способ получения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга млекопитающих и популяция мезенхимальных стволовых клеток, полученная этим способом

Формула изобретения

1. Способ получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из костного мозга млекопитающих, включающий выделение их с помощью центрифугирования и выращивание в культуральной среде, отличающийся тем, что жизнеспособные клетки с однородностью по фенотипу на 87-99,9% выделяют на границе сред ДМЕМ - фиколл на второй стадии обработки исходного материала после центрифугирования в течение 25-60 мин наслоенной на фиколл суспензии клеток гепаринизированного пунктата костного мозга в ДМЕМ при скорости 1000-2000 об/мин, выращивание клеточной массы осуществляют из полученных МСК в стандартной посуде с использованием среды ДМЕМ с добавлением 15-22% FBS путем высева клеток с плотностью 75-200 клеток на 1 см² и с продолжительностью инкубирования 18-52 ч.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточную массу в количестве 1,5-3·10⁶ до 1,5-3·10 ⁷ клеток на 1 мл исходного костного мозга получают в результате трех пассажей.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование осуществляют в фиколле плотностью 1,077 г/л или 1,115 г/л при температуре 18-23°С.

4. Популяция мезенхимальных стволовых клеток для трансплантации, полученная по способу п.1, характеризующаяся тем, что на 87-99,9% является жизнеспособной и однородной по клеточным маркерам CD 44+, CD 90+, CD105+, CD106+, CD 45-, CD 34-.

5. Популяция по п.4, отличающаяся тем, что костный мозг используют из грудины или крыла подвздошной кости таза.

6. Популяция по п.5, отличающаяся тем, что костный мозг является донорским.

7. Популяция по п.5, отличающаяся тем, что костный мозг является аутологичным.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и биофармакологии и касается получения из костного мозга человека культуры мезенхимальных стволовых клеток однородной клеточной популяции. Изобретение может найти применение в медицине для лечения различных заболеваний. При использовании по изобретению костного мозга животных (млекопитающих) оно может применяться в ветеринарии.

В настоящее время клеточная терапия приобрела большое значение. Путем трансплантации стволовых клеток лечат остеопороз (Патент РФ №2265442 от 10.12.2005), аллергические заболевания (Патент РФ №2250773 от 27.04.2005), паркинсонизм (Патент РФ №2259836 от 10.09.2005), травму головного мозга (Патент РФ №2216336 от 20.11.2003), онкологические заболевания (Патент РФ №2257219 от 27.07.2005) и иные болезни.

Стволовые клетки подразделяются на мезенхимальные (они способны дифференцироваться в клетки тканей мезодермального происхождения), гематопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной системы) и другие. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) часто используют в роли трансплантата, т.к. они активизируют собственные резервы организма, способствуют образованию цитокинов и факторов роста; МСК являются предшественниками остеобластов и способствуют формированию ремоделирующих единиц.

МСК получают обычно из костного мозга, хотя их можно выделять из фетальных органов гемопоэза, из скелетных мышц, из подкожной жировой ткани. Выделение и культивирование МСК относительно несложно, но существует проблема получения однородной клеточной популяции мезенхимальных стволовых клеток в достаточном количестве для трансплантации и консервации впрок. По известным методикам выращивания МСК из костного мозга обычно получают гетерогенные популяции клеток стромы с незначительным содержанием в них стволовых клеток. В работе с МСК используют традиционные методики работы с клетками (Культура животных клеток. Методы. Под ред. Р.Фрешни. М.: Мир. 1989 г.), в каждом случае подбирая индивидуальную последовательность действий, условия выделения и наработки клеточной массы.

При использовании костного мозга в качестве источника МСК обращает на себя внимание следующее: при заборе костного мозга в пунктат попадает периферическая кровь, в результате этого выделенная популяция клеток МСК часто бывает гетерогенной. Объясняется это тем, что в первичной культуре присутствовали эндотелиальные и гладкомышечные клетки. В процессе культивирования в среде ДМЕМ (среда Игла в модификации Дюльбекко) с добавлением фетальной бычьей сыворотки примесь миоцитов сохраняется.

