штамм escherichia coli bl21 (de3)[payc-et-(hifn- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Escherichia coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/images/patents/166/2303018/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacI] - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека.

2. Способ культивирования бактерий Escherichia coli на среде М9, содержащей глюкозу, гидролизат казеина, антибиотик и минеральные добавки, отличающийся тем, что культивируют штамм бактерий Escherichia coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/images/patents/166/2303018/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacI], питательная среда содержит 10-20 г/л гидролизата казеина и в качестве антибиотика - стрептомицин в дозе 20-40 мг/л, а также дополнительно 5-10 г/л дрожжевого экстракта и 0,05-0,1 таблетки витаминно-минерального препарата "Centrum"; причем культивирование проводят с введением в среду индуктора интерферона при поддержании постоянной концентрации глюкозы в среде на уровне 0.01-0.03 г/л и рН 6,7-6,8, а после индуцирования регулирование рН и содержания глюкозы производят дискретным введением в питательную среду глюкозосодержащей добавки, объемом 100 мл на 1 л среды культивирования, содержащей в своем составе следующие ингредиенты (мас.%):

кислотный гидролизат казеина	20-25
дрожжевой экстракт	10-15
глюкоза	20-50
магний сернокислый семиводный	0,1-0,6

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве индуктора интерферона вводят 1,2-изопропил-тио-бета-галактозид в дозе 0,1-0.2 г/л.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве индуктора интерферона вводят лактозу в дозе 6-8 г/л.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к рекомбинантным штаммам Escherichia coli (E.coli) для получения рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека медицинского назначения (далее ИНТ), а также к способам получения ИНТ.

Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами, двуцепочечными РНК и другими индукторами (SU 297296, 1970; SU 1366064, 1983, SU 1713591, 1986 - кл. С12N 15/00; RU 1364343, 1984; RU 1709615, 1990; RU 2066188, 1993 - кл. С12N 15/00). Недостатками этих способов являются, как правило, низкий выход продукта, невозможность масштабирования этого процесса, вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатита В и С, вируса иммунодефицита и др. Поэтому в настоящее время более перспективным признан способ получения ИНТ микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом химические подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

В качестве исходных микроорганизмов для получения ИНТ используют, в основном, искусственно сконструированные штаммы Р. Pastoris, Ps. putida и E. coli.

Недостатком штамма Р. Pastoris (J.N.Garcia, J.A.Aguiar et. al. // High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada., 12 (3)., 152-155., 1995), является низкий уровень выхода целевого продукта на грамм биомассы, а штамма Ps. putida (SU 1640996, 1989, кл. С12N 15/00) - сложность выделения конечного продукта и, следовательно, трудоемкость и высокая себестоимость процесса с его участием, что делает штаммы Е. coli наиболее перспективными.

Известно значительное количество штаммов Е. coli - продуцентов интерферона: Е. coli АТСС 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR 322 (Pstl) HclF-11-206 или Z-pBR 322 (Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (UA 13380, 1997, С12N 15/21), штамм Е.coli НВ 101 с плазмидой pER 103 (SU 1417800, 1985, кл. С12N 15/00); штамм E. coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, N 9, с.1186-1193) и другие.

Однако для технологий, основанных на этих штаммах, характерна нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Широкое применение нашел штамм E. coli sg 20050/pIF16, с рекомбинантной плазмидой pIF16, (RU 2054041, 1996, кл. С12N 15/21). Экспрессия альфа-интерферона штаммом E. coli SG 20050 (plF16), содержащий эту плазмиду, контролируется тандемом двух мутантных конститутивных триптофановых промоторов и терминатором транскрипции фага 1.

Недостатками данного штамма являются использование в плазмиде сильных нерегулируемых промоторов, что приводит к быстрой сегрегации плазмиды; а также использование гена бета-лактомазы в качестве селективного маркера, в связи с тем, что она секретируется из бактериальной клетки и разрушает антибиотик, в результате чего в процессе ферментации происходит постоянное снижение селективного давления для плазмидсодержащих клеток штамма, накопление бесплазмидных клеток и в результате снижение выхода интерферона.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемой группе изобретений является ранее разработанный авторами штамм Escherichia coli SS5 и технология его культивирования. Штамм Escherichia coli SS5 выращивают в ферментере с питательной средой М9 (3 г/л КН ₂PO₄, 6 г/л Na₂ HPO₄, 0,5 г/л NaCl, 0.1 г/л NH ₄Cl, 0.1 г/л MgSO₄), содержащей дополнительно 10 г/л кислотного гидролизата казеина, 10 г/л глюкозы, 0.1 г/л MgCl₂, 0.1 г/л CaCl₂ , 20 мкг/мл канамицина при температуре 38-39°С, при поддержании рН 7±0,15 путем автоматической подтитровки 40%-ным раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода в диапазоне (40±10)% от насыщения обеспечивали путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 400 об/мин и подачи воздуха от 0.2 до 1.5 объема воздуха/мин.

