питательная среда для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования и сохранения возбудителя гнильцовой болезни пчел - американского гнильца - Paenibacillus larvae subsp. larvae, европейского гнильца Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus, Enterococcus faecalis, содержащая в 1 л гидролизата казеина с содержанием аминного азота 140-150 мг% 15-2,0 г агар-агара или агара Дифко, рН среды 7,2±0,2.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть применено в пчеловодстве для культивирования и длительного сохранения в музейных условиях возбудителей гнильцовых болезней пчел.

Европейский гнилец - болезнь открытого расплода. Возбудители: Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus (доброкачественный гнилец); Enterococcus faecalis (кислый гнилец) культивируются на мясопептонных средах (МПА, МПБ).

Парагнилец - инфекционное заболевание личинок позднего возраста и куколок. Возбудитель - Bacillus paraalvei, культивируется на мясопептонных средах (МПА, МПБ).

Американский гнилец (злокачественный гнилец) - инфекционное заболевание пчелиных семей, приводящее к ослаблению и гибели печатного расплода (взрослые личинки и предкуколки), вызываемое спорообразующим микроорганизмом Paenibacillus larvae subsp. larvae, для культивирования которого требуются специальные среды, т.к. для его роста и споруляции необходимы дополнительные питательные вещества. Переход вегетативных клеток в спорулирующие необходим для сохранения музейных культур возбудителя американского гнильца.

Для культивирования возбудителя американского гнильца в настоящее время применяют среды: Бейли, Томашеца, молочно-желточную среду Уиллиса-Гоббза.

СРЕДА БЕЙЛИ: имеет в составе: 10% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, 1% крахмала, 0,1360 г КН₂PO ₄, 1% агар (рН 6,6) [1].

СРЕДА ТОМАШЕЦА: мясопептонная среда с добавлением 10% нормальной лошадиной сыворотки (рН 6,8-7,0) [2].

СРЕДА УИЛДИСА-ГОББЗА - молочно-желточная эмульсия, 2% мясопептонный агар (рН 7,0-7,2) [3].

Известна также среда, имеющая в составе: казеин 1-3,65%; кукурузный настой 1,0-5%; крахмал 0-9,2%; сахарозу 0,6-3,5%; неочищенную патоку 0-9,2%; дрожжи 0,5-0,8%; Na₂PO₄ 0,42-0,60%; КН₂PO₄ 0,17-0,24%. (рН 6,5-7,5). Ближайший аналог [4].

Недостаток среды - трудоемкий технологический процесс приготовления (рецептура состава: 8 компонентов). Среда не обеспечивает ранний рост, спорообразование и длительную сохранность возбудителя американского гнильца пчел.

В задачу исследований входило создание универсальной питательной среды, которая давала бы быстрый рост, максимальное накопление биомассы, раннее и интенсивное спорообразование, способствовала длительному сохранению возбудителей гнильцовых болезней пчел в музейных условиях, в частности для труднокультивируемого возбудителя американского гнильца.

Предложенная нами среда содержит гидролизат казеина, полученный путем разбавления дистиллированной водой до содержания аминного азота 140-150 мг%, кипячения при перемешивании 5 минут; добавления 5% NaOH и доведения рН 7,8-8,0; добавления агара "Дифко" - 15 г/л или агар-агара (одесского) - 20 г/л; смесь кипятят при перемешивании 5 минут; доводят рН 7,2-7,4 20% HCl; среду фильтруют и стерилизуют при 121°С 20 минут. После стерилизации рН 7,0-7,2. Среда применена для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел, преимущественно для трудно культивируемого возбудителя американского гнильца Paenibacillus larvae subsp. larvae, показав преимущественные результаты в сравнении с рекомендуемым средами: (Бейли, Томашеца, молочно-желточной средой Уиллиса-Гоббза).

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1
Сравнительная оценка биологических свойств возбудителя американского гнильца пчел Paenibacillus larvae subsp. larvae
№ п	Показатели	Среда Томашеца	Среда Бейли	Среда Уиллиса-Гоббза	Предложенная среда
1	2.	3.	4	5	6
1	Первичный рост	72-96 ч	48-72 ч	48 ч	18-24 ч
2	Интенсивность роста	++	++	+++	+++
3	Накопление биомассы (концентрация смыва)	500 млн/см3	500 млн/см 3	1 млрд/см3	2 млрд/см3
4	Спорообразование	отсутствует	96 ч. 200-300 спор/см3	72 ч. 500-550 спор/см3	72 ч. 800-1000 спор/см3
5	Биологические свойства (культурально-морфологические, гемолитические, биохимические). 10 пересевов	Изменение биологических свойств	Не изменялись	Не изменялись	Не изменялись
6	Цикл пересевов	2 недели	4 недели	1,5 мес.	3 мес.

Установлено, что предложенная среда в отличие от рекомендованных способствует раннему проявлению первичного роста (18-24 ч); максимальному накоплению биомассы (48 ч - 2 млрд/см³); быстрому спорообразованию (72 ч - 800-1000 спор/см ³); многократные пересевы не изменяли биологических свойств возбудителя американского гнильца пчел, а жизнеспособность музейных культур увеличивалась до 3 месяцев.

Установлено, что возбудители европейского гнильца (Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterospores, Enterococcus faecalis) и парагнильца (Bacillus paraalvei) при культивировании на предложенной среде при многократных пересевах (10 пассажей) не изменяли биологических свойств, наблюдалось усиленное накопление биомассы (2-2,2 млрд/см³ , быстрое спорообразование (48 ч - 800-1000 спор/см ³), ранний первичный рост (18-24 ч), увеличивался цикл пересевов возбудителей (3 мес) при хранении в музейных условиях.

Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2
Сравнительная оценка биологических свойств возбудителей европейского гнильца (Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus Enterococcus faecalis) и парагнильца (Bacillus paraalvei)
№	Показатели	Мясопептонные среды: (мпа,мпб)	Предложенная среда
1.	2.	3.	4.
1.	Первичный рост	24 ч	18-24 ч
2.	Интенсивность роста	+++	+++
3.	Накопление биомассы (концентрация смыва)	1-1,8 млрд/см 3	2-2,2 млрд/ см3
4.	Спорообразование	72 ч. 500-700 спор/см3	48 ч. 800-1000 спор/см3
5.	Биологические свойства (культурально-морфологические, гемолитические, биохимические). 10 пересевов	Не изменялись	Не изменялись
6.	Цикл пересевов	2 мес	3 мес

Апробация предложенной среды проведена на 100 музейных штаммах возбудителей гнильцовых болезней пчел с положительными результатами.

Преимущество среды - универсальность, упрощение и удешевление технологического процесса изготовления (рецептура содержит 2 компонента). Среда дает возможность длительного сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел в музейных условиях.

Предложенная среда найдет применение в бактериологических лабораториях, для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел, в диагностических исследованиях и в производстве биопрепаратов.

Источники информации

1. Книга: «Опасные болезни и вредители пчел.», под редакцией О.Ф.Гробова и других, М.: Нива России, с.5.

2, 3. Там же, с.6.

4. GB №1003977 от 08.09.1965 - ближайший аналог.