МСК реально получают из донорского, аутологичного или фетального материала. МСК из донорского костного мозга могут быть заготовлены заранее, как и из фетального. МСК (клеточную культуру после наработки клеточной массы) хранят путем криоконсервации.

Источник МСК играет определенную роль в последующем использовании клеток при лечении больных («Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток», А.Г.Румянцев, А.А.Масчан. - Медицинское информационное агентство. М. - 2003 г. - 912 с.)

Аутологичные клетки имеют преимущество, т.к. представляют собой фракцию высокоочищенных собственных стволовых клеток. Выращенные в культуральной среде аутологичные мезенхимальные стволовые клетки (АМСК) при введении больному безопасны, т.к. это собственные клетки, благодаря чему исключается возможность аллергических реакций. Большое количество вводимых клеток дает выраженный лечебный эффект.

Хотя аутогенные клетки предпочтительны, у них есть ограничения: клетки от тяжелобольных и от очень пожилых людей обладают низкой способностью к пролиферации и самообновлению.

Наилучшим материалом для наработки трансплантантных МСК является фетальный материал, т.к. клетки обладают выраженной способностью к дифференцировке, более активны функционально, обладают большим потенциалом пролиферации и роста, продуцируют факторы регенерации и роста; при пересадке они стимулируют ангиогенез. Остальные клетки лучше переносят гипоксию. Однако использование фетальных клеток связано с этическими проблемами и с труднодоступностью исходного материала.

Известен способ получения МСК для имплантации с целью направленной остеорегенерации (Патент РФ №2210352 от 20.08.2003). Была выращена гомогенная (не менее 80%) популяция плюрипотентных МСК, полученных путем дезагрегации ткани-источника МСК с последующим ресуспендированием суспензии и культивированием на ростовой среде. Недостатком метода является получение в результате гетерогенной популяции недифференцированных МСК.

Известен способ получения биотрансплантанта для лечения остепороза (Патент РФ №2265442 от 10.12.2005), состоящего из клеток МСК. В процессе получения МСК осуществляют ферментативную дезагрегацию, фильтрацию через мелкоячеистое сито, центрифугирование в солевом растворе Хенкса, ресуспендирование в ростовой среде ДМЕМ/F12, содержащий 15% эмбриональной телячьей сыворотки и глутамин. Посев осуществляют на пластиковые чашки Петри при удалении через 1 сутки неприкрепившихся клеток. Инкубирование проводят при 37°С в атмосфере 5% СО ₂ с последующей трипсинизацией и пересевом культуры. В результате нескольких пересевов получают культуру клеток МСК с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке, но эта культура является гетерогенной клеточной популяцией, не охарактеризованной фенотипированием.

Известен способ получения МСК, основанный на способности клеток прикрепляться к поверхности посуды, в которой выращивают культуру клеток (Bone, 1995, vol.13, p.81-95). В процессе используют бычью эмбриональную сыворотку (ее отобранные лоты). Были получены клетки с высокой адгезивной способностью, скоростью пролиферации и временем сохранения мультипотентности. К недостаткам этого способа относится трудоемкость анализа бычьей сыворотки, применяемой для выращивания клеток, но главное - плохая воспроизводимость метода, из-за чего наблюдается большой разброс результатов получения МСК.

Известна работа Majumdar М. К. et al. (J. Cell. Physiol., 2000, Oct., 185(1), p.98-106). Она посвящена выделению, характеристике и хондрогенному потенциалу мультиплетных стромальных клеток, полученных из костного мозга человека. Клетки выделяли, используя экспрессию эндоглина. Их выращивали in vitro в среде без сыворотки, в присутствии трансформирующего фактора роста-бета (TGF-beta), применяя для роста трехмерные матриксы альгинатных шариков. Клетки охарактеризованы маркером CD 34+. Работа является узкоспецифической, не прикладной.

Известна статья Feldmann R.E. et al. (Electrophoresis, 2005, v.26, п.14, р.2749-2758), в которой наиболее полно охарактеризованы по фенотипу МСК. Там использован дополнительный маркер МСК CD106+. Источник МСК - пуповинная кровь, поверхность культуральной посуды проходила предобработку, а инкубацию клеток проводили в специальной коммерческой среде MSCGM medium (MSCGM Cell Systems, St. Katharinen, Germany), высевая клетки в высокой плотности 1·10 ⁶/см².

