новый специфический механизм ингибирования адгезии тромбоцитов к коллагену

Формула изобретения

1. Применение рекомбинантного протеина 12 кДа пиявки Hirudo medicinalis, ингибирующего зависящее от vWF образование связей тромбоцитов с коллагенами стенки артерии при условиях повышенного сдвига (Саратина), в качестве средства для ингибирования аккумулирования тромбоцитов после повреждения сосуда или эндартеректомии, для предтвращения адгезии тромбоцитов, тромбоза и рестеноза.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что повреждение сосуда связано с атеро-склерозом, васкулопатией сердечного трансплантата, коронарным рестенозом после коронарного вмешательства, баллонной ангиопластикой, введением стента, эндартеректомией, включая эндартеректомию сонной артерии, шунтированием при помощи диализного трансплантата и других трансплантированных анастомозов, нестабильной стенокардией, острым инфарктом миокарда, инсультом, легкой формой гипертрофии, или легкой формой простатической гипертрофии.

3. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство предназначено для введения через катетер.

4. Покрытие для обеспечения антитромботической поверхности хирургического устройства или хирургического инструмента, отличающееся тем, что представляет собой гидрогель из биосовместимой полимерной матрицы, включающей рекомбинантный протеин 12 кДа пиявки Hirudo medicinalis, ингибирующий зависящее от vWF образование связей тромбоцитов с коллагенами стенки артерии при условиях повышенного сдвига (Саратин).

5. Покрытие по п.4, содержащее Саратин, отличающееся тем, что представляет собой полимер, который обеспечивает продолжительный местный выход Саратина, и полимер выбирают из группы, включающей оксид полиэтилена, альбумин, гидрофильные метакрилаты и гидрофильные полиуретаны, поли(лактиды), полигликолиды, полиангидриды, сложные поли-орто-эфиры, полиацетали, полигидропираны, полицианоакрилаты и их сополимеры и полиэтиленгликоль.

6. Покрытие по п.4, содержащее Саратин, отличающееся тем, что нанесено на стент, или на катетер, или на внутрисосудистый трансплантат.

7. Покрытие по п.4, содержащее Саратин, отличающееся тем, что указанные стент, катетер, или внутрисосудистый трансплантат помещают внутрь ткани или внутрь сосуда.

8. Гидрогелевое покрытие катетера для введения и локальной доставки рекомбинантного протеина 12 кДа пиявки Hirudo medicinalis, ингибирующего зависящее от vWF образование связей тромбоцитов с коллагенами стенки артерии при условиях повышенного сдвига (Саратина) в поврежденную ткань или в сосуд, причем саратин нанесен на покрытие катетера распылением или альтернативно включен в покрытие посредством набухания сухого гидрогеля в концентрированном растворе саратина.

9. Покрытие по п.8, отличающееся тем, что нанесено на эндолюминальную оболочку катетер, обращенную местно к ткани, и содержит Саратин.

10. Применение рекомбинантного протеина 12 кДа пиявки Hirudo medicinalis, ингибирующего зависящее от vWF образование связей тромбоцитов с коллагенами стенки артерии при условиях повышенного сдвига (Саратина), в качестве средства для покрытия хирургического устройства или хирургического инструмента, представляющего собой катетер, стент или внутрисосудистый трансплантат, предназначенный для ингибирования аккумулирования тромбоцитов после повреждения сосуда или эндартеректомии, для предотвращения адгезии тромбоцитов, тромбоза и рестеноза.

Описание изобретения к патенту

Резюме изобретения

Изобретение относится к действию полипептида Саратина, который значительно уменьшает адгезию и аккумулирование тромбоцитов после повреждений сосудов, таких как эндартеректомия. Кроме того, изобретение относится к ингибированию зависящего от vWF связывания тромбоцитов с коллагенами стенки сосуда в условиях повышенного сдвига и конкретнее к новому применению Саратина в медицине в качестве ингибитора тромбоза, при котором упомянутый полипептид можно применять местно, в виде топического вещества или в виде покрытия на медицинских устройствах.

Отрасль изобретения

Адгезия клеток крови, особенно тромбоцитов, к стенкам поврежденных сосудов - явление, широко известное в ангиопластике и хирургии. Такие повреждения могут возникать в ходе различных вариантов хирургического открытия блокированных каналов, протоков и других полостей, чтобы удалить больные ткани и имплантировать замещающие ткани или их компоненты.

Были разработаны различные типы методик вмешательства, которые усиливают или ослабляют, либо устраняют блокирование кровеносных сосудов, обеспечивая кровоток через сосуд. Один из методов лечения стеноза или закупорки кровеносных сосудов состоит в ангиопластике путем подкожного надувания. Баллонный катетер проводят через артериальную систему пациента и вставляют в зауженную или блокированную зону, затем в него накачивают воздух, чтобы расширить зауженную зону. Подкожная транслюминальная ангиопластика (РТСА) представляет собой методику ангиопластики, которая наиболее широко используется для раскрытия закупоренных атеросклеротических артерий.

В общем случае ангиопластические методы позволяют получать прекрасные результаты, поскольку позволяют обходиться без шунтирующей хирургии, но примерно у 30-40% пациентов, у которых наблюдались явные улучшения при первичном расширении артерии, впоследствии, через 3-9 месяцев возникает повторное сужение сосуда (рестеноз). Если рестеноз проявляется в тяжелой форме, пациенту может потребоваться повторная ангиопластика, часто с имплантацией стента, который в сосуде выполняет функцию распорки.

В других случаях может потребоваться реконструкция артерии при помощи шунтирующей хирургии, которая сопряжена с более высоким риском. Притом, что в мире ежегодно проводится более 800000 операций РТСА, социально-экономические последствия этих 30-40% случаев рестеноза стали объектом серьезного беспокойства хирургов-кардиологов.

Рестеноз часто является результатом растяжения и сминания баллоном стенки артерии и существует возможность, что направляющий провод катетеров, используемых в таких процедурах, в процессе разворачивания причинит повреждения и может привести к пролиферации клеток гладкой мускулатуры артерии, что обуславливает повторное закрытие артерии («рестеноз») через несколько месяцев.

Из-за возможных осложнений, связанных с рестенозом и угрозой перемещения эмбола от язвенного атеросклеротического повреждения ткани, что сопряжено с тяжелыми последствиями, применение повторной ангиопластики в сонной артерии строго ограничено вариантами минимального инвазионного вмешательства.

Раньше пытались лечить закупорку сонных артерий, ведущих к мозгу, путем вмешательств другого типа.

Эндартеректомия сонной артерии - хирургический метод устранения закупорки сонных артерий и в сосудистой хирургии США он используется чаще всего. Результаты испытаний, проведенных во многих центрах, продемонстрировали эффективность этой методики при лечении внечерепной сонной болезни как у симптоматических пациентов, так и пациентов, не обнаруживающих симптомов заболевания (JAMA 1995; 273: 1421-28; N Engl. J. Med. 1991; 325: 445-53), кроме того, методы эндартеректомии используются для лечения заболеваний закупорки сосудов, расположенных в других местах (Vasc. Surg. 1999; 33: 461-70).

При эндартеректомии сонную артерию разрезают и атеро склеротическое повреждение ткани удаляют из сосуда через разрез. В хирургии осуществляют раздвоение сонной артерии через разрез в шее пациента и помещают зажимы с обеих сторон места закупорки, чтобы изолировать его, затем делают разрез, чтобы раскрыть артерию. Удаляют закупорку, изолированную область промывают и удаляют из полости жидкость, затем артерию закрывают при помощи наложения шва. Зажимы удаляют, чтобы восстановить кровоток через артерию. Инвагинация и возможные загрязнения зажимов могут послужить причиной серьезных проблем, возникающих после открытия сонной артерии и возобновления кровотока в изолированной ранее области.

Хотя эндартеректомия является эффективным методом терапии, после нее часто остается адвентиция, и значительные области незащищенного тромбогенного субэндотелия. Несмотря на эффективность эндартеректомии сонной артерии, эта операция может приводить к осложнениям, включая тромбоз и развитие гиперплазии интимы, которые обуславливают осложнения, сводящие на нет эффект от вмешательства, или создают новые проблемы.

Клинические исследования свидетельствуют, что после эндартеректомии сонной артерии, непосредственно в послеоперационный период у 1-10% пациентов возникают инсульты, обусловленные, главным образом, образованием тромбов в зоне эндартеректомии с последующей церебральной эмболизацией (Stroke 1984; 15; 950-55). Аккумулирование тромбоцитов может также приводить к рестенозу, связанному с развитием гиперплазии интимы, который может возникать в течение двух лет после операции. Были сообщения, что через 2-5 лет после эндартеректомии у 10-20% пациентов возникает рестеноз, обусловленный гиперплазией интимы, утолщением интимы и уменьшением диаметра сосудов: об этом свидетельствует дуплексное ультразвуковое сканирование сонной артерии (J. Vasc. Surg. 1986; 3; 10-23).

На клеточном и молекулярном уровне реакцией стенки сосуда на механические травмы, хирургическое вмешательство, введение стента, введение трансплантированного сосуда (артериального или артериально венозного трансплантата, т.е. диализного трансплантата) является сложная комбинация воспаления, миграции клеток гладкой мускулатуры, пролиферации и трансформации миофибробластов; эти явления возникают непосредственно после травмы (Futura; 1997. p.289-317). Если в результате заболевания артерия сильно повреждена, что может усугубляться отложением кальция, вмешательство может также в некоторой мере обуславливать дополнительное повреждение с очаговой эндотелиализацией и уязвимость основных компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген и эластин. У некоторых пациентов появление избытка тромбоцитов и фибриногена может приводить к острой тромботической закупорке.

