кофейное растение с пониженной активностью -d-галактозидазы

Формула изобретения

1. Клетка кофейного растения, продуцирующая галактоманнаны, включающая нуклеиновую кислоту, которая транскрибируется в рибонуклеиновую кислоту, которая является антисмысловой к мРНК, происходящей из гена -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303018/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, или ее часть, под контролем конститутивного или индуцибельного промотора.

2. Клетка кофейного растения по п.1, отличающаяся тем, что промотор представляет собой кофейный промотор csp1.

3. Кофейное растение, содержащее растительную клетку по любому из предшествующих пунктов.

4. Способ получения растворимого кофе, включающий стадию использования кофейных зерен, полученных из кофейного растения по п.3.

5. Способ повышения растворимости кофе, включающий стадию использования кофейных зерен, полученных из растения по п.3.

6. Применение зерен, полученных из кофейного растения по п.3, для получения растворимого кофе.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к модификации галактоманнанов, находящихся в зеленых кофейных зернах, путем снижения эндогенного уровня активности -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы. В частности, настоящее изобретение относится к растительной клетке с пониженной активностью -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы и к растению, несущему такие растительные клетки.

В кофейных зернах содержание полисахаридов клеточной оболочки составляет примерно 48% сухого вещества зрелых кофейных зерен, из которых на долю маннанов приходится примерно половина. В основном данные полисахариды являются нерастворимыми в очищенной форме и имеют очень низкую степень разветвления галактозы (Bradbury and Haliday, J. agric. Food Chem. 38 (1990), 389-392). Считается, что полимеры маннаны являются основной причиной больших потерь исходной массы зеленого кофе при получении растворимых кофейных напитков. Потери происходят либо когда нерастворимый материал остается в виде осадка во время первоначальной экстракции, либо когда во время хранения кофейного напитка образуются осадки и гели. Также было показано, что маннаны являются основным компонентом, ответственным за помутнение и осаждение кофейных напитков при отстаивании.

Было установлено, что в некоторых растениях степень разветвления галактозы в маннановых цепях частично зависит от активности -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы (ЕС 3.2.1.22). Данный фермент способен высвобождать -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -1,6-связанные галактозные единицы из галактоманнанов в ткани зерен растений при хранении или созревании (Buckeridge and Dietrich, Plant Sci. 117 (1996), 33-43). Кроме того, было показано, что накопление галактоманнанов, имеющих очень низкое значение соотношения галактозы/маннозы в некоторых растительных тканях эндосперма и семидоли, связано с высокой активностью -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы во время созревания данных тканей и с последующим их затвердеванием и высыханием (Kontos and Spyropoulos, Plant Physiol. Biochem. 34 (1996), 787-793).

Также активность -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидаз связывают со способностью удалять остатки галактозы, которые связаны в полисахаридах галактоманнанах -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -1,6-связью, что приводит к снижению растворимости полимеров (McCleary, Carb. Res. 92 (1981), 269-285). Кроме того, удаление боковых цепей галактозы из галактоманнанов, по-видимому, повышает их способность к взаимодействию с другими полисахаридами, например ксантанами в камеди, с сопутствующим образованием сложного геля. Степень разветвления галактозы в маннанах кофейных зерен снижается примерно от 40% в незрелых зернах до низкого уровня, обнаруживаемого в зрелых зернах во время созревания. Одновременно ферментативная активность -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы повышается во время созревания кофейных зерен.

кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы из кофе была клонирована (Zhu and Goldstein, Gene 140 (1994), 227-231). Согласно данному документу -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидаза в зрелых кофейных зернах предпочтительно состоит из 363 аминокислот и синтезируется в виде препрофермента из 420 остатков. После биосинтеза в результате двух расщеплений протеазами удаляется сигнал секреции (38 остатков) и другой сигнальный пептид (19 остатков) с образованием белка, имеющего N-концевую аминокислотную последовательность, характерную для активного фермента.

В свете известного влияния галактоманнанов на получение и/или стабильность при хранении растворимого кофе в данной области техники имеется потребность в совершенствовании данной ситуации.

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение усовершенствованного способа получения растворимого кофе при одновременном устранении недостатков, известных как имеющиеся при хранении кофейного напитка.

