композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, и способы их использования

Формула изобретения

1. Композиция, подавляющая развитие кровеносных сосудов, включающая:

(a) таксол в качестве фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов; и

(b) фармацевтически приемлемый полимерный носитель.

2. Композиция по п.1, которая приготавливается в виде микросфер со средним размером от 0,1 до 200 мкм.

3. Композиция по п.1, которая приготавливается в виде пленки со средней толщиной от 100 мкм до 2 мм.

4. Композиция по п.1, которая представляет собой жидкость при температуре выше 45°С и которая представляет собой твердое вещество или полутвердое вещество при температуре 37°С.

5. Композиция по п.1, в которой указанным полимерным носителем является поли(этилен-винилацетат), сшитый 40%-тами винилацетата.

6. Композиция по п.1, в которой указанным полимерным носителем является сополимер молочной и гликолевой кислот.

7. Композиция по п.1, в которой указанным полимерным носителем является поликапролактон.

8. Композиция по п.1, в которой указанным полимерным носителем является полимолочная кислота.

9. Композиция по п.1, в которой указанным полимерным носителем является сополимер поли(этилен-винилацетата), сшитого 40%-тами винилацетата, и полимолочной кислоты.

10. Композиция по п.1, в которой указанным полимерным носителем является сополимер полимолочной кислоты и поликапролактона.

11. Способ эмболизации кровеносного сосуда, заключающийся в доставке в указанный сосуд терапевтически эффективного количества композиции по любому из пп.1-10, так что указанный кровеносный сосуд эффективно закупоривается.

12. Способ по п.11, где указанный кровеносный сосуд питает опухоль.

13. Стент для расширения просвета расположенного внутри тела канала, имеющий в общем случае трубчатую структуру, поверхность которой покрыта композицией по любому из пп.1-10.

14. Способ лечения места иссечения опухоли, заключающийся в нанесении композиции по любому из пп.1-10 на границы иссечения опухоли после операции, так что подавляется местный рецидив рака и образование в указанном месте новых кровеносных сосудов.

15. Способ по п.14, где указанной композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов является термопаста, представляющая собой жидкость при температуре выше 45°С и представляющая собой твердое вещество или полутвердое вещество при температуре 37°С.

16. Способ по п.14, в котором стадия нанесения включает разбрызгивание композиции наносфер на границы иссечения опухоли.

17. Способ подавления развития кровеносных сосудов у пациентов с неонкогенными заболеваниями, определяемыми развитием кровеносных сосудов, который заключается во введении терапевтически эффективного количества композиции по любому из пп.1-10, так что подавляется образование новых кровеносных сосудов.

18. Фармацевтическое средство, подавляющее развитие кровеносных сосудов, включающее

(a) композицию по любому из пп.1-10, содержащую таксол и полимерный носитель, помещенные в контейнер, и

(b) размещенное на контейнере извещение, форма которого определяется правительственным учреждением, регулирующим производство, использование и продажу фармацевтических препаратов, при этом в извещении должно быть указано, что указанный таксол разрешен указанным правительственным учреждением к использованию при лечении неонкогенных заболеваний человека и животных, определяемых развитием кровеносных сосудов.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к композициям и методам лечения рака и других заболеваний, определяемых развитием кровеносных сосудов, а именно к композициям, включающим факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов, и полимерные носители, к устройствам для реконструкции просвета сосудов, покрытым указанными композициями, а также к способам использования указанных устройств для реконструкции просвета сосудов и к способам использования указанных композиций.

Предпосылки изобретения

Рак занимает второе место среди причин смертности в США и ответственен более чем за одну пятую часть от общей смертности. Если коротко, то рак характеризуется бесконтрольным делением популяций клеток, которое, как правило, приводит к образованию одной или большего количества опухолей. Хотя в настоящее время рак гораздо легче диагностируют, чем раньше, многие формы, даже при их раннем выявлении, все еще не поддаются лечению.

В настоящее время при лечении рака используется множество методов, в том числе, например, различные хирургические процедуры. Однако, если проводить лечение лишь хирургическим способом, то у многих пациентов (в частности, у тех, которые страдают от определенных типов рака, таких как рак груди, рак мозга, рак толстой кишки и рак печени) наблюдается рецидив рака. Помимо хирургического вмешательства многие виды рака лечат с применением комбинированной терапии, включающей использование цитотоксических химиотерапевтических средств (в частности, винкристина, винбластина, цисплатина, метотрексата, 5-FU и т.д.) и/или радиационную терапию. Одна из сложностей указанного подхода заключается в том, что радиотерапевтические и химиотерапевтические средства являются токсичными по отношению к нормальным тканям и часто вызывают опасные для жизни побочные эффекты. Далее, при таком подходе весьма часто наблюдаются неблагоприятные исходы или временное исчезновение симптомов заболевания.

Помимо хирургии, химиотерапии и радиотерапии предпринимались попытки использовать для уничтожения раковых клеток собственную иммунную систему пациента. Например, было предложено применять бактериальные или вирусные компоненты в качестве адъювантов с целью стимулировать иммунную систему для уничтожения опухолевых клеток (см. "Principles of Cancer Biotherapy", Oldham (ed.), Raven Press, New York, 1987). Подобные агенты обычно применяют в качестве адъювантов и неспецифичных стимуляторов в опухолевых моделях животных, однако еще не показано, что они в целом эффективны для лечения людей.

При лечении рака также использовали лимфокины. Если коротко, то лимфокины секретируются разными клетками и обычно оказывают воздействие на специфические клетки, вызывая ответную иммунную реакцию. Примерами лимфокинов являются интерлейкины (IL)-1, -2, -3 и -4, а также колониестимулирующие факторы, такие как G-CSF, GM-CSF и M-CSF. Недавно одна из групп исследователей применила IL-2 для стимулирования клеток периферической кровяной системы с целью их разрастания и выделения больших количеств клеток, которые являются цитотоксичными для опухолевых клеток (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med., 313: 1485-1492,1985).

Другими группами исследователей для лечения рака предложено использовать антитела. Если коротко, то могут быть получены антитела, распознающие определенные антигены на поверхности клеток, которые либо уникальны для раковых клеток, либо превалируют у раковых клеток по сравнению с нормальными клетками. Указанные антитела, или "магические пули", могут использоваться сами по себе или в сочетании с токсином, с тем, чтобы они могли специфично нацелиться и поразить раковые клетки (Dilman, "Antibody Therapy", "Principles of Cancer Biotherapy", Oldham (ed.), Raven Press Ltd, New York, 1987). Трудность, однако, заключается в том, что большинство моноклональных антител имеют муриновое происхождение и, таким образом, гиперчуствительность по отношению к муриновому антителу может ограничивать их эффективность, особенно после повторных лечений. Обычные побочные эффекты включают жар, испарину и озноб, высыпания на коже, артрит и нервный паралич.

Дополнительная сложность существующих методов заключается в том, что локальный рецидив и локальный контроль остается важнейшей задачей при лечении злокачественных образований. В частности, в общей сложности 630000 пациентов (в США) ежегодно страдают от локальных заболеваний (не замечено распространение отдаленных метастазов); это составляет 64% от числа всех пациентов, у которых обнаружены злокачественные образования (в него не входит немеланомный рак кожи или карцинома in situ). Для подавляющего большинства этих пациентов хирургическое лечение болезни предоставляет наибольший шанс для выздоровления, и действительно 428000 из них вылечиваются после первичного лечения. К сожалению, у 202000 (или 32% пациентов с локальными заболеваниями) наблюдается рецидив после первичного лечения. Из пациентов, у которых наблюдается рецидив, число тех, у кого наблюдается рецидив локального заболевания, достигает 133000 ежегодно (или 21% от числа пациентов с локальными заболеваниями). Число тех, у кого рецидив связан с отдаленными метастазами, составляет 68000 пациентов ежегодно (11% из всех пациентов с локальными заболеваниями). Еще 102139 пациентов ежегодно умирают непосредственно в результате невозможности контролировать локальное распространение болезни.

Нигде эта проблема не проявляется так ярко, как при раке груди, который ежегодно поражает 186000 женщин в США, при этом уровень смертности сохраняется без изменения в течение 50 лет. Хирургическое иссечение по методу радикальной мастэктомии, модифицированной радикальной мастэктомии или удаление опухоли остаются главным оплотом при лечении этого состояния. К сожалению, у 39% пациентов, которым проведено одно лишь удаление опухоли, наблюдается локальный рецидив болезни и, что неожиданно, это же наблюдается у 25% пациентов, у которых, как показано, границы иссечения гистологически свободны от опухоли. Вплоть до 90% из этих рецидивов возникает на расстоянии не более 2 см от прежнего места иссечения.

Аналогично в 1991 только в Северной Америке сообщается о более чем 113000 смертных случаях и 238600 новых случаях метастаза печени. Среднее время жизни пациентов с метастазами в печени составляет всего 6,6 месяцев после развития поражений в печени. Нехирургическое лечение метастаза печени включает общую химиотерапию, облучение, химиоэмболизацию, химиотерапию печеночных артерий и внутриартериальное облучение. Однако, несмотря на то, что подобная обработка может временно привести к уменьшению размера поражений печени (в частности, общая химиотерапия и химиотерапия печеночных артерий первоначально уменьшает поражения на 15-20% и 80% соответственно), поражения неизбежно возобновляются. Хирургическое иссечение метастаза печени является единственным возможным способом лечения, однако, эта процедура возможна лишь для 5% пациентов с метастазами и для 15-20% пациентов с первичным раком печени.

Одним из методов, который опробован при лечении опухолей и имел ограниченный успех, является терапевтическая эмболизация. Если коротко, то кровеносные сосуды, которые питают опухоль, преднамеренно блокируют путем введения в сосуды эмболических веществ. С этой целью испытано большое количество материалов, в том числе аутогенных веществ, таких как жир, сгустки крови и измельченные фрагменты мышц, а также искусственные материалы, такие как шерсть, хлопок, стальные шарики, пластиковые или стеклянные шарики, порошок тантала, кремниевые соединения, радиоактивные частицы, стерильный поглощаемый губчатый желатин (Sterispon, Gelfoam), окисленная целлюлоза (Oxycel), стальная спираль, спирт, лиофилизованная твердая мозговая оболочка человека (Lyodura), микрофибриллярный коллаген (Avitene), фибриллы коллагена (Tachotop), губчатый поливиниловый спирт (PVA, Ivalon), импрегнированные барием кремниевые сферы (Biss) и съемные надувные шарики. При использовании указанных методов размер метастаза печени может быть временно уменьшен, однако опухоль отвечает тем, что стимулирует прорастание внутрь нее новых кровеносных сосудов.

Проблемой, связанной с образованием опухоли, является развитие вызванных раком блокад, которые препятствуют прохождению веществ по находящимся внутри организма каналам, таким как желчные протоки, трахея, пищевод, сосудистая система и мочеиспускательный канал. Чтобы держать открытыми проходы, блокированные опухолями или другими веществами, было разработано устройство для реконструкции органов - стент. Примерами обычных стентов являются стеночный стент, стент Штреккера, стент Жиантурко и стент Пальмаца. Основная проблема при использовании стентов заключается, однако, в том, что они не препятствуют проникновению опухоли или воспалительного вещества через щели стента. Если указанные вещества проникают внутрь стента и возникает опасность закупорки отверстия стента, то это может привести к блокаде расположенного внутри тела прохода, в который стент установлен. Далее, присутствие стента внутри организма может привести к тому, что активные или воспалительные ткани (в частности, кровеносные сосуды, фибробласты, белые кровяные тельца) попадают в проход стента, что приводит к частичной или полной закупорке стента.

В настоящем изобретении заявляются композиции и способы, пригодные для лечения рака и других заболеваний, связанных с развитием кровеносных сосудов, которые позволяют решить проблемы, возникшие при использовании вышеуказанных методов, а также предоставляют дополнительные преимущества.

Краткое описание изобретения

Если коротко, то в настоящем изобретении заявляются композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, а также методы и устройства, в которых указанные композиции используются, для лечения рака и других заболеваний, связанных с развитием кровеносных сосудов. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения заявляются композиции (далее называемые "композициями, подавляющими развитие кровеносных сосудов"), включающие (а) фактор, препятствующий развитию кровеносных сосудов и (b) полимерный носитель. В рамках настоящего изобретения в качестве факторов, препятствующих развитию кровеносных сосудов, может использоваться широкий круг молекул, в том числе, например, антиинвазивный фактор, ротеновые кислоты и их производные, таксол, аналоги таксола и производные таксола, и члены группы, включающей сурамин, тканевый ингибитор металлопротеиназы-1, тканевый ингибитор металлопротеиназы-2, ингибитор-1 плазминогенного активатора, ингибитор-2 плазминогенного активатора. Аналогично может использоваться широкий круг полимерных носителей, выборочными примерами которых являются поли(этилен-винилацетат), сшитый 40% винилацетата, сополимер молочной и гликолевой кислот, поликапролактон полимолочной кислоты, сополимеры полиэтилена и винилацетата, сшитые 40% винилацетата и молочной кислоты, сополимеры полимолочной кислоты и поликапролактона. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения средний размер частиц композиции составляет от 15 до 200 микрон.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы эмболизации (закупорки сосудов с лечебной целью) кровеносных сосудов, включающие стадию доставки в сосуд терапевтически эффективного количества вышеописанной композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов, что приводит к эффективной закупорке кровеносного сосуда. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция, подавляющая развитие кровеносных сосудов, вводится в кровеносный сосуд, который питает опухоль.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения, заявляются стенты, имеющие в общем случае трубчатую структуру, а их поверхность покрыта одной или несколькими композициями, подавляющими развитие кровеносных сосудов. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы расширения просветов находящихся внутри организма проходов, которые заключаются в размещении стента внутри прохода, при этом стент имеет в общем случае трубчатую структуру, а его поверхность покрыта вышеуказанной композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что проход расширяется. В рамках различных вариантов осуществления настоящего изобретения заявляются способы устранения закупорки желчных протоков, заключающиеся в размещении желчного стента в желчном протоке; способы устранения закупорки мочеиспускательных каналов, заключающиеся в размещении уретрального стента в мочеиспускательном канале; способы устранения закупорки пищевода, заключающиеся в размещении стента внутри пищевода, и способы устранения закупорки трахеи и бронхов, заключающиеся в размещении трахеально-бронхиального стента внутри трахеи или бронха. В каждом из этих вариантов осуществления настоящего изобретения стент имеет в общем случае трубчатую структуру, а его поверхность покрыта вышеуказанной композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения заявляются способы обработки мест иссечения опухолей, которые заключаются в нанесении вышеуказанной композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов, на границы иссечения опухоли после проведения хирургической операции, так что подавляется местный рецидив рака и образование новых кровеносных сосудов в этом месте. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы устранения образования новых кровеносных сосудов в роговице, заключающиеся во введении в роговицу терапевтически эффективного количества вышеуказанной композиции», подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что образование новых кровеносных сосудов подавляется. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция, подавляющая развитие кровеносных сосудов, дополнительно содержит кортикостероидный гормон местного действия.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения заявляются способы подавления образования новых кровеносных сосудов у пациентов с неонкогенными заболеваниями, определяемыми развитием кровеносных сосудов, которые заключаются в назначении пациенту с неонкогенными заболеваниями, определяемыми развитием кровеносных сосудов, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей таксол, так что подавляется образование новых кровеносных сосудов. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения заявляются способы эмболизации кровеносных сосудов при неонкогенных заболеваниях, определяемых развитием кровеносных сосудов, которые заключаются во введении в кровеносный сосуд терапевтически эффективного количества композиции, содержащей таксол, так что кровеносный сосуд эффективно закупоривается.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения заявляются способы расширения просветов находящихся внутри организма проходов, которые заключаются в размещении стента внутри прохода, при этом стент имеет в общем случае трубчатую структуру, а его поверхность покрыта композицией, содержащей таксол, так что проход расширяется. В рамках различных вариантов осуществления настоящего изобретения заявляются способы устранения закупорки желчных протоков, заключающиеся в размещении желчного стента в желчном протоке; способы устранения закупорки мочеиспускательных каналов, заключающиеся в размещении уретрального стента в мочеиспускательном канале; способы устранения закупорки пищевода, заключающиеся в размещении стента внутри пищевода, и способы устранения закупорки трахеи и бронхов, заключающиеся в размещении трахеально-бронхиального стента внутри трахеи или бронха. В каждом из этих вариантов осуществления настоящего изобретения стент, имеет в общем случае трубчатую структуру, а его поверхность покрыта композицией, содержащей таксол.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения заявляются способы обработки мест иссечения опухолей, которые заключаются в нанесении содержащей таксол композиции на границы иссечения опухоли после проведения операции, так что подавляется местный рецидив рака и образование новых кровеносных сосудов в этом месте. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы устранения образования новых кровеносных сосудов в роговице, заключающиеся во введении в роговицу терапевтически эффективного количества композиции, содержащей таксол, так что образование новых кровеносных сосудов подавляется.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения заявляются фармацевтические средства, включающие (а) таксол в контейнере и (b) размещенное на контейнере извещение, форма которого определяется правительственным учреждением, регулирующим производство, использование и продажу фармацевтических препаратов, и в этом извещении должно быть указано, что таксол разрешен к использованию при лечении неонкогенных заболеваний, связанных с развитием кровеносных сосудов у человека и животных. Если коротко, то Федеральное законодательство требует, чтобы использование фармацевтического средства при лечении людей было разрешено учреждением Федерального правительства. Обязанности по соблюдению законодательства возложены (в Соединенных Штатах) на Комитет по пищевым продуктам и лекарствам, который выпускает соответствующие инструкции, что подробно указано в материалах 21 Конгресса США в параграфах 301-392. Инструкции по использованию биологических веществ, включающих продукты, выделенные из тканей животных, содержатся в материалах 42 конгресса США в параграфе 262. Аналогичные разрешения требуются в большинстве стран, хотя инструкции в каждой стране могут отличаться друг от друга.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения более подробно поясняются приведенным далее подробным описанием и прилагаемыми чертежами. Ниже указаны многочисленные ссылки, подробно описывающие некоторые методики и композиции, которые приводятся здесь для справок.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А представлена фотография, на которой изображена культура яйца без оболочки на 6-й день. На фиг.1В приведен после цифровой обработки на компьютере образ живых неокрашенных капилляров, полученный с помощью стереомикроскопа (1040х). На фиг.1С показаны микрососуды хорионалантоисной мембраны, которые питаются нижележащими более крупными сосудами (стрелки, 1300х). На фиг.1D показан разрез хорионалантоисной мембраны толщиной 0,5 мм, наблюдаемый в оптический микроскоп. На этой фотографии приведена композиция хорионалантоисной мембраны, включающая внешний двухслойный эктодерм (Ec), мезодерм (М), содержащий капилляры (стрелки) и разбросанные клетки адвентициальной оболочки, и однослойный эндодерм (En) (400х). Фиг.1Е представляет собой полученную с помощью электронного микроскопа (3500х) фотографию, на которой показана типичная капиллярная структура с тонкостеночными эндотелиальными клетками (острие стрелок) и связанным с ними перицитом.

Фиг.2А, 2 В, 2С и 2D представляют собой серию цифровых образов четырех различных неокрашенных хорионалантоисных мембран, полученные после 48-часового воздействия таксола.

Фиг.3А, 3 В и 3С представляют собой серию фотографий разрезов толщиной 0,5 мм, полученных от обработанных хорионалантоисных мембран в трех различных местах в пределах содержащей сосуды зоны.

Фиг.4А, 4 В и 4С представляют собой серию полученных на электронном микроскопе микрофотографий мест, близких к тем, которые показаны выше на фиг.3А, 3В и 3С (соответственно).