Штамм достаточно устойчив в ходе культивирования, однако его продуцирующая способность недостаточно велика, причем используемые условия культивирования оказались малоэффективны для культивирования заявляемого штамма.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание штамма с повышенной продуцирующей способностью и технологии его культивирования.

Технический результат был получен в результате создания штамма Е. coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-IacI] и технологии его культивирования, заключающейся в том, что в качестве питательной среды используют среду М9 (3-5 г/л глюкозы и 10-20 г кислотного гидролизата казеина (КГК), антибиотик - стрептомицин (Sm) в дозе 20-40 мг/л), в которую дополнительно добавлены 5-10 г/л дрожжевого экстракта (ДЭ), 0.05-0.1 таблетки витаминно-минерального препарата «Centrum» производства фирмы «American Cyanainid Сотр.» USA (BMK). Культивирование проводят при рН 6.7-6.8 с введением в среду дополнительно индуктора генной экспрессии-1,2-изопропил-тио-бета-галактозида (IP'I'G) в дозе 0,1-0.2 8 г/л (0,5 мМ) или лактозы в дозе 6-8 г/л (20 мМ) при поддержании постоянной концентрации глюкозы в среде на уровне 0.01-0.03 г/л и рН 6.7-6.8. Поддержание постоянной концентрации глюкозы и рН осуществляется регулярным введением в ферментер в автоматическом режиме (режиме рН-стата) питательной добавки с рН 6.7-6.8, содержащей следующие ингредиенты (% мас.):

кислотный гидролизат казеина (КГК) - 20-25,

дрожжевой экстракт (ДЭ) - 2-5,

глюкоза (ГЛ) - 20-50,

магний сернокислый семиводный (МГС) 0.1-0.6,

вода дистиллированная до 100 г.

Использование питательной среды и добавок с содержанием ингредиентов вне заявляемых рамок приводит к сокращению выхода целевого продукта или ухудшению условий его выделения.

Основными отличиями заявляемой группы изобретений от аналогов является получение нового более эффективного штамма, введение в среду при его культивировании дополнительных источников витаминов и органического азота - препарата «Centrum» и дрожжевого экстракта, что обеспечивает благоприятные условия для роста данного микроорганизма, а также использование для поддержания рН в ходе индукции ИНТ глюкозосодержащего раствора, обеспечивающего в среде постоянный рН и уровень глюкозы 0.01-0.03 г/л, что не подавляет индукцию синтеза ИНТ при одновременном обеспечении клеток бактерии энергией, необходимой им в ходе биосинтеза (в производстве ИНТ, после индукции, поддержание рН проводят с помощью раствора соляной кислоты). Уровень глюкозы менее 0.01 г/л приводит к снижению выхода ИНТ в связи с нехваткой энергетических ресурсов, уровень глюкозы более 0.03 г/л приводит к снижению выхода ИНТ в связи с подавлением индукции синтеза белка.

Штамм Е. coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hlFN-( 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl] - продуцент рекомбинантного интерферона - 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b человека был получен в результате трансформации реципиентного штамма Е. coli BL21 (DE3), созданной in vitro плазмидой pAYC-ET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl.

Реципиентный штамм Е. coli BL21 (DE3) (F ^- ompTr^- _Bm ^- _Blon; 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> D69^imm21int:: (lacI 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P_lacUV5-T7_gene 1)) получен в лаборатории проф. Студиера (США) [Studier, F.W. and Moffatt, В.A. // Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130] на основе штамма Е. coli BL21 путем введения профага 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> D69^imm21, в котором в область гена int предварительно с помощью технологии генной инженерии была введена искусственная кассета, содержащая нативный ген репрессора лактозного оперона Е. coli (IacI), а также структурная часть гена, кодирующего РНК полимеразу бактериофага T7 (genel, T7) под контролем промотора p_Iacuv5 E.coli. Этот штамм широко применяется в лабораторной практике как специализированный реципиент для обеспечения индуцибельной (при добавлении IPTG) экспрессии генов, транскрибирующихся под контролем промоторов, узнаваемых РНК полимеразой бактериофага T7 (Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorff, J.W. // Use of T7 RNA polymerase to direct the expression of cloned genes. Methods in Enzymology 185 (1990) 60-89).

Рекомбинантная плазмида pAYC-ET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl вводилась в реципиентный штамм Е. coli BL21 (DE3) стандартным методом Са²⁺ - зависимой трансформации клеток (Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T.H Molecular Cloning. A Laboratory Manual. - New York: Cold Spring Harbor, 1989), с последующим отбором целевых трансформантов на агаризованной питательной среде, содержащей стрептомицин (Sm) в концентрации 50 мкг/мл.