Вышеуказанная проблема была решена путем получения клетки кофейного растения и соответственно кофейного растения, где степень разветвления галактозы в галактоманнанах была повышена.

По предпочтительному воплощению данная цель может быть достигнута снижением эндогенного уровня активности -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы. Этого можно достичь обычными методами мутирования и отбора с использованием способов, известных в данной области. Так, растительные клетки можно подвергнуть мутагенным обработкам, таким как воздействие на них химических соединений и облучение, что приводит к изменению клеточной ДНК. Затем обработанные таким образом клетки отбирают на наличие желаемого свойства.

По другому предпочтительному воплощению подобный сниженный эндогенный уровень активности -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы получают введением конструкции в клетку кофейного растения, содержащую нуклеиновую кислоту, которая транскрибируется в антисмысловую копию мРНК, кодируемую геном -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, или ее часть.

С этой целью антисмысловая копия мРНК, кодируемая геном -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, может представлять собой любую рибонуклеиновую кислоту, способную образовать димеры в физиологических условиях, т.е. гибридизоваться с мРНК, кодируемой геном -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы в условиях, преобладающих в клетках. Таким образом, отсутствует необходимость в том, чтобы антисмысловая копия была на 100% гомологична соответствующей копии, а в большей степени требуется обеспечение достаточного связывания с образованием димера. Следовательно, антисмысловые копии (и соответствующие нуклеиновые кислоты, из которых они транскрибируются), которые модифицированы заменой, делецией и/или вставкой нуклеотидов, находятся в контексте настоящего изобретения. В данном отношении также следует понимать, что антисмысловая копия может представлять собой полноразмерную копию мРНК, кодируемую геном -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, т.е. она может обеспечивать молекулу РНК, имеющую в основном ту же длину, что и мРНК, кодирующая полипептид -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы. С другой стороны, антисмысловая копия может охватывать только часть мРНК, кодирующей полипептид -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы.

Нуклеиновая кислота, кодирующая рибонуклеиновую кислоту, антисмысловую к мРНК, кодируемой геном -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, или ее часть, может находиться под контролем конститутивного или индуцибельного промотора так, что уровень антисмысловой РНК может регулироваться традиционным образом. Однако во всех случаях уровень антисмысловой копии должен быть в достаточной мере высоким, чтобы уменьшить число копий мРНК, кодирующей полипептид -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, доступных для рибосом.

По предпочтительному воплощению используемый промотор представляет собой cspl-промотор кофе, который обеспечивает достаточно высокий уровень транскрипции.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает соответственно модифицированную клетку кофейного растения и кофейное растение, где уровень активности -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы снижен таким образом, что в конечном итоге повышается степень разветвления галактозы в галактоманнанах. По предпочтительному воплощению растение является трансгенным растением, клетки которого несут конструкцию, способную обеспечить антисмысловую копию мРНК, происходящей из гена -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, или ее часть.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения растворимого кофе, который включает стадию использования кофейных зерен, полученных из растения, обладающего пониженной активностью -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы. В данном отношении настоящее изобретение также обеспечивает способ повышения растворимости кофе путем увеличения степени разветвления галактозы.

Данное изобретение относится к повышению растворимости галактоманнанов кофе путем увеличения степени разветвления галактозы в них. Принятой стратегией является снижение эндогенного уровня активности -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, предпочтительно введением антисмысловой копии ее кДНК под контролем cspl-промотора кофе.

Данный cspl-промотор уже охарактеризован (Marraccini et al., Plant Physiol. Biochem. 37 (1999), 273-282) и регулирует экспрессию гена, кодирующего запасающий белок 11S кофе. Была сконструирована кассета, включающая данный промотор, и введена в область Т-ДНК бинарного вектора трансформации, полученного из плазмиды pTiT37 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721). Данный рекомбинантный вектор был встроен в Agrobacterium tumefaciens, которую использовали для трансформации эксплантатов кофе. Регенерировали кофейные растения, несущие Т-ДНК, встроенную в их геном, и анализировали на активность -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы в их зернах.

I. Анализ активности -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы в кофейных зернах во время созревания

Собирали плоды на различных стадиях созревания (возраст выражался в неделях после цветения: WAF) Coffea Arabica сорта Caturra Т2308, растущего в теплице (температура примерно 25°С, 70% влажность и естественное освещение). После сбора зерна замораживали в жидком азоте и хранили при -85°С до использования. Для проведения исследований по созреванию отделяли ткани эндосперма и перисперма.