Фиг.5 представляет собой гистограмму, на которой приведено числовое распределение размеров микросфер (5% ELVAX с 10 мг сурамина натрия в 5% поливиниловом спирте).

Фиг.6 представляет собой гистограмму, на которой приведено весовое распределение размеров микросфер (5% ELVAX с 10 мг сурамина натрия в 5% поливиниловом спирте).

На фиг.7 приведен график, на котором показан вес инкапсулированного сурамина натрия в 1 мл 5%-ного ELVAX.

На фиг.8 приведен график, на котором указан процент инкапсулированного сурамина натрия в ELVAX.

На фиг.9 приведена гистограмма распределения размеров 5%-ных микросфер ELVAX, содержащих 10 мг сурамина натрия в 5%-ном поливиниловом спирте, включающем 10% NaCl.

На фиг.10 приведена гистограмма весового распределения размеров 5%-ных микросфер PLL, содержащих 10 мг сурамина натрия в 5%-ном поливиниловом спирте, включающем 10% NaCl.

На фиг.11 приведена гистограмма числового распределения размеров 5%-ных микросфер PLL, содержащих 10 мг сурамина натрия в 5%-ном поливиниловом спирте, включающем 10% NaCl.

Фиг.12 представляет собой график, который показывает количество высвобожденого сурамина натрия в зависимости от времени.

На фиг.13A, B приведен пример эмболизации опухоли печени.

Фиг.14A, B показывает выборочный пример размещения стента, покрытого композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, по настоящему изобретению.

На фиг.15А приведен график, показывающий влияние отношения сополимер этилена и винилацетата : поли-1-молочная кислота в смеси полимеров на агрегацию микросфер. На фиг.15 В приведена микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, которая показывает размер "маленьких" микросфер. На фиг.15С приведена микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, которая показывает размер "больших" микросфер. На фиг.15D приведен график, который показывает выделение таксола с течением времени из сфер, изготовленных из полимерной смеси 50:50 сополимер этилена и винилацетата : поли-1-молочная кислота и наполненных 0,6%-ным (вес/об) раствором таксола, в забуференный фосфатом солевой физиологический раствор (рН 7,4) при температуре 37°С. Незакрашенные кружки соответствуют микросферам "маленького" размера, а закрашенные кружки соответствуют микросферам "большого" размера. На фиг.15Е приведена фотография хорионалантоисной мембраны, которая показывает результаты высвобождения таксола микросферами (MS). Фиг.15F соответствует фиг.15Е при большем увеличении.

На фиг.16А приведен график, показывающий профили высвобождения таксола из поликапролактоновых (PCL) микросфер, содержащих 1%, 2%, 5% или 10% таксола, в забуференный фосфатом солевой физиологический раствор при температуре 37°С. На фиг.16В представлена фотография, на которой показана хорионалантоисная мембрана, обработанная контрольными микросферами. На фиг.16С представлена фотография, на которой показана хорионалантоисная мембрана, обработанная микросферами, наполненными 5%-ным таксолом.

На фиг.17А и 17В соответственно представлены два графика, на которых показано высвобождение таксола из пленок сополимера этилена и винилацетата (EVA) и процент таксола, остающегося в тех же пленках с течением времени. На фиг.17С показано набухание пленок EVA/F127, не содержащих таксола, с течением времени, на фиг.17D показано набухание пленок EVA/Span 80, не содержащих таксола, с течением времени. На фиг.17Е приведена зависимость напряжения от деформации в различных смесях EVA/F127.

На фиг.18А и 18В приведена зависимость точки плавления полимерных смесей PCL/MePEG в зависимости от процентного содержания (18А) и процент увеличения времени, необходимого, чтобы паста PCL начала затвердевать при температуре 60°С в зависимости от количества MePEG (18В). На фиг.18С показана хрупкость различных полимерных смесей PCL/MePEG. На фиг.18D приведен график, показывающий изменение веса, выраженное в процентах, с течением времени для полимерных смесей с различным содержанием MePEG. На фиг.18Е представлен график, показывающий скорость высвобождения таксола с течением времени из различных полимерных смесей, нагруженных 1% таксола. Графики на фиг.18F и 18G показывают влияние различного содержания таксола на общее количество таксола, высвобождаемого из смеси 20% MePEG/PCL. График, приведенный на фиг.18Н, показывает влияние MePEG на прочность полимеров MePEG/PCL при пластической деформации.

На фиг.19А приведена фотография контрольной термопасты (ненагруженной) на хорионалантоисной мембране. На фиг.19 В приведена фотография термопасты, содержащей 20% таксола, на хорионалантоисной мембране.

Фиг.20А и 20В показывают две фотографии хорионалантоисной мембраны, содержащей опухоль, обработанную контрольной (ненагруженной) термопастой. Фиг.20С и 20D показывают две фотографии хорионалантоисной мембраны, содержащей опухоль, обработанную нагруженной таксолом термопастой.

График на фиг.21А показывает влияние таксола на поликапролактоне на рост опухоли. На фиг.21В и 21С приведены две фотографии, показывающие влияние контрольной термопасты и термопасты, содержащей 10% и 20% таксола, на рост опухоли.

На фиг.22А представлена фотография синовиальной мембраны из сустава после инъекции забуференного фосфатом солевого раствора. На фиг.22В представлена фотография синовиальной мембраны из сустава после инъекции микросфер. На фиг.22С представлена фотография хряща из сустава после инъекции забуференного фосфатом солевого раствора, а на фиг.22D представлена фотография хряща из сустава после инъекции микросфер.

Подробное описание изобретения

Как указано ранее, в настоящем изобретении заявляются способы и композиции, в которых используются факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов. Следует понимать, что в контексте настоящего изобретения под факторами, подавляющими развитие кровеносных сосудов, подразумеваются белковые, пептидные, химические или другие молекулы, действие которых приводит к ингибированию роста сосудов. Существует множество простых способов определения подавляющей развитие кровеносных сосудов активности данного фактора, в том числе, например, анализы с хорионалантоисной мембраной (САМ) цыплят, как показано ниже, в Примерах 2А и 2С, удаляют оболочку у свежеоплодотворенных куриных яиц и на мембрану помещают диск из метилцеллюлозы, содержащий образец фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов. Через несколько дней (в частности, через 48 час) ингибирование роста сосудов под действием испытуемого образца может быть легко замечено путем визуального изучения хорионалантоисной мембраны в области, окружающей диск из метилцеллюлозы. Ингибирование роста сосудов можно также оценить количественно, например, определяя количество и размер кровеносных сосудов, окружающих диск из метилцеллюлозы, по сравнению с контрольным диском из метилцеллюлозы. Наиболее предпочтительные факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов, пригодные для использования по настоящему изобретению, полностью подавляют образование новых кровеносных сосудов в указанном выше анализе.

Кроме того, может быть использовано множество способов определения в условиях in vivo эффективности факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов, в том числе, например, в мышиных моделях, которые были разработаны с этой целью (см. Roberston et al., Cancer. Res. 51:1339-1344, 1991). Кроме того, множество примеров анализов в условиях in vivo, относящихся к описываемым различным аспектам настоящего изобретения, более подробно рассматривается далее в Примерах 5-7 и 17-19.

Как указано ранее, в настоящем изобретении заявляются композиции, содержащие фактор, подавляющий развитие кровеносных сосудов, и полимерный носитель. Если коротко, то в соответствии с настоящим изобретением может использоваться множество факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов. Отдельные примеры включают антиинвазивный фактор, ретеновую кислоту и ее производные, таксол и члены группы, включающей сурамин, тканевый ингибитор металлопротеиназы-1, тканевый ингибитор металлопротеиназы-2, ингибитор-1 плазминогенового активатора, ингибитор-2 плазминогенового активатора. Эти и другие факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов, будут подробнее рассмотрены далее.

Если коротко, то антиинвазивный фактор, или AIF, который получают из экстрактов хрящей, как известно, содержит компоненты, которые отвечают за подавление роста новых кровеносных сосудов. Эти компоненты включают семейство из семи низкомолекулярных белков (<50000 дальтон) (Kuettner and Pauli, "Inhibition of neovascularization by cartilage factor" in: Development of the Vascular System, Pitman Books (Ciba Foundation Symposium 100), pp.163-173, 1983), в том числе различные белки, которые оказывают ингибирующее действие на различные протеиназы (Eisentein et al., Am. J. Pathol. 81: 337-346, 1975; Langer et al., Science 193: 70-72, 1976; Horton et al., Science 199: 1342-1345, 1978). Антиинвазивный фактор, пригодный для использования по настоящему изобретению, может быть легко получен по методам, известным из области техники (в частности, Eisentein et al., см. ранее, Kuettner and Pauli, см. ранее, и Langer et al., см. ранее). Очищенные компоненты антиинвазивного фактора, такие как выделенный из хряща ингибитор (GDI) (см. Moses et al., Science 248: 1408-1410, 1990), также могут быть легко получены и использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

Ретеновые кислоты изменяют метаболизм внеклеточных компонентов матрицы, что приводит к подавлению развития кровеносных сосудов. Добавка аналогов пролина, подавляющих кровотечение стероидов или гепарина, может использоваться с целью синергического увеличения воздействия трансретеновой кислоты на подавление развития кровеносных сосудов. Ретеновая кислота или ее производные, которые также могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть легко получены из промышленных источников, в том числе из компании "Sigma Chemical Co." (No. R2625).

Таксол представляет собой содержащий большое количество заместителей дитерпеноид (Wani et ai., J. Am. Chem. Soc., 93: 2325, 1971), который получают после сбора и высушивания коры Taxus brevifolia (тиса тихоокеанского) и из Taxomyces Andreanae и Endophytic Fungus. (Stierle et al., Science 60: 214-216, 1993). В общем случае действие таксола приводит к стабилизации микротрубчатой структуры сосудов за счет присоединения тубулина с образованием ненормальных митотических веретен. Таксол (в контексте настоящего изобретения следует понимать, что этот термин включает аналоги и производные таксола, такие как, например, баккатин и таксотер) может быть легко получен с использованием методов, известных специалистам в данной области техники (см. также Международные заявки WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076, Патенты США с номерами 5294637, 5283253, 5279949, 5274137, 5202448, 5200534 и Европейскую патентную заявку 590267), или от различных промышленных источников, в том числе, например, компании "Sigma Chemical Co." (Сент-Луис, штат Миссури) (Т7402 - из Taxus brevifolia).

Сурамин представляет собой полисульфонированное производное нафтилмочевины, которое обычно применяют в качестве средства, уничтожающего трипаносом. Если коротко, то сурамин блокирует специфическое связывание поверхности клетки различными факторами роста, такими как фактор роста, полученный из тромбоцитов (PDGF), фактор роста эпидермиса (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF- ), инсулиноподобный фактор роста (IGF-l) и фактор роста фибробластов ( FGF). Сурамин можно получить в соответствии с известными методиками или легко приобрести из различных промышленных источников, в том числе, например, из компании "Mobay Chemical Со." (Нью-Йорк) (см. Gagliardi et al., Canver Res. 52: 5073-5075, 1992, и Coifey, Jr., et al., J. of Cell. Phys. 132: 143-148, 1987).

Тканевый ингибитор металлопротеиназы-1 (TIMP) секретируется клетками эндотелия, которые секретируют также МТРазы. TIMP является гликозилированным и имеет молекулярный вес, равный 28,5 кДа. TIMP-1 регулирует развитие кровеносных сосудов путем присоединения к активированной металлопротеиназе, подавляя тем самым инвазию кровеносных сосудов во внеклеточную матрицу, для подавления развития кровеносных сосудов может также использоваться тканевый ингибитор металлопротеиназы-2 (TIMP-2). Если коротко, то TIMP-2 представляет собой негликозилированный белок весом 21 кДа, который присоединяется к протеиназе как в активной, так и латентной, проферментной форме, как TIMP-1, так и TIMP-2 могут быть получены из промышленных источников, таких как компания "Synergen" (Боулдер, штат Колорадо).

Ингибитор-1 плазминогенового активатора (РА) представляет собой гликопротеин весом 50 кДа, который присутствует в тромбоцитах, а также может синтезироваться клетками эндотелия и клетками мышц. Ингибитор-1 плазминогенового активатора ингибирует t-PA и плазминогеновый активатор урокиназы в базолатеральном месте эндотелия и дополнительно регулирует процесс фибринолиза. Ингибитор-2 плазминогенового активатора обычно обнаруживается в крови лишь при определенных обстоятельствах, таких как беременность, а также в случае опухолей. Если коротко, то ингибитор-2 плазминогенового активатора представляет собой белок с весом 56 кДа, который секретируется моноцитами и макрофагами, полагают, что он регулирует фибринолитическую активность, в частности ингибирует плазминогеновый активатор урокиназы и тканевый плазминогеновый активатор, тем самым препятствуя фибринолизу.

В соответствии с настоящим изобретением может использоваться большое разнообразие других факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов. Отдельными примерами являются фактор 4 тромбоцитов ("Sigma Chemical Co.", No. F1385), сульфат протамина (клупеин) ("Sigma Chemical Co.", No. P4505), сульфированные производные хитина (получают из оболочки самки краба) ("Sigma Chemical Co.", No. C3641; Murata et. al., Cancer Res. 51: 22-26, 1991); сульфированный полисахаридный пептидогликановый комплекс (SP-PG) (функции этого соединения могут быть усилены в присутствии стероидов, таких как эстроген и цитрат тамоксифена); ставроспорин ("Sigma Chemical Co.", No. S4400); модуляторы метаболизма матрицы, в том числе, например, аналоги пролина {[(L-азетидин-2-карбоновая кислота (LACA) ("Sigma Chemical Co.", No. AО760)), цисгидроксипролин, d,L-3,4-дегидропролин ("Sigma Chemical Co.", No. D0265); тиапролин ("Sigma Chemical Co.", No. Т0631)], альфа,альфа-дипиридил ("Sigma Chemical Co.", No. D7505), фумарат бета-аминопропионитрила ("Sigma Chemical Co.", No. A3134)]}; MDL 27032 (4-пропил-5-(4-пиридинил)-2(3Н)-оксазолон; "Merion Merrel Dow Research Institute), метотрексат ("Sigma Chemical Co.", No. A6770; Hirata et al., Arthritis arid Rheumatism 32: 1065-1073, 1989); митоксантрон (Polverini and Novak, Biochem. Biophys. Res. Comm. 140: 901-907); гепарин (Folkman, Bio. Phar. 34:905-909, 1985; "Sigma Chemical Co.", No. P8754); интерфероны (в частности, ("Sigma Chemical Co.", No. 13265); 2 макроглобулиновая сыворотка (" Sigma Chemical Co.", No. M7151); ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267: 17321-17326, 1992); химостатин ("Sigma Chemical Co.", No. C7268; Tomkinson et ai., Biochem. J. 286: 475-480, 1992); тетрадесульфат бета-циклодекстрина ("Sigma Chemical Co.", No. C4767); эпонемицин; эстрамустин (получают из компании "Sigma", Wang and Stearns, Cancer Res., 48: 6262-6271, 1988); фумагиллин ("Sigma Chemical Co.", No. F6771; Патент Канады 2024306; Ingber et al., Nature 348: 555-557, 1990); тиомалат золота-натрия ("Sigma Chemical Co.", No. G4022; Matsubara and Ziff: J. Ciin. Invest. 79: 1440-1446, 1987); D-пеницилламин ("Sigma Chemical Co.", No.P4875 или P5000(HCl)); бета-1-антиколлагеназовая сыворотка, альфа-2-антиплазмин ("Sigma Chemical Co.", No.AO914; Holmes et al., J. Biol. Chem. 262(4): 1659-1664, 1987); бизантрен (Национальный институт рака); динатриевая соль лобензарита (динатриевая соль N-(2)-карбоксифенил-4-хлорантраниловой кислоты; Takeuchi et al., Agents Actions 36: 312-316, 1992); талидомид, подавляющий развитие кровеносных сосудов стероид, AGM-1470, карбоксиаминолмидазол, ингибиторы металлопротеиназы, такие как ВВ94 и пептид CDPGYIGSR-NH ₂ (последовательность с номером идентификации 1) ("Iwaki Glass", Токио, Япония).

Композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, помимо фактора, ингибирующего развитие кровеносных сосудов, и полимерного носителя, могут дополнительно включать широкий круг соединений. Например, композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, по настоящему изобретению в некоторых вариантах его осуществления могут также содержать один или большее количество антибиотиков, антивоспалительных средств, антивирусных средств, антигрибковых средств и/или средств, убивающих простейших. Отдельными примерами антибиотиков, которые включаются в приведенные в настоящем описании композиции, являются пенициллины; цефаллоспорины, такие как цефадроксил, цефазолин, цефаклор; аминогликозиды, такие как гентамицин и тобрамицин; сульфонамиды, такие как сульфаметоксазол, и метронидазол. Отдельными примерами антнвоспалптельных средств являются: стеронды, такие как преднизон, преднизолон, гидрокортизон, адренокортикотропный гормон и сульфазалазин, и нестероидные антивоспалительные средства, такие как аспирин, ибупрофен, напроксен, фенопорфен, индометацин и фенилбутазон. Отдельными примерами антивирусных средств являются ацикловир, ганцикловир, зидовудин. Отдельными примерами антигрибковых средств являются нистатин, кетоконазол, гризеофульвин, флуцитозин, миконазол, клотримазол. Отдельными примерами средств, убивающих простейших, являются изетионат пентамидина, хинин, хлорхинин и мефлохин.

Композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут также содержать один или несколько гормонов, таких как гормон щитовидной железы, эстроген, прогестерон. кортизон и/или ростовой гормон, другие биологически активные молекулы, такие как инсулин, а также такие как цитокины T_H1 (в частности, интерлейкины -2, -12 и -15, гамма-интерферон) или Т_Н2 (в частности, интерлейкины -4 и -10).

Композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут также включать дополнительные ингредиенты, такие как поверхностно-активные вещества (как гидрофильные, так и гидрофобные; см. Пример 13), антиопухолевые или химиотерапевтические средства (в частности, 5-фторурацил, винбластин, доксирубицин, адриамицин или рамоцифен), радиоактивные средства (в частности, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 и Bi-212) или токсины (в частности, рицин, абрин, токсин дифтерии, холерный токсин, гелонин, антивирусный белок филолакки американской, тритин, токсин Shigella и экзотоксин A. Pseudomonas).

Как указано ранее, композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, содержат фактор, подавляющий развитие кровеносных сосудов, и полимерный носитель. Помимо широкого спектра факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов, и других соединений, рассмотренных выше, композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут включать самые разнообразные полимерные носители, в том числе, например, как биоразлагаемые, так и небиоразлагаемые соединения. Отдельными примерами биоразлагаемых композиций являются альбумин, желатин, крахмал, целлюлоза, декстраны, полисахариды, фибриноген. поли(d,l-лактид), поли(d,l-лактид-гликолид), поли(гликолид), поли(гидроксибутират), поли(алкилкарбонат) и поли(ортоэфиры) (см. L. Illum, S.S. Davids (eds.) "Polymers in Controlled Drug Delivery", Wright, Bristol, 1987; J. Arshady, J. Controlled Release 17: 1-22, 1991; Pitt, Int. J. Phar. 59: 173-196, 1990; Holland et al., J. Controlled Release 4: 155-180, 1986). Отдельными примерами небиоразлагаемых полимеров являются сополимеры этилена и винилацетата, кремнийорганические каучуки и поли(метилметакрилат). Наиболее предпочтительными полимерными носителями являются сополимеры этилена и винилацетата (в частности, ELVAX 40, поли(этилен-винилацетат), сшитый 40% винилацетата; "DuPont."), поли(молочная кислота-гликолевая кислота), поликапролактон, полимолочная кислота, сополимеры этилена и винилацетата. сшитые 40% винилацетата и полимолочной кислоты, сополимеры полимолочной кислоты и поликапролактона.