Рекомбинантная плазмида pAYC-ET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl была получена по стандартным генно-инженерным методикам (Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T.H Molecular Cloning. A Laboratory Manual. - New York: Cold Spring Harbor, 1989) на основе pAYC32 в качестве вектора. Конструирование pAYC32 на основе плазмиды RSF1010 и ее нуклеотидная последовательность описаны в литературе (Tsygankov, Y.D. and Chistoserdov, A.Y.II Specific-purpose broad-host-range vectors. Plasmid 14 (1985) 118-125; Chistoserdov, A.Y., and Tsygankov, Y.D.ll Broad host range vectors derived from an RSF1010::Tnl plasmid. Plasmid 16 (1986) 161-167).

Генетическая карта исходной плазмиды - RSF1010 приведены на фиг.1. При конструировании pAYC32 для обеспечения транскрипции структурных генов устойчивости к стрептомицину (strA, strB) авторы использовали BamHI-EcoRI - фрагмент хорошо известной векторной плазмиды pBR322 (Balbas, P., Soberon, X., Merino, E., Zurita, M., Lomeli, H., Flores, N. and Bolivar, F. // Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives - a review. Gene 50 (1986) 3-40), содержащий, в частности, часть гена устойчивости к тетрациклину (tet') и промотор, работающий в противоположную сторону - p_anti-tet. Соединение указанного фрагмента ДНК pBR322 с фрагментом ДНК RSF1010 по сайту расщепления EcoRI при конструировании векторной плазмиды pAYC32 привело к тому, что экспрессия генов устойчивости к стрептомицину в составе целевой плазмиды осуществлялась под транскрипционным контролем промотора p_anti-tet-. В составе созданной in vitro рекомбинантной плазмиды pAYC-ET-(hlFN-( 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl был использован BamHI-PstI - фрагмент ДНК плазмиды pAYC32 (длиной 8157 н.п.) (фиг.2 - фрагмент 1), содержащий оперон устойчивости к стрептомицину (strA-strB) под контролем промотора p_anti-tet, а также все известные гены, обеспечивающие репликацию и мобилизацию векторов на основе репликона RSF1010.

Вторым фрагментом (см. фиг.2 - фрагмент 2), использованным при конструировании целевой рекомбинантной плазмиды pAYC-ET-(hlFN-( 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl, являлся Pstl-Apal-фрагмет созданной в лаборатории проф. С.В.Машко (ЗАО «АГРИ», Москва) плазмиды pACYCPIaclacI [8], любезно предоставленной нам авторами. Этот фрагмент ДНК (длиной 885 н.п.) содержал С-концевой фрагмент кодирующей части гена lacl E. coli и высокоэффективный 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -независимый терминатор транскрипции оперона rrnB E.coli. Детали конструирования плазмиды pACYCPIaclacI, структура которой приведена на фиг.3А, представлены в (Каташкина Ж.И. Разработка и использование методов модификации целевых генетических локусов хромосомы E.coli при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот. Автореферат кандидатской диссертации. Москва, ГУП ГосНИИГенетика, 2003). Для ее конструирования предварительно с помощью полимеразной цепной реакции была осуществлена амплификация фрагментов ДНК, несущих структурную часть гена lacl (с заменой нативного инициирующего gtg-кодона на более эффективный - atg) и участок р-независимого терминатора транскрипции оперона rrnB E. coli. В качестве 3'-концевого праймера для амплификации lacl использовали химически синтезированный олигонуклеотид: 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0"> в структуре которого «жирно» выделены нуклеотиды, соответствующие сайту расщепления BamHI, а подчеркнуты нуклеотиды, комплементарные tga-терминирующему кодону амплифицированного гена lacl. Нуклеотидная последовательность амплифицированного фрагмента ДНК, содержащего участок терминации транскрипции оперона rrnB, фланкированный участками расщепления рестриктазами, которые использовались для конструирования рекомбинантных плазмид, представлена на фиг.3Б. Из представленных данных структура Pstl-Apal - фрагмента ДНК (сайт расщепления Apal расположен в кодирующей части гена lacl E.coli) из плазмиды pACYCPIaclacI (Каташкина Ж.И. Разработка и использование методов модификации целевых генетических локусов хромосомы E. coli при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот. Автореферат кандидатской диссертации. Москва, ГУП ГосНИИГенетика, 2003), при конструировании которой соединение 3'-концевой части lacl и Т_rrnB осуществлялось по сайту расщепления BamHI, легко восстанавливается.