Исследования, проведенные на моделях крыс после эндартеректомии сонной артерии (Neurosurg 1985; 16: 773-79), а также на моделях эмболектомии баллонных повреждений (Lab. Invest 1983; 49: 327-33), показали, что при повреждении сосуда обдираются клетки эндотелия и начинается адгезия тромбоцитов к незащищенному субэндотелию. Методом сканирующей электронной микроскопии Spallone и др. (Neurosurg, 1985; 16: 773-79) установили, что через пять минут после эндартеректомии сонной артерии у крысы в поврежденной зоне формируется монослой тромбоцитов. Через пятнадцать минут после травмы наблюдается агрегация тромбоцитов и формирование тромбов. Через тридцать минут после эндартеректомии эта область оказывается покрытой активированными тромбоцитами, фибрином и красными кровяными клетками. Образование тромбов достигает пика через три часа после травмы и наблюдается толстый фибрино-тромбоцитный слой. Тромбоциты являются важнейшими участниками этого процесса образования тромбов, а следовательно, неотъемлемыми компонентами тромбоза, но, кроме того, они также играют важную роль в развитии гиперплазии интимы.

Исследования с использованием тромбопенических крыс свидетельствуют, кроме того, что у них наблюдается значительно меньшая толщина интимы после повреждения сонной артерии по сравнению с контрольными крысами (Proc. Natl Acad. SCI, USA 1989; 86: 8412-16). Когда тромбоциты прилипают к незащищенному субэндотелию поврежденного сосуда, они активируются и высвобождают свои гранулы. Эти гранулы содержат вазоактивные и тромботические факторы (серотонин, ADP, фибриноген, фактор Von Willebrands, тромбоксан А2), а также факторы роста (порожденный тромбоцитом фактор роста, трансформирующий рост фактор-бета и фактор эпидермального роста) (Circulation 1985; 72: 735-40). Точные механизмы, по которым тромбоциты ускоряют развитие гиперплазии интимы, полностью пока неясны. Результаты исследований позволяют предположить, что тромбоциты, в первую очередь, поставляют фактор, вызывающий хемотаксис для миграции срединных клеток гладкой мускулатуры по направлению к интиме во второй фазе развития гиперплазии интимы (Vasc. Surg, 1991; 13: 885-91). Другие исследования с использованием антител анти-PDGF продемонстрировали важнейшую роль, которую PDGF играют в аккумулировании неоинтимальных клеток гладкой мускулатуры после повреждения сосуда (Science 1991; 253: 1129-32). Другой механизм, по которому тромбоциты могут усиливать развитие гиперплазии интимы, заключается в активации каскада коагуляции и последующего аккумулирования тромбина в зоне повреждения. Результаты некоторых исследований свидетельствуют о митогеническом воздействии тромбина на клетки гладкой мускулатуры (J. Clin. Invest. 1993; 91: 94-98, J. Vasc. Surg. 1990; 11: 307-13). Кроме того, установлено, что тромбин является фактором, стимулирующим активацию тромбоцитов. Безотносительно к точному механизму адгезия и активация тромбоцитов в зоне повреждения сосуда играют важную роль в развитии тромбоза и гиперплазии интимы, а следовательно, ингибирование адгезии и активации тромбоцитов может способствовать предотвращению или уменьшению скорости развития тромбоза и гиперплазии интимы.

Медиатором прилипания тромбоцитов к поврежденной стенке артерии является, в первую очередь, фактор von Willebrand (vWF), мультимерный гликопротеин, который высвобождается из клеток эндотелия и циркулирует в плазме, где функционирует в качестве переносчика протеина для фактора VIII (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67: 395-424). Высокомультимеризованный vWF тоже циркулирует, заключенный внутри альфа-гранул тромбоцитов, из которых он высвобождается после активации тромбоцита (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67: 395-424). В условиях повышенного сдвига, которые встречаются в зоне атероматического очага или механического повреждения, vWF может через свой домен A3 образовывать связи с выходящими на поверхность волокнами коллагена (Biochemistry 1986; 25(26): 8357-8361, Blood 1987; 70(5); 1577-1583, J.Biol. Chem. 1987; 262(28); 13835-13841). Затем связанный с коллагеном vWF, в свою очередь, связывает тромбоциты через антигенную детерминанту, появляющуюся в зависимости от сдвига в домене А1 vWF, которая взаимодействует с тромбоцитом GPIb/IX/V (Blood 1985; 65(1): 85-90. Blood 1985; 65(4): 823-831, Br.J.Haematol 1986; 63(4): 681-691). Таким образом, vWF играет роль мостика между коллагеном и тромбоцитами и это является необходимым условием для осуществления адгезии тромбоцитов к коллагену в потоке (J.Lab. Clin. Med, 1974; 83(2): 296-300). Тем не менее, прокатывание тромбоцита по vWF приводит к слабой адгезии, и для осуществления прочной адгезии, активации и агрегации тромбоцитов требуются, кроме того, прямые взаимодействия между коллагеном и другими рецепторами на поверхности тромбоцита (Thromb. Haemost 1997; 78(1): 434-438, Thromb. Haemost 1997; 78(1): 439-444). В число прямых рецепторов коллагена на тромбоцитах входят GP VI (Blood 1987; 69(6): 1712-1720. Thromb. Haemost 1999; 81(5): 782-792, J Clin. Invest 1989; 84(5): 1440-1445), GP Ia/IIa ( ₂/ ₁) (J. Clin. Invest. 1989; 84(5): 1440-1445, Nature 1985; 318(6045): 470-472) и в меньшей степени GP IV (CD36) (J. Biol. Chem. 1989; 264(13): 7576-7583) и, возможно, даже р65 (J. Clin. Invest. 1997; 100(3): 514-521). Установлено, что в отсутствие связывания тромбоцитов при участии vWF эти рецепторы являются слишком слабыми медиаторами, чтобы осаждать тромбоциты на коллагене из потока (Br.J.Haematol 1986; 63(4): 681-691). Наконец, vVW в комбинации с фибриногеном способствует структурированию и дальнейшей активации тромбоцитов через связывание с GP IIb/IIIa тромбоцита (J. Clin. Invest. 2000; 105(6): 783-791), что обеспечивает стабильность и прочность, необходимые для развития тромба.

В последние годы, после открытия GP IIb/IIIa тромбоцита и антагонистов рецептора ADP, в противоагрегационной терапии появился большой прогресс (Coronary Art Dis 1999; 10(8): 553-560, J.Am, Coil. Surg. 2000; 191((1): 76-92). Тем не менее, разработанные методы не предназначены для ингибирования начальной адгезии тромбоцитов к подверженным этому волокнам коллагена, и, несмотря на эффективность антагонистов GP IIb/IIIa в ослаблении взаимодействий тромбоцит-тромбоцит, тромбоциты по-прежнему налипают на поврежденные участки стенки сосуда (Blood 1993; 81(5): 1263-1276, Circulation 1995; 91(5): 1354-1362). Далее активация тромбоцитов почти всегда влечет за собой более широкие последствия, чем агрегация и острый тромбоз, прогрессирование подострой и хронической гиперплазии интимы должно быть, по крайней мере, частично, подвержено воздействию митогенических медиаторов, таких как произведенный тромбоцитом фактор роста (PDGF), высвобождаемый активацией тромбоцитов. В самом деле, было установлено, что ингибирование PDGF уменьшает гиперплазию интимы у различных видов животных (Science 1991; 253(5024): 1129-11f32, Circulation 1999; 99(25): 3292-3299).

Предположить, что vWF имеет большое патофизиологическое значение, можно исходя из факта повышения количества циркулирующих vWF у пациентов с острым инфарктом миокарда (Thromb Haemost 2000; 84: 204-209, Circulation 1998; 98(4): 294-299), причем уровни vWF положительно коррелируют с плохим прогнозом (Circulation 1998; 98(4): 294-299). Кроме того, исследования in vivo свидетельствуют, что нейтрализация антител анти-vWF приводит к ингибированию экспериментального тромбоза, что подтверждает важную роль vWF в формировании тромбов (Thromb. Haemost 1998; 79(1): 202-210). Далее, по мере еще большего распространения в лечении острых коронарных синдромов методов ангиопластики, которые неизбежно приводят к повреждению стенки сосуда и уязвимости коллагена, становится еще более актуальной разработка способов как можно более раннего фармакологического вмешательства в каскад адгезия-активация агрегация тромбоцитов.

Два основных направления в современной терапии, имеющей целью ограничение адгезии и активации тромбоцитов, а также последующего тромбоза и гиперплазии интимы, состоят в использовании антитромбоцитных агентов и антитромботических назначений. Хотя такие лекарственные препараты, как аспирин, эффективно блокируют синтез Тромбоксана А2 за счет ингибирования мостиков циклооксигеназы, они не предотвращают индуцированную коллагеном адгезию и активацию тромбоцитов, которые стимулируют развитие гиперплазии интимы. Применение гепарина в качестве антитромботического агента сопряжено с осложнениями и ограничениями, включая непредсказуемую реакцию на дозу, необходимую для надежного лабораторного мониторинга, ограниченную активность против связанного с тромбом тромбина, множественные зоны ингибирования, зависимость от антитромбина III, риск сильного кровотечения, так же, как и необходимость в непрерывном вливании. Очевидно, что идеальный терапевтический агент должен оказывать специфическое к зоне и локализованное действие, без системного распределения или общей коагулопатии.