Известен способ получения МСК из костного мозга человека, по которому выделяли мононуклеарные клетки путем центрифугирования в градиенте фиколла с последующей селекцией на антитела к поверхностному антигену CD 105 ⁺, экспрессирующемуся на поверхности МСК. Клетки отбирали по адгезии МСК на пластике, затем осуществляли их культивирование (J. Cell. Physiol. 2000. vol.185. p.98-106). В результате была выделена фракция клеток CD 105⁺, обогащенная МСК. Выход клеток не был высоким, а способ оказался достаточно затратным.

Клеточная масса, полученная из костного мозга реципиента, содержит (в пунктате) не более 1-3% стволовых клеток, т.е. клеток с полипотентными свойствами, а основную часть пунктата при заборе составляет периферическая кровь. Из-за этого необходимы методики наработки однородной по фенотипу массы МСК, пригодной для использования в медицинских целях, выращенной в необходимых для лечения количествах (80-100 млн. клеток на процедуру), полученной с минимумом затрат времени и финансов, с минимальным травмированием реципиента.

Различные источники МСК подразумевают и разную обработку исходного биоматериала: жировая ткань, пуповинная кровь, фетальный материал, костный мозг. Условия выделения МСК для дальнейшего культивирования и условия наработки нужной клеточной массы зависят от состава культуральной среды, условий посева и культивирования, посуды и т.д.

Наиболее близким к изобретению - по достигнутому результату - является способ выделения мезенхимальных стволовых клеток по патенту РФ №2252252 от 20.05.2005 г. Ткани человека по этому способу измельчают, обрабатывают раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, центрифугируют, после чего полученную суспензию очищают от эритроцитов с помощью лизирующего раствора с последующей последовательной фильтрацией через фильтры с разным размером пор. Выращивают клетки посевом во флаконы. Клетки получают однородными, с высоким выходом, клетки жизнеспособны. Выход 10⁶/1 г ткани. Недостатком метода является многоступенчатость очистки, связанная с исходным материалом для выделения МСК, это - жировая ткань или плацента. Только на 4-ом пассаже авторы получают однородные клетки, соответствующие иммунофенотипу МСК: CD 13+, CD 44+, CD 90+, CD105-, CD 31-, CD 45-, CD 117-.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является получение высокой однородности клеточной популяции мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга человека различного возраста, причем получение их с минимальными затратами времени, энергии, материалов.

Техническим результатом изобретения является оптимизация процесса выделения клеток МСК высокой однородности из костного мозга реципиента и ускорение этого процесса. Упрощение и удешевление получения культуры МСК в необходимых для прикладных целей количествах связано с низкой плотностью высева клеток, что отличает данный способ от известных, а также то, что не используется специальная посуда и специальная среда. Условия получения культуры МСК подобраны так, чтобы минимизировать воздействие на клетки химических веществ, т.е. не подвергать клетки отрицательному влиянию реактивов. Клетки МСК получены по заявляемому способу жизнеспособными, они охарактеризованы 6 маркерами по фенотипу CD 44+, CD 90+, CD105+, CD106+, CD 45-, CD 34-, выход однородных клеток до 99,9%.

Выход клеток составляет от 1,5-3·10⁶ до 1,5-3·10 ⁷ на 1 мл исходного материала, т.е. костного мозга. Таким образом, первичный материал использован максимально полно, потери минимизированы.

Подобраны оптимальные условия культивирования МСК in vitro, в результате чего процесс накопления клеточной массы занимает от 7 до 9 суток и количество проводимых операций сведено к минимуму.

Сущностью данного изобретения является выделение однородной на 80-99,9% клеточной фракции на второй стадии (стадии селекции) после получения обогащенной культуры МСК из дезагрегированного костного мозга. Выделение МСК осуществляют с помощью центрифугирования в течение 25-60 минут при скорости 1000-2000 об/мин в фиколле. Дальнейшее культивирование собранной на границе сред популяции клеток производят путем пассирования на матрасах при контроле посевного материала по ошариванию клеток и при контроле полноты снятия клеточной массы, охарактеризованной методами иммунофенотипирования как МСК. Культуральная среда состоит из питательной среды ДМЕМ с 15-22% FBS.