Растительный материал измельчали в жидком азоте и экстрагировали на льду холодным буфером для выделения фермента (глицерин 10% об./об., 10 мМ метабисульфита натрия, 5 мМ ЭДТА, 40 мМ MOPS (NaOH), рН 6,5) при примерном соотношении 20 мг на 100 мкл. Смесь перемешивали на льду в течение 20 мин, центрифугировали (12000 g · 30 мин), разливали на порции и хранили при -85°С до использования. Активность -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы определяли спектрофотометрически, испольуя в качестве субстрата п-нитрофенил- -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактопиранозид (pNGP).

Реакционная смесь содержала 200 мкл 100 мМ pNGP в буфере МакИлваина (100 мМ лимонной кислоты - 200 мМ Na₂HPO₄, рН 6,5) до конечного объема 1 мл с экстрактом фермента. Реакцию проводили при 26°С и начинали добавлением фермента и останавливали добавлением 4 объемов раствора для остановки реакции (100 мМ Na₂CO₃-NaHCO ₃, рН 10,2). Поглощение определяли при 405 нм. Рассчитывали образование нитрофенила с использованием молярного коэффициента экстинкции -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> = 18300 (специфичный для рН 10,2) и превращали в ммоль·мин ^-1·мг белка^-1. Общее содержание белка определяли в пробах, экстрагированных водным буфером, по методу Бредфорда (Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254). Для экспрессии активности каждую пробу экстрагировали и разливали на порции, анализ проводили в трех параллелях, результаты выражали в виде средних значений.

Активность -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы была очень низкой или практически не определялась в незрелых зернах и достигала максимального значения, которое совпадало с покраснением перикарпия. На более поздних стадиях активность снижалась, в то время как зерна оставались по-прежнему красными. Также сравнивали активность в различных тканях кофейного растения. Активность в периспермии, корнях и листьях была особенно низкой и близкой к пределам определения. Однако высокие значения активности обнаруживали в эндосперме, где активность достигала максимального значения примерно через 36 WAF, а также в развивающемся зерне после поглощения воды.

II. Выделение полноразмерной кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы из C. arabica

Несмотря на то, что в литературе имеются данные по нескольким последовательностям кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы кофе, происхождение кофейного материала не указывается. Для установления того, имеются ли различия в аминокислотных и последовательностях нуклеиновой кислоты между С. arabica и C. canephora, было принято решение клонировать кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы из обоих видов.

Библиотеку кДНК Coffea arabica сорта Caturra T2308 конструировали с помощью полиА+мРНК, выделенной через 30 недель после цветения по методу Rogers et al. (Plant Physiol. Biochem., 37 (1999), 261-272). Данную плазмидную библиотеку кДНК (10 нг) тестировали ПЦР с использованием праймеров BETA1 (SEQ ID NO:2) и BETA3 (SEQ ID NO:3), непосредственно расшифрованных из последовательности кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы кофе (Zhu and Goldstein, 1994). Праймер ВЕТА1 расположен между нуклеотидами 177 и 193 в последовательности SEQ ID NO:1. Праймер BETA3 располагается между нуклеотидами 1297 и 1313 в последовательности SEQ ID NO:1. Реакцию ПЦР проводили с ДНК-полимеразой Pfu (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, США) в соответствующем 1×буфере, 0,2 мМ каждого dNTP и 0,25 мкМ каждого из олигонуклеотидов. Температура денатурации, отжига и удлинения составляла соответственно 94°С в течение 30 сек, 46°С в течение 30 сек и 72°С в течение 3 мин. Данный цикл повторяли 30 раз в Robocycler Statagene (США). Продукты ПЦР очищали с помощью картриджа Microcon 100 (Millipore SA, BP307 Saint Quentin Yvelines cedex 78054, Франция) и лигировали в pCR-Script SK (+), как описано Stratagene (США). Затем смесь для лигирования использовали для трансформации штамма E. coli XL1-Blue MRF' и выделяли рекомбинантный вектор, включающий фрагмент -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, и клонировали в сайт SfrI в pCR-Script SK Amp (+). Его последовательность находится между положениями 177 и 1313 последовательности SEQ ID NO:1.