Обнаружилось, что важнейшие эффекты, которые инициируют каскад событий, приводящих к тромбозу и последующей гиперплазии интимы, возникают в результате взаимодействий между незащищенным коллагеном субэндотелия в зоне повреждения сосуда и монослоем тромбоцитов, которые налипли на незащищенный коллаген. Следовательно, специфический ингибитор адгезии тромбоцита к коллагену субэндотелия может предотвращать или, по крайней мере, тормозить развитие тромбоза и гиперплазии интимы.

В литературе описано, что некоторые извлеченные из пиявки вещества способны ингибировать взаимодействия коллаген-тромбоцит (Blood 1995; 85(3): 705-711, Platelets 2000; 11(2): 83-86, J. Biol. Chem, 1992; 267(10): 6893-6898, J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6899-6904, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1): 179-184). Известно, что дестабилаза, изопептидаза, проявляющая активность в плане деполимеризации фибрина, выделенная из Hirudo medicinalis, ингибирует агрегацию тромбоцитов, вызываемую различными агонистами, включая коллаген, но считается, что она образовывает связи непосредственно с мембраной тромбоцита (Platelets 2000; 11(2): 83-86). Антитромбоцитный протеин пиявки (LAPP), протеин с массой 13 кДа из слюны Haementeria officinalis, ингибирует адгезию тромбоцитов к коллагену при статических условиях (J. Biol. Chem. 1992; 267{10): 6899-6904, Thromb. Haemost 1999, 82(3):1160-11б3) и при ускоренном протоке (Arterioscler Thromb. Vasc. Biol 1995, 15(9): 1424-1431) и оказывает воздействие как на vWF, так и на связывание тромбоцита с коллагеном, медиатором которого является GP Ia/IIa (Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160-1163). Калин представляет собой протеин 65 кДа из Hirudo medicinalis, который обладает аналогичным действием. Калин тоже ингибирует взаимодействия коллаген-тромбоцит как в статических, так и в динамических условиях (Blood 1995; 85(3): 705-711, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1): 179-184, Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160-1163). Кроме того, как LAPP, так и Калин являются потенциальными ингибиторами инициируемой коллагеном агрегации тромбоцитов, ингибирующими агрегацию при концентрациях, близких к тем, которые блокируют образование связей vWF с коллагеном (J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6893-6898, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1): 179-184, Blood 1995, 85(8):712-719).

Оценка эффективности как LAPP, так и Калина при тестировании в моделях тромбоза in vivo имела переменный успех. Обнаружено, что LAPP не может тормозить формирование тромба на покрытых коллагеном трансплантатах артериально-венозной развилки в бабуине, несмотря на применение доз, которые ингибируют инициированную коллагеном агрегацию (Arterioscler Thromb 1993, 13(11): 1593-1601), тогда как Калин оказывал зависящее от дозы ингибирующее действие на формирование тромбов в модели венозного тромбоза хомяка (Blood 1995, 85(3): 712-719).

В этой отрасли знаний известны нетромбогенные и антитромбогенные покрытия для стентов и катетеров. Нетромбогенные покрытия и продукты основаны на модифицированных и высших полимерах, примеры описаны в заявках WO 9301221 и WO 9830615.

Антитромботические и антирестенозные покрытия представляют собой в общем случае биосовместимые покрытия, которые могут также служить источниками местной поставки лекарственных препаратов. Покрытия основаны, главным образом, на гидрогелях, их примеры описаны в патентной литературе, посвященной методикам приготовления различных типов гидрогелей и покрытий для медицинских устройств, в том числе такие примеры приведены в заявках WO 9211896, WO 9811828, WO 0147572, ЕР 0887369 и WO 0139811.

Профиль выхода содержащихся в покрытии терапевтических веществ можно регулировать, например, при помощи варьирования толщины полимерных слоев или путем выбора специфических полимерных покрытий, которые обладают подобранными физико-химическими свойствами (такими как заряд, гидрофобность, гидрофильность) и/или путем приготовления покрытий в виде различных слоев. Специалистам известны критерии выбора полимера и оптимизации скорости выхода. Другие покрытия описаны в работе Fischell (Circulation, 1996, 94: 1494-95), Topol и др. (Circulation, 1998, 98: 1802-20) и McNair и др. в методике Technology, 1996, 16-22.

Применение стентов, проводов и катетеров в сердечно-сосудистой системе является общепринятой практикой, поэтому повреждение сосудов, эмболизация и последующий рестеноз являются главным объектом беспокойства кардиологов в процессе катетеризации или хирургического вмешательства, а также в послеоперационный период. Альтернативные методы, такие как эндартеректомия, сопряжены с возникновением сопоставимых проблем. Каждая процедура, связанная с манипулированием артериями, т.е. сосудистая хирургия и ангиопластика допускает развитие гиперплазии интимы. Пользу, которую могут принести способы предотвращения или торможения развития гиперплазии интимы, невозможно переоценить, а преимущества способа, позволяющего достигать этих эффектов без попутного создания системных эффектов, являются еще более очевидными.

Таким образом, очевидна необходимость разработки улучшенных фармацевтических препаратов и способов ингибирования самых ранних событий в патофизиологии (т.е. адгезии тромбоцитов) и ожидается, что достижения в этой сфере позволят значительно понизить уровни заболеваемости и смертности, сопряженных с такими процедурами как ангиопластика и хирургическое вмешательство.

Описание изобретения

В общем случае настоящее изобретение включает введение недавно описанного ингибитора адгезии тромбоцитов Саратина внутрь или на выбранную зону внутри или на полости тканей, т.е. в сосудистую систему или органы, при таких условиях, чтобы Саратин можно было применять местно, в качестве топического агента или связывающего покрытия на поверхности, для предотвращения и ингибирования нежелательной тромботической и/или рестенозной реакции на повреждение стенки сосуда, включая повреждения, обусловленные стентами, диализными трансплантатами, другими сосудистыми трансплантатами, и для лечения формирующихся при легких травмах рубцов, а также для лечения и пассивации нестабильных атеросклеротических очагов.

Белок (названный Саратином) характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ. ID. No.l) и содержит 103 аминокислотных остатка, его теоретическая относительная молекулярная масса составляет приблизительно 12068±1 кДа. Белок характеризуется уникальной первичной структурой и отсутствием значительной гомологии с ранее описанными белками. Белок характеризуется высоким содержанием аспаратиновой и глутаминовой кислот, которые вносят вклад в низкую величину изоэлектрической точки молекулы pI 3,7±0,5 по данным изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле (ИЭФ-ПААГ).

Последовательность ID.No.1

Он был недавно описан (см. WO 0056885 стр.6 строки 31-33 и стр.7 строки 1-4) рекомбинантный протеин 12 кД, исходно выделенный из пиявки. Протеин ингибирует зависящее от vWF образование связей тромбоцитов с коллагенами стенки артерии при условиях повышенного сдвига, и именно этот аспект изобретения делает Саратин пригодным для ингибирования артериального тромбоза. Другой новый аспект состоит в том, что Саратин можно применять в качестве топического агента в зоне повреждения, что приводит к торможению тромбоза и/или гиперплазии интимы без каких бы то ни было системных эффектов. Это представляет методику со специфическими эффектами, вполне подходящую для применения в равной мере как хирургами, так и радиологами.

Саратин можно комбинировать с множеством разнообразных терапевтических агентов для поставки на месте. Примерами веществ, применяемых в коронарных артериях, являются антитромботические агенты, такие как простациклин и салицилаты, тромболитические агенты, такие как стрептокиназа, урокиназа, активатор плазминогена тканей (ТРА) и анисоилированный активирующий комплекс плазминоген-стрептокиназа (APSAC), сосудорасширяющие агенты, такие как нитраты, лекарства, блокирующие кальций в каналах, антипролиферационные агенты, такие как колхицин, и алкилирующие агенты, интеркаляционные агенты, факторы модулирования роста, такие как интерлейкины, трансформирующий рост фактор-бета и аналоги выделенного из тромбоцита фактора роста, моноклонные антитела, ориентированные против факторов роста, противовоспалительные агенты как стероидные, так и нестероидные, и другие агенты, которые могут модулировать тоны сосудов, их функции, артериосклероз, и реакцию заживления повреждения сосуда или органа, возникшего в результате вмешательства. В комбинации или покрытия по данному изобретению можно также включать антибиотики. Более того, покрытие можно применять для доставки фармацевтических препаратов ориентированно, внутрь стенки сосуда. При помощи введения действующего вещества в способный разбухать полимер этот активный агент можно высвобождать при разбухании полимера. В одном из воплощений данного изобретения покрытие приготавливают из гидрогеля, такого как оксид полиэтилена, альбумин, гидрофильные полиметакрилаты и гидрофильные полиуретаны. Настоящее изобретение относится, кроме того, к применению Саратина и его производных, например, через устройства для доставки лекарства в нужное место/катетеры или через стенты и покрытия стентов, а также через сосудистые трансплантаты и покрытия трансплантатов. Изобретение относится также к способам назначения Саратина в композициях, из которых с течением времени вымывается регулируемое количество Саратина в локализованной области. В частности, одно из воплощений настоящего изобретения относится к применениям катетерных устройств для доставки Саратина к нужной зоне; при помощи катетеров Саратин можно также применять внутри тканей самостоятельно или вместе с другими терапевтическими агентами вне полимерной матрицы. Основные требования к применяемому полимерному материалу по данному способу заключаются в его биосовместимости и способности высвобождать лекарственные вещества, которую можно приспособить для специфического применения. Контролируемого местного высвобождения Саратина можно добиться путем одного только пропитывания, одного только ионтофореза и одной только электропорации, или для эффективного высвобождения и введения Саратина внутрь полости сосуда можно использовать комбинацию ионтофореза и электропорации. Предпочтительно, если катетер пригоден для выполнения процедуры, направленной на поддержание высокой концентрации лекарственного препарата в выбранной области пространства сосуда, так, что это приводит к улучшенному покрытию сосуда одним Саратином или его комбинацией с дополнительными лекарственными веществами. Данное изобретение особенно полезно для местной поставки Саратина в течение или после процедур кардиологического вмешательства, таких как ангиопластика, имплантация стента и эндартеректомия.