Изменение параметров проведения заявляемых процедур в сторону увеличения или уменьшения не может привести к указанному техническому результату изобретения, т.к. при этом наступает резкое снижение выхода МСК, нарушается однородность суспензии клеток. Снижение температуры фиколла до +10°С приводит к потере градиента, а увеличение температуры повышает токсические свойства фиколла.

Уменьшение времени и скорости центрифугирования приводит к потере кольца мононуклеарной фракции костного мозга, и тем самым снижает суммарный выход продукта на 25-30%. Это видно из диаграммы на фиг.1 по оси ординат - количество МСК на 7-ой день культивирования клеток. Показатель 1 - клетки, полученные из мононуклеарного кольца, образованного при центрифугировании в течение 30 минут при 1000 об/мин. Показатель 2 - клетки, полученные из массы, не являющейся четким мононуклеарным кольцом, т.е. при потере кольца, когда посевной материал выделен центрифугированием в течение 20 минут при 500 об/мин.

Изменение среды культивирования МСК в сторону уменьшения составляющей сыворотки или изменению питательной среды, например, на RPMI, приводит к увеличению сроков нарастания клеточного материала до 3-х месяцев. Данные представлены на фиг.2. По оси ординат - количество клеток, по оси абсцисс - дни роста.

На данной диаграмме представлены результаты анализа роста клеточных культур МСК в различных условиях. чМСК - МСК человека.

1. чМСК - стандарт, усредненные данные, полученные при использовании методики патента.

2. чМСК - 10% сыворотки, усредненные данные, полученные при использовании 10% фетальной сыворотки.

3. чМСК - 5% сыворотки, усредненные данные, полученные при использовании 5% фетальной сыворотки.

4. чМСК - RPMI, усредненные данные, полученные при использовании среды RPMI.

Из диаграммы видно, что методика оптимальна и отличия достоверны.

При сравнении заявляемого способа с прототипом, где выделение клеток также осуществляли центрифугированием, следует отметить, что однородную по фенотипу популяцию клеток МСК по заявке получали практически сразу, центрифугируя в фиколле суспензию гепаринизированного пунктата костного мозга в ДМЕМ. Уже на стадии выделения клеток на границе сред ДМЕМ - фиколл «пенка» содержит однородные клетки МСК, охарактеризованные шестью маркерами: CD 45-, CD 34-, CD 90+, CD106+, CD 44+, CD105+. Таким образом, популяция клеток МСК по заявляемому изобретению отличается от прототипа более полной, более четкой дифференцировкой: наличие маркера CD106+ - дополнительная характеристика однородности МСК.

Также в изобретении обработка посуды не являлась необходимой, используемая среда доступна, стандартна, широко применяется, не является специальной, плотность высева МСК 75-200 клеток на см², срок инкубации 56-72 часа. Таким образом, конечный продукт получается по изобретению ощутимо дешевле, с высоким выходом и однородностью.

Работая с клетками МСК реципиента-человека, выделенными из костного мозга, авторы изобретения не обрабатывали клетки химическими реагентами, чтобы минимизировать отрицательное воздействие на клетки.

Способ по изобретению осуществляют следующим образом. Костный мозг человека получают путем пунктирования из грудины (5-10 мл) или из крыла подвздошной кости таза (15-30 мл) в условиях малой операционной под местной анестезией. Пунктат смешивают с гепарином (500 ЕД) и помещают в стерильный контейнер с герметической крышкой (объем 25 мл или 50 мл). 10 мл костного мозга разводят до 30 мл стерильной питательной средой ДМЕМ (минимальная среда Игла в модификации Дюльбекко). Этот образец помещают, не допуская перемешивания, в пробирку с 20 мл подогретого до комнатной температуры (18-23°С) фиколла (плотность 1,077 или 1,115 г/л). Пунктат, наслоенный на фиколл, центрифугируют в течение от 25 до 60 минут при 1000-2000 об/мин, после чего отбирают клеточную фракцию на границе фиколла и верхний слой супернатанта. Объясняется это тем, что на границе сред образуется белое кольцо, представляющее собой моноцитарную фракцию костного мозга, а на поверхности супернатанта находятся оставшиеся кусочки костного мозга.