Полимерным носителям можно придать разнообразную форму, в том числе, например, форму наносфер или микросфер, форму стержней, таблеток, полосок или капсул (см.. в частности, Goodell et al., Am. J. Hosp.Pharm. 43: 1454-1461, 1986; Langer et al., "Controlled release of macromolecules from polymers", in: "Biomedical polymers, Polymeric materials and pharmaceuticals for biomedical use", E.P. Goldberg, A. Nakagim (eds.), Academic Press, pp.113-137, 1980; Rhine et al., J. Pharm. Sci. 69: 265-270, 1980; Brown et al., J. Pharm. Sci. 72: 1181-1185, 1983, и Bawa et al., J. Controlled Release 1: 259-267, 1985).

Композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов и содержащие один или несколько факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов, и полимерный носитель, преимущественно изготавливают в форме, удобной для конкретного использования. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, должны быть биоразлагаемыми и высвобождать один или несколько факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов, в течением времени от нескольких недель до нескольких месяцев. Далее, композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, преимущественно должны быть устойчивы в течение нескольких месяцев и их можно было бы получать и хранить в стерильных условиях. В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут быть изготовлены в виде частиц любого размера, начиная от наносфер и кончая микросферами (в частности, от 0,1 до 500 мкм), в зависимости от конкретного использования. Например, при использовании для эмболизации опухоли (как описано далее) в общем случае желательно, чтобы композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, были изготовлены в виде микросфер с размером от 15 до 500 мкм, преимущественно с размером от 15 до 200 мкм и наиболее предпочтительно с размером от 25 до 150 мкм. Подобные частицы можно также легко использовать в виде "аэрозоля", который затвердевает в виде пленки или покрытия. Наночастицы (которые называют также "наносферами") могут быть получены с широким диапазонам размеров, включая, например, наночастицы с размерами от 0,1 до 3 мкм, от 10 до 30 мкм и от 30 до 100 мкм (см. Пример 8).

Композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут быть также приготовлены, в соответствии с настоящим описанием, для различных других применений. Например, для введения в роговицу композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов, она может быть заключена в полимеры в виде наночастиц (см. Kreuter, J. Controlled Release 16: 169-176, 1991; Couvreur and Vauthier, J. Controlled Release 17: 187-198, 1991). Подобные наночастицы можно также легко нанести в виде "аэрозоля", который затвердевает в виде пленки или покрытия. Наночастицы (которые называют также "наносферами") могут быть получены с широким диапазонам размеров, включая, например, наночастицы с размерами от 0,1 до 3 мкм, от 10 до 30 мкм и от 30 до 100 мкм (см. Пример 8).

Композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут быть также приготовлены в форме разнообразных "паст" или гелей. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заявляются композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, которые представляют собой жидкость при одной температуре (в частности, при температуре выше 37°С, такой как 40°С, 45°С, 50°С, 55°С или 60°С) и является твердыми или полутвердыми при другой температуре (в частности, при обычной температуре тела или при температуре менее 37°С). Подобные "термопасты" могут быть легко получены в соответствии с настоящим описанием (см., в частности, Примеры 10 и 14).

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут быть приготовлены в виде пленки, эти пленки обычно имеют толщину преимущественно менее 5, 4, 3, 2 или 1 мм, более предпочтительно толщину от менее 500 мкм до 100 мкм. Указанные пленки являются преимущественно гибкими с хорошей прочностью на разрыв при пластической деформации (в частности, с величиной более 50, преимущественно более 100 и наиболее преимущественно более 150 или 200 Н/кв.см), хорошими адгезионными свойствами (т.е. обладают хорошей адгезией к влажным или сырым поверхностям) и обладают хорошей проникающей способностью, отдельные примеры подобных пленок приведены далее в Примерах (см., в частности, Пример 13).

Отдельные примеры включения факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов, в полимерные носители более подробно изложены далее в Примерах 3, 4 и 8-15.

Эмболизация артерий

Помимо вышеуказанных композиций, в настоящем изобретении заявляется также ряд методов, в которых используются вышеописанные композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов. В частности, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, заявляются способы эмболизации кровеносных сосудов, которые включают стадии доставки в сосуд терапевтически эффективного количества композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов (как указано ранее), так что кровеносный сосуд надежно закупоривается. Терапевтически эффективные количества, пригодные для закупорки кровеносных сосудов, могут быть легко определены на основании приведенного ниже описания, а также из Примера 6. В одном из наиболее предпочтительных вариантов осуществления изобретения композиция, подавляющая развитие кровеносных сосудов, доставляется в кровеносный сосуд, который питает опухоль (см. фиг.13).

Если коротко, то возможен ряд клинических ситуаций (в частности, кровотечение, развитие опухоли), когда желательно уменьшить или прекратить подачу крови к органу или в какую-либо область. Как более подробно рассматривается далее, это можно осуществить с помощью инъекции композиции по настоящему изобретению, подавляющей развитие кровеносных сосудов, в нужный кровеносный сосуд через селективно размещенный катетер (см. фиг.13). Композиция перемещается с потоком крови до тех пор, пока он не застревает в сосудистой системе, при этом физически (или химически) закупоривая кровеносный сосуд, уменьшение или прекращение тока крови к выбранной области приводит к инфаркту органа (смерти клеток вследствие неадекватного поступления кислорода или питательных веществ) или уменьшению потери крови из поврежденного сосуда.

Композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, используемые при эмболизационной терапии, преимущественно являются нетоксичными, тромбогенными, должны легко вводиться с помощью сосудистого катетера, должны быть непрозрачными для рентгеновских лучей, оказывать быстрое и длительное воздействие, быть стерильными и легко получаться в различной форме или различного размера в процессе использования. Далее, композиции преимущественно должны приводить к медленному (в идеале - в течение от нескольких недель до нескольких месяцев) высвобождению фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов. Наиболее предпочтительные композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, должны обеспечивать после инъекции в сосудистую систему получение частиц ожидаемого размера, составляющего 15-200 мкм. Они преимущественно не должны комковаться с образованием больших по размеру частиц как в растворе, так и после инъекции, Далее, предпочтительные композиции не должны изменять свою форму или физические свойства во время хранения перед их использованием.

Можно называть по крайней мере три варианта использования эмболизационной терапии с целью помочь в устранении опухолей: (1) непосредственное лечение опухолей (обычно доброкачественных); (2) предоперационная эмболизация и (3) паллиативная эмболизация. Если коротко, то доброкачественные опухоли можно иногда успешно лечить, применяя лишь эмболизационную терапию. Примерами таких опухолей являются простые опухоли сосудистого происхождения (в частности, гемангиомы), эндокринные опухоли, такие как аденомы паращитовидной железы, и доброкачественные костные опухоли.

Для других опухолей (в частности, почечной аденокарциномы) предоперационная эмболизация может использоваться за несколько часов или дней до хирургического иссечения, с целью уменьшения потери крови при операции, сокращения длительности операции и уменьшения риска распространения жизнеспособных злокачественных клеток при хирургических манипуляциях с опухолью. Предоперационная эмболизация с успехом проводится для многих опухолей, в том числе, например, для носоглоточных опухолей, опухолей шейного гломуса, менингиом, нехромаффинных параганглиом и невромы блуждающего нерва.

Эмболизация может быть также использована в качестве главного метода лечения неоперабельных злокачественных опухолей с целью продлить существование пациентов с болезнью в развившейся стадии. Эмболизация может привести к заметному улучшению качества жизни пациентов со злокачественными опухолями, облегчая неприятные симптомы, такие как кровотечение, закупорка вен и сдавливание трахеи. Тем не менее наибольшая польза от паллиативной эмболизации опухоли может наблюдаться у пациентов, страдающих от гуморальных эффектов злокачественных эндокринных опухолей, когда метастазы раковых опухолей и других эндокринных новообразований, таких как инсулиномы и глюкагономы, могут расти медленно, вызывая тем не менее особенно тяжелые расстройства вследствие вызываемых ими болезней эндокринной системы.

В общем случае эмболизационная терапия с использованием композиции по настоящему изобретению, подавляющей развитие кровеносных сосудов, проводится аналогично независимо от конкретного места. Если коротко, то вначале проводится ангиография (картографирование направления кровеносных сосудов) подвергаемой эмболизации области путем введения непрозрачного в рентгеновских лучах контрастного материала с помощью катетера, размещенного в артерии или вене (в зависимости от подвергаемого эмболизации места) в процессе рентгеноскопии. Катетер может вводиться как чрескожно, так и хирургическим способом. Затем проводят эмболизацию сосуда путем инъекции через катетер композиции по настоящему изобретению, подавляющей развитие кровеносных сосудов, до тех пор пока ток не прекратиться. Закупорку можно подтвердить, повторно сняв ангиограмму.

Эмболизационная терапия обычно приводит к распределению композиции, содержащей подавляющие развитие кровеносных сосудов факторы, внутри пустот опухоли или сосудистой массы, лечение которых проводится. Физическая масса эмболических частиц, перекрывающая канал артерии, приводит к прекращению поступления крови. Помимо этого присутствие факторов. подавляющих развитие кровеносных сосудов, препятствует образованию новых кровеносных сосудов, которые должны снабжать опухоль или сосудистую массу, усиливая умерщвляющее клетки воздействие, вызванное прекращением подачи крови.

На основании изложенного следует понимать, что с применением композиций по настоящему изобретению могут быть подвергнуты эмболизации самые разнообразные опухоли. Если коротко, то опухоли обычно делятся на два класса: доброкачественные и злокачественные. В доброкачественной опухоли клетки сохраняют свои дифференцированные свойства и не могут делиться совершенно бесконтрольно. Кроме того, опухоль локализована и не метастазирует. В злокачественной опухоли клетки становятся недиференцированными, не соответствуют росту организма и сигналам гормонов и делятся бесконтрольно; опухоль является инвазивной и способна распространяться в отдаленные места (метастазирует).

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения метастазы (вторичные опухоли) печени можно лечить с помощью эмболизационной терапии. Если коротко, то катетер вводят в бедренную или плечевую артерию и перемещают в печеночную артерию, направляя его по артериальной системе, осуществляя контроль методом флюороскопии. Катетер настолько далеко продвигают в дерево печеночной артерии, насколько это необходимо, чтобы полностью блокировать кровеносные сосуды, снабжающие опухоль (опухоли), и в то же время щадя как можно больше артериальных ветвей, которые снабжают нормальные структуры. В идеале это может быть сегмент ветви печеночной артерии, однако может оказаться необходимым блокировать, в зависимости от степени распространения опухоли и ее индивидуального кровяного снабжения, всю печеночную артерию в сторону от гастродуоденальной артерии или даже несколько отдельных артерий. Как только катетер занимает необходимое положение, проводят эмболизацию артерии путем инъекции композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов (как указано ранее), через артериальный катетер до тех пор, пока не прекратится течение в блокируемой артерии, предпочтительно даже после наблюдения в течение пяти минут. Закупорку артерии можно подтвердить путем инъекции непрозрачного в рентгеновских лучах контрастного вещества через катетер и наблюдения методом флюороскопни или с помощью рентгеновского снимка, что сосуд, который ранее наполнялся контрастным веществом, больше им не наполняется. Ту же самую процедуру можно повторить с каждой питающей артерией, которую необходимо закупорить.

Как указано ранее с использованием композиций по настоящему изобретению можно проводить эмболизацию как доброкачественных, так и злокачественных опухолей. Отдельными примерами доброкачественных опухолей печени являются печеночно-клеточная аденома, многополостная гемангинома и локализованная узелковая гиперплазия. Можно лечить также и другие доброкачественные опухоли, которые встречаются более редко и часто не имеют клинических проявлений. Они включают аденомы желчных протоков, кистозные аденомы желчных протоков, фибромы, жировики, лейомиомы, мезотелиомы, тератомы, миксомы и узелковую регенеративную гиперплазию.

Злокачественные опухоли печени обычно делят на две категории: первичные и вторичные. Первичные опухоли обычно возникают непосредственно из тканей, в которых они обнаруживаются. Так, первичные опухоли печени обычно возникают из клеток, которые образуют ткани печени (таких как гепатоциты и желчные клетки). Отдельные примеры первичных злокачественных образований печени, которые можно лечить методом артериальной эмболизации, включают печеночно-клеточную карциному, холлангиоцеллюлярный рак, ангиобластому, цистаденокарциному, плоскоклеточный рак и злокачественную опухоль из эмбриональных печеночных клеток.

Вторичная опухоль или метастаз, представляет собой опухоль, которая возникает где-либо в организме, а затем распространяется в отдаленный орган. Обычными путями продвижения метастаза являются непосредственное врастание в соседние структуры, распространение через сосудистую или лимфатическую систему и проникновение по плоскостям тканей и промежуткам внутри тела (внутрибрюшинная жидкость, спинномозговая жидкость и т.п.). Вторичные опухоли печени являются одной из самых распространенных причин смерти у больных раком пациентов и являются в настоящее время самыми распространенными формами рака печени. Хотя фактически любое злокачественное образование может метастазировать в печень, опухолями, которые с большей вероятностью проникают в печень, являются: рак желудка, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы; меланома; опухоли легких, ротоглотки и мочевого пузыря; лимфома типа Ходжкина и лимфома не типа Ходжкина; опухоли груди, яичника и предстательной железы, каждая из указанных первичных опухолей имеет множество различных типов опухолей (например, существует более 32 различных типов рака яичника), которые можно лечить методом артериальной эмболизации.

Как указано ранее, эмболизационная терапия с использованием композиций по настоящему изобретению, подавляющих развитие кровеносных сосудов, может быть также применена к различным клиническим ситуациям, когда необходимо закупорить кровеносные сосуды. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения артериовенозные злокачественные образования можно лечить путем назначения одной из вышеуказанных композиций. Если коротко, то термин артериовенозные злокачественные образования (сосудистые злокачественные образования) относится к группе заболеваний, при которых возникает по крайней мере одна, а наиболее типично - множество соединений между артериями и венами, что приводит к возникновению локальной опухолеподобной массы, составленной главным образом из кровеносных сосудов. Подобные соединения могут быть как врожденными, так и приобретенными.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения артериовенозные злокачественные образования можно лечить, вводя катетер в бедренную или плечевую артерию и направляя его в питающую артерию, при этом контроль осуществляют методом флюороскопии. Катетер продвигают настолько далеко, насколько это необходимо, чтобы полностью блокировать кровеносные сосуды, снабжающие сосудистое злокачественное образование, и в то же время щадя как можно больше артериальных ветвей, которые снабжают нормальные структуры (в идеале это может быть одна артерия, однако наиболее часто может оказаться необходимым закупорить, в зависимости от степени развития сосудистого злокачественного образования и его индивидуального кровяного снабжения, множество отдельных артерий). Как только катетер занимает необходимое положение, можно провести эмболизацию каждой артерии, используя композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения можно провести эмболизацию с целью лечения состояния избыточного кровотечения. Например, гиперменорея (избыточное кровотечение при менструации) можно легко лечить путем эмболизации маточных артерий. Если коротко, то маточные артерии являются расположенными с двух сторон ответвлениями подвздошной артерии. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения катетер можно ввести в бедренную или плечевую артерию и направить его в каждую маточную артерию, продвигая катетер по артериальной системе под контролем методом флюороскопии. Катетер продвигают настолько далеко, насколько это необходимо, чтобы полностью блокировать кровеносные сосуды матки, щадя при этом как можно больше артериальных ветвей, которые выходят из маточной артерии и снабжают нормальные структуры. В идеале эмболизации может быть подвергнута одна артерия с каждой стороны, однако иногда может оказаться необходимым блокировать, в зависимости от индивидуального кровоснабжения, множество отдельных артерий. Как только катетер занимает необходимое положение, можно провести эмболизацию каждой артерии путем назначения вышеуказанных композиций, подавляющих развитие кровеносных сосудов.

Аналогично можно осуществить артериальную эмболизацию для ряда других состояний, включая, например, острое кровотечение, сосудистые аномалии, расстройства центральной нервной системы и гиперспленичный синдром.

Использование композиций, подавляющих развитие кровеносных сосудов, в качестве покрытий стентов

Как указано ранее, в настоящем изобретении заявляются также стенты, имеющие в общем случае трубчатую структуру (которая охватывает, например, спиральную форму), поверхность которых покрыта описанной выше композицией. Если коротко, то стент представляет собой распорку, обычно имеющую трубчатую форму, которую можно поместить в находящийся внутри тела проход (в частности, желчные протоки), суженный вследствие протекания болезненного процесса (в частности, вследствие врастания опухоли), чтобы предотвратить закрытие или повторное закрытие прохода. Стент функционирует, физически удерживая открытыми стенки прохода внутри тела, в который он помещен.

В соответствии с настоящим изобретением могут использоваться разнообразные стенты, включая, например, стенты пищевода, сосудистые стенты, стенты желчных протоков, стенты поджелудочной железы, стенты мочеточников и уретральные стенты, стенты слезных путей, стенты евстахиевой трубы, стенты фаллопиевой трубы и трахеально-бронхиальные стенты.

Стенты легко доступны из коммерческих источников или могут быть легко изготовлены по известным методикам. Отдельными примерами стентов являются стенты, описанные в Патенте США 4776337, озаглавленном "Expandable Intraluminal Graft, and Method and Apparatus for Implanting and Expandable Intraluminal Graft", Патенте США 5176626, озаглавленном "Indweling Stent", Патенте США 5147370, озаглавленном "Nitinol Stent for Hollow Body Conduits", Патенте США 5064435, озаглавленном "Self-Expanding Prosthesis Having Stable Axial Length", Патенте США 5052998, озаглавленном "Indwelling Stent and Method of Use", и Патенте США 5041126, озаглавленном "Endovascular Stent and Delivery System", которые все приводятся здесь для справок.

Стенты могут быть покрыты композициями по настоящему изобретению, подавляющими развитие кровеносных сосудов, или факторами, подавляющими развитие кровеносных сосудов, с использованием различных способов, в том числе, например: (а) непосредственного нанесения на стент композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов (в частности, путем разбрызгивания на стент пленки полимер/лекарство или путем окунания стента в раствор полимер/лекарство), (b) покрытия стента веществом, таким как гидрогель, которое, в свою очередь, абсорбирует композицию, подавляющую развитие кровеносных сосудов (или вышеуказанного фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов), (с) вплетения нити (или самого полимера, сформированного в виде нити), покрытой композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, в структуру стента, (d) размещения стента в муфте или петле, которая изготовлена или покрыта композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, или (е) изготовления самого стента из композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиция должна надежно прикрепляться к стенту в процессе хранения и в процессе размещения стента и не должна отделяться от стента, когда диаметр стента изменяется при переходе от свернутого состояния в полностью развернутое состояние. Предпочтительные композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, не должны деградировать в процессе хранения, перед размещением стента или при нагревании до температуры тела после расширения внутри тела. Далее, она предпочтительно должна покрывать стент ровно и однородно, при этом ингибитор процесса развития кровеносных сосудов должен быть распределен равномерно, а стент не менять своих контуров. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, должны обеспечивать равномерное, поддающееся расчету и продолжительное высвобождение факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов, в окружающие стент ткани после его развертывания. Для сосудистых стентов, помимо вышеуказанных свойств, композиция не должна приводить к появлению у стента тромбогенных свойств (вызывать образование сгустков крови) или вызывать значительную турбулентность потока крови (большую, чем можно было бы ожидать при размещении непокрытого стента).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы, расширения просветов находящихся внутри тела протоков, которые заключаются в размещении стента в канале, при этом стент имеет в общем случае трубчатую структуру, поверхность которой покрыта композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов (или одним лишь фактором, подавляющим развитие кровеносных сосудов), так что канал расширяется. Ниже приводят различные варианты осуществления настоящего изобретения, где просвет находящегося внутри тела канала расширяют, чтобы устранить закупорку желчных протоков, пищевода, трахеально-бронхиальных каналов, мочеточников или сосудов, кроме того, отдельный пример более подробно рассматривается в Примере 7.

