±3,42	10,98±0,57
				*	*	*#
	3	11,5±0,45	156,7±7,1	5,7±1,2	6,89±0,93	80,1±7,4	20,1±2,3
						*#	*
	1	11,45±0,26	143,3±4,2	3,19±0,31	8,14±0,74	29,81±8,47	22,25±1,87
5-е				*	*		*
		12,26±0,06	162,25±4,94	4,12±0,2	11,53±0,31	39,22±1,58	24,69±2,97
	2	*	*#	*#	*#	*	*
		11,97±0,22	164,7±5,3	4,56±0,47	10,3±0,26	74,5±5,6	27,4±3,6
	3		*#	*#	*#	*#	*
	1	10,6±0,24	121,4±6,74	3,9±0,61	5,5±0,50	21,73±4,75	29,12±3,34
7-е		*	*	*			*
	2	11,98±0,06	149,94±12,35	4,3±0,68	5,8±0,43	28,6±3,78	20,98±0,57
		*#		*	*		*
	3	11,73±0,04	153,48±6,1	4,51±1,01	8,4±6,1	62,9±7,1	27,89±2,9
		*#	#	*	*#	*#	*
10-е	1	11,0±0,21	151,4±3,95	3,35±0,27	7,16±0,60	55,77±3,74	24,14±3,29
				*	*	*	*
	2	11,51±0,2	149,17±7,26	4,1±0,78	7,43±0,49	43,36±3,54	23,7±1,34
				*	*	*	*
		12,01±0,27	167,32±4,5	4,78±0,32	10,2±0,49	61,2±11,7	19,4±2,3
	3	*#	*#	*#	*#	*	*
* - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05

Таблица 2
Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBACaLac после моделирования энцефалопатии, введением 150 мг/кг солянокислого фенилгидразина (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) после воздействия, (Х±m)
Сроки исследования, сутки		Эритроциты, Т/л	Гематокрит, %	Эритрокариоциты, × 106/бедро	КОЕ-Э, на 105/нуклеаров	КОЕ-Э в S-фазе, %	Интенсивность диф-ки, в усл.ед.
интакт		11,22±0,16	45,88±0,76	3,02±0,25	3,83±0,48	37,33±6,17	15,56±2,89
3-е	1	5,57±0,17	20,47±0,82	3,39±0,17	5,67±0,49	53,79±3,62	34,79±1,77
		*	*		*		*
	2	6,07±0,14	27,15±4,28	3,2±0,58	7,83±0,73	53,28±5,05	41,04±4,38
		*	*				*
	3	6,07±0,14	27,15±4,28	3,2±0,58	7,4±0,8	83,28±4,05	39,5±3,74
		*	*			*#	*
5-е	1	5,59±0,65	21,9±2,36	5,01±0,31	4,33±0,61	70,0±3,35	37,99±2,79
		*	*	*	*	*	*
	2	6,2±0,1	29,32±4,53	6,2±0,29	7,0±0,58	62,93±6,2	39,49±6,45
		*	*	*#	*#		*
	3	6,2±0,1	29,32±4,53	6,7±0,34	7,3±0,44	60,4±3,9	42,3±5,97
		*	*	*#	*#	*	*
7-е	1	4,4±0,55	18,5±2,84	4,91±0,27	5,17±0,4	56,0±2,0	19,95±0,77
		*	*	*	*	*
	2	5,63±0,19	24,2±3,38	5,82±0,21	5,4±0,43	61,67±9,12	23,53±2,87
		*#	*#	*	*		*
	3	5,9±0,34	28,3±2,09	6,07±0,35	6,9±0,16	88,6±6,9	33,53±4,2
		*#	*#	*#	*#	*#	*
10-е	1	3,94±0,57	21,32±3,11	5,34±0,46	8,67±0,88	57,55±3,51	25,96±1,65
		*	*	*	*	*	*
	2	5,1±0,11	30,48±1,91	5,5±0,26	7,03±1,1	42,47±6,75	26,24±5,82
		*#	*#	*	*
		6,0±0,18	34,7±2,2	6,5±0,17	12,03±1,07	47,31±12,1	16,24±8,2
	3	*#	*#	*#	*#
* - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05

Таблица 3
Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBACaLac после моделирования энцефалопатии, вызванной потерей 70% объема циркулирующей крови (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) в постгеморрагическом периоде, (Х±m)
Сроки исследования, сутки		Эритроциты, Т/л	Гематокрит, %	Эритрокариоциты, × 106/бедро	КОЕ-Э, на 105/ нуклеаров	КОЕ-Э в S-фазе, %	Интенсивность диф-ки, в усл.ед.
интакт		11,42±0,28	48,45±1,05	2,44±0,3	7,67±1,12	19,95±5,43	6,64±0,56
3-е	1	6,22±0,09	27,98±0,31	5,45±0,64	9,33±1,91	57,02±6,9	18,08±1,6
		*	*	*	*	*	*
	2	6,33±0,07	29,91±0,54	5,7±0,41	14,5±0,43	41,09±6,62	17,29±1,16
		*	*	*	*#	*	*
	3	6,41±0,14	27,1±0,61	5,7±0,41	13,7±0,24	75,4±7,11	16,9±2,3
		*	*	*	*#	*#	*
5-е	1	6,49±0,12	29,73±0,53	4,88±0,23	10,5±0,72	46,79±4,44	16,26±0,4
		*	*	*	*	*	*
	2	7,85±0,41	36,34±0,89	6,74±0,31	11,8±0,86	38,79±3,41	16,22±1,53
		*#	*#	*#	*	*	*
	3	8,15±0,48	37,4±0,87	7,0±0,62	13,8±0,91	81,6±10,02	19,4±2,6
		*#	*#	*#	*#	*#	*
7-е	1	6,59±0,14	30,08±0,71	6,33±0,68	10,5±1,1	44,67±2,96	12,0±1,59
		*	*	*	*	*	*
	2	7,27±0,27	33,78±2,7	7,1±0,95	15,67±0,9	44,38±4,18	15,68±1,38
		*#	*	*	*#	*	*
	3	7,8±0,21	35,0±1,1	7,33±0,11	11,67±1,09	79,3±7,62	14,8±0,97
		*#	*#	*#		*#	*
10-е	1	9,08±0,39	39,5±1,18	6,01±0,24	12,33±0,8	29,17±3,11	7,16±0,65
		*	*	*	*
	2	8,87±0,21	40,45±1,27	7,2±0,21	15,33±1,84	37,06±2,9	7,66±0,74
		*#	*	*#	*	*
	3	9,68±0,21	42,6±0,97	7,06±0,18	18,7±1,4	33,2±4,1	6,39±1,3
		*#	*#	*#	*#	*
* - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05