Подробное описание изобретения

Рекомбинантный Саратин, подходящий для применения по данному изобретению, экспрессировали и выделили из Hansenula polymorpha; было обнаружено, что он действует через блокирование образования связей vWF с коллагеном и эффективно предотвращает адгезию тромбоцитов к коллагену при повышенном сдвиге. Саратин производил зависящее от дозы ингибирование связывания очищенного человеческого vWF с человеческими коллагенами типа I и типа III (IC₅₀=0,23±0,004 и 0,81±0,04 мкг мл^-1 соответственно) и с коллагеном кожи теленка (IC₅₀=0,44±0,008 мкг мл^-1). Кроме того, Саратин проявил аналогичную ингибирующую способность против связывания с этими коллагенами vWF плазмы человека, грызунов и свиней. В проточной камере, при условиях повышенного сдвига (2700 сек^-1 ) Саратин проявлял зависящее от дозы и сильное ингибирующее действие на формирование агрегатов тромбоцитов на покрытой коллагеном поверхности (IC₅₀=0,96±0,25 мкг мл ^-1), но при пониженном сдвиге (1300 сек ^-1) на кривой зависимости от дозы наблюдался сдвиг вправо (IC₅₀=5,2±1,4 мкг мл ^-1). Резонансным анализом поверхностных плазмонов на человеческом коллагене типа III обнаружены связывающие Саратин сайты как с высоким, так и с низким сродством (К_d=5·10 ^-8М и 2·10^-6М соответственно), и хотя низкие концентрации Саратина, которые ингибировали адгезию тромбоцитов при повышенном сдвиге (т.е. насыщение связывающих сайтов с высоким сродством), не оказывала действия на зависящую от vWF агрегацию тромбоцитов, индуцированную коллагеном, было обнаружено, что высокие концентрации (т.е. насыщение связывающих сайтов с низким сродством) ингибируют агрегацию тромбоцитов. Эти данные свидетельствуют, что Саратин является сильным ингибитором зависящей от vWF адгезии тромбоцитов к коллагену, что создает основу для его терапевтического потенциала в качестве антитромботического агента. Кроме того, исследованиями установлено, что Саратин проявляет сильное и зависящее от дозы ингибирующее действие на связывание vWF не только с коллагеном кожи теленка, но и с человеческим коллагеном типов I и III, каждый из которых в изобилии присутствует в субэндотелиальных слоях стенки артерии, и, как считается, играет важную роль во взаимодействиях тромбоцитов со стенкой сосуда (Thromb Haemost 1997, 78(1): 434-438). Поскольку взаимодействия коллаген - vWF - GP Ib/IX/V происходят только при достаточно повышенном сдвиге, важным аспектом настоящего изобретения являлась демонстрация факта, что Саратин эффективен не только при статических условиях, но также и в среде, которая наиболее приближена к ситуации, встречающейся in vivo. В проточной камере, позволяющей изменять силы сдвига для моделирования такой среды, Саратин отчетливо ингибировал аккумулирование тромбоцитов к коллагену, особенно при более высоких сдвигах. Смещение вправо кривой зависимости от дозы в результате уменьшения сдвига является существенным, поскольку из этого можно сделать вывод, что эффективность Саратина in vivo может быть локализована в областях высокого сдвига, где в результате изменений обращенной к крови эндотелиальной поверхности, например, в связанных с атеросклеротическими очагами или механическим вмешательством, происходит нарушение ламинарности кровяного потока. Исследованием резонанса поверхностных плазмонов с Саратином установлено, что коллаген может захватывать Саратин двумя независимыми связывающими сайтами, один - с высоким сродством, а второй - с низким сродством. Способность Саратина ингибировать связывание vWF с коллагеном объясняется насыщением связывающего сайта с высоким сродством, у которого значения IC₅₀ составляют около 5·10^-8М, т.е. равны константе диссоциации для этого сайта. Поскольку независящая от vWF индуцированная коллагеном агрегация тромбоцитов ингибировалась только большими дозами Саратина (более 100 мкМ), можно предположить, что насыщение связывающих коллаген сайтов с низким сродством ассоциировано с ингибированием прямых взаимодействий коллаген-рецептор коллагена.

Другим предметом настоящего изобретения является эффект, состоящий в воздействии, которое Саратин оказывает на локальное окружение эндартеректомизированного сосуда без необходимости системного распределения и без изменения функции тромбоцита или изменения коагуляции, что делает его идеальной методикой для топического применения в процессе процедур сосудистой хирургии и радиологического вмешательства. В этом аспекте данного изобретения действие терапевтического Саратина исследовали на модели эндартеректомии сонной артерии крыс (СЕА), описанной ранее (J.Vasc. Surg. 1998, 28: 909-918). Предполагается, что активация PLT является первым этапом развития тромбоза и рестеноза после СЕА, обусловленных IH. Было обнаружено, что местное применение Саратина на поверхности со стороны полости уменьшает количество тромбоцитов, налипающих на эндартеректомизированную артерию, и таким образом тормозит развитие постоперационного тромбоза и IH. Результаты экспериментов по антиадгезионному действию Саратина на тромбоциты, которое оценивали после прохождения двух различных послеоперационных периодов, свидетельствуют, что количество тромбоцитов, налипших на стенку сосуда через 3 ч (фигура 4) и через 24 ч (фигура 5) после эндартеректомии сонной артерии, у крыс, обработанных Саратином, было значительно меньшим, чем у крыс из контрольной группы. Адгезия тромбоцитов через 3 часа была уменьшена на 59% (64±17,2 по сравнению с 155±33,4 PLT на решетку, Р=0,05) и на 77% через 24 ч (35±11,3 по сравнению с 149±36,6 PLT на решетку, Р=0,0110). В контрольной группе адгезия тромбоцитов была аналогичной через 3 ч и через 34 ч, однако в группе, обработанной саратином, адгезия уменьшилась от 64 до 35 тромбоцитов на решетку.