Клеточную суспензию разбавляют эквивалентным или двукратным объемом среды ДМЕМ, содержащей антибиотики (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл), и осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин. Клетки суспендируют в среде ДМЕМ, дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS, fetal bovine serum), антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл) и снова осаждают центрифугированием в том же режиме. Клеточный осадок и верхний слой пренатанта переносят в посуду для культивирования и покрывают средой культивирования, содержащей ДМЕМ с добавлением 15-22% FBS и антибиотиков. Высев клеток производят с начальной плотностью 75-200 клеток на см² и помещают в СО₂ инкубатор на 18-52 часа. Затем тщательно отбирают среду культивирования, а клеточную культуру дважды промывают раствором Хенкса и покрывают свежей средой культивирования, подогретой до +37°С. Культуру помещают в CO ₂ инкубатор на 56-72 часа, ежедневно наблюдая за ростом культуры; при необходимости, осуществляют замену половину объема кондиционированной среды культивирования на равный объем свежеприготовленной среды. Культуру пересевают с применением раствора трипсина на новую посуду с плотностью 1-2·10³ клеток на 1 см². Культуру помещают в CO ₂ инкубатор на 56-72 часа. Осуществив от 2 до 4 пассажей, получают популяцию клеток, характеризующуюся высокой однородностью по положительным маркерам (CD 90, CD 105, CD 106 и CD 44) - маркерам МСК. Выход составляет до 99,9% окрашенных клеток.

В процессе пересева и выращивания культуры количество снятых с матраса клеток подсчитывают с помощью камеры Горяева. Для этого суспендируют клеточный смыв, заполняют полученной суспензией камеру Горяева, подсчитывают количество клеток в 25 больших квадратах.

Подсчет клеток производят по формуле

к×400×1000= кл/мл,

где к - сумма клеток в 25 больших квадратах, кл/мл - количество клеток в 1 мл клеточной взвеси. До подсчета культивируемые клетки промывают раствором Хенкса, затем раствором трипсина, после чего помещают матрас на 1-3 минуты в СО ₂ инкубатор с визуальным контролем за ошариванием клеток. При ошаривании не менее 80% клеток клетки смывают с матраса теплой (t°=+37°С) средой культивирования. При площади матраса 175 см² объем используемой среды равен 10 мл. После подсчета количества клеток, снятых с матраса, осуществляют следующий пассаж. Оценку качества МСК осуществляют с помощью антител FITC, РЕ, biotin, Су, со стрептовидином ECD и с иодидом пропидия (PI). Определили клетки с фенотипом CD 45- CD 34-, CD 90+, CD 106+, CD 44+, CD 105+, которые являются мезенхимными. Клетки, непрокрашенные иодидом пропидия, являются жизнеспособными.

Методика оценка качества МСК следующая. В стерильных условиях отбирают 1-1,2 млн. клеток в объеме 250 мкл. Перемешав суспензию в пробирке с помощью автоматизированной пипетки, переносят по 50 мкл ее в микропробирки, маркированные цифрами от 1 до 5. Используя автоматическую пипетку, в пробирки вносят антитела в соответствии с таблицей №1:

Таблица №1 Фенотипирование МСК
№ пробирки	Антитела FITC	Антитела РЕ
1	Изотип контроль и CD 45
2	CD 45	CD 34
3	CD 71	CD 34
4	CD 45	CD 90
5	CD 45	CD 106

Антитела вносят по 10 мкл, в соответствии с инструкцией по их применению. Содержимое пробирок перемешивают пипетированием и инкубирует 25 минут при t°=20-22°C (комнатная t°) в темном месте, без света. Добавляют в каждую пробирку по 1 мл раствора Хенкса и центрифугируют при ускорении 400 об/мин в течение 5 минут. Удаляют из пробирок супернатант. В пробирки №1 и №2 вносят 2,5 мл стрептавидина ECD, перемешивают и инкубируют, как выше, 15 минут, затем вносят туда 1 мл раствора Хенкса, снова центрифугируют 5 минут при ускорении 400 об/мин, удаляют супернатант. Ресуспендируют клеточную суспензию в 400 мкл раствора Хенкса. Полученную клеточную взвесь перемешивают пипетированием.