Третьим фрагментом (см. фиг.2 - фрагмент 3), использованным при конструировании целевой рекомбинантной плазмиды pAYC-ET-(hlFN-( 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl, являлся Apal-Xbal - фрагмент коммерчески доступной векторной плазмиды рЕТ-22b (+) ("Novagen", США). Этот фрагмент ДНК (длиной 990 н.п.) содержал N-концевой фрагмент кодирующей части гена lacl E. coli с собственным промотором p _lacl, a также искусственную гибридную регуляторную область Т7-O_lac, включающую в себя высокоспецифичный промотор, узнаваемый РНК полимеразой бактериофага Т7, и основной оператор лактозного оперона E.coli.

Четвертым фрагментом (см. фиг.2 - фрагмент 4), использованным при конструировании целевой рекомбинантной плазмиды pAYC-ET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl, являлся Xbal-Bg/ll - фрагмет (длиной 835 н.п.), содержащий химически синтезированный участок, кодирующей области зрелого интерферона- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b человека с дополнительным формил-метиониновым кодоном для обеспечения инициации трансляции в E. coli, фланкированный высокоэффективным участком связывания рибосом, включающим SD- и 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -последовательности гена 10 бактериофага Т7 (Olins, P.O., Devine, C.S., Rangwala, S.H. and Kavka, K.S.H The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene 73 (1988) 227-235; Olins, P.O. and Rangwala, S.H. // A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the facZ gene in Escherichia coli. J.Biol. Chemistry 264, 1989, 16973-16976), на 5'-конце, и тандемом терминаторов транскрипции для РНК полимеразы фага T7 - на 3'-конце. Для создания этого фрагмента первоначально был осуществлен химический синтез структурной части гена, кодирующего зрелый интерферон - 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b-человека с дополнительным формил-метиониновым кодоном на N-конце. При этом для выбора синонимических аминокислотных кодонов при разработке стратегии химического синтеза использовались кодоны, наиболее часто встречаемые в эффективно экспрессирующихся генах E. coli и колифагов, которым соответствуют максимальные концентрации изо-акцепторных тРНК. Введение дополнительного формил-метионинового atg-кодона осуществлялось одновременно с восстановлением уникального участка расщепления рестриктазой Ndel(СА 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> TATG), перед которым был дополнительно расположен сайт расщепления рестриктазой Kpnl для удобства последующего генно-инженерного конструирования. Выбор нуклеотидной последовательности N-терминальной части синтезируемого гена проводился с учетом возможного формирования потенциальных вторичных структур мРНК, синтезируемых с промотора, узнаваемого РНК полимеразой бактериофага T7, и содержащих нуклеотиды участка связывания рибосом гена 10 фага T7 в 5'-нетранслируемой области синтетического гена: выбранная стратегия синтеза исключала возможность формирования будущей мРНК вторичных структур, в которых нуклеотиды кодирующей части гена могли бы участвовать в образовании спиральных участков с элементами 5'-нетранслируемой области, обеспечивающими эффективное взаимодействие с рибосомами при инициации трансляции. Непосредственно за терминирующим кодоном синтетического гена интерферона было запланировано введение уникальных участков расщепления рестриктазами HmdIII и BamHI для удобства последующей интеграции гена в состав плазмидных векторов. Кроме того, в дистальной части кодирующей области гена интерферона было запланировано формирование уникального участка расщепления рестриктазой PstI для удобства рестрикционного анализа плазмид с синтетическим геном как на этапе конструирования промежуточных вариантов, так и целевой плазмиды при ее последующем практическом использовании.

Синтез полноразмерного гена осуществлялся в результате сборки отдельных химически синтезированных олигонуклеотидов с помощью обработки ДНК-лигазой фага Т4 по стандартной методике с последующей амплификацией образующегося фрагмента в результате полимеразной цепной реакции при использовании двух концевых олигонуклеотидов в качестве праймеров и термостабильной ДНК полимеразы (Tag) непосредственно для амплификации. После расщепления продуктов амплификации рестриктазами KpnI и BamHI соответствующий фрагмент ДНК (длиной 526 н.п.) был клонирован в состав репликативной формы ДНК фага M13tg131 (Kieny, M.P., Lathe, R. and Lecocq, J.P. il New versatile cloning and sequencing vectors based on bacteriophage M13. Gene 26 (1983) 91-99), расщепленную теми же рестриктазами. Отбор фаговых ДНК, содержащих синтетический ген со структурой, в точности соответствующей запланированной, был проведен в результате сиквенирования нескольких ДНК, выделенных из независимо отобранных рекомбинантных фагов.