На фигурах 6 и 7 представлены типичные картины эндартеректомизированной поверхности, обработанной и не обработанной топическим Саратином, полученные при помощи сканирующей электронной микроскопии при 2000-кратном увеличении. На фигуре 6А показана контрольная поверхность через 3 часа после эндартеректомии сонной артерии, свидетельствующая об изобилии клеточного материала, фибриновых нитей, многочисленных красных кровяных клеток и многочисленных тромбоцитов, различимых совершенно отчетливо. На фигуре 6В показана обработанная Саратином поверхность через 3 часа после эндартеректомии сонной артерии. Отмечены недостаток клеточных элементов и почти свободная поверхность коллагена. На фигуре 7А показана контрольная поверхность через 24 часа после эндартеректомии сонной артерии, тромбоциты видны как маленькие белые точки. На фигуре 7В показана обработанная Саратином поверхность через 24 часа после эндартеректомии сонной артерии. В случае обработки Саратином наблюдается отчетливое уменьшение адгезии тромбоцитов. Применение топического Саратина после эндартеректомии сонной артерии значительно тормозит развитие гиперплазии интимы по сравнению с контрольной группой. Процент полостного стеноза, который используется как мера IH, был значительно меньшим в случае применения Саратина, чем у контрольной группы. Это снижение формирования IH коррелировало с ингибированием адгезии PLT. В исчислении полостного стеноза у контрольных крыс наблюдалось 29,8±6,8%, р=0,0042 полостного стеноза против 10,9±1,8% полостного стеноза у обработанной Саратином группы (фигура 6). У обработанной Саратином крысы диаметр полости был на 18,9% больше, чем у контрольных крыс. Результаты гистологического анализа свидетельствуют, что через две недели после эндартеректомии сонной артерии у 5 из 15 контрольных крыс (15%) развился полноценный тромбоз сонной артерии притом, что тромбоз сонной артерии наблюдался у 0 крыс из 15 особей, обработанных Саратином (0%). Вероятностный анализ хи-квадрат дает вероятность успешного исхода 16,238, это означает, что вероятность развития тромбоза с закупоркой у контрольной группы в 16 раз больше, чем у крыс, обработанных Саратином Р=0,0156. У обработанной Саратином группы не наблюдалось повышенного кровотечения вдоль линии наложенного на артерию шва. У обработанных Саратином крыс не обнаружено значительных изменений в продолжительности кровотечения и числе системных тромбоцитов по сравнению с контрольными крысами через 3 и 24 ч после эндартеректомии. Модель СЕА находится в близком соответствии с операцией СЕА человека, и следовательно, на основании полученных результатов можно предложить способ уменьшения вредного воздействия адгезии и агрегации тромбоцитов в зоне эндартеректомии без системного воздействия на функцию тромбоцитов или снижения гемостаза. Простое, топическое применение Саратина в процессе СЕА крыс уменьшает адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также последующий рестоноз в полости сонной артерии, обусловленный гиперплазией интимы. В таблице 3 приведены результаты по продолжительности кровотечения и количеству тромбоцитов. Статистически значимого различия между продолжительностями кровотечения до и после операции не наблюдалось. Кроме того, не наблюдалось статистически значимого различия между числом тромбоцитов у обработанных Саратином и контрольных крыс. Мы доказали значительное уменьшение адгезии и аккумулирования тромбоцитов после повреждения сосуда, аналогичного эндартеректомии. Уменьшение адгезии тромбоцитов наблюдалось как сразу после эндартеректомии (3 ч), так и через 24 ч. Через 24 ч эффект был более значительным, чем мы ожидали, и этот эффект обусловлен непрямым ингибирующим воздействием Саратина на коллаген (период полураспада Саратина в сыворотке составляет 90 мин), а связан скорее с исходным ингибированием агрегации тромбоцитов и последующим нарушением каскада активации тромбоцитов. Если ингибируется исходное прилипание тромбоцитов к незащищенному коллагену, то не может начаться и каскад активации тромбоцитов. Данные, представленные на фигурах 4 и 5, демонстрируют, что местное применение Саратина на свежеповрежденном сосуде может в значительной степени ингибировать адгезию тромбоцитов. Саратин ингибировал адгезию тромбоцитов на 60% и 75% через 3 и 24 ч соответственно. Это ингибирование определяется по видимым различиям в осаждении клеточных элементов, которые наблюдаются между контрольными и обработанными Саратином артериями через 3 ч и 24 ч (фигуры 7 и 8). Мы предполагаем, что это уменьшение клеточной реакции обусловлено ингибированием адгезии тромбоцитов. Это представляет уникальный вариант терапии для ингибирования адгезии тромбоцитов к поврежденному сосуду. Через две недели после эндартеректомии сонной артерии у контрольных крыс был значительно меньший диаметр полости, чем у особей, обработанных Саратином (фигура 9). Количество очагов развития гиперплазии интимы у обработанных Саратином крыс был значительно снижен, что коррелирует с уменьшенными адгезией и аккумулированием тромбоцитов. Обнаружение уменьшения числа очагов гиперплазии интимы и тромбоза, что связано со снижением адгезии тромбоцитов, обеспечивает клинически важные пределы и следствия уменьшенной адгезии тромбоцитов. Это свидетельствует, что специфическое к очагу несистемное ингибирование адгезии и агрегации тромбоцитов приводит к уменьшению скорости развития тромбоза и закупорки, а следовательно, уменьшает процент постоперационных черепномозговых событий и инсультов после эндартеректомии сонной артерии. Улучшение уровня гиперплазии интимы и полостного стеноза демонстрируется, кроме того, важным фактом уменьшения процента тромбоза у крыс, обработанных Саратином. У 33% контрольных крыс обнаруживался тромбоз, тогда как ни в одной из обработанных Саратином сонных артерий тромбоза не наблюдалось. Особенно важное клиническое значение имеет характерное для этого агента отсутствие системных эффектов. Местное применение Саратина не оказывает воздействия на случаи системного кровотечения или количества тромбоцитов. На этом основании можно сделать вывод, что уменьшение адгезии тромбоцитов и последующее снижение тромбоза и гиперплазии интимы являются результатом местного воздействия. Обнаружение этих новых, связанных с Саратином фактов имеет важное значение в том отношении, что спектр клинических применений для методик, которые могут осуществлять местное ингибирование вредных эффектов адгезии и активации тромбоцитов без нарушения механизма системного гемостаза, весьма широк. Ранее было указано, что различные терапевтические вмешательства индуцируют локальные повреждения, которые можно идеально обрабатывать немедленно и местно. Оставленные без обработки, поврежденные клетки инициируют серию процессов, вовлеченных в свертывание, дополнительную активацию и клеточную реакцию высвобождения цитокинов, индуцирование пролиферации и другие биологически активные процессы. Эти сложные, взаимосвязанные процессы трудно остановить, если они уже начались. Важный аспект настоящего изобретения состоит в том, что Саратин расположен непосредственно на обрабатываемых тканях. Другим аспектом местного применения является минимизация потенциальных проблем, связанных с системными эффектами лекарственных препаратов, применяемых для вмешательства. В идеале лечение Саратином можно назначать одновременно с подходящим терапевтическим вмешательством, что можно осуществлять путем введения Саратина в покрытие на хирургических устройствах, таких как баллонный катетер, или другие устройства или их детали. Другой аспект может также включать непосредственное покрытие Саратином поврежденных сосудов. Кроме того, по данному изобретению можно применять и обычные способы поставки Саратина, такие как тип свободной жидкости, включающей комбинации с другими терапевтическими агентами. Тем не менее, применение матрицы полимер/гидрогель имеет определенные преимущества перед поставками свободной жидкостью. Поставка агента, который был введен в полимерную матрицу, не требует дополнительных полостей во вспомогательном катетере для транспортировки свободной жидкости с лекарственным раствором к месту обработки и обратно. Кроме того, полимерная матрица исключает риск утечки лекарственного раствора с током крови, которая может происходить при неплотном заполнении баллоном сегментов сосуда, что обуславливает риск подвергания нецелевых тканей воздействию высоких концентраций лекарства. Общим техническим решением относительно местного применения Саратина либо на медицинском устройстве либо в виде покрытия на поврежденном сосуде является, например, введение Саратина в полимерное или гидрогелевое покрытие. Относительно полимерных композиций используемый здесь термин «гидрогель» охватывает синтетические полимеры с порами или пустотами различных размеров и емкостей и варьируемыми физико-химическими свойствами, в особенности зарядом или гидрофильной/гидрофобной природой гелевой матрицы, которые можно варьировать в процессе изготовления покрытия или устройства с покрытием. Специалистам известно множество синтетических эластомеров и встречающихся в природе полимерных материалов. Саратин можно вводить в матрицу в процессе получения полимера или добавлять после покрытия или формовки полимера в желательную форму. Кроме того, для формирования полимерных матриц, применяемых по настоящему изобретению, можно использовать многие из известных многочисленных различных полимерных материалов и способов изготовления. Примеры подходящих полимерных материалов или комбинаций включают, но не ограничиваются этим, биосовместимые и/или разлагаемые микроорганизмами полимеры. Были изучены некоторые алкилалкил- и цианоакрилаты в аспекте их хирургического применения и обнаружилось, что особенно подходящими являются некоторые изобутилцианоакрилаты. Типичный гидрогелевый полимер можно получить из смеси мономеров, содержащей 40-60 весовых долей очищенного моноэфира гидроксиалкилалкилакрилата, имеющего единственную олефиновую двойную связь, 40-60 весовых долей метакрилатного мономера, содержащего одну олефиновую двойную связь и 0,001-5 весовых долей инициатора полимеризации. Полимеризацию можно производить по стандартным методикам полимеризации в массе, полимеризации в растворе, полимеризации в суспензии или полимеризации в эмульсии. Выбор методики полимеризации зависит от требуемого объема полимера и природы конечного продукта, который требуется получить. Типичный гидрогелевый продукт может быть описан молярным отношением моноэфира к метакрилатному мономеру в диапазоне от 1:1 до 2,3:1, предпочтительно 1,5:1, в котором диаметр пор полимера превышает 90 ангстрем. Поскольку моноэфир гидроксиалкилакрилата имеет единственную олефиновую двойную связь, перечень подходящих соединений включает, но не ограничивается ими, 2-гидроксиэтилметакрилат, глицерилметакрилат, 2-гидроксипропилметакрилат, глицидилметакрилат, 2-гидроксиэтилакрилат; и 2-гидроксипропилакрилат. Подходящими метакриловыми мономерами являются метакриловая кислота, метакриламид 5 и метакрилонитрил. Выбор инициатора полимеризации может зависеть от методики полимеризации или конечного назначения полимера. Например, если полимер предполагается сформовать в виде твердого объекта, можно использовать инициаторы типа свободных радикалов. В число предпочтительных инициаторов этого типа входят бифункциональные полиэфиры, такие как 2,5-диметил-2,5-бис(2-этилгексоилперокси)гексан или третичного бутила пероксипивилат. Альтернативно, если окончательным назначением полимера является его применение в виде покрытия, которое наносят в виде смеси мономеров и полимеризуют in situ, инициатором могут быть активированные облучением типа УФ катализаторы 2,2-азобис(2-метилпропилнитрил) или азобисбутиронитрил (AIBN). Применение этих инициаторов не ограничено конкретной методикой полимеризации или конкретным конечным продуктом. Например, инициаторы типа свободных радикалов можно применять в покрытиях, и активированные облучением инициаторы можно использовать при формовке твердых объектов. В дополнение к в большой мере похожим фракциям моноэфира и метакрилатного мономера смесь мономеров можно укрепить следовыми количествами алкилакрилата с более длинными цепочками или комономера метакрилатного эфира, такого как циклогексилметакрилат, триметилолпропантриметакрилат или этиленгликоля диметакрилат. Такие дополнительные комономеры укрепляют сетчатую структуру в случаях, когда желательно укрепить добавленный полимер. Следовые количества этих комономеров в общем случае составляют менее 0,1 вес. % всей смеси мономеров. Гидрогелевые полимеры, которые применяются по настоящему изобретению, можно формовать таким образом, чтобы получать объекты, сшитые внутренними воздействиями в достаточной мере, чтобы окончательный объект не требовал дополнительных сшивающих мономеров.