Обычно стенты размещаются аналогичным образом независимо от места и болезни, лечение которой проводится. Если коротко, то с целью определить подходящее место размещения стента, вначале проводят обследование, обычно методами получения диагностического образа, эндоскопии или непосредственным визуальным наблюдением в процессе проведения операции. Направляющий шнур затем вставляют в разрез или в предполагаемое место размещения стента, а по нему перемещают специальный катетер, который позволяет вставлять стент в его сжатом виде. Обычно стенты можно сжать так, что их можно внести через мельчайшие полости с помощью маленьких катетеров, а после того, как они попадают в нужное место, они расширяются до большего диаметра. Расширившись, стент физически препятствует смыканию стенок прохода и заставляет его быть открытым. Таким образом, стенты можно вставлять через маленькие отверстия, но они способны держать открытыми полости или каналы большого диаметра. Стент может быть саморасширяющимся (в частности, стеночный стент или стент Жиантурко), расширяться при надувании (в частности, стент Пальмаца и стент Штреккера) или имплантироваться при изменении температуры (в частности, стент из нитинола).

Маневры по перемещению стента обычно проводят под радиологическим или визуальным контролем, принимая все меры предосторожности к тому, чтобы разместить стент точно поперек сужения в органе, лечение которого проводится. Направляющий катетер затем удаляют, оставляя стент в качестве подпорки. Для подтверждения правильности размещения обычно чаще используют рентгеноскопию.

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения заявляются способы устранения закупорки желчных протоков, которые заключаются в размещении соответствующего стента в желчном протоке, при этом стент имеет в общем случае трубчатую структуру, поверхность которой покрыта вышеуказанной композицией, так что закупорка желчного протока устраняется. Если коротко, то разрастание опухоли обычного желчного протока приводит к прогрессирующей холестатической желтухе, которая несовместима с жизнью. Обычно желчная система, которая перемещает желчь из печени в двенадцатиперстную кишку, наиболее часто закупоривается (1) опухолью, составленной клетками желчного прохода (холангиокарцинома), (2) опухолью, которая вторгается в желчный проток (в частности, при раке поджелудочной железы) или (3) опухолью, которая оказывает внешнее давление и сжимает желчный проток (в частности, увеличенные лимфатические узлы).

Как первичные опухоли печени, так и другие опухоли, вызывающие сжатие дерева желчных протоков, можно лечить с использованием стентов, приведенных в настоящем описании, одним из примеров первичных опухолей являются аденокарциномы (которые также называют опухолями Клатскина, если они обнаруживаются в разветвлении обычного протока печени). Указанные опухоли часто относят к раку печени, холедохолангиокарциномам или железистому раку желчной системы. Доброкачественные опухоли, которые оказывают воздействие на желчные протоки (в частности, аденома желчной системы), и в редких случаях плоскопленочный рак желчных протоков и аденокарциномы желчного пузыря также могут сжимать желчные протоки, а следовательно, привести к непроходимости желчи.

Сжатие дерева желчных протоков в первую очередь является следствием опухолей печени и поджелудочной железы, которые сжимают, а потому закупоривают протоки. Большинство опухолей поджелудочной железы возникает из клеток протоков поджелудочной железы. Эта форма рака характеризуется очень высокой смертностью (5% от всех смертей, вызванных раком; 26000 новых случаев в США ежегодно), при этом среднее время жизни больных составляет 6 месяцев, а до одного года доживает лишь 10% больных. Когда указанные опухоли располагаются в головке поджелудочной железы, они часто вызывают непроходимость желчи, что значительно ухудшает качество жизни пациентов. Хотя все типы опухолей поджелудочной железы обычно называют "раком поджелудочной железы", существуют ее гистологические подтипы, включающие железистый рак, аденосквамозный рак, цистаденокарциному и рак гроздевидных клеток, опухоли печени, как указано ранее, также могут вызывать сжатие дерева желчных протоков и, следовательно, закупорку желчных протоков.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения стент желчного протока вначале помещают в желчный канал одним из следующих способов: с верхнего конца, вводя иглу через стенку брюшной полости и через печень (чрескожно чреспеченочная холангиография); с нижнего конца путем каннелирования желчного протока с помощью эндоскопа, который вводят через рот, желудок или двенадцатиперстную кишку (эндоскопическая дегенеративная холангиография), или прямым рассечением при проведении хирургической операции. Обычно перед хирургической операцией проводят чрескожно чреспеченочную холангиографию, эндоскопическую дегенеративную холангиографию или прямую визуализацию, с целью определения соответствующего участка для размещения стента. Затем через разрез вводят направляющий шнур, а через него пропускают катетер для доставки, который позволяет разместить стент в свернутой форме. Если при диагностике используют чрескожно чреспеченочную холангиографию, то направляющий шнур и катетер помещают через стенку брюшной полости, а если первичные исследования проводят методом эндоскопической дегенеративной холангиографии, то стент вводят через рот. Затем стент размещают, проводя радиологический, эндоскопический или прямой визуальный контроль и принимая специальные меры для того, чтобы стент был размещен точно поперек сужения желчного протока. Катетер для доставки удаляют, и он оставляет стент в виде подпорки, которая удерживает проток открытым. С целью определить, что стент установлен правильно, проводят дальнейшую холангиографию.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения заявляются способы устранения непроходимостей пищевода, которые заключаются в размещении стента в пищеводе, при этом стент в общем случае имеет трубчатую структуру, а его поверхность покрыта вышеуказанной композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что устраняется непроходимость пищевода. Если коротко, то пищевод представляет собой полую трубку, по которой транспортируется пища и жидкости изо рта в желудок. Рак пищевода или инвазия рака из соседних органов (в частности, рака желудка или рака легких) приводит к невозможности проглатывать пищу или слюну. В этом варианте осуществления изобретения перед введением стента необходимо провести предварительное исследование, обычно с помощью назначаемого внутрь соединения бария или методом эндоскопии, с целью определить нужное место размещения стента. Затем через рот вводят катетер или эндоскоп и через блокаду вводят направляющий шнур. Катетер для доставки стента перемещают по направляющему шнуру при радиологическом или эндоскопическом контроле, а стент размещают точно в месте сужения пищевода. Наблюдение после размещения стента, с целью подтверждения правильности установки, можно провести методом флюороскопии с использованием назначаемого внутрь соединения бария.

В других вариантах осуществления изобретения заявляются способы устранения трахеально-бронхиальных закупорок, которые заключаются в размещении трахеально-бронхиалъного стента в трахее или бронхе, при этом стент в общем случае имеет трубчатую структуру, а его поверхность покрыта вышеуказанной композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что устраняется трахеально-бронхиальная закупорка. Если коротко, то трахея и бронхи представляют собой трубки, по которым воздух изо рта или носа подается в легкие. Блокирование трахеи раком, инвазией рака, возникающего в соседних органах (в частности, рака легких), или схлопывание трахеи или бронхов вследствие хондромаляции (размягчения хрящевой ткани) приводит к невозможности дышать. В этом варианте осуществления настоящего изобретения обычно проводят предварительное исследование методом эндоскопии, с целью определения подходящего места для размещения стента. Затем через рот вводят катетер или эндоскоп и через блокаду вводят направляющий шнур. Катетер для доставки стента перемещают по направляющему шнуру, чтобы ввести стент в сжатом состоянии. Стент размещают при радиологическом или эндоскопическом контроле, чтобы установить его точно поперек сужения, затем катетер для доставки извлекают и стент остается в виде подпорки. Наблюдение после размещения стента, с целью подтверждения правильности установки, можно провести методом бронхоскопии.

В другом варианте осуществления изобретения заявляются способы устранения непроходимости мочеиспускательного канала, которые заключаются в размещении уретрального стента в мочеиспускательном канале, при этом стент в общем случае имеет трубчатую структуру, а его поверхность покрыта вышеуказанной композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что устраняется закупорка мочеиспускательного канала. Если коротко, то мочеиспускательный канал представляет собой трубку, соединяющую мочевой пузырь с половым членом. Наружное сужение мочеиспускательного канала по пути его через предстательную железу, вызванное гипертрофией предстательной железы, наблюдается практически у всех мужчин в возрасте старше 60 лет и вызывает прогрессирующие затруднения при мочеиспускании. В этом варианте осуществления настоящего изобретения вначале обычно проводят предварительное исследование методом эндоскопии или уретрографии, с целью определения подходящего места для размещения стента, которое расположено выше внешнего сфинктера мочеиспускательного канала в нижней конце и вблизи шейки мочевого пузыря в верхнем конце. Затем через отверстие полового члена вводят катетер или эндоскоп и продвигают направляющие в мочевой пузырь. Катетер для доставки стента перемещают по направляющим, чтобы установить стент, затем катетер для доставки извлекают и стент расширяется в месте его установки. Наблюдение после размещения стента, с целью подтверждения правильности его установки, можно провести методом эндоскопии или дегенеративной уретрографии.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения заявляются способы устранения закупорки сосудов, которые заключаются в размещении сосудистого стента в кровяном сосуде, при этом стент в общем случае имеет трубчатую структуру, а его поверхность покрыта вышеуказанной композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что устраняется закупорка сосуда. Если коротко, то стенты могут быть размещены в самых разнообразных кровяных сосудах, как артериях, так и венах, с целью предотвращения рецидивирующего стеноза в случае неудачных пластических операций на сосудах, при лечении сужений, которое вероятнее всего будет неудачным, если применить пластическую операцию, и при лечении послеоперационных сужений (в частности, диализного стеноза трансплантанта). Отдельными примерами подходящих стентов являются подвздошный стент, почечный стент и стент коронарных артерий, стент верхней полой вены и диализный трансплантант. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вначале проводят рентгеноангиографию, с целью локализации места установки стента. Практически это осуществляют путем инъекции непрозрачного для рентгеновских лучей контрастного материала, который вводят в артерию или вену с помощью катетера по мере проведения рентгеноскопии. Катетер можно ввести как чрескожно, так и хирургическим способом в бедренную артерию, плечевую артерию, бедренную вену или плечевую вену и продвинуть в соответствующий кровяной сосуд перемещением по сосудистой системе под контролем методом флюороскопии. Затем поперек сосудистого стеноза может быть размещен стент. Наблюдение после размещения стента, с целью подтверждения правильности его установки, можно провести методом ангиографии.

Использование композиций, подавляющих развитие кровеносных сосудов, в хирургических операциях

Как указано ранее, композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут быть использованы при проведении широкого круга хирургических операций. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов (например, в форме аэрозоля или пленки) могут быть использованы для покрытия или нанесения методом распыления на поверхность перед удалением опухоли, чтобы изолировать нормальные окружающие ткани от злокачественных тканей и/или предотвратить распространение болезни в окружающие ткани. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов (в частности, в виде аэрозоля), могут быть доставлены методом эндоскопии для того, чтобы покрыть опухоль или подавить развитие сосудов в нужном месте. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения хирургические петли, покрытые композицией по настоящему изобретению, подавляющей развитие кровеносных сосудов, могут использоваться при проведении операций, в которых могут применяться хирургические петли. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения при хирургической резекции брюшного рака (в частности, после резекции толстой кишки) используют хирургическую петлю с композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, с целью укрепить структуру и сократить количество фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов.

В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения заявляются способы лечения мест иссечения опухоли, которые заключаются в нанесении вышеуказанной композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов, на границы опухоли после проведения операции, так что подавляется локальный рецидив рака и образование новых кровеносных сосудов в указанном месте. В одном из вариантов осуществления изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов (или факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов), наносят непосредственно на место иссечения опухоли (в частности, наносят с помощью тампона, кисти или иным способом, покрывая границы иссечения опухоли композициями или факторами, подавляющими развитие кровеносных сосудов). В качестве альтернативы композиции и факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов, перед нанесением могут включаться в известные хирургические пасты. В соответствии с наиболее предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, наносят после резекции злокачественных образований в печени и после нейрохирургических операций.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, вышеуказанные композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут наноситься на границы иссечения различных опухолей, в том числе, например, опухолей груди, толстой кишки, мозга и печени. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут наноситься на неврологической опухоли после иссечения, так что в этом месте подавляется развитие кровеносных сосудов. Если коротко, то мозг является функционально высоко локализованным, т.е. каждая специфическая анатомическая область выполняет специфические функции. Поэтому именно расположение патологии, а не ее тип наиболее часто имеет решающее значение. Относительно небольшое поражение в ключевой области может оказать гораздо более разрушительное воздействие, чем значительно большее поражение в менее важной области. Аналогично поражение на поверхности мозга можно легко удалить хирургически и в то же время может оказаться, что ту же самую опухоль, расположенную глубже в мозге, удалить невозможно (чтобы добраться до нее, пришлось бы прорезаться через многие важные структуры). Кроме того, по ряду причин опасными могут оказаться даже доброкачественные опухоли: они могут вырасти в ключевой области и привести к значительным поражениям; даже если бы их можно было бы вылечить с помощью хирургической резекции, это может оказаться невозможным, и наконец, если их не остановить, то они могут привести к повышенному внутричерепному давлению. Череп представляет собой замкнутое пространство, которое неспособно расширяться. Поэтому если что-либо вырастает в одном месте, то что-либо другое сжимается в другом месте, и это приводит к развитию высокого внутричерепного давления. Если это состояние оставить без лечения, то могут быть сжаты жизненно важные структуры, что приведет к смерти, частота возникновения злокачественных образований центральной нервной системы составляет 8-16 на 100000. Прогнозы первичного злокачественного образования в мозге являются печальными, среднее время жизни больных составляет менее одного года, даже после хирургического удаления. Указанные опухоли, особенно глиомы, являются преимущественно локальными заболеваниями, которые вновь возникают после операции на расстоянии не более двух сантиметров от первоначального очага болезни.

Отдельными примерами опухолей мозга, которые можно лечить, используя описываемые здесь композиции и методы, являются глиальные опухоли (такие как анапластическая астроцитома, полиаморфная глиобластома, пилоидная астроцитома, олигодендроглиома, эпидендимома, миксопапиллярная эпендимома, субэпендиальная астроцитома, папиллома сосудистого сплетения); нейронные опухоли (в частности, невробластома, ганглионевробластома, ганглионеврома и медуллобластома); опухоли шишковидной железы (в частности, пинеобластома и пинеоцитома); менингеальные опухоли (в частности, менингиома, менингеальная гемангиоперицитома, менингеальная саркома; опухоли клеток периневрия (в частности, невринома (невролеммома) и неврофиброма); лимфомы (в частности, лимфома типа Ходжкина и лимфома не типа Ходжкина (в том числе различные подтипы, как первичные, так и вторичные); врожденные опухоли (в частности, краниофарингиома, эпидермоидная киста, дермоидная киста и коллоидная киста) и метастазирующие опухоли (которые могут развиться практически из любой опухоли, а наиболее часто из опухолей легких и груди, меланомы, опухолей почки и желудочно-кишечного тракта.

Другое терапевтическое использование композиций, подавляющих развитие кровеносных сосудов

Помимо опухолей, с помощью композиций по настоящему изобретению, подавляющих развитие кровеносных сосудов, или факторов, ингибирующих развитие кровеносных сосудов, можно лечить многие другие неонкогенные заболевания, которые характеризуются ненормальным ростом кровеносных сосудов. Отдельными примерами подобных неонкогенных болезней, вызванных развитием кровеносных сосудов, являются образование новых сосудов в роговице, гипертрофированные рубцы и келоиды, пролиферативная диабетическая ретинопатия, ревматоидный артрит, артериовенозные злокачественные образования (рассмотрены ранее), атеросклеротические бляшки, запоздалое заживление раны, гемофилическая атропатия, несращение переломов, синдром Ослера-Вебера, псориаз, пиогенная гранулема, склеродерма, трахома, гиперменорея (рассмотрена ранее) и слипание сосудов.

В частности, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения заявляются способы устранения образования новых сосудов роговицы (в том числе образование новых сосудов в трансплантантах роговицы), которые включают стадию нанесения на роговицу терапевтически эффективного количества указанной выше композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что подавляется образование кровеносных сосудов. Если коротко, то роговица представляет собой ткань, у которой в обычном состоянии отсутствуют кровеносные сосуды. Однако в некоторых патологических ситуациях капилляры могут проникать в роговицу из расположенного вокруг роговицы сосудистого сплетения лимба. В том случае, если в роговице появляются кровеносные сосуды, она мутнеет, что приводит к уменьшению остроты зрения пациента. Если роговица целиком мутнеет, то потеря зрения может стать полной.

Кровеносные сосуды могут проникать в роговицу разными путями и на разную глубину, в зависимости от процесса, который индуцирует образование новых кровеносных сосудов. Эти пути традиционно делятся офтальмологами на следующие типы: трахематозный паннус, лепрозный паннус, фликтенулезный паннус, дегенеративный паннус и глаукомный паннус. В вещество роговицы могут также проникать ветви передней ресничной артерии (это явление носит название интерстициальной васкуляризации), что приводит к нескольким отчетливым клиническим поражениям: концевым петлям, "щетинистым" структурам, зонтичным формам, решетчатым формам, сериям межтканевых дуг кровеносных сосудов (из сосудов наружного слоя склеры) и отклоняющимся от нормы нерегулярным сосудам.

К образованию новых сосудов роговицы может привести широкий круг заболеваний, в том числе инфекция роговицы (в частности, трахома, герпетический кератит, лейшманиоз и онхоцеркоз), иммунологические процессы (в частности, отторжение трансплантантов и злокачественная экссудативная эритема (синдром Стивенса-Джонсона)), ожоги щелочью, травмы, воспаление (вызванное любой из причин), действие токсинов и дефицит питательных веществ, а также осложнения при ношении контактных линз.

Хотя причины образования новых сосудов роговицы могут различаться, ответная реакция роговицы на поражение и последующее врастание сосудов одинаковы независимо от причины. Если коротко, то положение раны играет важную роль, поскольку лишь поражения, которые расположены в пределах критического расстояния от лимба, индуцируют ответный рост кровеносных сосудов. Это вероятно объясняется тем, что ангиогенные факторы, способствующие проникновению кровеносных сосудов, формируются в месте поражения и, чтобы оказать свое воздействие, должны диффундировать к месту расположения ближайших кровеносных сосудов (лимбу). На некотором расстоянии от лимба это становится уже невозможным и нельзя индуцировать рост эндотелия лимба в роговицу. В этом процессе вероятно участвуют несколько факторов, способствующих развитию кровеносных сосудов, многие из которых являются следствием воспалительного отклика. В самом деле, образование новых сосудов роговицы вероятно возникает в связи с инфильтрацией воспалительных клеток, а степень развития новых кровеносных сосудов пропорциональна степени воспалительной реакции. Врастанию кровеносных сосудов способствует также отек роговицы, за счет ослабления структуры вещества роговицы и формирования путей "наименьшего сопротивления", по которым могут расти капилляры.