Отобранный рекомбинантный бактериофаг M13-tg131-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b) служил донором репликативной формы ДНК, из которой структурная часть гена, кодирующего зрелый интерферон-a2b с дополнительным формил-метиониновым atg-кодоном, выделялась в виде Ndel˜BamHI-фрагмента и клонировалась в состав имевшейся в нашем распоряжении векторной плазмиды pET-3b-cat-2T _{2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">} , структура и схема конструирования которой детально описаны в (Lebedeva, M.I., Tsyba, N.A., Kotenko, S.V., Epishin, S.M., Lomakin, l.B., Vinetski, Yu.P., Mironov, A.A., Ketlinsky, S.A. and Mashko, S.V.H Efficient expression of human interleukin-la gene in Escherichia coli under the control of a T7 RNA polymerase-derived system. Биотехнология №4 (1993) 18-25). Для этого ДНК рЕТ-3b-са1-2Т _{2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">} также расщеплялась рестриктазами Ndel и BamHI, больший из образующихся фрагментов очищался электрофорезом в геле легкоплавкой агарозе с последующей обработкой векторного и клонируемого фрагмента ДНК лигазой фага Т4 по стандартным методикам. Полученная таким образом рекомбинантная плазмида рЕТ-hlPM- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-2Т _{2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">} содержала в своем составе синтетический ген hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b с дополнительным atg-кодоном перед структурной частью фрагмента, кодирующего зрелый интерферон- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b человека, под транскрипционным контролем промотора, узнаваемого РНК полимеразой фага T7, в 5'-концевой области гена был создан гибридный участок связывания рибосом на основе соответствующей области гена 10 фага T7, а в 3'-концевой части гена был расположен тандем терминаторов транскрипции для РНК полимеразы T7.

Эта плазмида, будучи введенной в клетки реципиентного штамма Е. coli BL21 (DE3), уже обеспечивала эффективную экспрессию гена hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b в условиях индуцированного добавлением IPTG синтеза РНК полимеразы фага T7, ген которой, как уже упоминалось выше, был расположен в хромосоме реципиентного штамма в составе профага под транскрипционным контролем системы лактозного оперона. Однако, для целей последующего практического использования, более стабильного культивирования рекомбинантных бактерий за счет значительного снижения базального уровня синтеза интерферона рекомбинантными бактериями в отсутствие индуктора (без добавления IPTG) (Dubendorff, J.W. and Studier, F.W.i! Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with / ac represser. J. Mol. Biol. 219 (1991) 45-59; Giordano, J., Deuschle, U., Bujard, H. and McAllister, W.T.II Regulation of coliphage T3 and T7 RNA polymerases by the lac repressor-operator system. Gene 84 (1989) 209-219) представлялось целесообразным проведение последующих модификаций. Для этого рекомбинантная плазмида pET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-2Т _{2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">} была использована как донор Xbal-BglII - фрагмента ДНК (длиной 835 н.п.) и содержащего полноразмерный синтетический ген, кодирующий зрелый интерферон - 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b человека с дополнительным atg-кодоном и реконструированным участком связывания рибосом гена 10 фага Т7 - на 5'-конце и фланкированного сайтом узнавания Xbal, а также с тандемом терминаторов транскрипции для РНК полимеразы фага Т7 и фланкированного сайтом узнавания BglII - на 3'-конце.

Таким образом, целевая рекомбинантная плазмида pAYC-ET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl была получена in vitro в результате обработки ДНК лигазой фага Т4 четырех предварительно очищенных электрофорезом в геле легкоплавкой агарозы фрагментов ДНК, образующихся после расщепления четырех исходных плазмид, описанных выше, парами рестриктаз. При этом выбор рестриктаз предусматривал однозначность получения целевой структуры в результате сборки функционально активной рекомбинантной плазмиды: так фрагмент 1, содержащий гены репликации, мобилизации и устойчивости к стрептомицину, соединялся по сайту PstI с фрагментом 2, содержащим С-концевую область гена lacl E.coli и терминатор транскрипции оперона rrnB E. coli, соединение фрагмента 2 с фрагментом 3 по сайту ApaI приводило к восстановлению структуры функционально активного гена lacl и добавляло структуру гибридной промоторно-операторной области - поздний промотор для РНК полимеразы фага Т7-O _lac E. coli в свою очередь - фрагмент 3 соединялся по сайту расщепления рестриктазой Xbal с фрагментом 4 с одновременным введением в состав целевой конструкции гена hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b с тандемом терминаторов транскрипции для РНК полимеразы фага Т7 в 3'-концевой нетранслируемой области, замыкание кольцевой структуры целевой плазмиды происходило за счет соединения ДНК лигазой одноцепочечных «липких» концов фрагментов 4 и 1, образованных в результате расщепления исходных ДНК рестриктазами BglII и BamHI, соответственно - последнее соединение одинаковых по последовательности «липких» одноцепочечных концов в то же время приводило к образованию гибридного - BglII/BamHI - сайта, который не узнается использованными для его создания рестриктазами.