По литературным данным 5'-конец кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы содержит 198 п.н. выше 5'-конца праймера BETA1. Для клонирования данной последовательности этого генотипа заявители проводили дополнительную ПЦР, как описано ранее, с праймерами BETA100 (SEQ ID NO:3) и BETA101 (SEQ ID NO:4). Данную последовательность С. arabica клонировали в вектор pCR-Script Amp SK (+) с получением pLP1, соответствующей SEQ ID NO:1.

Полученная кДНК содержит открытую рамку считывания из 1263 п.н. с началом в положении 51 и концом в положении 1313 последовательности SEQ ID NO:1. Продукт трансляции соответствует последовательности SEQ ID NO:2, на основании чего можно предположить, что -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидаза кофе синтезируется в виде препрофермента с использованием кодона инициации трансляции ATG в положении 51 вместо ATG в положении 126. С другой стороны, анализ кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы, клонированной из C. canephora, показал, что продукт ее трансляции обладает высокой гомологией (сходство >99%) к белку, обнаруженному в С. arabica .

III. Экспрессия гена -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидазы во время созревания зерен

Прослеживали экспрессию гена, кодирующего -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазу в кофейных зернах С. arabica сорта Caturra, собранных на различных стадиях развития, т.е. через 9, 12, 16, 30 и 35 недель после цветения (WAF). Для этого 10 мкг общей фракции РНК данных кофейных зерен денатурировали в течение 15 мин при 65°С в буфере 1×MOPS (20 мМ MOPS, 5 мМ ацетата натрия, 1 мМ ЭДТА, рН 7) в присутствии формамида (50%) и формальдегида (конечная концентрация 0,66 М). Затем материал разделяли электрофорезом в течение 6 ч при 2,5 В/см в присутствии буфера 1×·MOPS в 1,2% агарозном геле, содержащем 2,2 М формальдегида в конечной концентрации.

После разгонки РНК окрашивали бромистым этидием (ВЕТ) по Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, США, 1989, chapter 9.31 to 9.51). Данная процедура позволяет стандартизировать количества, отложенные на геле, от интенсивности флуоресценции рибосомальных 18S- и 25S-РНК. Затем общую фракцию РНК переносили и фиксировали на положительно заряженных нейлоновых мембранах согласно рекомендациям изготовителя Boehrinfer Mannheim (Roche-Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica, Postfach 310120, Mannheim 31, DE). Прегибридизацию и гибридизацию проводили в условиях, описанных выше.

Результаты нозерн-блоттинга показывали пик экспрессии гена на ранней стадии развития эндосперма. Пик экспрессии специфической мРНК в условиях теплицы имеет место примерно через 26 WAF и соответствует началу повышения ферментативной активности. Период максимальной экспрессии мРНК соответствует основному периоду распускания и затвердевания эндосперма в созревающих зернах в данных условиях. Пик экспрессии специфической мРНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы либо совпадает, либо имеет место несколько позднее по сравнению с максимальной экспрессией мРНК запасающего белка 11S зерен. Данные результаты приводили к конструированию антисмысловой кассеты кДНК кофе, кодирующей -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазу, под контролем кофейного промотора 11S для снижения уровня активности -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы в кофейных зернах при созревании.

IV. Конструкция антисмысловой кассеты -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы

Последовательность 11S-промотора (Marraccini et al., Plant Physiol. Biochem. 37 (1999), 272-282) из кофе амплифицировали со специфическим праймером UP210-1, соответствующим последовательности SEQ ID NO:7, и BAGUS2, соответствующим последовательности SEQ ID NO:8. Олигонуклеотид UP210-1 соответствует последовательности между нуклеотидами 24 и 76, опубликованной Marraccini et al., выше, и содержит на 5'-конце синтетическую последовательность CGGGGTACCCCG, включающую сайт рестрикции KpnI и соответствующую последовательности SEQ ID NO:9. Праймер BAGUS2 содержит на 5'-конце синтетическую последовательность CGCGGATCCGCG, соответствующую последовательности SEQ ID NO:10, которая несет сайт рестрикции BamHI. Данный праймер также включает нуклеотиды 998-976 последовательности, опубликованной Marraccini et al. (1999). Данную реакцию проводили в присутствии ДНК-полимеразы Pfu (3 единицы) с 10 нг pCSPP4 (WO 99/02688) в конечном объеме 50 мкл, содержащем 10 мМ KCl, 6 мМ (NH₄)₂SO ₄, 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,1% Тритона Х-100, 2 мМ MgCl ₂, 10 мкг/мл BSA, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,25 мкМ каждого из олигонуклеотидов, описанных выше. Затем реакционную смесь инкубировали в течение 30 циклов (94°С - 60 сек, 55°С - 60 сек, 72°С - 3 мин) с последующим конечным циклом удлинения при 72°С в течение 7 мин.