Вслед за первоначальной воспалительной реакцией рост капилляров в роговицу происходит аналогично тому, как это происходит в других тканях. Происходит стимуляция деления и перемещения обычно неактивных эндотелиальных клеток капилляров и венул лимба. Клетки эндотелия распространяются от сосудов, в которых они первоначально возникли, ферментируют окружающую мембрану и ткани, через которые они продвигаются, и мигрируют к источнику, стимулирующему развитие кровеносных сосудов. В слепых отростках появляется просвет, а затем они срастаются с образованием капиллярных петель. Конечным результатом является образованием сплетений сосудов в веществе роговицы.

Композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, полезны для ингибирования стимулирующего воздействия промоторов развития кровеносных сосудов за счет сокращения деления клеток эндотелия, снижения миграции клеток эндотелия и ослабления активности протеолитических ферментов, которые секретируются эндотелием.

В соответствии с наиболее предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения фактор, подавляющий развитие кровеносных сосудов, может быть приготовлен для местного нанесения в солевом физиологическом растворе (вместе с любыми консервантами или антимикробными средствами, которые обычно применяются в глазных препаратах) и назначаться в виде глазных капель. Раствор фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов, может быть получен в чистой форме и назначаться несколько раз в день. Иначе, композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, полученные как указано ранее, могут также наноситься непосредственно на роговицу. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, готовят вместе с полимером, обладающим адгезией к слизистой оболочке, который связывается с роговицей. В других вариантах осуществления факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут использоваться в добавление к обычной стероидной терапии.

Местная терапия полезна также для профилактики при поражениях роговицы (таких как химичиские ожоги), которые, как известно, с большой вероятностью индуцируют ангиогенный отклик. В этих случаях лечение, также в сочетании со стероидами, может назначаться немедленно, чтобы помочь предотвратить последующие осложнения.

В других вариантах осуществления изобретения вышеуказанные композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут вводиться офтальмологом в виде инъекций непосредственно в вещество роговицы при контроле под микроскопом. Предпочтительное место инъекции может меняться в зависимости от морфологии индивидуального поражения, однако цель назначения состоит в том, чтобы нанести композицию на передний фронт сосудистой сети (т.е. сосудов, разбросанных между кровеносными сосудами и нормальной роговицей). В большинстве случаев это осуществляют с помощью инъекции в перилимбную область роговицы с целью "защитить" роговицу от передних кровеносных сосудов. Этот способ может также использоваться через короткое время после повреждения роговицы, с профилактической целью подавить образование новых кровеносных сосудов. В этом случае вещество можно ввести в виде инъекции в перилимбную область роговицы, расположенную между местом поражения роговицы и нежелательным источником крови из лимба. Указанные способы могут быть также использованы аналогичным образом, чтобы предотвратить инвазию капилляров трансплантированной роговицы. Если инъекции проводятся в форме, медленно выделяющей лекарство, то может потребоваться провести лишь 2-3 инъекции в год. В раствор для инъекции может также добавляться стероид с целью уменьшения воспаления, вызываемого самой инъекцией.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются методы лечения гипертрофических рубцов и келоидов, которые включают стадию нанесения одной из вышеуказанных композиций, подавляющих развитие кровеносных сосудов, на гипертрофированный рубец или келоид.

Если коротко, то залечивание ран и формирование рубца происходит в три стадии: воспаление, разрастание и созревание. Первая фаза, воспаление, начинается в ответ на повреждение, которое является достаточно серьезным, чтобы повредить кожу. Во время этой фазы, которая продолжается от 3 до 4 дней, кровь и тканевая жидкость образуют адгезионный коагулянт и фибриновую сеть, которая служит для связывания поверхностей раны друг с другом. Затем начинается фаза разрастания, при которой наблюдается врастание капилляров и соединительных тканей из краев раны и закрываются дефекты кожи. Наконец, после того как разрастание капилляров и фибропластов закончится, начинается процесс созревания, в ходе которого рубец сжимается и становится менее ячеистым, менее насыщен сосудами и становится гладким и белым, эта последняя фаза может продолжаться от 6 до 12 месяцев.

Если образуется слишком много соединительной ткани и рана долго остается ячеистой, то рубец может стать красным и рельефным. Если рубец остается в пределах границ первоначальной раны, то его называют гипертрофическим рубцом, а если он простирается за пределы первоначального рубца в окружающие ткани, то поражение называют келоидом. Гипертрофические рубцы и келоиды образуются на второй и третьей стадиях рубцевания. Несколько типов ран обладает особенной предрасположенностью к разрастанию клеток эндотелия и фибробластов, в том числе ожоги, открытые раны и раны, вызванные инфекцией. При гипертрофических рубцах в некоторой степени наблюдается созревание и наступает постепенное улучшение. Однако в случае келоидов фактически образуется опухоль, которая может стать весьма большой, спонтанные улучшения в этом случае наблюдаются крайне редко.

Поэтому в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сам по себе фактор, подавляющий развитие кровеносных сосудов, или вышеописанная композиция, подавляющая развитие кровеносных сосудов, непосредственно наносится на гипертрофический рубец или келоид, чтобы предотвратить развитие этих поражений. Частота инъекций зависит от кинетики высвобождения используемого полимера (если он есть) и клинической ответной реакции. Эта терапия имеет особое значение при профилактическом лечении состояний, которые, как известно, приводят к развитию гипертрофических рубцов и келоидов (в частности, ожогов) и предпочтительно инициируются после того, как прошло некоторое время с начала фазы разрастания (приблизительно 14 дней после первоначального поражения), однако до начала развития гипертрофического рубца или келоида.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы лечения реваскуляризационной глаукомы, которые включают стадию введения в глаз терапевтически эффективного количества композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что подавляется развитие кровеносных сосудов.

Если коротко, то реваскуляризационная глаукома представляет собой патологическое состояние, в котором в радужной оболочке глаза возникают новые капилляры. Процесс развития кровеносных сосудов начинается из сосудов, расположенных в области зрачка, и распространяется через корень радужной оболочки в трабекулярную сеть. Фибробласты и другие элементы соединительных тканей связаны с ростом капилляров, и развивается фибрососудистая мембрана, которая распространяется через внутреннюю поверхность радужной оболочки. В конце концов эта ткань достигает угла внутренней полости, где она образует спайки. Указанные спайки в свою очередь слипаются, рубцуются и сжимаются в непосредственной близости от угла внутренней полости. Образование рубца препятствует адекватному удалению тканевой жидкости через угол в трабекулярную сеть, что приводит к возрастанию внутриглазного давления и может привести к слепоте.

Реваскуляризационная глаукома обычно возникает как осложнение после болезней, среди которых преобладает ишемия роговицы. В частности, приблизительно одна треть всех пациентов с указанным расстройством страдает от диабетической ретинопатии, а 28% больных страдают от закупорки центральной роговичной вены. Другие причины включают хроническое отслоение сетчатки, конечную стадию глаукомы, болезни, связанные с закупоркой сонной артерии, ретролентальную фиброплазию, серповидно-клеточную анемию, внутриокулярные опухоли и каротидно-кавернозные свиши. На ранних стадиях реваскуляризационную глаукому можно обнаружить при большом увеличении с помощью биомикроскопа с использованием щелевой лампы, при этом она проявляется в виде маленьких расширенных неорганизованных капилляров (которые не содержат флюоресцеина) на поверхности радужной оболочки. Затем метод гониоскопии показывает прогрессирующее зарастание угла внутренней полости фиброклеточными скоплениями, хотя угол внутренней полости все еще открыт, может оказаться полезной традиционная терапия, однако как только угол закрывается, для снижения давления потребуется хирургическое вмешательство.

Поэтому в одном из вариантов осуществления изобретения факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов (как в виде индивидуальных соединений, так и в виде вышеуказанных композиций, подавляющих развитие кровеносных сосудов) могут наноситься местно на глаза с целью лечения ранних форм реваскуляризационной глаукомы.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут имплантироваться путем инъекции композиции в угол внутренней полости. Это приводит к длительному локальному повышению содержания фактора, ингибирующего развитие кровеносных сосудов, и предотвращает врастание сосуда в эту область. Имплантированные или введенные с помощью инъекции композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, которые помещают между выдвинутыми капиллярами радужной оболочки и углом внутренней полости, способны "защитить" открытый угол от реваскуляризации. Поскольку капилляры не растут на значительном пространстве, занятом композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов, то угол может поддерживаться в раскрытом состоянии. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут также размещаться в любом месте, так что фактор, подавляющий развитие кровеносных сосудов, постоянно выделяется в тканевую жидкость. Это приводит к увеличению содержания фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов, в тканевой жидкости, которая, в свою очередь, омывает поверхность радужной оболочки и ее ненормальные капилляры, создавая тем самым другой механизм доставки медицинского средства. Это лечебное воздействие может оказаться полезным также с точки зрения профилактики и как дополнение к существующим методам лечения.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы лечения пролиферативной диабетической ретинопатии, которые включают стадию ведения в глаза терапевтически эффективного количества композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что образование кровеносных сосудов подавляется.

Если коротко, то патология диабетической ретинопатии, как полагают, аналогична описанной для реваскуляризационной глаукомы, В частности, считается, что фоновая диабетическая ретинопатия переходит в пролиферативную диабетическую ретинопатию под действием кислородной недостаточности сетчатки. В общем случае реваскуляризационные ткани отрастают от зрительного нерва (обычно в пределах 10 мм от края) и от поверхности сетчатки в те области, в которых наблюдается недостаток кровоснабжения. Первоначально капилляры растут между внутренней ограничивающей мембраной сетчаткой и задней поверхностью стекловидного тела. В конце концов сосуды врастают в стекловидное тело и прорастают через внутреннюю ограничивающую мембрану. При сокращении стекловидного тела сосуды вытягиваются, что часто приводит к их разрыву и ослеплению стекловидного тела вследствие кровотечения. Вытягивание фибров из рубца в сетчатке может также привести к ее отслоению.

Обычная терапия включает панретинальную фотокоагуляцию с целью уменьшить количество тканей сетчатки и тем самым уменьшить количество потребляемого сетчаткой кислорода. Хотя эта терапия вначале достаточно эффективна, уровень рецидивов является очень высоким, при этом новые поражения развиваются в других частях сетчатки. Осложнениями при указанной терапии являются ухудшение периферического зрения почти у 50% пациентов, механические царапины на роговице, вызванное действием лазера развитие катаракты, острая глаукома и стимулирование развития кровеносных сосудов под роговицей (что может привести к потере зрения). В итоге эту процедуру используют лишь когда присутствует несколько факторов риска, так что отношение риск/целесообразность складывается явно в пользу хирургического вмешательства.

Таким образом, в соответствии с наиболее предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, пролиферативную диабетическую ретинопатию можно лечить путем инъекции факторов, подавляющих развитие кровеносных сосудов (или композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов), в тканевые жидкости стекловидного тела с целью увеличить локальную концентрацию в сетчатке фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов. Это лечение предпочтительно должно быть начато прежде, чем разовьется серьезное заболевание, лечение которого потребует применения фотокоагуляции. В соответствии с другими способами осуществления настоящего изобретения артерии, которые питают реваскуляризационные поражения, могут быть подвергнуты эмболии (с использованием вышеописанных композиций, подавляющих развитие кровеносных сосудов).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы лечения ретролентальной фиброплазии, включающие стадию введения в глаз терапевтически эффективного количества фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов (или композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов), так что образование кровеносных сосудов ингибируется.

Если коротко, то ретролентальная фиброплазия является состоянием, которое возникает у недоношенных детей, которые получают кислородную терапию. Периферическая сосудистая сеть сетчатки, в частности, на височной стороне полностью формируется лишь в последние дни жизни плода в утробе. Избыточное количество кислорода (даже то количество, которое было бы физиологически необходимым при родах в срок) и образование свободных радикалов кислорода, как полагают, играет важную роль в повреждении кровеносных сосудов недоразвившейся сетчатки. Указанные сосуды сжимаются, а после воздействия кислорода происходит разрушение их структуры. В итоге в периферической области сетчатки перестает происходить процесс развития новых сосудов и возникает ишемия сетчатки. В ответ на ишемию на границе нормальной сетчатки и области сетчатки, испытывающей ишемию, начинается реваскуляризация.

В 75% случаев эти сосуды самопроизвольно исчезают, однако в оставшихся 25% случаев продолжается рост капилляров, сжатие фибрососудистого компонента и вытягивание как сосудов, так и сетчатки. Это приводит к кровотечению в стекловидном теле и/или отслоению сетчатки, которое может привести к слепоте. Следствием этого состояния является приводящая к закрытию угла реваскуляризационная глаукома.

Поскольку часто невозможно определить, какие из случаев разрешатся спонтанно, а какие будут далее усугубляться, то обычное лечение (т.е. хирургическое вмешательство) начинают лишь у пациентов с установленным заболеванием и хорошо развившейся патологией. Этот подход типа "жди и смотри" препятствует раннему хирургическому вмешательству и дает возможность развиться заболеванию у 25% пациентов, проходящих комплексный курс лечения. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения новорожденным с высоким риском развития указанного состояния можно местно назначить факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов (или композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов), с целью сократить сферу распространения ретролентальной фиброплазии. В соответствии с другими способами осуществления настоящего изобретения можно применять инъекции внутрь стекловидного тела и/или внутриглазные импланты композиций, подавляющих развитие кровеносных сосудов. Эти способы особенно предпочтительны в случаях установленных заболеваний с целью снизить необходимость проведения хирургической операции.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения заявляются способы лечения ревматоидного артрита, включающие стадию введения в сустав терапевтически эффективного количества композиции, подавляющей развитие кровеносных сосудов, так что образование кровеносных сосудов подавляется.

Если коротко, то при ревматоидном артрите поражение сустава вызывается комбинацией развития воспалительных тканей (включающих белые кровяные тельца и продукты белых кровяных телец) и тканей паннуса (тканей, составленных из реваскуляризационных тканей, обычных тканей и воспалительных тканей). В общем случае само по себе хроническое воспаление недостаточно для того, чтобы привести к повреждению поверхности сустава, однако формируется постоянный дефицит, как только фибрососудистая ткань ферментирует хрящевую ткань.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов (в том числе вышеуказанные композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов), могут вводиться внутрисуставной инъекцией, в виде хирургической пасты или орального средства (в частности, содержащего талидомид в качестве фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов), чтобы ингибировать формирование кровеносных сосудов внутри сустава. Отдельный пример осуществления указанного способа более подробно рассмотрен ниже в Примере 19.

Как указано выше, в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения заявляются трансплантанты сосудов, представляющие собой синтетическую трубку, поверхность которой покрыта вышеуказанной композицией, подавляющей развитие кровеносных сосудов. Если коротко, то сосудистые трансплантанты являются синтетическими трубками, обычно изготовленными из дакрона или гортекса, которые размещают хирургически, чтобы обойти блокаду артерии, чаще всего от аорты до бедренной артерии или от бедренной артерии до подколенной артерии. Основной проблемой, которая особенно осложняет установку бедренно-подколенных шунтирующих трансплантантов, является формирование субэндотелиальной реакции, напоминающей рубцевание, в стенке кровеносного сосуда, называемой гиперплазией неоинтимы, которая сокращает полость внутри трансплантанта и по соседству с одним из концов трансплантанта и может быть прогрессирующей. Трансплантант, покрытый и содержащий факторы, подавляющие развитие кровеносных сосудов (или вышеописанные композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов), можно использовать с целью ограничения формирования гиперплазии неоинтимы на любом из концов трансплантанта. Затем можно установить трансплантант с использованием обычных методов создания шунтов.

Композиции по настоящему изобретению, подавляющие развитие кровеносных сосудов, могут также использоваться и в других самых разнообразных способах. Например, они могут включаться в хирургический шовный материал с целью предотвратить шовную гранулему, имплантироваться в матку (также как IUD) для лечения гиперменореи или в качестве женского средства контроля за рождаемостью, назначаемого внутрибрюшинно в виде жидкости для промывки полости или для внутрибрюшинной имплантации при лечении эндометриоза и присоединенного к моноклональному антителу, нацеленному против активированных клеток эндотелия, как формы системной химиотерапии, или используют при диагностической интраскопии, когда они присоединяются к несущему радиоактивную метку моноклональному антителу, которое распознает активированные клетки эндотелия.

Следующие примеры приводятся для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Приготовление антиинвазивного фактора

Отрезают плечевой пояс и череп акулы и соскабливают его скальпелем, отделяя все мышцы и связанные с ними соединительные ткани от хряща. Хрящ затем подвергают гомогенизации с помощью гомогенизатора тканей и экстрагируют при непрерывном перемешивании при комнатной температуре в течение 2-5 дней в раствор, содержащий 2,0 М гидрохлорида гуанидина и 0,02 М буфера MES с рН 6.0.

Через 2-5 дней экстракт хряща пропускают через марлю с целью удаления крупных составных частей. Фильтрат далее пропускают через узел ультрафильтрации фирмы "Amicon" с патронами со спиральной намоткой, величина отсечки молекулярного веса которых составляет 100000. Фильтрат (содержащий белки с молекулярным весом менее 100000 дальтон) подвергают диализу по отношению к 0,02 М буфера MES (рН 6,0) с помощью узла ультрафильтрации фирмы "Amicon", который удерживает белки с молекулярным весом более 3000 дальтон. Используя указанный способ, выделяют низкомолекулярные белки и составные части, а также избыточное количество гидрохлорида гуанидина. Диализат концентрируют до конечной величины 9 мг/мл.

Пример 2. Анализ различных средств на ингибирующую активность по отношению к развитию кровеносных сосудов

А. Анализ хорионалантоисной мембраны цыплят

Оплодотворенные эмбрионы цыплят перед получением безоболочечной культуры выдерживают в инкубаторе в течение 3 дней. В соответствии с этой методикой содержимое яиц высвобождают, удаляя оболочку, расположенную вокруг воздушного пространства. Мембрану внутренней оболочки отделяют и противоположный конец оболочки протыкают, чтобы содержимое яйца могло осторожно вылиться из тупого конца. Содержимое яйца выливают в круглодонную стерильную стеклянную чашку и покрывают крышкой от чашки Петри. Помещают в инкубатор с относительной влажностью 90% и с содержанием диоксида углерода 3% и выдерживают в течение 3 дней.

Таксол ("Sigma", Сент-Луис, штат Миссури) смешивают с концентрацией 1, 5, 10, 30 мг на 10 мл аликвоты 0,5%-ного водного раствора метилцеллюлозы. Поскольку таксол не растворяется в воде, для получения тонкодисперсных частиц используют стеклянные шарики. Аликвоты по 10 микролитров полученного раствора высушивают на пленке в течение 1 час с образованием дисков размером 2 мм в диаметре. Высушенные диски, содержащие таксол, осторожно помещают на растущий край каждого образца хорионалантоисной мембраны на 6-й день инкубации, контрольные образцы получают, помещая не содержащие таксола диски на хорионалантоисную мембрану на то же самое время. Через 2 дня экспонирования (8 дней инкубации) исследуют сосудистую систему с помощью стереомикроскопа. Липозин II в виде белого непрозрачного раствора вводят с помощью инъекции в хорионалантоисную мембрану, с целью визуализации деталей сосудов, сосудистую систему неокрашенных живых эмбрионов визуализуют с помощью стереомикроскопа фирмы "Zeiss", который сопрягают с видеокамерой ("Dage-MTI Inc.", Мичиган-Сити, штат Иллинойс). Указанные сигналы передают на дисплей при увеличении в 160 раз и захватывают с помощью системы анализа образа ("Vidas, Rontron", Энкинг, Германия). Негативы образа затем получают с помощью графопостроителя (Модель 3000, "Matrix Instruments", Оранжбург, штат Нью-Йорк).