Продуктами конструирования целевой плазмиды при лигировании четырех исходных фрагментов ДНК in vitro была проведена трансформация клеток лабораторного штамма Е. coli TG1 (supE, hsd, thi, 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> (fac-proAB), F' [traD36, proAB+, lacl ^q, lacZ 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> M15]) по стандартной методике (Sambrook J., Fritsch E., Maniatis Т.Н. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. - New York: Cold Spring Harbor, 1989) с селекцией трансформантов на полной агаризованной среде, содержащей стрептомицин (50 мкг/мл). Плазмиды из нескольких независимо отобранных трансформантов были выделены и подвергнуты рестрикционному анализу с помощью рестриктаз, которые ранее были использованы для получения исходных фрагментов. Для всех полученных вариантов этот анализ подтвердил совпадение ожидаемой (фиг.2) и экспериментально полученной структуры. Поскольку целевая структура была получена в результате сборки фрагментов ДНК известной нуклеотидной последовательности, общая организация плазмиды была реконструирована. Одна из полученных плазмид была введена трансформацией в клетки реципиентного штамма E. coli BL21 (DE3), как описано выше, и полученный рекомбинантный штамм E. coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl] исследовался на способность к индуцибельному синтезу рекомбинантного интерферона.

Ночная культура рекомбинантного штамма E. coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hlFN-( 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl], выращенная при 37°С на полной среде LB с добавлением стрептомицина (50 мкг/мл), разводилась 1:100 свежей средой с антибиотиком, и культивирование продолжали до оптической плотности 0D₅₅₀=(0,8-1,0). После этого к части культуры добавляли IPTG до концентрации 1 мМ для индукции синтеза РНК полимеразы фага Т7. Культивирование продолжали в течение 2 часов, при этом наблюдалось замедление увеличения оптической плотности в пробирках с индуцированными бактериями по сравнению с контрольной группой, куда IPTG не добавлялось. После этого клетки осаждали центрифугированием, разрушали кипячением (10 мин) в буфере, содержащем 1% SDS и 5% 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -меркаптоэтанола, раствор осветляли центрифугированием и использовали для анализа клеточных белков дискэлектрофорезом в ПААГ по стандартной методике (фиг.4).

Штамм Е. coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl] характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные прямые палочки с закругленными краями, размером 1.1-1.5×2.0-3.0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Колонии на питательном агаре LB гладкие, слабовыпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную муть. Штамм идентифицирован по Определителю Берги (1974) как штамм вида Escherichia coli.

Физико-биологические признаки. Типичные для Escherichia coli. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Катаболизируют D-глюкозу, L-арабинозу, D-ксилозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, маннит, D-маннозу, L-рамнозу, сорбит, тригаллозу с образованием кислоты (и газа). Не гидролизуют желатину, мочевину, индол (+), триптофандезаминаза (-), лизиндекарбоксилаза (+), рост в присутствии KCN (-), малонат не используют, пигмент не образуют. Реакция «Фогес-Проскауэра» отрицательная. Не образуют Н ₂S. Не растут на цитратной среде «Симмонса».

Генетические особенности. Escherichia coli BL-21 (F^- , ompT, lon, hsd S, gal, r^-m ^-) характеризуется отсутствием lon и ompT протеаз для предотвращения расщепления рекомбинантного белка и признаками, кодируемыми рекомбинантной плазмидой pAYC-ET-(hlFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacl: устойчивостью к стрептомицину (Sm) (в концентрации 50 мкг/мл). Штамм лизогенен по DE3, который содержит ген Т7 RNA pol под контролем lacUV5 промотора (индукторы - IPTG, галактоза; лактоза.). Плазмида имеет размер 10,868 kbp. В результате индукции наблюдается эффективный синтез белка с молекулярной массой, характерной для зрелого интерферона - 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b человека, при этом уровень накопления этого полипептида (по данным компьютерного денситометрирования сканированного геля) составляет 10-20% от суммарных клеточных белков.

Условия хранения штамма. Штамм хранится лиофильно высушенным (до 2 лет), криоконсервированным при -70°С (до 6 месяцев) в 15%-ном растворе глицерина (или 7% растворе диметилсульфоксида) в питательной среде LB (Бакто-триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлористый натрий - 10 г/л, рН 6.8). Условия размножения штамма: Штамм выращивают при 30°С в L-бульоне или среде М9 (г/л: NH₄CI - 1.0, КН₂PO ₄ - З.0, Na₂HPO₄ - 6.0, глюкоза - 4.0, CaCl₂ - 0.01, MgSO₄×7Н₂О - 0.12, рН среды 6,8-7,0). Все среды содержат стрептомицин в концентрации 30 мкг/см.

Условия индукции целевого белка. Индукторы - IPTG, галактоза, лактоза. Основные свойства штамма. Является продуцентом интерферона - 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b, может быть использован для получения медицинских и ветеринарных препаратов на основе рекомбинантного интерферона - 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b.