Фрагменты ПЦР размером примерно 950 п.н. выделяли на картридже Microcon 100 (Millipore, Франция) и лигировали в вектор pCR-Script Amp SK (+) в присутствии ДНК-лигазы Т4 (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin 53711, США), следуя рекомендациям изготовителя. Затем штамм E. coli XL1-Blue MRF' трансформировали полной смесью для лигирования. Отбирали один трасформант и его плазмиду выделяли для секвенирования вставки для определения ориентации фрагмента ПЦР. Проведенный таким образом анализ позволил отобрать плазмиду pLP7.

Более короткий вариант 11S-промотора также амплифицировали с использованием того же подхода, за исключением того, что праймер UP213-1, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:11, замещал праймер UP210-1. Данный праймер соответствует последовательности нуклеотидов 754-777, опубликованной Marraccini et al., выше, и содержит на 5'-конце синтетическую последовательность SEQ ID NO:9. Это приводило к амплификации фрагмента 250 п.н. p11S-промотора кофе, который клонировали, как описано ранее с получением плазмиды pLP8.

Терминатор TNOS амплифицировали, следуя методике, описанной для амплификации р11S-промотора, за исключением того, что использовали праймер TNOS1, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:12, и TNOS2, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:13. TNOS1 включает последовательность SEQ ID NO:10 на 5'-конце. TNOS2 включает последовательность SEQ ID NO:9 на 5'-конце последовательности. Данные праймеры приводили к амплификации последовательности TNOS из промышленно доступного вектора р35SGFP (Clontech Laboratories Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, California 94303-4230, США). Продукт ПЦР клонировали в вектор pCR-Script Amp SK (+), как описано ранее, с получением рекомбинантного вектора, названного pLP32, и его секвенировали для определения его ориентации. Затем данный вектор расщепляли рестриктазой BamHI с удалением последовательности TNOS, которую затем обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 с получением «затупленных» концов.

Затем векторы pLP7 и pLP8 линеаризовали с помощью EcoRI и также обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 с получением «затупленных» концов. Затем TNOS-терминатор клонировали в правильной ориентации в векторах pLP7 и pLP8 с получением соответственно векторов p11STNOS7 и p11STNOS7+.

кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы амплифицировали из ранее выделенного вектора pLP1 в условиях, описанных выше, за исключением того, что использовали праймер BETA100В1, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:14, и BETA101В1, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:15. Данные олигонуклеотиды соответствуют ранее использованным праймерам BETA101 и BETA100, в которые был введен в 5'-концы сайт рестрикции BamHI, соответствующий последовательности SEQ ID NO:10. Продукт ПЦР клонировали в вектор pCR-Script Amp SK (+), как описано ранее, с получением рекомбинантного вектора, названного pLP20.

Данную плазмиду расщепляли рестриктазой BamHI с выделением кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы. С другой стороны, реципиентные векторы p11STNOS7 и p11STNOS7+ независимо расщепляли с помощью той же рестриктазы и дефосфорилировали обработкой CIAP согласно указаниям изготовителя (Promega, США). кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы клонировали в антисмысловой ориентации соответственно в векторы p11STNOS7 и p11STNOS7+ с получением векторов, обозначенных pALPHA1 и pALPHA9.