Мембраны восьмидневных безоболочечных эмбрионов питают 2%-ным глутаровым альдегидом в 0,1 М буферном растворе какодилата натрия; в хорионалантоисную мембрану вводят дополнительное количество комплементсвязываюшего антитела. Через 10 минут in situ хорионалантоисную мембрану удаляют и на 2 час при комнатной температуре помещают в свежий раствор комплементсвязывающего антитела. Затем оставляют ткани промываться на ночь в какодилатном буфере, содержащем 6% сахарозы. Представляющие интерес области подвергают после фиксационной обработке в 1%-ном растворе тетроксида осмия в течение 1,5 час при температуре 4°С. Затем ткани обезвоживают последовательно этанолом, оксидом пропилена и внедряют в смолу Spurr". Полученные срезы разрезают алмазным лезвием, помещают на медную сетку, окрашивают и изучают с помощью электронного микроскопа 1200ЕХ фирмы "Jeol". Аналогично готовят срезы толщиной 0,5 мм и окрашивают их с помощью толуолового голубого для изучения методом оптической микроскопии.

На 11 день развития эмбрионы цыплят используют в методе коррозионного формообразования. Смолу Mercox ("Ted Pella, Inc.", Реддинг, штат Калифорния) вводят в сосудистую систему хорионалантоисной мембраны с помощью гиподермической иглы номер 30. Материал для формообразования включает 2,5 г полимера Mercox CL-2B и 0,05 г катализатора (55%-ная перекись бензоила), время полимеризации которого составляет 5 минут. После инъекции пластику дают дать усадку в течение 1 час при комнатной температуре, а затем в течение ночи при температуре 65°С. Хорионалантоисную мембрану помещают в 50%-ный водный раствор гидроксида натрия, чтобы переработать все органические компоненты. Пластиковые формы затем тщательно промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе, покрывают золотом/палладием и исследуют с помощью электронного микроскопа 501В фирмы "Philips".

Результаты вышеописанных экспериментов приведены на фиг.1-4. Если коротко, то основные характеристики нормальной культуры безоболочечного куриного яйца представлены на фиг.1А. Через 6 дней выдерживания в инкубаторе эмбрионы располагается в центре по отношению к радиально распространяющейся сети кровеносных сосудов; хорионалантоисная мембрана развивается в непосредственной близости от эмбриона. Эти растущие сосуды находятся вблизи поверхности и легко различимы, что делает эту систему идеальной моделью для изучения процесса развития кровеносных сосудов. Живую неокрашенную сеть капилляров хорионалантоисной мембраны можно неинвазивно визуализовать с помощью стереомикроскопа. На фиг.1В показана эта сосудистая область, в которой кровяные элементы клетки внутри капилляров регистрируют с использование интерфейса монитор/компьютер. Трехмерная структура подобной капиллярной сети хорионалантоисной мембраны получена методом коррозионного формообразования и визуализована с помощью сканирующего электронного микроскопа (фиг.1С). Это формование вскрывает нижележащие сосуды, которые простираются в сторону поверхности хорионалантоисной мембраны, где они образуют один слой анастомозных капилляров.

Поперечные сечения хорионалантоисной мембраны показывают внешний эктодерм, составленный двумя слоями клеток, более широкий слой мезодерма, содержащий капилляры, который примыкает к эктодерму, адвентициальную оболочку и внутренний одиночный слой, составленный клетками эндодерма (фиг.1D). Электронная микроскопия позволяет увидеть типичные структурные детали капилляров хорионалантоисной мембраны. Обычно эти сосуды лежат в непосредственной близости от внутреннего слоя эктодерма (фиг.1Е).

Через 48 час воздействия концентрациями таксола, равными 1, 5, 10 или 30 мг, каждую хорионалантоисную мембрану исследуют в живых условиях с помощью стереомикроскопа, снабженного интерфейсом монитор/компьютер, с целью установить воздействие процесса развития кровеносных сосудов. Это приспособление для визуализации используют при увеличении в 160 раз, что позволяет непосредственно наблюдать клетки крови внутри капилляров; при этом можно легко обнаружить и зарегистрировать ток крови в представляющих интерес областях. В этом исследовании подавление развития кровеносных сосудов определяют как область хорионалантоисной мембраны, лишенную сети капилляров и составляющую 2-6 мм в диаметре. В ингибированных областях ток крови в сосудах отсутствует и они наблюдаются лишь в экспериментальных условиях с использованием метилцеллюлозы, содержащей таксола; в контрольных экспериментах с использованием дисков, не содержащих таксола, воздействие на развивающуюся капиллярную систему не наблюдается. Экспериментальные данные в зависимости от дозы таксола при различных концентрациях приведены в таблице I.

Таблица I
Подавление развития кровеносных сосудов таксолом
Концентрация таксола, мкг	Исследованные эмбрионы (положительные/общее количество)	Процент ингибирования
30	31/31	100
10	16/21	76
5	18/25	72
1	6/15	40
Контрольный образец	0/30	0

Типичные хорионалантоисные мембраны, обработанные таксолом (фиг.2А и 2В), показаны вместе с прозрачным диском из метилцеллюлозы, расположенным в центре лишенной сосудов зоны с диаметром 6 мм. При несколько большем увеличении ясно видна периферия указанной лишенной сосудов области (фиг.2С); окружающие функциональные сосуды часто меняют направление в сторону от источника таксола (фиг.2С и 2D). Подобные углы направленного в новую сторону потока крови никогда не наблюдается в нормальных условиях. Другой особенностью воздействия таксола является образование островков крови в лишенной сосудов зоне, что указывает на агрегацию кровяных клеток.

Связанные с воздействием таксола морфологические изменения хорионалантоисной мембраны легко различимы как в оптическом, так и в электронном микроскопе. Для удобства рассмотрения приведены три отличительные фазы при общем переходе от нормального состояния до лишенного сосудов состояния. Вблизи периферии лишенной сосудов зоны в хорионалантоисной мембране отмечается избыток митотических клеток внутри всех трех слоев эмбриона (фиг.3А и 4А). Это повышенное деление митотических клеток также устойчиво наблюдается для эндотелиальных клеток капилляров. Однако места соединения клеток эндотелия остаются незатронутыми и транссудация клеток крови не наблюдается. Последующая деградация хорионалантоисной мембраны характеризуется разрушением и растворением капилляров (фиг.3В и 4В). Предположительно эндотелиальные клетки, обычно захваченные при митотическом делении, все еще сохраняют тесные пространственные связи с клетками крови и располагаются непосредственно рядом с эндодермом; однако эти клетки уже не соединяются между собой. Расположенная в самом центре часть лишенной кровеносных сосудов зоны характеризуется увеличенной толщиной эктодермального и эндодермального слоев (фиг.3С и 4С). Хотя эти слои увеличили свою толщину, клеточные связи остались незатронутыми и слои сохраняют свою структурные особенности. Внутри мезодерма наблюдается множество разбросанных клеток, захваченных при митотическом делении; эти клетки не обладают поляризацией клеток эндотелия, которая наблюдалась в предыдущей фазе. По всей этой лишенной сосудов зоне располагаются деградирующие клетки, что отмечается наличием небольших полостей в тканях и клеточных остатках, непрозрачных при исследовании в электронном микроскопе (фиг.4C).

Таким образом, это исследование показывает, что через 48 час после нанесения таксола на хорионалантоисную мембрану развитие кровеносных сосудов подавляется. Ингибирование развития кровеносных сосудов приводит к формированию лишенной сосудов зоны, которая в зависимости от воздействия таксола характеризуется наличием трех зон. Центральная зона, где воздействие максимально, содержит разрушенные капилляры с вырожденными красными кровяными тельцами; это указывает на то, что межклеточные связи между клетками эндотелия отсутствуют. Клетки эндодерма и эктодерма сохраняют свои межклеточные связи, а потому эти слои эмбриона остаются незатронутыми; однако они слегка утолщены. При приближении к нормальной содержащей сосуды области кровеносные сосуды сохраняют свои связанные комплексы, а потому также остаются незатронутыми. На периферии обработанной таксолом зоны ингибируется рост новых кровеносных сосудов, что проявляется в изменении направления или эффекте "локтя" кровеносных сосудов (фиг.2D).

В областях, обработанных таксолом, наблюдается также обилие клеток, захваченных митотическим делением во всех трех слоях хорионалантоисной мембраны; это явление уникально для таксола, поскольку в предыдущих исследованиях оно не отмечено. Захваченные митозом клетки эндотелия не могут выполнять свои метаболические функции, связанные с развитием новых кровеносных сосудов. Для сравнения лишенная сосудов зона, образующаяся под действием сурамина и ацетата кортизона, не приводит к образованию в хорионалантоисной мембране захваченных при митотическом делении клеток; указанные препараты лишь препятствуют дальнейшему росту кровеносных сосудов в сторону подвергнутой обработке области. Таким образом, хотя указанные средства и являются ингибиторами процесса развития кровеносных сосудов, сохраняется большое количество точек, на которые может нацелиться процесс развития кровеносных сосудов.

Мы наблюдали также воздействие таксола в течение 48 час и обнаружили, что подавление ангиогенеза начинается уже через 9 час после нанесения. Гистологические срезы показывают одинаковую морфологию, которая наблюдается в первой переходной фазе лишенной сосудов зоны после 48 час, что показано на фиг.3А и 4А. Мы также наблюдали развитие реваскуляризационного процесса в ранее наблюдаемой лишенной сосудов зоне. Было показано, что лишенная сосудов зона, образующаяся под действием гепарина и стероидов, подавляющих развитие кровеносных сосудов, реваскуляризуется через 60 час после применения указанных препаратов. В нашем исследовании лишенная сосудов зона, полученная обработкой таксолом, не реваскуляризуется в течение по крайней мере 7 дней после применения препарата, что свидетельствует о потенциально более длительном воздействии.

Пример 3. Инкапсулирование сурамина

1 мл 5%-ного ELVAX (сополимер этилена и винилацетата, сшитый 5% винилацетата) в дихлорметане смешивают с фиксированным количеством натриевой соли сурамина, измельченной до субмикронных размеров. Полученную смесь вносят в 5 мл 5%-ного раствора поливинилового спирта в воде в пробирке с плоским дном. Содержимое пробирок, содержащих различное весовое количество лекарства, затем суспендируют в течение 90 минут при нагревании до 40°С на водяной бане и при автоматическом перемешивании. Смеси извлекают из бани и берут образцы микросфер для определения их размеров. Пробирки центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 5 минут. Жидкость над осадком, содержащую поливиниловый спирт, отделяют и сохраняют для анализа (неинкапсулированное лекарство). Затем микросферы промывают (при вихревом перемешивании) в 5 мл воды и вновь подвергают центрифугированию. Эти промывные воды объемом 5 мл сохраняют для проведения анализа (лекарства, связанного на поверхности микросфер). Далее микросферы замачивают в 50 мкл метанола и при перемешивании добавляют в 1 мл дихлорметана, чтобы растворить ELVAX. Затем микросферы нагревают до температуры 40°С и медленно добавляют при перемешивании 5 мл воды, нагретой до температуры 50°С. При этом происходит мгновенное испарение дихлорметана и натриевая соль сурамина переходит в 5 мл воды. Все три образца затем исследуют на содержание лекарства.

Натриевая соль сурамина поглощает в видимой области спектра с max 312 нм. Поглощение линейно в интервале от 0 до 100 мкг/мл как в водном растворе, так и в 5%-ном растворе поливинилового спирта. Лекарство обладает сильной флюоресценцией с максимумом возбуждения при 312 нм и максимум испускания при 400 нм. Величину флюоресценции можно количественно оценить в интервале от 0 до 25 мкг/мл.

Полученные результаты приведены на фиг.5-10. Если коротко, то распределение размеров микросфер не зависит от включения лекарства в дихлорметане (см. фиг.5 и 6). С хорошим выходом могут быть получены микросферы с размером в интервале от 20 до 60 мкм.

Величина инкапсулирования сурамина является очень низкой (<1%) (см. фиг.8). Однако по мере возрастания содержания в дихлорметане общее количество инкапсулированного лекарства увеличивается, хотя в процентном выражении количество инкапсулированного лекарства уменьшается. Как показано на фиг.7, в 50 мг ELVAX может быть инкапсулировано 50 мкг лекарства. Инкапсулирование натриевой соли сурамина в 5%-ном поливиниловом спирте, содержащем 10% хлорида натрия, показано на фиг.9-10.

Пример 4. Инкапсулирование таксола

500 мкг таксола или баккатина (аналог таксола, получают из компании "Inflazyme Pharmaceuticals Inc.", Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) растворяют в 1 мл смеси 50:50 ELVAX:PLL. Затем получают 3 порции микросфер в устройстве для приготовления растворов (шестишпинделевая исследовательская машина, "VanderKanp, Van Kell Industries Inc.", США) при перемешивании в течение 3 час со скоростью 200 об/мин при температуре 42°С. Полученные таким образом микросферы дважды промывают водой и их размер оценивают с помощью микроскопа.

Определение инкапсулирования проводят с помощью УФ-спектрометра ( max 237 нм, возбуждение флюоресценции при 237 нм, испускание при 325 нм); результаты исследований представлены в квадратных скобках [ ]). При использовании вышеописанной методики из общего количества 500 мкг исходного вещества может быть инкапсулировано 58 мкг (+/-12 мкг) [75 мкг (+/-25 мкг)] таксола. Это соответствует 12% (+/-2,4%) [15% (+/-5%)] от первоначального веса или 1,2% (+/-0,25%) от веса полимера. Через 18 час после выдерживания в сушильном шкафу при температуре 37°С 10,3%(+/-10%)[6%(+/-5,6%)] общего количества таксола было высвобождено из микросфер.

Для баккатина, 100+/-15 мкг [83+/-23 мкг] баккатина может быть инкапсулировано из общего количества 500 мкг исходного вещества. Это соответствует 20% (+/-3%) [17%(+/-5%)] от первоначального веса баккатина и 2%(+/-0,3%) [1,7%(+/-0,5%)] от веса полимера. Через 18 часов после выдерживания в сушильном шкафу при температуре 37°С 55%(+/-13%) [60%(+/-23%)] баккатина высвобождается из микросфер.

Пример 5. Исследование хирургической пасты, содержащей композиции, подавляющие развитие кровеносных сосудов

Крыс Fisher весом приблизительно 300 г анестезируют и делают им поперечный разрез длиной 1 см в верней части брюха. В две из пяти долей печени вводят 0,2 мл физиологического солевого раствора, содержащего один миллион живых клеток гликосаркомы 9L (элюируют непосредственно перед использованием из тканевой культуры), протыкая оболочку печени на глубину 1 см с помощью иглы номер 27. Рану на брюхе зашивают, используя рассасывающийся шовный материал номер 6,0 и кожные скобки, и реакцию антиген-антитело прерывают.

Через две недели метастазы опухоли имеют размер приблизительно 1 см. К этому времени обе печеночные опухоли удаляют и на голые края печени тампоном наносят средство, подавляющее развитие кровеносных сосудов. Крыс делят на две группы: одной половине наносят лишь полимерный носитель, а второй половине наносят композицию, подавляющую развитие кровеносных сосудов.

Крыс умерщвляют на 2, 7, 14, 21 и 84 день после проведения операции на печени. В частности, крыс подвергают легкой смерти, вводя им эутанил в заднюю вену хвоста. Печень, селезенку и оба легких извлекают и для исследования опухолей на предмет наличия ингибирующей активности по отношению к развитию кровеносных сосудов проводят гистологический анализ.

Пример 6. Эмболизация артерий v крыс

Крыс Fisher весом приблизительно 300 г анестезируют. В асептических условиях осуществляют поперечный разрез длиной 1 см в верхней части брюха и находят печень. В две из пяти долей печени вводят 0,2 мл физиологического солевого раствора, содержащего один миллион живых клеток гликосаркомы 9L (элюируют непосредственно перед использованием из тканевой культуры), протыкая оболочку печени на глубину 1 см с помощью иглы номер 27. При вытаскивании иглы в нее вводят 0,1 мл обычного солевого раствора, чтобы предотвратить попадание клеток в брюшинную полость. На место каждого прокола для остановки кровотечения кладут тампон. Рану на брюхе зашивают, используя рассасывающийся шовный материал номер 6,0 и кожные скобки, и добавление анестезирующего средства прекращают. Крыс возвращают в питомник, где они в течение 14 дней получают стандартную пищу, а за это время метастаз опухоли увеличивается до размера 1 см в диаметре. Ту же самую процедуру осуществляют для крыс Westar, используя клеточную линию рака толстой кишки ("Radiologic Oncology Lab, M.D.Anderson", Хьюстон, штат Техас). В этом случае для того, чтобы метастаз опухоли достиг размера 3 см в диаметре, требуется 3 недели.

Через 2 или 3 недели в зависимости от вида крыс применяют ту же самую общую анестезию и делают разрез по средней линии брюха. Слегка ударяют по двенадцатиперстной кишке и находят и иммобилизуют гастродуоденальную артерию. Выше и ниже места разреза в средней части гастродуоденальной артерии делают узлы и в обратном направлении в артерию под контролем с помощью операционного микроскопа вставляют полиэтиленовую 0,038-дюймовую (0,96 мм) трубку. Узел ниже места вставки пережимает артерию, в то время как узел выше места вставки служит для закрепления катетера. Проводят ангиографию, вводя 0,5 мл 60%-ного непрозрачного в рентгеновских лучах контрастного вещества через катетер и наблюдая флюороскопически. Затем проводят эмболизацию печеночной артерии с помощью частиц с размерами 15-200 мкм, подаваемых в обратном направлении через желудочно-кишечный катетер до тех пор, пока поток, наблюдаемый в операционный микроскоп, не прекратится по крайней мере на 30 секунд. Непроходимость печеночной артерии подтверждают, повторяя ангиографию с использованием желудочно-кишечного катетера. При использовании этой методики одна половина крыс получает лишь полимер с размерами частиц 15-200 мкм, а другая половина получает композицию полимер-фактор, подавляющий развитие кровеносных сосудов, с размерами частиц 15-200 мкм. Верхний узел на гастродуоденальной артерии связывают потуже во время извлечения катетера, чтобы обеспечить остановку кровотечения, а печеночную артерию (хотя она и эмболизована) не трогают. Рану на брюхе зашивают, используя рассасывающийся шовный материал номер 6,0 и кожные скобки.

Крыс затем умерщвляют на 2, 7, 14, 21 и 84 день после проведения эмболизации с целью определить эффективность фактора, подавляющего развитие кровеносных сосудов. Если коротко, то проводят местный наркоз и в стерильных условия делают разрез по средней линии. Гастродуоденальную артерию вновь иммобилизуют и после перевязки недалеко от места соединения гастродуоденальной артерии и печеночной артерии (т.е. гораздо выше места первого разреза) через разрез в сосуде вставляют 0,038-дюймовую (0,96 мм) полиэтиленовую трубку, а затем проводят ангиографию. Затем крыс быстро умерщвляют, вводя им эутанил в заднюю вену хвоста. После наступления смерти удаляют печень en bloc вместе с желудком, селезенкой и обоими легкими.

Гистологический анализ проводят на полученном срезе, который окрашивают гематоксилином и эозином (Н и Е). Если коротко, то делают срезы легких через интервал в 1 см и изучают прохождение эмболитического вещества по печеночной артерии и в правую часть при циркуляции. Аналогично делают срезы желудка и селезенки с целью изучения непреднамеренной иммобилизации за счет потока частиц в брюшную полость при боковой циркуляции.