Биомассу клеток Е. coli BL21 (DE3) [pAYC˜ET-(hlFN-a2b)-lacll, содержащую рекомбинантный 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b интерферон, получают методом глубинного культивирования с использованием ферментационного оборудования, снабженного системой термостатирования, регулируемого перемешивания, рН-статирования, системой автоматической подачи добавки в режиме рН-стата.

Ферментацию проводят в жидкой питательной среде М9 (аммоний хлористый NH₄CI - 1.0 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный КН₂РО₄ - 3.0 г/л, натрий фосфорнокислый Na₂HPO ₄ - 6.0 г/л, натрий хлористый NaCI - 0,5 г/л, магний сернокислый семиводный MgSO₄×7Н ₂О - 0.1 г/л,) содержащую 3-5 г/л глюкозы, 10-20 г кислотного гидролизата казеина, антибиотик - стрептомицин в дозе 20-40 мг/л, в которую дополнительно добавлены 5-10 г/л дрожжевого экстракта, 0.05-0.1 таблетки витаминно-минерального препарата «Centrum», производства фирмы «American Cyanainid Сотр.» (USA). Культивирование проводят при рН 6.7-6.8 с введением в среду дополнительно индуктора интерферона - 1,2-изопропил-тио-бета-галактозида (IPTG) в дозе 0,1-0.2 г/л или лактозы в дозе 6-8 г/л при поддержании постоянной концентрации глюкозы в среде на уровне 0.01-0.03 г/л и рН 6.7-6.8.

Поддержание постоянной концентрации глюкозы и рН осуществлялось регулярным введением в ферментер в автоматическом режиме (режиме рН-стата) питательной добавки с рН 6.7-6.8, содержащей следующие ингредиенты (% мас.):

кислотный гидролизат казеина - 20-25,

дрожжевой экстракт - 10-15,

глюкоза - 20-50,

магний сернокислый семиводный - 0.1-0.6,

вода дистиллированная - остальное.

При проведении процесса во время индукции в ферменте вводится питательная добавка в режиме хемостатного культивирования (режим рН-стата, регулированием уровня рН среды 6,7-6,8 глюкозой). Индукция синтеза ИНТ производилась введением 1,2-изопропил-тио-бета-галактозид (IPTG) 0,12 г/л (0,5 мМ) или лактозы 6,8 г/л (20 мМ) среды культивирования с последующим подключением системы хемостата по глюкозе (глюкоза в составе питательной добавки, как кислотный титрующий агент). При этом концентрация глюкозы в среде поддерживается на уровне 0,01-0,03 г/л., что не подавляет индукцию синтеза рекомбинантного белка.

Состав питательной добавки (на один литр среды культивирования) при индукции IPTG: кислотный гидролизат казеина - 5,0 дрожжевой экстракт - 2,5. глюкоза - 10,0, магний сернокислый семиводный 0-0.13, вода дистиллированная до 20 мл, рН добавки 6,7-6,8.

Состав питательной добавки (на один литр среды культивирования) при индукции лактозой: кислотный гидролизат казеина - 20,0; дрожжевой экстракт - 10; глюкоза - 20.0; магний сернокислый семиводный MgSO₄ ×7H₂O - 0.13; вода дистиллированная до 100 мл (рН добавки 6,7-6,8).

Температуру среды культивирования поддерживают автоматически на уровне 37±0.5°С. Уровень рО₂ 40% (±10) в среде культивирования поддерживают автоматически скоростью оборотов мешалки и объемом воздуха, проходящего через барботажное устройство. Стабилизацию рН на уровне 6,7-6.8 до введения индуктора поддерживают автоматически 25% раствором гидроокиси аммония. Стабилизацию рН на уровне 6,7-6,8 по окончанию питательной добавки производят 10% раствором соляной кислоты. Концентрация биомассы производится методом центрифугирования.

Сущность и преимущества заявляемого изобретения иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Ферментацию клеток Е. coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacI] проводили на жидкой питательной среде состава (г/л): аммоний хлористый NH₄Cl - 1.0; калий фосфорнокислый однозамещенный КН₂PO ₄ - 3.0; натрий фосфорнокислый Na₂ HPO₄ - 6.0; натрий хлористый NaCl - 0,5; глюкоза - 4.0; кальций хлористый CaCl₂ - 0.01; магний сернокислый семиводный MgSO₄ ×7H₂O - 0.13; кислотный гидролизат казеина - 15,0; дрожжевой экстракт - 7,5; препарат «Centrum» - 0,05 таблетки; стрептомицин - 30 мг, рН среды 6,7-6,8.

Температуру среды культивирования поддерживали автоматически на уровне 37±0,5°С. Уровень pO₂ - 40% (±10) в среде культивирования поддерживали автоматически: скоростью оборотов мешалки и объемом воздуха, проходящего через барботажное устройство. Стабилизацию рН на уровне 6,7-6,8 до введения индуктора поддерживали автоматически 25% раствором гидроокиси аммония.