В пробирку №4 вносят 0,5 мкл иодида пропидия, перемешивают на вортексе, затем пробирку инкубируют 5 минут в темноте при комнатной температуре. Прокрашенную клеточную суспензию анализируют в проточном цитофлуориметре EPICS XL (Beckman, Coulter, USA) или аналогичном.

Пример выполнения изобретения

Пример 1. МСК человека

Из грудины, под местной анестезией, пунктировали 10 мл костного мозга в шприц, стерильный, содержащий 500 ЕД гепарина.

Пунктат для дальнейшей работы перенесли в стерильный контейнер, представляющий собой пробирку объемом 50 мл с герметической крышкой. Процедуру фракционирования костного мозга (фенотипировали костный мозг) осуществляли в стерильных помещениях, в ламинарном шкафу 2-ого класса защиты, Kajar.

К полученному пунктату прибавили стерильную питательную среду ДМЕМ, доведя объем образца до 30 мл.

В стерильную пробирку на 50 мл поместили 20 мл фиколла (плотность 1,077 г/л) и, не допуская перемешивания сред, на фиколл наслоили 30 мл пунктата. Эту пробирку поместили в центрифугу с бакет ротором. Пунктат центрифугировали 40 минут на скорости 1500 об/мин при температуре t°=20-22°С (комнатная температура). Отобрали клетки, находящиеся на границе сред (образовалось специфическое белое кольцо, представляющее собой моноцитарную фракцию костного мозга), и собрали оставшиеся на поверхности супернатанта кусочки костного мозга.

Собранный материал поместили в стерильную пробирку и к нему добавили питательную среду ДМЕМ, объем которой в 2 раза больше объема отобранного материала.

Центрифугировали полученную суспензию в течение 5 минут на скорости 1500 об/мин при комнатной температуре.

Супернатант удалили, к осадку прибавили 12 мл среды культивирования, состоящей из ДМЕМ, 80%, и из сыворотки плодов коровы, 20%.

Суспензию клеток перенесли на матрас для культивирования площадью 75 см². Его поместили в СО₂ инкубатор на 48 часов. После эксплантации из матраса тщательно отобрали среду культивирования с оставшимися в суспензии клетками. Промыли матрас раствором Хенкса, 10 мл. Под инвертированным микроскопом оценили эффективность отмывки по количеству оставшихся в суспензии клеток (гемопоэтических клеток). В матрас для культивирования добавили подогретую до +37°С среду культивирования (80%, ДМЕМ, 20% сыворотки плодов коровы), объем 12 мл, после чего матрас поместили в СО ₂ инкубатор на 3 дня. За ростом культуры наблюдали ежедневно, осуществляя кормление культуры путем замены 6 мл кондиционированной среды на 6 мл свежеприготовленной.

На 3-й день культивирования с помощью инвертированного микроскопа оценили проективное покрытие матраса клетками первичной культуры костного мозга. Оно составило более 80%, поэтому произвели пересев культуры на матрас большей площади, площадь его 175 см². Пассаж 1 (P1).

Для пересева произвели следующие процедуры:

1. удалили кондиционированную среду культивирования;

2. промыли культивируемые клетки 10 мл раствора Хенкса;

3. промыли культивируемые клетки 4 мл раствора трипсина;

4. повторили промывку трипсином, 4 мл;

5. поместили матрас в СО₂ инкубатор на 2 минуты (время ошаривания клеток, за процессом наблюдали каждую минуту), за которые произошло ошаривание более 80% клеток;

6. смыли клетки с матраса 10 мл нагретой до +37°С средой культивирования;

7. поместили суспензию клеток в стерильную пробирку на 15 мл;

8. проверили качество снятия клеток с матраса с помощью инвертированного микроскопа: остаются на матрасе единичные клетки;

9. произвели подсчет клеток с помощью камеры Горяева. Они составили 8,4 млн.