Дополнительными примерами разлагаемых микроорганизмами полимеров являются поли(лактиды), полигликолиды, полиангидриды, полиортоэфиры, полиакталы, полидигидропираны, полицианоакрилаты и их кополимеры, а также полиэтиленгликоль. Они могут принимать форму кополимерных гидрогелей или структурированных полимерных сетей, в которые лекарства, предназначенные для концентрированной поставки в нужную зону, можно либо вводить в процессе полимеризации либо в случае определенных гидрогелей, загружать впоследствии. Предпочтительными матрицами могут быть те, которые созданы в соответствии с молекулярными характеристиками агента, чтобы контролировать его диффузию наружу.

Разнообразнейшие типы катетеров и других медицинских устройств, покрытых Саратином, можно сконструировать и применять в соответствии с индивидуальными терапевтическими потребностями, для удовлетворения которых они были сконструированы, или для решения более специфической задачи доставки загруженного Саратином полимера в нужное место. Настоящее изобретение прошло тестирование на баллонном катетере, который продается под названием Blue medical Devices BV GO, поставляемый компанией Blue medical, но сфера его применения не ограничивается данным типом катетера.

Другие примеры

Пример 1

Связывание очищенного vWF и тромбоцита с коллагеном в статических условиях

Образование связей vWF с коллагеном исследовали на микротитровальных пластинках, в соответствии с известными методиками (Blood 1995, 85(3):705-711). Различные коллагены - человеческий коллаген типов I и III и коллаген кожи теленка (Sigma) - покрыли составом из 50 мкл коллагена, растворенного в 50 мМ уксусной кислоты, который нанесли по 125 мкг мл^-1 на 96-колодезные микротитровальные пластинки, и выдерживали в течение ночи в присутствии 200 мкл PBS, чтобы подтолкнуть ренатурацию. После блокирования непокрытых участков при помощи BSA очищенный человеческий vWF (1,25 мкг мл^-1 для пластинок, покрытых коллагеном типа I и коллагеном кожи теленка; 0,625 мкг мл ^-1 для пластинок, покрытых коллагеном III) или разбавленную обычную плазму (человеческая плазма: 1/80 на коллаген I и III, 1/40 на коллаген кожи теленка; плазма хомяка, мыши и свиньи: 1/80 на коллаген III; 1/20 на коллаген I и коллаген кожи теленка) добавили в колодцы в присутствии Саратина и инкубировали в течение 2 часов (разбавленная плазма) или 1 часа (очищенный vWF). Связывание остаточного vWF с коллагеном определяли после последующего этапа промывки при помощи антисыворотки кролика анти-vWF (Dako, Copenhagen, Denmark), транспонированной пероксидазой хрена, которую проработали и измерили поглощение света при 492 нм.

Если микротитровальные пластинки подвергали предварительному инкубированию с человеческим коллагеном I, человеческим коллагеном III и коллагеном кожи теленка, последующее инкубирование очищенного vWF в присутствии Саратина было сопряжено с зависящим от дозы ингибированием образования связей vWF-коллаген, и значения IC₅₀ составляли 0,23±0,004, 0,81±0,04 и 0,44±0,008 мкг мл ^-1 соответственно (фигура 1). Если очищенный vWF был заменен разбавленной обычной человеческой плазмой, ингибирующая способность Саратина сохранялась (таблица 1). Саратин ингибировал также связывание vWF с различными тестируемыми коллагенами в разбавленной плазме свиньи, хомяка и мыши и проявил ощутимо наивысшую эффективность против коллагена I (таблица 1).

Пример 2

Адгезия тромбоцитов при повышенном сдвиге

С учетом важности сил сдвига для контроля зависящей от vWF адгезии тромбоцитов к коллагену (J.Lab. Clin. Med. 1974, 83(2): 296-300), в проточной камере были проведены перфузионные исследования для изучения ингибирующего действия Саратина в условиях потока, аналогичных тем, которые встречаются в поврежденных или пораженных болезнью артериях. Коллаген кожи теленка нанесли на пластиковые покровные стекла по описанной ранее методике (Blood 1995, 85(3); 705-711). Перфузии осуществляли в перфузионной камере с параллельными пластинками с двумя держателями покровных стекол, высота камеры составляла 0,4, 0,6 или 1,0 мм, а ширина - 1,0 см, в пульсирующем потоке (роликовый насос, Watson Mariow 603S, VEL, Leuven, Beligjum) при примерных скоростях сдвига 2700, 1300 и 300 с ^-1 соответственно. Предохраненная от свертывания здоровая кровь (0,2 IU мл^-1 гепарина с низким молекулярным весом, Clexane) разбрызгали по покрытым коллагеном покровным стеклам на 5 мин, после чего промытые покровные стекла подкрасили Grunwald-Gfemsa и оценили осаждение тромбоцитов при помощи оптической микроскопии и анализа изображений по известной методике (Blood 1995, 85(3): 705-711) с использованием покрытия поверхности в качестве количественного параметра.

При скорости сдвига 2700 сек^-1 наблюдалось зависящее от дозы Саратина ингибирование адгезии тромбоцитов с значениями IC ₅₀=0,96±0,25 мкг мл^-1 (фигура 2). Тем не менее, при более умеренной скорости сдвига 1300 сек ^-1, наблюдался отчетливый сдвиг вправо на кривой зависимости от дозы, с значениями IC₅₀=5,2±1,4 мкг мл^-1 (фигура 2). При скорости венозного сдвига 300 сек^-1 Саратин оказался неспособным ингибировать адгезию разбрызганных тромбоцитов вплоть до 10 мкг мл^-1 (данные не приводятся).

Пример 3

Анализ связывания при помощи резонанса поверхностных плазмонов (SPR)

Взаимодействия протеинов идентифицировали и охарактеризовали при помощи SPR на установке BlAcore 3000 (BlAcore, Freiburg, Germany). В соответствии с инструкцией поставщика аппаратуры были использованы спаривающие агенты. Связывание с сенсором СМ 5 было произведено через активированные карбоксилатные группы, чтобы высвободить аминовые группы человеческого коллагена типа III (Sigma). Подгонку pH и химические реакции спаривания провели при стандартных условиях (Anal Biochem. 1991, 198(2): 268-277, JAI Press Ltd., 1992). Для спаривания коллаген разбавили до 0,125 мкг мл^-1 в 10 мМ ацетатного буфера (pH 4,5), что привело к появлению 331 резонансной единицы (RU) иммобилизованного материала. Эту матрицу использовали для изучения связывания очищенного рекомбинантного Саратина, который был растворен в 20 мМ Hepes (pH 7,4), 150 мМ NaCI, 5 мМ EDTA, 0,005% Tween 20. Все эксперименты по связыванию проводили при 25°С. Титрование с Саратином производили при варьировании концентраций от 7,8 нМ до 10 мкМ. Получившиеся экспериментальные значения плато RU были нанесены по уравнению:

R_eq/концентрация Саратина = (-К_A·R_eq)+(К _A·R_max).

Титрование Саратина на иммобилизованном на поверхности коллагене привело к зависящему от концентрации связыванию. Далее максимальное количество Саратина, связанного с коллагеном на поверхности датчика, обусловило появление более высокого сигнала, чем максимальный сигнал, рассчитанный для модели связывания 1:1. Это указывает на существование более чем одного связывающего сайта для Саратина на коллагене типа III, далее этот вывод был подтвержден фактом, что подгонка данных по Лэнгмюру к модели связывания 1:1 не дает положительных результатов.

Анализ Скетчарда данных SPR свидетельствует о существовании двух различных связывающих сайтов с значительно отличающимся сродством к саратину (фигура 3). Расчет констант равновесия привел к получению константы диссоциации 5·10^-8 М для сайта с высоким сродством и 2·10^-6 М для связывающего сайта с низким сродством.

Пример 4

Агрегация тромбоцитов

Специфичность Саратина к функции тромбоцита оценили путем исследования агрегации в обогащенной тромбоцитами плазме с использованием в качестве агонистов коллагена, ADP, ристоцетина, арахидоновой кислоты или аналогов тромбоксана U46619. Цитратированную кровь (3,13%) не принимавших лекарства здоровых доноров центрифугировали (15 мин, 100 г), чтобы получить обогащенную тромбоцитами плазму, к которой добавили Саратин (конечная концентрация 0-200 мкг мл^-1 ) за 1 мин до индуцирования агрегации тромбоцитов коллагеном (0,5 мкг мл ^-1 ), ADP (2,5 мкМ), ристоцетином (0,9 мг мл ^-1 ), арахидоновой кислотой (1,0 мМ) или U46619 (1,3 мкМ). Для каждого агониста наблюдался максимум агрегации (амплитуда) после прохождения 5-минутного периода.