Индукция синтеза рекомбинантного 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b - интерферона производилась введением 0,12 г 1,2 изопропил-тио-бета-галактозид IPTG (0,5 мМ). После чего в ферментер вводили питательную добавку в режиме хемостатного культивирования (режим рН-стата, регулированием уровня рН среды 6,7-6,8 глюкозой), содержащую в г на литр среды культивирования: кислотный гидролизат казеина - 5,0, дрожжевой экстракт - 2,5; глюкоза - 10,0; магний сернокислый семиводный MgSO₄×7H₂O - 0.13; вода дистиллированная - до 20 мл.

Выход биомассы с влажностью 80% составлял 18±3 г с 1 л культуральной жидкости.

Пример 2. Ферментацию клеток Е. coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacI] проводили на жидкой питательной среде состава (г/л): аммоний хлористый NH₄Cl - 1.0; калий фосфорнокислый однозамещенный КН₂РО ₄ - 3.0; натрий фосфорнокислый Na₂ HPO₄ - 6.0; натрий хлористый NaCl - 0,5; глюкоза - 5.0; кальций хлористый CaCl₂ - 0.001; магний сернокислый семиводный MgSO₄ ×7H₂O - 0.13; кислотный гидролизат казеина - 15,0; дрожжевой экстракт - 7,5; витаминно-минеральный препарат «Centrum» 0,1 таблетки; стрептомицин - 40 мг, рН среды 6,7-6,8.

Температуру среды культивирования поддерживали автоматически на уровне 37±0,5°С. Уровень pO ₂ - 40% (±10) в среде культивирования поддерживали автоматически: скоростью оборотов мешалки и объемом воздуха, проходящего через барботажное устройство. Стабилизацию рН на уровне 6,7-6,8 до введения индуктора поддерживали автоматически 25% раствором гидроокиси аммония.

Индукция синтеза ИНТ производилась введением 6,8 г/л лактозы (20 мМ). После чего в ферментер вводили питательную добавку в режиме хемостатного культивирования (режим рН-стата, регулированием уровня рН среды 6,7-6,8 глюкозой), содержащую в г на литр среды культивирования: кислотный гидролизат казеина - 20,0; дрожжевой экстракт - 10; глюкоза - 20,0; магний сернокислый семиводный MgSO₄×7H ₂O - 0.13; вода дистиллированная до 100 мл.

Выход биомассы с влажностью 80% при индукции 20 мМ лактозы составлял 38.5 граммов с 1 литра культуральной жидкости.

Пример 3. В условиях примеров 1 и 2 проводилось культивирование штамма клеток E. coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования, патент № 2303063" SRC="/patents/2054041" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 2b)-lacI] при варьировании состава используемой питательной среды и вводимых добавок. Полученные результаты приведены в таблице.

Таблица
Влияние условий культивирования на выход ИНТ.
Содержание компонентов в питательной среде, (г/л)				Индуктор г/л	Содержание компонентов в добавке, % мас.				Уровень гл, (г/л)	Выход ИНТ, (г/л)
КГК	ДЭ	ГЛ	Sm		КГК	ДЭ	ГЛ	МГС
10	7.5	4	30	IPTG 0.15	25	12.5	50	0.4	0.02	0,48
15	7.5	4	30		25	12.5	50	0.4	0.02	0,6
20	8	4	30		25	12.5	50	0.4	0.02	0,5
15	10	4	30		25	12.5	50	0.4	0.01	0,51
15	5	4	30		25	12.5	50	0.4	0.02	0,48
15	7.5	5	30		25	10.0	50	0.4	0.02	0,49
15	7.5	4	30		25	15	50	0.13	0.02	0,5
15	7.5	3	30		20	15	50	0.1	0.02	0,48
15	7.5	5	20		25	12.5	50	0.3	0.02	0,43
15	7.5	4	40		25	12.5	50	0.6	0.02	0,44
15	7.5	4	30		Без добавки					0,38
15	7.5	4	30	0.1	25	12.5	50	0.4	0.02	0,48
15	7.5	4	30	0.2	25	12.5	50	0.4	0.02	0,55
15	7.5	4	30	Лактоза 7	20	10	20	0.13	0.03	1,3
15	7.5	4	30		20	10	30	0.1	0.02	1,2
15	7.5	4	30		20	15	20	0.1	0.02	1,1
15	7.5	4	30		20	10	20	0.13	0.01	0,96
15	7.5	4	30		Без добавки					0,71
15	7.5	4	30	6	20	15	20	0.1	0.02	1,1
15	7.5	4	30	8	20	15	20	0.1	0.02	1,2

Полученные результаты свидетельствуют о возможности в результате использования заявляемой группы изобретений получения ИНТ с повышенным выходом по сравнению с известными аналогами.