Пример 7. Трансплантация стентов желчных протоков у крыс

Крысам Fisher весом 300 г делают общий наркоз, делают поперечный разрез длиной 1 см в верхней части брюха и находят печень. В ближайшую к поверхности долю печени вводят 0,2 мл физиологического солевого раствора, содержащего один миллион живых клеток гликосаркомы 9L (элюируют непосредственно перед использованием из тканевой культуры), протыкая оболочку печени на глубину 1 см с помощью иглы номер 27. Чтобы остановить кровотечение, на место прокола после удаления иглы кладут тампон. По мере вытаскивания иглы в нее вводят солевой раствор, чтобы предотвратить попадание клеток в брюшинную полость или вдоль пути движения иглы. На место каждого прокола для остановки кровотечения помещают тампон. Общую анестезию прерывают и крыс возвращают в питомник, где они получают обычную пищу.

Через две недели вновь осуществляют общий наркоз и в асептических условиях идентифицируют долю печени, содержащую опухоль, и проводят разрез по средней линии. Затем сквозь оболочку печени в опухоль вводят ангиографическую иглу номер 16, через иглу вводят 0,038-дюймовый (0,96 мм) направляющий шнур и иглу вынимают. Вдоль направляющего шнура в опухоль вводят французский расширитель номер 5, затем вдоль направляющего шнура вводят французский катетер для доставки номер 5 с находящимся в нем в сжатом состоянии стальным стеночным стентом (5 мм в диаметре и 1 см в длину). Стент размещают внутри опухоли и катетер для доставки извлекают. Одной трети крыс внутри опухоли размещают обычные стальные стенты, одной трети крыс внутри опухоли размещают стальные стенты, покрытые полимером, а одной трети крыс внутри опухоли размещают стальные стенты, покрытие композиций полимер-фактор, подавляющей развитие опухоли. Общий наркоз прерывают и крыс возвращают в питомник.

Через два дня проводят простое флюороскопическое обследование с целью определения степени раскрытия стента, крыс умерщвляют на 2, 7, 14, 28 и 56 день после размещения стента, вводя эутанил, и их печень удаляют en bloc после наступления смерти. После фиксирования в формальдегиде в течение 48 час печень разрезают с интервалом 0,5 мм; одновременно проводят и поперечный разрез стента, используя каждый раз новое лезвие. Гистологические разрезы окрашивают с помощью гематоксилина и эозина и анализируют с целью определить степень врастания опухоли в полость стента.

Пример 8. Изготовление микросфер

Оборудование, которое является предпочтительным для изготовления микросфер, которые описываются ниже, включает стакан (из кимакса или пирекса) емкостью 200 мл с водяной рубашкой, водяную баню с циркуляцией фирмы "Haake", размещаемую сверху мешалку и контроллер диаметром 2 дюйма (50,8 мм) (4-лопастная мешалка пропеллерного типа из нержавеющей стали фирмы "Fisher"), стеклянный стакан емкостью 500 мл, магнитную мешалку с подогревом (от фирмы "Corning"), 4×50 мл полипропиленовые трубки для центрифуги (от фирмы "Nalgene"), стеклянные пробирки для сцинтилляции с пластиковыми крышечками, настольную центрифугу (от фирмы "GPR Beckman"), высокоскоростную напольную центрифугу (модель JS 21 фирмы "Beckman"), аналитические весы фирмы "Mettler" (модель AJ 100, 0,1 мг), цифровые аналитические весы с верхней загрузкой фирмы "Mettler" (модель АЕ 163, 0,01 мг), автоматическую пипетку (от фирмы "Gilson"). Используемые реагенты включают поликапролактон (PCL) с молекулярным весом от 10000 до 20000 ("Polysciences", Уоррингтон, штат Пенсильвания, США), "промытый" этиленвинилацетат (EVA, промывают с целью удаления антиоксиданта ВНТ), поли(dl)молочную кислоту (PLA) с молекулярным весом от 15000 до 25000 ("Polysciences"), поливиниловый спирт (PVA) с молекулярным весом от 124000 до 186000; гидролизован на 99% ("Aldrich Chemical Co", Миллуоки, штат Висконсин, США), дихлорметан для жидкостной хроматографии высокого разрешения ("Fisher Scientific Co") и дистиллированную воду.

А. Приготовление 5%-ных (вес/об) растворов полимеров

В зависимости от приготавливаемого раствора полимера 1,00 г поликапролактона или поли(dl)молочной кислоты или по 0,50 г поли(dl)молочной кислоты и промытого этиленвинилацетата отвешивают непосредственно в стеклянные пробирки для сцинтилляции емкостью 20 мл. Добавляют 20 мл дихлорметана и пробирки плотно закрывают. Пробирки оставляют при комнатной температуре (25°С) на один час (изредка можно встряхивать) или до тех пор, пока полимер не растворится (раствор должен быть прозрачным). Раствор можно хранить при комнатной температуре по крайней мере две недели.

В. Получение 5%-ного (вес/об) маточного раствора поливинилового спирта

Двадцать пять граммов поливинилового спирта непосредственно отвешивают в стеклянный стакан емкостью 600 мл. Добавляют 500 мл дистиллированной воды и покрытый тефлоном якорь мешалки длиной 3 дюйма (76,2 мм). Стакан накрывают стеклом, чтобы уменьшить потери, вызванные испарением, и помещают в стеклянный стакан емкостью 2000 мл, содержащий 300 мл воды (которая играет роль водяной бани). Поливиниловый спирт перемешивают со скоростью 300 об/мин при температуре 85°С (на мешалке с подогревом фирмы "Corning") в течение 2 час или до полного растворения. Растворение поливинилового спирта можно определить визуально; раствор должен быть прозрачным. Раствор переносят в стеклянный контейнер с завинчивающейся крышкой и хранят при температуре 4°С не более двух месяцев, однако перед использованием или разбавлением раствор необходимо нагреть до комнатной температуры.

С. Методика получения микросфер

В зависимости от размеров изготавливаемых микросфер (см. таблицу II) 100 мл раствора поливинилового спирта (концентрации указаны в таблице II) помещают в стакан с водяной рубашкой емкостью 200 мл. Водяную баню фирмы "Haake" с циркулирующей водой подсоединяют к этому стакану и дают температуре содержимого установиться на уровне 27°С (+/-1°С) в течение 10 минут. В зависимости от размеров изготавливаемых микросфер (см. таблицу II) устанавливают стартовую скорость верхней мешалки, а лопасти мешалки наполовину помещают в раствор поливинилового спирта. Мешалку включают и в перемешиваемый раствор поливинилового спирта добавляют по каплям в течение 2 минут 10 мл раствора полимера (раствор полимера используют в зависимости от типа изготавливаемых микросфер) с помощью автоматической пипетки емкостью 5 мл. Через 3 минуты устанавливают необходимую скорость перемешивания (таблица II) и раствор перемешивают в течение 2,5 час, затем лопасти мешалки вынимают из препарата микросфер и промывают их 10 мл дистиллированной воды так, чтобы промывочный раствор стекал в препарат микросфер. Затем препарат микросфер выливают в стакан емкостью 500 мл и водяную рубашку промывают 70 мл дистиллированной воды, которой также дают стечь в препарат микросфер. 180 мл препарата микросфер затем перемешивают стеклянной палочкой и равными частями выливают в четыре трубки для центрифуги из полипропилена емкостью 50 мл. Затем трубки закрывают крышками и центрифугируют в течение 10 минут (величина ускорения указана в таблице II). Для удаления 45 мл раствора поливинилового спирта от каждой таблетки микросфер применяют автоматическую пипетку емкостью 5 мл или вакуумный отсос.

Таблица II

Требования к концентрации поливинилового спирта, скорости перемешивания и ускорения при центрифугировании для каждого диапазона диаметров микросфер

Стадия получения	Диапазон диаметров микросфер
	30-100 мкм	10-30 мкм	0,1-3 мкм
Концентрация поливинилового спирта	2,5% (вес/об) (т.е. разбавленный дистиллированной водой 5%-ный маточный раствор	5% (вес/об) (т.е. неразбавленный маточный раствор	3,5% (вес/об) (т.е. разбавленный дистиллированной водой 5%-ный маточный раствор
Исходная скорость перемешивания	500+/-50 об/мин	500+/-50 об/мин	3000+/-200 об/мин
Установившаяся скорость перемешивания	500+/-50 об/мин	500+/-50 об/мин	2500+/-200 об/мин
Ускорение при центрифугировании	1000+/-100 g (настольная модель)	1000+/- 100 g (настольная модель)	10000+/-1000 g (высокоскоростная модель)

В каждую пробирку для центрифугирования затем добавляют по пять миллилитров дистиллированной воды и перемешивают, чтобы ресуспендировать микросферы. Затем четыре суспензии микросфер сливают в одну трубку для центрифугирования вместе с 20 мл дистиллированной воды и центрифугируют еще в течение 10 минут (ускорение указано в таблице II). Эту процедуру повторяют еще дважды, т.е. всего три раза. Микросферы затем центрифугируют в последний раз и вновь подвергают дисперсии в 10 мл дистиллированной воды. После последней промывки препарат микросфер переносят в заранее взвешенную стеклянную пробирку для сцинтилляции. Пробирку закрывают крышкой и оставляют на ночь при комнатной температуре (25°С), давая возможность микросферам осесть под действием силы тяжести. Микросферы, размер которых попадает в диапазон от 0,1 до 3 мкм, не оседают под действием силы тяжести, так что они остаются в 10 мл суспензии.

D. Сушка микросфер с диаметром 10-30 мкм или 30-100 мкм

После того как микросферы осели при стоянии в течение ночи при комнатной температуре для удаления жидкости над осадком от седиментированных микросфер используют автоматическую пипетку емкостью 5 мл или вакуумный отсос. Дают микросферам высохнуть в незакрытой пробирке в течение одной недели до тех пор, пока они полностью не высохнут (до постоянного веса пробирки). Более быстрое высушивание может быть достигнуто, если оставить незакрытые пробирки под вытяжным шкафом в токе азота (поток газа составляет приблизительно 10 мл/мин). После полного высушивания (до постоянного веса пробирки) пробирку взвешивают и закрывают крышкой. Снабженную меткой закрытую крышкой пробирку хранят в шкафу при комнатной температуре. Микросферы обычно хранят не более 3 месяцев.

Е. Сушка микросфер с диаметром 0,1-3 мкм

Микросферы с размерами в указанном интервале не оседают, так что их оставляют при 4°С не более чем на четыре недели. Чтобы определить концентрацию микросфер в 10 мл суспензии берут образец в 200 мкл с помощью пипетки и помещают в трубку микроцентрифуги емкостью 1,5 мл. Затем трубку центрифугируют с ускорением 10000 g (настольная микроцентрифуга фирмы "Eppendorf"), жидкость над осадком удаляют и трубке дают высохнуть в течение ночи при температуре 50°С. Затем трубку вновь взвешивают, чтобы определить вес высушенных микросфер внутри трубки.

F. Изготовление микросфер, наполненных таксолом

Для приготовления микросфер, наполненных таксолом, соответствующее количество таксола (в зависимости от процентного содержания таксола, которое необходимо инкапсулировать) помещают непосредственно в стеклянную пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл. Десять миллилитров соответствующего раствора полимера затем добавляют в пробирку, содержащую таксол и перемешивают до тех пор, пока таксол не раствориться.

Аналогично по описанным выше стадиям (С)-(Е) могут быть получены микросферы, содержащие таксол.

Пример 9. Изготовление покрытия стента

Реагенты и оснастка, которую используют в описываемом эксперименте, включают медицинские стенты, приобретаемые у различных изготовителей (в частности, стенты фирмы "Strecker"), и держатель для них, стеклянные пробирки для сцинтилляции с крышками (из пластмассы, которые вставляются внутрь), распылитель для тонкослойной хроматографии, баллон с газообразным азотом, стеклянные пробирки (разного размера, емкость от 1 мл и более), стеклянные стаканы (разного размера), пипетку Пастора, пинцет, поликапролактон с молекулярным весом от 10000 до 20000 ("Polysciences"), таксол ("Sigma Chemical Co", Сент-Луис, штат Миссури, чистота 95%), сополимер этилена и винилацетата (промытый, как указано ранее), поли(d1)молочную кислоту с молекулярным весом от 15000 до 25000 ("Polysciences"), дихлорметан для жидкостной хроматографии высокого разрешения ("Fisher Scientific Co.").

А. Нанесение покрытия на стенты распылением

Следующая методика описывает стандартный метод с использованием гофрированного слоеного стента из металлической проволоки с диаметром 3 мм и длиной приблизительно 3 см. Для стентов большего диаметра используют большие количества растворов полимер/лекарство.

Отвешивают необходимое количество полимера непосредственно в стеклянную пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл и добавляют достаточное количество дихлорметана, чтобы получить раствор с концентрацией 2% (вес/об). Пробирки закрывают крышками и перемешивают смесь для растворения полимера (встряхивают вручную). Собирают стент с вертикальной ориентацией. Это можно осуществить, используя кусочек найлона и привязывая стент к штативу. Помещают это устройство для поддержания стента на высоте 6-12 дюймов (15-30 см) от пола вытяжного шкафа на подставку (в частности, перевернутый стакан емкостью 2000 мл), чтобы можно было осуществить горизонтальное нанесение распылением. С помощью автоматической пипетки переносят нужный объем (минимум 5 мл) 2%-ного раствора полимера в отдельную пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл. Добавляют к раствору соответствующее количество таксола и растворяют, встряхивая закрытую колпачком пробирку.

Перед подготовкой к распылению колпачок с пробирки снимают и погружают корпус распылителя для тонкослойной хроматографии в раствор полимера. Следует отметить, что резервуар распылителя использовать нельзя: роль резервуара играет стеклянная пробирка емкостью 20 мл. Соединяют баллон с азотом с отверстием для ввода газа распылителя. Постепенно увеличивают давление до тех пор, пока не начнется атомизация и распыление. Замечают это давление и используют его в течение всей процедуры. Для нанесения покрытия на стент распыляют жидкость в течение 5 секунд, совершая круговые движения, а затем сушат в течение 15 секунд между каждой порцией распыления. Проводят 5 циклов распыления, вращая стент на 90 градусов и нанося каждый раз покрытие на часть стента. Операцию повторяют, пока не будут покрыты все стороны стента. Во время сушки газовую линию зажимают пальцем, чтобы предотвратить потерю распыляемого продукта. Распыление продолжают до тех пор, пока на полимер не будет нанесено требуемое количество полимера. Это количество может зависеть от конкретного использования стента in vivo. Для определения нанесенного количества полимера стент взвешивают по окончании распыления и сушки стента. Вычитают исходный вес стента из конечного веса, это и составляет количество полимера (плюс таксол), нанесенного на стент. Стенты с покрытием хранят в закрытом контейнере.

В. Нанесение покрытия на стент окунанием

Следующая методика описывает стандартный метод с использованием гофрированного слоеного стента из металлической проволоки с диаметром 3 мм и длиной приблизительно 3 см. Для стентов большего диаметра используют большие количества растворов полимер/лекарство в больших по размеру пробирках.

В стеклянную пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл отвешивают 2 г сополимера этилена и винилацетата и добавляют 20 мл дихлорметана. Накрывают пробирку колпачком и оставляют на 2 час для растворения (часто встряхивая для ускорения процесса растворения). Прямо в пробирку емкостью 1 мл отвешивают известное количество таксола и добавляют 0,5 мл раствора полимера. С помощью стеклянной пипетки Пастера растворяют таксол, осторожно прокачивая раствор полимера. Как только таксол растворится, наклоняют пробирку практически горизонтально (так чтобы вязкий раствор полимера начал растекаться). С помощью пинцета помещают стент в трубку и опускают на дно, дают раствору полимера практически достигнуть горловины пробирки, наклоняя ее ниже горизонтального уровня и возвращая пробирку в исходное состояние с углом чуть больше горизонтального. Медленно вращая стент в пробирке, медленно извлекают стент (приблизительно в течение 30 секунд).

Для просушки устанавливают стент в вертикальное положение. Некоторые из закупоренных перфораций могут трескаться, так что в непрерывной пленке полимера могут возникнуть отверстия. Их можно устранить, повторяя ранее описанную процедуру, однако повторение процедуры также может привести к дальнейшему растрескиванию и получению в целом неровно сформированного покрытия полимера. В общем случае лучше окунать стент всего один раз и отрезать часть стента, где нет растрескиваний на перфорации. Стент с нанесенным методом окунания покрытием хранят в закрытом контейнере.

Пример 10. Изготовление хирургической "пасты"

Как указано ранее, в настоящем изобретении заявляется большое количество полимерсодержащих лекарственных композиций, которые могут быть использованы в различных клинических ситуациях. Например, композиции могут готовиться (1) в виде "термопасты", которая наносится на нужное место в виде жидкости и затвердевает в твердый продукт нужной формы при специфической температуре (в частности, при температуре тела); (2) в виде аэрозоля (в частности, "наноаэрозоля"), который может наносится на нужное место как непосредственно, так и с помощью соответствующего устройства (в частности, эндоскопически) и который затем превращается в твердое вещество, прилипающее к тканям, на которые оно нанесено; (3) в виде плотно прилегающей, гибкой эластичной пленки полимер-ингибитор развития кровеносных сосудов, которую наносят на нужное место как непосредственно, так и с помощью специального устройства и которая преимущественно прилегает к тому месту, на которое она нанесена, и (4) в виде жидкости, содержащей суспензию микросфер в подходящей среде-носителе, которую наносят на нужное место как непосредственно, так и с помощью специального устройства и которая оставляет в месте ее нанесения слой, составленный микросферами. Отдельные примеры каждого из этих вариантов осуществления изобретения более подробно представлены ниже.

А. Методика получения термопасты

Реагенты и оборудование, которое используется для проведения указанных далее экспериментов, включает стерильный стеклянный шприц (емкостью 1 мл), мешалку с обогреваемым столиком фирмы "Corning'"), стеклянную трубку для сцинтилляции емкостью 20 мл, формы для отливки (в частности, кюветы, используемые в методе сканирующей дифференциальной калориметрии, емкостью 50 мкл или внутренняя часть колпачка трубки для центрифуги емкостью 50 мл), скальпель и пинцет, поликапролактон с молекулярным весом от 10000 до 20000 ("Polysciences", Уоррингтон, штат Пеннсильвания, США) и таксол ("Sigma", минимальное содержание 95%).

Непосредственно в пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл отвешивают 5,00 г поликапролактона. Помещают пробирку в стакан емкостью 600 мл, содержащий 50 мл воды. Осторожно нагревают стакан до 65°С и поддерживают эту температуру в течение 20 минут, при этом полимер плавится. Тщательно смешивают известное количество таксола или другого ингибитора образования кровеносных сосудов с расплавленным полимером при 65°С. Выливают расплав полимера в предварительно подогретую (60°С) форму. Перемешивают с помощью шпателя, ускоряя процесс растворения. Дают форме остыть, при этом полимер затвердевает. Нарезают или разбивают полимер на мелкие кусочки (приблизительно размером 2×2 мм). Эти кусочки должны входить в стеклянный шприц емкостью 1 мл. Извлекают поршень из шприца емкостью 1 мл (не удаляя колпачок с его конца) и кладут на весы. Показание весов обнуляют.

Отвешивают 0,5 г кусочков прямо в открытый конец шприца. Устанавливают шприц вертикально (снизу находится колпачок) в стеклянном стакане емкостью 500 мл, содержащем дистиллированную воду с температурой 65°С (мешалка с обогреваемым столиком фирмы "Corning"), так чтобы вода не поступала в баллончик шприца. В этом устройстве полимер полностью расплавляется в течение 10 минут. После того как кусочки полимера расплавились, баллончик извлекают из водяной бани, размещают его горизонтально и удаляют колпачок. Вставляют поршень в баллон шприца и сжимают расплав полимера в вязкую массу в тонком конце баллончика. Закрывают шприц колпачком и дают остыть до комнатной температуры.