Саратин оказался неспособным ингибировать максимальную агрегацию ко всем тестированным агонистам, включая коллаген, при конечной концентрации вплоть до 40 мкг мл^-1 (таблица 2). Тем не менее, Саратин мог частично ингибировать индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов при 100 мкг мл^-1 (не показано) и полностью ингибировать при 200 мкг мл^-1 , хотя на агрегацию к ADP Саратин не оказывал влияния даже при концентрации 200 мкг мл^-1.

Пример 5

Модель СЕА крысы

В модели СЕА крысы, в которой используется открытая методика с артериотомией, использовали прямое удаление интимы, частей среды и шва артерии. Одна группа крыс получала Саратин, в то время как другая группа использовалась для контроля. Измерения конечной точки включали 1) адгезию PLT, 2) скорость тромбоза, 3) развитие гиперплазии интимы. Саратин применяли непосредственно к поверхности эндартеректомизированной поверхности сонной артерии перед закрытием артерии. Электронные микроснимки (2000 X) препарированных сонных артерий использовали для количественного анализа агрегации PLT. Общие количества PLT рассчитывали с использованием стандартизованной палетки. IH и тромбоз анализировали при помощи компьютеризованного морфометрического анализа подкрашенных эластином сегментов сонной артерии с прямым измерением площади IH.

Пример 6

Операция эндартеректомии сонной артерии

Животных усыпляли изофлюраном в стеклянном колпачке, взвешивали и затем анестезировали комбинацией кетамина (100 мг/кг) и ацепромазина малеата (1 мг/кг) внутрибрюшинно. После того, как адекватность анестезии подтверждалась отсутствием реакции на раздражение задней лапы, подкожно в области верхней части середины спины вводили 4 см³ обычного салина, который служил источником жидкости (1 см ³/кг) для компенсации потери крови в ходе операции. Затем область шеи выбривали и обрабатывали 7%-ным изопропиловым спиртом. С применением стерильной методики и препарационного микроскопа (х40, sz40 Olympus, Olympus America Inc., Melville, NY) производили цервикальный разрез. Отделяли внешние мускулы и производили рассечение до уровня правой сонной артерии. Затылочные нервы в области артерии произвольным образом отсекали для сохранения фарингеальной функции и предотвращения постоперационного респираторного риска.

После адекватного воздействия на сонную артерию ближний и дальний контроль развилки примерно на 1,5 см расстоянии осуществили при помощи наложения 3-0 турникетов из шовного шелка. При помощи корнеального лезвия произвели артериотомию и растянули до длины 6 мм при помощи микроножниц. При помощи иглы №27 интиму процарапали поперечно по сосуду по двум параллельным линиям, отстоящим друг от друга примерно на 2 мм. Интиму и срединный слой удалили микропинцетом. Саратиновая группа крыс получала по 5 мкл раствора Саратина, примененного непосредственно на эндартеректомизированную поверхность. Артериотомию закрыли бегущим 10-0 швом из моноволоконного нейлона (MS/9, Ethilon, Ethicon Inc., Somerville, NJ), начиная от дальнего конца. Дальний турникет удалили первым, чтобы оценить гемостаз линии шва после удаления ближнего турникета. Продолжительность применения Саратина составляла 5 мин, что соответствует времени, которое требуется для закрытия артерии. Любое кровотечение линии шва осторожно тампонировали стерильным кончиком хлопкового аппликатора до достижения гемостаза. Эндартеректомизированную сонную артерию оценивали ручным Doppler, чтобы усилить наглядность. Затем внешний слой мускулов и кожу зашивали бегущим 3-0 рассасывающимся швом.

Пример 7

Адгезия тромбоцитов

В подгруппах адгезии тромбоцитов крыс повторно анестезировали, собирали эндартеректомизированные сонные артерии и фиксировали их в 4%-ном растворе глютальдегида через 3 ч или через 24 ч после эндартеректомии сонной артерии. На протяжении процедуры сбора сегменты сонной артерии были продолжительное время открытыми вдоль области шва, таким образом оставляя незащищенной эндартеректомизированную область. Затем артерии постфиксировали тетроксидом осмия, дегидратировали в серии градационных спиртов, важные точки высушивали при помощи СО₂ (1072 psi и 31,1°С), покрывали золото-палладием и помещали в сканирующий электронный микроскоп (JEOL JSM 5410, JEOL, USA Peabody, MA).

Эндартеректомизированные области сканировали при 2000-кратном увеличении и получили фотографии изображений. Фотографические изображения были согласованы и упорядочены в комбинацию, позволяющую визуализацию большей зоны, чем это можно было сделать при помощи единственного поля монитора сканирующего электронного микроскопа. После монтажа комбинации фотографий ее накрыли прозрачной палеткой. Такие же палетки были использованы для фотографий всех образцов. Для подсчета общего количества тромбоцитов использовали 116 квадратов на каждой фотографии. Число 116 - это максимальное число квадратов, которые можно было наверняка обнаружить на всех комбинациях фотографий. Подсчет тромбоцитов производили вслепую два наблюдателя.

Пример 8

Гиперплазия интимы

Через две недели после эндартеректомии сонной артерии крыс из группы гиперплазии интимы анестезировали и обнажали эндартеректомизированную сонную артерию. Брюшную полость вскрыли по средней линии и вскрыли периферическую аорту и внутреннюю полую вену. Произвели поперечный надрез полой вены, и периферическую аорту канюлировали катетером №20 для вливания нормального салина при 100 мм Hg до тех пор, пока выходящий из полой вены поток не становился чистым. Следующим этапом было вливание в равном объеме 10%-ный формалина, содержащего буферный раствор, при 100 мм Hg, для завершения метода перфузии-фиксации. Односантиметровый сегмент оперированной сонной артерии отсекли и поместили в 10% формалин до последующей обработки для гистологии. Артерии блокировали парафином, секционировали и подкрасили эластином при помощи красителя Verhoeff и Van Gieson. Для стандартизации области секционирования отбирали кратные сегменты через интервалы 3 мкм, каждый из которых располагался вдоль линии непрерывного 10-0 нейлонового шва, закрывающего артериотомию. Подкрашенные эластином стекла сфотографировали при помощи цифрового фотоаппарата KODAK DC 120 Zoom (Eastman KODAK Company, Rochester, NY). На этот момент должны уже были быть заметны любые тромбозные сегменты. Нетромбозные изображения загрузили в компьютер, области полостей сонных артерий проанализировали при помощи программы National Institutes of Health (Bethesda, MD), ImageJ Software, Version 0.99f. Этот пакет программ позволил нам очертить внутреннюю область гиперплазии интимы и таким образом получить точную оценку площади поперечного сечения полости сосуда. Кроме того, была определена наружная область гиперплазии интима. Разницу между двумя областями (наружная площадь гиперплазии интима минус действительная полость) определили как абсолютную площадь гиперплазии интимы. Поскольку артериальное поперечное сечение имело индивидуальные вариации формы, значения были выражены как отношение абсолютной площади гиперплазии интимы к внешнему пределу гиперплазии интимы, и о них упоминается как о проценте полостного стеноза. Это отношение представляет долю площади полости, занятую гиперплазией интимы, и позволяет производить сравнение поперечных сечений артерий различных размеров (4). Между измерениями, которые вслепую производили два наблюдателя, обнаруживались минимальные расхождения.

Пример 9

Продолжительность кровотечений и количество тромбоцитов

Чтобы оценить влияние Саратина на количество системных тромбоцитов и продолжительность кровотечений, были измерены количество системных тромбоцитов и продолжительность кровотечений у 12 крыс. При необходимости получить образцы дооперационной крови каждой крысы у них приходилось отбирать по 1-1,5 см ³ крови, что представляет значительную долю общего объема крови животного. С учетом этого факта логично было ожидать уменьшения количества тромбоцитов после операции как у контрольных, так и у обработанных Саратином крыс. Поэтому, чтобы оценить влияние Саратина на количество тромбоцитов, мы определяли разницу между количествами тромбоцитов для каждой крысы путем вычитания дооперационного количества тромбоцитов из постоперационного количества тромбоцитов и определяли различия. Различия количества тромбоцитов проанализировали с использованием 2×2 конфигурации точек плана факторного эксперимента, обработанных по модели ANOVA, и продемонстрировали отсутствие статистически значимых различий количеств тромбоцитов между контрольными и обработанными Саратином крысами. У всех крыс перед операцией были определены количества тромбоцитов и продолжительности кровотечений. Шесть крыс подвергли эндартеректомии сонной артерии, и через три часа после операции усыпили и измерили продолжительности кровотечений и количество тромбоцитов, а остальные 6 крыс усыпили через 24 ч после операции и измерили продолжительности кровотечений и количество тромбоцитов. Три крысы из каждой временной группы получали топический Саратин, а остальные три крысы использовались для контроля.

Продолжительности кровотечений определяли при помощи поперечного надреза дистальных 2 мм хвоста крыс и погружения примерно 4 см хвоста в раствор фосфатного буферного раствора при 37°С. Измеряли время, прошедшее от момента надреза до остановки кровотечения, и определяли его как продолжительность кровотечения. Количество тромбоцитов определяли путем отбора 1-1,5 см³ образцов крови из яремной вены, анализировали образцы в анализаторе крови Coulter STKS и выражали результаты в виде данных ·10³.