Для включения данных кассет в бинарный вектор, использованный для трансформации кофейной клеточной суспензии, проводили конечную реакцию ПЦР с ДНК-полимеразой Pfu с использованием праймеров UPSAL1, имеющего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:16, и UPSAL2, имеющего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:17. Оба олигонуклеотида включают сайт рестрикции SalI и последовательности распознавания ДНК вектора pCR-Script Amp SK (+), фланкирующего с ДНК-областями 11S-промотора и NOS-терминатора (TNOS). Кроме того, данный сайт рестрикции отсутствует в последовательности, предназначенной для введения в Т-ДНК бинарной плазмиды. Данные продукты ПЦР вновь клонировали в вектор pCR-Script Amp SK (+), который расщепляли рестриктазой SalI для подтверждения того, что данный сайт рестрикции фланкирован с кассетами. Полученные плазмиды были названы соответственно pALP414 и pALP50 и происходили соответственно от pALPHA1 и pALPHA9.

V. Клонирование антисмысловой кассеты -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы в бинарный вектор трансформации

Кассеты -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы, находящиеся в векторах pALP414 и pALP50, секвенировали для подтверждения их целостности, в частности для подтверждения отсутствия точечных мутаций или перестроек, которые могли иметь место во время проведения циклов амплификации ПЦР. Затем данные кассеты очищали расщеплением векторов pALP414 и pALP50 рестриктазой SalI и независимо клонировали в плазмиду, производную pBin19, схожую с вектором, описанным Leroy et al. (Plant Cell Rep. 19 (1999), 382-389), за исключением того, что отсутствовал ген crylAc. Для выполнения этого вектор расщепляли рестриктазой SalI, которая распознает уникальный сайт между генами uidA и csrl-1, и дефосфорилировали. После данного лигирования отбирали векторы pBIA121, pBIA126 и pBIA9. В векторе pBIA121 кассету SalI, полученную из pALP414, клонировали в ориентации [LB] Gus-интрон > p11S (длинная) антисмысловая кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы > csrl-1 [RB]. Однако ту же кассету клонировали в обратной ориентации в вектор pBIA126. С другой стороны, кассету SalI, полученную из pALP50, клонировали в векторе pBIA9, в следующей ориентации: [LB]Gus-интрон > p11S (короткая) антисмысловая кДНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы > csrl-1 [RB].

VI. Трансформация Agrobacterium tumefaciens

Бинарные векторы трансформации pBIA121, pBIA126 и pBIA9, описанные выше, независимо вводили в штамм Agrobacterium tumefaciens LBА4404 без «плеч» c использованием метода прямой трансформации, описанного An et al. (Plant Mol. Biol. Manuel, Gelvin, Schilperoort and Verma Eds, Kluwer Academic Publishers Dordrecht, Нидерланды, A3 (1993), 1-19). Для каждой трансформации отбирали рекомбинантные клоны Agrobacterium tumefaciens на среде LB с добавлением канамицина (50 мкг/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и рифампицина (50 мкг/мл).

Для проверки структуры введенных в Agrobacterium tumefaciens плазмид их выделяли экспрессивным минипрепаративным методом и затем анализировали рестрикционным картированием после обратной трансформации в штамме E. coli XL2 Blue MRF'.

VII. Трансформация Coffea sp.

Культивировали эксплантаты листьев и субкультивировали каждые пять недель в течение 3-5 месяцев, пока не появлялись соматические зародыши по краю эксплантатов. Соматические зародыши собирали на стадии покоя, надрезали стерильным скальпелем и замачивали в течение двух часов в 0,9% растворе NaCl, содержащем рекомбинантный штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404 до OD _{600 нм} 0,3-0,5. Проводили совместное культивирование в темноте на полутвердой среде MS без гормонов в течение трех суток и затем отмывали в жидкой среде MS, содержащей цефотаксим (1 г/л) в течение 3-5 ч при постоянном, но мягком встряхивании. Зародыши культивировали на полутвердой среде с 5 мкМ ВАР, 90 мкМ сахарозы в присутствии цефотаксима (400 мг/л) при низкой освещенности (период освещения 16 ч в день). Через 3-4 недели их переносили на селективную среду MS с добавлением цефотаксима (400 мг/л) и хлорсульфурона (80 мг/л). Затем их переносили каждый месяц на свежую селективную среду до регенерации каллусов. Трансформированные зародыши, растущие вокруг каллусов, затем культивировали на полутвердой среде MS с витаминами Morel (1 мкМ ВАР и 30 мкМ сахарозы) для индукции их роста. После данной стадии их переносили на среду для укоренения, соответствующую среде, описанной выше, но без ВАР.