10. перенесли клеточную суспензию в стерильный матрас для культивирования площадью 175 см²;

11. добавили в матрас 15 мл среды культивирования и перемешали вращательным движением суспензию клеток;

12. поместили матрас в СО₂ инкубатор.

На второй день культивирования после Р1 проективное покрытие матраса составило более чем 80% площади 175 см² (по оценке с помощью инвертированного микроскопа). Произвели пересев культуры на три матраса, площадью каждый 175 см² , пассаж 2 (Р2).

Повторили процедуру культивирования клеток на каждом матрасе, как описано для пассажа 1 в п.п.1-9.

Подсчет клеток с помощью камеры Горяева на стадии 9 дал 15,6 млн. клеток.

На стадии 10 объем клеточной суспензии довели с помощью среды культивирования до 15 мл, после чего по 5 мл ее перенесли на три стерильных матраса, каждый площадью 175 см. В каждый матрас прибавили 20 мл среды культивирования и поместили их в СО₂ инкубатор. Клетки культивировали 4 дня до проективного покрытия матраса более чем на 80%. Кормление клеточной культуры провели на 3-й день путем замены 12 мл кондиционированной среды культивирования на 12 мл свежеприготовленной.

После пассажа 2 (Р2) выход клеток составил 58,3 млн. клеток.

Пассаж 3 (Р3) осуществили по аналогии с Р2, произведя пересев культуры с каждого матраса на 3 новых, каждый площадью 175 см ². Клеточную культуру после Р3 иммунофенотипировали окраской антителами к поверхностным антигенам с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter), используя непрямую флуоресценцию. Клетки соответствуют иммунофенотипу МСК, т.к. положительны по CD 45- CD 34-, CD 90+, CD106+, CD 44+, CD 105+. Клетки являются жизнеспособными, т.к. не прокрашены иодидом пропидия. Результаты анализа в таблице №2.

Таблица №2 Характеристика полученных после пассажей мезенхимальных стволовых клеток
№ пробирки	Антитела FITC	Антитела РЕ	Антитела biotin	Антитела Су	Стрептавидин ЕСО	PI
1	-				+	--
2	CD 44	CD 105	CD 106	CD 90	+	--
3	CD 71				-	-
4	CD45	CD 34			-	+
5		CD 106			-	-

Выход клеток после пассажа 3 составил 159 млн. клеток. Они характеризуются высокой однородностью: 99%. Все клетки жизнеспособны.

Процедуры, применяемые для выделения МСК из костного мозга человека, могут использоваться для выделения МСК из костного мозга млекопитающих, если они являются необходимыми в ветеринарии или исследовательской работе для каких-либо целей.

Пример 2: МСК животных.

Забор костного мозга произведен у белых крыс. Суспензию выделяли из бедренных костей крыс сразу после декапитации.

Мозг подвергли следующим операциям, как в примере 1: дезагрегирование гепарином; приготовление его суспензии в среде ДМЕМ; после чего полученную суспензию аккуратно, без перемешивания наслоили на фиколл; центрифугирование суспензии осуществляли в фиколле с плотностью 1115 г/л. Время центрифугирования - 40 минут, число оборотов - 1500 об/мин, температура фиколла +20°С. На границе сред образовалось кольцо - «пенка», состоящая из клеток костного мозга. Клеточную суспензию разбавили равным ей по объему количеством среды ДМЕМ и повторно провели центрифугирование. Полученные клетки МСК были на 98% однородны по фенотипу CD 45-, CD 90+ (проверяли по 2-м маркерам).

Клетки поместили в стандартную посуду для культивирования, среда - МЕМ с добавлением 20% FBS. Проведено 3 пассирования. Получено 1,55·10 ⁶ клеток с 1 мл костного мозга. По реакции с иодидом пропидия (окрашиваемость) клетки жизнеспособны, однородность клеток по фенотипу составляет 90,5% (маркеры CD 45-, CD 90+, CD 44+, CD 34-, CD105+, CD106+).