Пример 10

Статистические методы

Представлены значения ± стандартная погрешность. Для сравнения количества налипших тромбоцитов, процента полостного стеноза и продолжительности кровотечений у обработанных Саратином и контрольных крыс произвели непарный анализ t-тест с использованием программы Stat View (SAS Institute Inc. Сагу, NC 27513), версия 5.0. Отношение правдоподобия в анализе хи-квадратов использовали для оценки вероятности успешного исхода для развития тромбоза через две недели после эндартеректомии сонной артерии. Для оценки различий дооперационного и постоперационного количеств тромбоцитов использовали 2×2 конфигурацию точек плана факторного эксперимента, обработанных по модели ANOVA.

Пример 11

Экспериментальные животные

Крысы Sprague-Dawley (350-400 г) объединили в группы для эндартеректомии сонной артерии, предназначенные для двух главных целей. 1) оценка адгезии тромбоцитов и 2) оценка скорости полостного стеноза, обусловленного гиперплазией интимы, и скорости тромбоза. В плане достижения этих двух главных целей крыс разделили на контрольных и обработанных Саратином животных. Всех крыс подвергли эндартеректомии сонной артерии (см. ниже), обработанные Саратином крысы получили местное назначение 5 мкл раствора Саратина на поверхность полости сонной артерии сразу после удаления интимы/слоя среды. Группа адгезии тромбоцитов состояла из электронно-микроскопической оценки через 3 ч после эндартеректомии сонной артерии (n=17) и через 24 ч после эндартеректомии сонной артерии (n=19). Группу гиперплазии интимы (n-25) усыпляли через две недели после эндартеректомии сонной артерии.

Пример 12

Приготовление покрытых Саратином гидрогелевых катетеров

Поверхности материалов на основе РА-12 активировали путем погружения устройств в раствор 2 мол. % макроинициатора поли(октадецен-алт-малеинуксусной кислоты ангидрид) с перэфиром (11-18 мол. %), растворенным в изопропаноле, и 0,5 моля этиленгликоля диметакрилата (EGDMA)/1 моль макроинициатора. Затем высушивали покрытие макроинициатор/EGDMA. Покрытие отжигали еще 5 раз по 10 мин при 120°С, что способствовало улучшению фиксации макроинициатора на поверхности, и таким образом улучшало структурирование.

Для оптимизации условий нанесения покрытия применяли выращивание гидрогелевых покрытий на пластинках носителя РА-12. Перед нанесением покрытия пластинки промывали изопропанолом или ацетоном и высушивали.

Для покрытия гидрогелем использовали баллонный катетер типа Blue Medical Devises GO (катетер RX РТСА), состоящий из Vestamid (РА-12). Водные растворы 5 мол. % акриловой кислоты 100 мл и 0,2 бис 0,8 мол. % метилен-бис-акриловой смешали и использовали для покрытия пластинок или катетеров. После полимеризации устройство с покрытием промывали водой и еще 24 ч в буфере PBS.

После этого полимер отжигали в печи при 60-80°С от 0,5 до 3 ч.

Толщина высушенных гидрогелевых покрытий находилась в интервале от 1 до 4 мкм, разбухание гидрогеля в водном растворе варьировалось от 10 до 50 г гидрогеля влажного/1 г гидрогеля сухого.

При погружении (30 мин) в буферированный буфером PBS pH 7,4 раствор Саратина использовали концентрации 50 мкг мл^-1 .

Для приготовления растворов для покрытий использовали органические растворители, а при напылении на баллонный катетер использовали стандартное маломасштабное оборудование для нанесения покрытий, которое поставляет EFD.

Описание фигур

Фигура 1. Влияние Саратина на связывание очищенного человеческого vWF с человеческим коллагеном типа I (кружки), коллагеном типа III (квадратики), коллагеном кожи теленка (треугольники). Для коллагена типа I, IC₅₀=0,23±0,004 мкг мл^-1, для типа III=0,81±0,04 мкг мл^-1 и для коллагена кожи теленка=0,44±0,008 мкг мл^-1.

Фигура 2. Влияние сдвига на ингибирование Саратином формирования агрегатов тромбоцитов на человеческом коллагене типа III в проточной камере in vitro. Кружки обозначают скорость сдвига 2700 сек^-1 (IC₅₀=0,96±0,25 мкг мл ^-1 ), квадратики обозначают скорость сдвига 1300 сек ^-1 (IC₅₀=5,2±1,4 мкг мл ^-1 ).

Фигура 3. Анализ Скетчарда данных по связыванию Саратина с иммобилизованным человеческим коллагеном, полученных методом резонанса поверхностных плазмонов, свидетельствует о наличии на коллагене III связывающих Саратин сайтов с высоким сродством (K_d=5·10 ^-8М, сплошная линия) и низким сродством (K _d=2·10^-6М, пунктирная линия).

Фигура 4. Число тромбоцитов, прилипших к незащищденной поверхности субэндотелия через 3 ч после эндартеректомии сонной артерии, сопоставление данных по группе с применением Саратина (n=7) и контрольной группе (n=10). Данные означают ±SE. Животные Саратиновой группы получали по 5 мкл раствора Саратина местно, на незащищенную поверхность субэндотелия. Звездочка указывает, что значение Р составляет 0,05.

Фигура 5. Число тромбоцитов, прилипших к незащищенной поверхности субэндотелия через 24 ч после эндартеректомии сонной артерии, сопоставление данных по группе с применением Саратина (n=9) и контрольной группе (n=10). Данные означают ±SE. Тромбоциты подсчитывали при помощи сканирующего электронного микроскопа. Животные Саратиновой группы получали по 5 мкл раствора Саратина местно, на незащищенную поверхность субэндотелия. Звездочка указывает, что значение Р составляет 0,01.

Фигура 6. Электронная микрофотография (2000 X) эндартеректомизированной сонной артерии крысы через 3 ч после эндартеректомии сонной артерии: А - контрольная поверхность; В - поверхность, к которой местно применяли Саратин (5 мкл). На контрольной поверхности видны многочисленные элементы клеток, включая волокна фибрина, красные кровяные клетки и тромбоциты. На обработанной Саратином поверхности видно значительное уменьшение количества клеточных элементов.

Фигура 7. Электронная микрофотография (2000 X) эндартеректомизированной сонной артерии крысы через 3 ч после эндартеректомии сонной артерии: А - контрольная поверхность; В - поверхность, к которой местно применяли Саратин (5 мкл). На контрольной поверхности видны многочисленные красные кровяные клетки и тромбоциты. На обработанной Саратином поверхности видно значительное уменьшение адгезии тромбоцитов.

Фигура 8. Процент полостного стеноза, вторичного по отношению к гиперплазии интимы, через 2 недели после эндартеректомии сонной артерии. Показаны обработанная Саратином (n=15) и контрольныя группы (n=10). Животные Саратиновой группы получали по 5 мкл раствора Саратина местно, на незащищенную поверхность субэндотелия. Звездочка указывает, что значение Р составляет 0,004.

Фигура 9. Поперечное сечение сонной артерии свидетельствует об уменьшении гиперплазии интимы в обработанных Саратином артериях (В) по сравнению с необработанными артериями (А) контрольных крыс, IH=гиперплазия интимы.

Таблица 1. Концентрации IC₅₀ Саратина, необходимые для ингибирования адгезии тромбоцитов в PRP из различных видов, образующих связи с человеческим коллагеном типов I и III, а также коллагеном кожи теленка.

Таблица 2. Влияние Саратина на максимальную агрегацию тромбоцитов (%) в PRP, индуцированную различными агонистами, конечная концентрация реагентов соответствует указанной.

Таблица 3. Дооперационные и послеоперационные продолжительности кровотечения и количества тромбоцитов.

Таблица 1.
Источник плазмы Plasms source		IC50 Саратина ( мкг мл-1 )
		Коллаген типа I				Коллаген типа III				Коллаген кожи теленка
Человек		0,2				0,9				0,3
Свинья		0,2				0,5				0,5
Хомяк		0,4				n.t.				7,0
Мышь		0,1				0,6				0,3
Таблица 2
Агонист				Агрегация (%) при указанных концентрациях Саратина (мкг мл-1)
				0	10		20		40		200
Коллаген (0,5 мкг мл -1)				62	67		63		64		0
ADP (2,5 мкМ)				60	64		69		82		88
Ристоцетин (0,9 мкг мл-1)				61	67		75		63		n.t.
Арахидоновая кислота (1,0 мМ)				66	66		67		57		n.t.
U46619 (1,0 мкМ)				66	65		57		56		n.t.
Таблица 3.
ВРЕМЯ	УСЛОВИЯ		КОЛИЧЕСТВО ТРОМБОЦИТОВ					ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ КРОВОТЕЧЕНИЯ
ДО ОП.	КОНТРОЛЬ		752±36,05·10 3					11,9±0,91 мин
ПОСЛЕ ОП.	САРАТИН		829±33,85·10 3					8,6±0,62 мин
3 ЧАСА	КОНТРОЛЬ		604±34,2·10 3					10,8±0,9 мин
3 ЧАСА	САРАТИН		590±76·10 3					9,1±0,5 мин
24 ЧАСА	КОНТРОЛЬ		694±117·10 3					12,9±1,1 мин
24 ЧАСА	САРАТИН		729±19·10 3					11,5±1,3 мин