Для проверки эффективности трансформации каллусы, веточки, корни и листья регулярно тестировали на экспрессию uidA-репортера с помощью гистохимического метода GUS (Jefferson et al., J. EMBO 6 (1987), 3901-3907).

После данной процедуры отбирали несколько отдельных растений и размножали в условиях in vitro с помощью микрочеренков. Некоторые из них переносили в теплицу для достижения развития. Морфологических аномалий не наблюдали.

VIII. Анализ соматических зародышей из трансформированных кофейных растений

Соматические зародыши также индуцировали из эксплантатов листьев для детектирования присутствия антисмысловой мРНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы. В соматических зародышах детектировали запасающий белок 11S кофе (Yuffa et al., Plant Cell Rep. 13 (1994), 197-202), на основании чего можно было предположить, что cspl-промотор активен в данной ткани. Если это так, то анализ соматических зародышей, полученных из листьев молодых трансгенных кофейных растений, позволит определить наличие антисмысловой мРНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы раньше, чем в зернах.

Из 100 мг трансформированных соматических зародышей выделяют общую фракцию РНК, как описано ранее, и тестировали ОТ-ПЦР с использованием набора Access RT-PCR system (Promega, США). Вначале подтверждали присутствие специфической мРНК 11S осуществлением ОТ-ПЦР с использованием праймеров, расположенных в кодирующей последовательности 11S-кДНК. Данную процедуру проводили с использованием праймера SO11, соответствующего последовательности SEQ ID NO:18, и SO2-1, соответствующего последовательности SEQ ID NO:19. Праймер SO11 соответствовал последовательности между нуклеотидами 1035 и 1059 последовательности, опубликованной Marraccini et al., выше. С другой стороны, праймер SO2-1 соответствовал последним 24 нуклеотидам в опубликованной последовательности. Синтез первой цепи кДНК (стадия обратной транскрипции) проводили, как описано изготовителем (45 мин, 48°С). Для реакции ПЦР использовали следующие параметры: 45 циклов (60 сек при 94°С на стадии денатурации, 90 сек при 52°С на стадии отжига, 4 мин при 68°С на стадии удлинения) с конечным удлинением при 68°С в течение 7 мин.

В результате этого опыта получали продукт ПЦР из 1590 п.н., соответствующий последовательности 11S-кДНК, фланкированной праймерами SO11 и SO2-1. Данные подтверждали, что мРНК 11S отсутствовала во всех тестированных тканях, т.е. корнях, листях, цветах, но имелась в высокой концентрации в соматических зародышах Coffea canephora, а также в зернах через 27 WAF.

Второе, тестировали присутствие смысловой мРНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы осуществлением ОТ-ПЦР с использованием только праймера В33, соответствующего последовательности SEQ ID NO:21, во время стадии обратной транскрипции (условие 1). Данный праймер соответствовал комплементарной последовательности из нуклеотидов 1286-1314 последовательности SEQ ID NO:1.

Параллельно проводили детектирование антисмысловой мРНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы с использованием только одного праймера В11 во время стадии обратной транскрипции (условие 2). Данный праймер соответствует последовательности между нуклеотидами 50 и 78 последовательности SEQ ID NO:1. После данной обратной транскрипции (45 мин, 48°С) реакционную смесь обрабатывали при 94°С в течение 1 мин для дезактивации обратной транскриптазы MMLV. Добавляли недостающий олигонуклеотид В11 при условии 1 и В33 при условии 2 и реакцию продолжали ПЦР: 45 циклов (60 сек при 94°С на стадии денатурации, 90 сек при 45°С на стадии отжига, 4 мин при 68°С на стадии удлинения) с конечным удлинением при 68°С в течение 7 мин. С использованием соматических клеток из нетрасформированного С. arabica обнаруживали продукт амплификации размером 1310 п.н. при условии 1, но не при условии 2. Однако в соматических зародышах, полученных из кофейных ростков, трансформированных вектором pBIA9, можно было детектировать продукт амплификации при опытном условии 2, что подтверждает присутствие антисмысловой мРНК -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="/images/patents/166/2303349/2303349-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидазы.

Список последовательностей приведен в конце описания.

-d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0"> -d-галактозидазы, патент № 2303349" SRC="" height=100 BORDER="0">