Перед использованием шприц можно вновь нагреть до температуры 60°С и вводить содержимое в виде жидкости, которая затвердевает при температуре тела.

В. Методика получения наноаэрозоля

Наноаэрозоль представляет собой суспензию маленьких микросфер в солевом физиологическом растворе. Если микросферы являются очень маленькими (т.е. менее 1 мкм в диаметре), они образуют коллоидный раствор, так что суспензия не седиментирует в поле силы тяжести. Как более подробно поясняется ниже, суспензию микрочастиц с размерами от 0,1 до 1 мкм можно подготовить для нанесения на ткани с помощью ручного распылителя. Оборудование и материалы, которые могут быть использованы для получения наноаэрозоля, включают стакан (из кимакса или пирекса) емкостью 200 мл с водяной рубашкой, водяную баню с циркуляцией фирмы "Haake", размещаемую сверху мешалку и контроллер диаметром 2 дюйма (50,8 мм) (4-лопастная мешалка пропеллерного типа из нержавеющей стали фирмы "Fisher"), стеклянный стакан емкостью 500 мл, магнитную мешалку с подогревом (от фирмы "Corning"), 4×50 мл полипропиленовые трубки для центрифуги (от фирмы "Nalgene"), стеклянные пробирки для сцинтилляции с вставляемыми внутрь пластиковыми крышечками, настольную центрифугу (от фирмы "Beckman"), высокоскоростную напольную центрифугу (модель JS 21 фирмы "Beckman"), аналитические весы фирмы "Mettler" (модель AJ 100, 0,1 мг), цифровые аналитические весы с верхней загрузкой фирмы "Mettler" (модель АЕ 163, 0,01 мг), автоматическую пипетку (от фирмы "Gilson"), стерильные наконечники пипеток, приводящийся в действие насосом пульверизатор (от фирмы "Pfeiffer Pharmaceuticals") емкостью 20 мл, вытяжной шкаф с ламинарным потоком, поликапролактон (PCL) с молекулярным весом от 10000 до 20000 ("Polysciences", Уоррингтон, штат Пенсильвания, США), "промытый" (см. ранее) этиленвинилацетат (EVA), поли(dl)молочную кислоту (PLA) с молекулярным весом от 15000 до 25000 ("Polysciences"), поливиниловый спирт (PVA) с молекулярным весом от 124000 до 186000; гидролизован на 99% ("Aldrich Chemical Co", Миллуоки, штат Висконсин, США), дихлорметан для жидкостной хроматографии высокого разрешения ("Fisher Scientific Co."), дистиллированную воду и стерильный солевой физиологический раствор (от компании "Becton and Dickenson" или эквивалентный).

1. Приготовление 5%-ных (вес/об) растворов полимеров

В зависимости от приготавливаемого раствора полимера 1,00 г поликапролактона или поли(dl)молочной кислоты или по 0,50 поли(dl)молочной кислоты и промытого сополимера этилена и винилацетата отвешивают непосредственно в стеклянные пробирки для сцинтилляции емкостью 20 мл. С помощью мерного цилиндра добавляют 20 мл дихлорметана и пробирки плотно закрывают. Пробирки оставляют при комнатной температуре (25°C) на один час или до тех пор, пока полимер не растворится (изредка можно встряхивать вручную). За процессом растворения полимера можно следить визуально; раствор должен быть прозрачным. Раствор можно хранить при комнатной температуре и использовать в течение двух недель.

2. Получение 3,5%-ного (вес/об) маточного раствора поливинилового спирта

Раствор можно получить по приведенной ниже методике или путем разбавления 5%-ного (вес/об) маточного раствора поливинилового спирта, приготовленного для получения микросфер (см. Пример 8). Если коротко, то 17,5 г поливинилового спирта непосредственно отвешивают в стеклянный стакан емкостью 600 мл. Добавляют 500 мл дистиллированной воды. Помещают в стакан покрытый тефлоном якорь мешалки длиной 3 дюйма (76,2 мм). Стакан накрывают покровным стеклом, чтобы уменьшить потери, вызванные испарением. Стакан помещают в стеклянный стакан емкостью 2000 мл, содержащий 300 мл воды. Он играет роль водяной бани. Поливиниловый спирт перемешивают со скоростью 300 об/мин при температуре 85°С (на мешалке с подогревом фирмы "Corning") в течение 2 час или до полного растворения. Растворение поливинилового спирта можно определить визуально; раствор должен быть прозрачным. Раствор переносят в стеклянный контейнер с завинчивающейся крышкой и хранят при температуре 4°С не более двух месяцев. Однако перед использованием или разбавлением раствор необходимо нагреть до комнатной температуры.

3. Методика получения наноазрозоля

Размещают устройство для перемешивания в вытяжном шкафу. Помещают 100 мл 3,5%-ного раствора поливинилового спирта в стакан с водяной рубашкой емкостью 200 мл. Водяную баню фирмы "Haake" с циркулирующей водой подсоединяют к этому стакану и дают температуре содержимого установиться на уровне 27°С (+/-1°С) в течение 10 минут. Устанавливают стартовую скорость верхней мешалки 3000 об/мин (+/-200 об/мин). Лопасти мешалки наполовину помещают в раствор поливинилового спирта и включают мешалку. В перемешиваемый раствор поливинилового спирта добавляют по каплям в течение 2 минут 10 мл раствора полимера (раствор полимера используют в зависимости от типа изготавливаемого наноаэрозоля) с помощью автоматической пипетки емкостью 5 мл. Через 3 минуты устанавливают скорость перемешивания 2500 об/мин (+/-200 об/мин) и перемешивают в течение 2,5 час. Через 2,5 час лопасти мешалки вынимают из препарата микросфер и промывают их 10 мл дистиллированной воды, так чтобы промывочный раствор стекал в препарат микросфер.

Затем препарат микросфер выливают в стакан емкостью 500 мл. Водяную рубашку промывают 70 мл дистиллированной воды, которой также дают стечь в препарат микросфер. 180 мл препарата микросфер затем перемешивают стеклянной палочкой и равными частями выливают в четыре трубки для центрифуги из полипропилена емкостью 50 мл. Трубки закрывают крышками. Центрифугируют в течение 10 минут с ускорением 10000 g (+/-1000 g). Для удаления 45 мл раствора поливинилового спирта от каждой таблетки микросфер применяют автоматическую пипетку емкостью 5 мл. В каждую пробирку для центрифугирования затем добавляют по пять миллилитров дистиллированной воды и перемешивают, чтобы ресуспендировать микросферы. Затем четыре суспензии микросфер сливают в одну трубку для центрифугирования вместе с 20 мл дистиллированной воды. Чтобы промыть микросферы, центрифугируют препарат наноаэрозоля в течение 10 минут с ускорением 10000 g (+/-1000 g). Удаляют жидкость над таблеткой из микросфер. Добавляют 40 мл дистиллированной воды и перемешивают для ресуспендирования микросфер. Процедуру повторяют еще дважды, т.е. всего три раза. Проводят четвертую промывку, однако используют для ресуспендирования микросфер лишь 10 мл (не 40 мл) дистиллированной. После четвертой промывки препарат микросфер переносят в заранее взвешенную стеклянную пробирку для сцинтилляции.

Пробирку закрывают крышкой и оставляют на 1 час при комнатной температуре (25°С), давая возможность микросферам с диаметром 2 мкм и 3 мкм осесть под действием силы тяжести. Через 1 час верхние 9 мл суспензии удаляют, используя автоматическую пипетку емкостью 5 мл. Помещают эти 9 мл в стерильную трубку для центрифуги емкостью 50 мл, снабженную крышкой. Центрифугируют суспензию с ускорением 10000 g (+/-1000 g) в течение 10 минут. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 20 мл стерильного солевого физиологического раствора. Центрифугируют суспензию с ускорением 10000 g (+/-1000 g) в течение 10 минут. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в стерильном солевом физиологическом растворе. Количество используемого физиологического раствора зависит от конечной требуемой концентрации (обычно 10% вес/об). Тщательно промывают устройство для получения аэрозоля стерильным солевым физиологическим раствором и добавляют суспензию наноаэрозоля в распылитель.

С. Изготовление наноаэрозоля, содержащего таксол

Для приготовления наноаэрозоля, содержащего таксол, используют таксол фирмы "Sigma" (с чистотой 95%). Для получения маточного раствора полимер/лекарство отвешивают соответствующее количество таксола прямо в стеклянную пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл. Это количество определяют в зависимости от процентного содержания таксола в наноаэрозоле. Например, если требуется получить наноаэрозоль, содержащий 5% таксола, то отвешивают 25 мг таксола, поскольку количество добавляемого полимера составляет 10 мл 5%-ного раствора в дихлорметане (см. следующую стадию).

Добавляют 10 мл 5%-ного раствора подходящего полимера в пробирку, содержащую таксол. Пробирку закрывают и перемешивают механически или вручную, чтобы растворить таксол (проверяют полноту растворения таксола визуально). На пробирку наклеивают этикетку, на которой указывают дату изготовления. Препарат должен быть использован в тот же день.

Повторяют описанные выше процедуры, взяв вместо раствора полимера маточный раствор полимер/лекарство (в частности, таксол).

D. Методика получения пленки

Термин "пленка" относится к полимеру, полученному в одной из множества геометрических форм. Пленка может быть тонким эластичным листом полимера или изготовленным из полимера диском с диаметром 2 мм. Форму пленки подбирают таким образом, чтобы ее можно было поместить на ткань, с тем чтобы инкапсулированное лекарство выделялось из полимера в окружающие ткани в течение длительного периода времени. Пленки могут быть получены разными способами, в том числе, например, отливкой и пульверизацией.

В методе получения пленки отливкой полимер либо расплавляют и выливают в форму, либо растворяют в дихлорметане и выливают в форму. Затем полимер соответственно либо затвердевает по мере охлаждения, либо затвердевает по мере испарения растворителя. В методе получения пленки пульверизацией полимер растворяют в растворителе и разбрызгивают на стекло, и при испарении растворителя полимер затвердевает в виде пленки на стекле. Повторным разбрызгиванием можно получить слой полимера на стекле, который можно снять со стекла.

Реагенты и оснастка, которая применяется в указанных экспериментах, включают маленькие стаканчики, мешалку с подогреваемым столиком фирмы "Corning", формы для отливки (в частности, колпачки трубок для центрифуги емкостью 50 мл) и устройство для закрепления форм, пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл с колпачком, который вставляется внутрь, распылитель для тонкослойной хроматографии, баллон с газообразным азотом, поликапролактон с молекулярным весом от 10000 до 20000 ("Polysciences"), таксол ("Sigma", содержание основного вещества 95%), этанол, "промытый" (см. ранее) этиленвинилацетат, поли(dl)молочную кислоту с молекулярным весом от 15000 до 25000 ("Polysciences"), дихлорметан для жидкостной хроматографии высокого разрешения ("Fisher Scientific Co.").

1. Методика получения пленок - формовка из расплава

Непосредственно в маленький стеклянный стакан отвешивают известное количество поликапролактона. Помешают стакан в больший стакан, содержащий воду (играет роль водяной бани) и на 15 минут, или пока полимер не расплавится, помещают на горячую плитку с температурой 70°С. В расплавленный полимер добавляют известное количество лекарства и смесь тщательно перемешивают. Чтобы облегчить образование дисперсии лекарства в расплаве поликапролактона, лекарство можно растворить/суспендировать в небольшом объеме (<10% от объема расплава поликапролактона) абсолютного этанола. Полученную суспензию в этаноле затем смешивают с расплавленным полимером. Выливают расплав полимера в форму и дают остыть. После охлаждения пленку хранят в контейнере.

2. Методика получения пленок - формовка из раствора

Отвешивают известное количество поликапролактона непосредственно в пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл и добавляют необходимое количество дихлорметана, так чтобы концентрация составила 10% (вес/об). Закрывают пробирку пробочкой и перемешивают. Добавляют достаточное количество таксола, чтобы получить нужную конечную концентрацию таксола. Для растворения таксола пробирку встряхивают вручную или осуществляют перемешивание механически. Дают раствору отстояться в течение одного часа (чтобы уменьшить количество пузырьков газа) и медленно выливают в форму. Используют форму в зависимости от необходимой конфигурации изделия. Форму на ночь помещают в вытяжной шкаф, и дихлорметан испаряется. Пленку либо оставляют в форме, либо отслаивают и хранят в закрытом контейнере.

3. Методика получения пленок - разбрызгивание

Отвешивают достаточное количество полимера непосредственно в пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл и добавляют необходимое количество дихлорметана, так чтобы концентрация составила 2% (вес/об). Закрывают пробирку пробочкой и перемешивают, чтобы растворить полимер (встряхивают вручную). Собирают формы в вертикальном положении в подходящем держателе и помещают под вытяжной шкаф, размещают устройство для закрепления форм на высоте 6-12 дюймов (15-30 см) над поверхностью вытяжного шкафа на подходящей подставке (в частности перевернутом стеклянном стакане емкостью 2000 мл), чтобы облегчить горизонтальное разбрызгивание. С помощью автоматической пипетки переносят подходящий объем (минимум 5 мл) 2%-ного раствора полимера в отдельную пробирку для сцинтилляции емкостью 20 мл. К раствору добавляют достаточное количество таксола и растворяют его, встряхивая закрытую колпачком пробирку вручную. Перед подготовкой к распылению колпачок с пробирки снимают и погружают корпус распылителя для тонкослойной хроматографии в раствор полимера. Следует отметить, что резервуар самого распылителя использовать нельзя; роль резервуара играет стеклянная пробирка емкостью 20 мл.

Соединяют баллон с азотом с отверстием для ввода газа-распылителя. Постепенно увеличивают давление до тех пор, пока не начнется атомизация и распыление. Замечают это давление и используют его в течение всей процедуры. Для разбрызгивания формы распыляют жидкость в течение 5 секунд, совершая круговые движения, а затем сушат в течение 15 секунд между каждой порцией распыления. Во время сушки газовую линию зажимают пальцем, чтобы предотвратить потерю распыляемого продукта. Распыление продолжают до тех пор, пока на форму не будет нанесено требуемое количество полимера.

Е. Методика получения нанопасты

Нанопаста представляет собой суспензию микросфер в гидрофильном геле. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения гель или пасту можно намазать на ткани в качестве метода размещения наполненных лекарством микросфер вблизи ткани-мишени. Поскольку она имеет водную основу, паста вскоре разбавляется циркулирующими внутри организма жидкостями, ухудшая прилипаемость пасты и способствуя осаждению микросфер на ближележащих тканях. Поэтому все количество инкапсулированного лекарства стремятся нанести как можно ближе к тканям-мишеням.

Реагенты и оснастка, которые используют в указанных экспериментах, включают стеклянные стаканы, карбопол 925 (для использования в фармацевтике, "Goodyear Chemical. Co."), дистиллированную воду, раствор гидроксида натрия (1 М) в воде, раствор гидроксида натрия (5 М) в воде, микросферы размером в интервале от 0,1 до 3 мкм, суспендированные в воде с концентрацией 20% (см. ранее).

1. Приготовление 5%-ного геля карбопола

Достаточное количество карбопола добавляют в 1 М раствор гидроксида натрия, чтобы получился 5%-ный (вес/об) раствор. Чтобы растворить карбопол в 1 М растворе гидроксида натрия, оставляют смесь приблизительно на 1 час. В течение указанного времени смесь перемешивают стеклянной палочкой. Через час измеряют рН смеси. Низкое значение рН свидетельствует о том, что карбопол растворился не полностью. Необходимо, чтобы величина рН составляла 7,4. Для того чтобы подогнать значение рН, используют 5 М раствор гидроксида натрия. Эту процедуру осуществляют очень медленно, добавляя по каплям 5 М раствор гидроксида натрия в смесь, перемешивают и измеряют величину рН. Чтобы довести рН до величины 7,4, обычно требуется около одного часа. Как только величина рН 7,4 достигнута, закрывают гель и оставляют его на 2-3 час. После этого проверяют, равно ли значение рН 7,4. Если оно изменилось, то вновь доводят его до величины 7,4, добавляя 5 М раствор гидроксида натрия. Оставляют гель еще на несколько часов, чтобы убедиться, что рН стабилизирован на уровне 7,4. Повторяют процедуру до тех пор, пока не будет достигнуто требуемое значение рН и величина его не будет стабильной. После этого гель следует использовать в течение одной следующей недели для приготовления нанопасты.

2. Методика получения нанопасты

Добавляют достаточное количество микросфер с размерами в интервале 0,1-3 мкм в воду для получения 20%-ной суспензии микросфер. Помещают 8 мл 5%-ного геля карбопола в стеклянный стакан. В стакан добавляют 2 мл 20%-ной суспензии микросфер. Используя стеклянную палочку или шпатель, смесь перемешивают, чтобы тщательно распределить микросферы внутри геля. Обычно это занимает 30 минут. Как только микросферы распределились внутри геля, смесь помещают в сосуд на хранение.

Хранят сосуд при температуре 4°С. Нанопасту следует использовать в течение месяца.

Пример 11. Контролируемое выделение таксола из микросфер, изготовленных из смеси сополимера этилена и винилацетата и поли(dl)молочной кислоты. Испытания in vivo микросфер в анализе с использованием хорионалантоисной мембраны цыпленка

В этом примере описывается получение наполненных таксолом микросфер, изготовленных из смеси биоразлагаемого полимера поли(dl)молочной кислоты и небиоразлагаемого сополимера этилена и винилацетата. Кроме того, в условиях in vitro показана скорость выделения и ингибирующая активность таксола. выделившегося из микросфер, нанесенных на хорионалантоисную мембрану, по отношению к развитию кровеносных сосудов.

Реагентами, которые используют в этих экспериментах, являются таксол, который покупают у компании "Sigma Chemical Со." (Сент-Луис, штат Миссури), поли(dl)молочная кислота с молекулярным весом от 15000 до 25000 и полиэтиленвинилацетат (60% винилацетата) (которые покупают у компании "Polysciences", Уоррингтон, штат Пенсильвания), поливиниловый спирт с молекулярным весом от 124000 до 186000, гидролизован на 99% (покупают у компании "AIdrich Chemical Co.", Миллуоки, штат Висконсин), и дихлорметан для жидкостной хроматографии высокого разрешения ("Fisher Scientific Co."). Всюду используют дистиллированную воду.

А. Приготовление микросфер

Микросферы в основном получают по методике, приведенной в Примере 8, используя способ с испарением растворителя. Если коротко, то получают 5%-ные (вес/об) растворы полимера в 20 мл дихлорметана из смесей сополимер этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота с соотношениями от 35:65 до 90:10. К 5 мл 2,5%-ного (вес/об) раствора поливинилового спирта в воде, помещенного в пробирку емкостью 20 мл, по каплям при перемешивании добавляют 1 мл раствора полимера. Шесть аналогичных пробирок устанавливают в аппарат для растворения фирмы "Vanderkamp" с расположенными вверху мешалками и перемешивают со скоростью 200 об/мин. Температуру в пробирках в течение 15 минут повышают от комнатной до 40°С и выдерживают при указанной температуре в течение 2 час. Пробирки центрифугируют с ускорением 500 g и микросферы трижды промывают водой. Для некоторых смесей сополимер этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота образцы микросфер агрегируют при проведении стадии промывки вследствие удаления диспергирующего или эмульгирующего агента - поливинилового спирта. Указанное влияние агрегации можно полуколичественно оценить, поскольку агрегированные микросферы слипаются и полученная полимерная масса плавает на поверхности промывных вод. Этот слой полимера на поверхности сливают при проведении промывок, а оставшиеся в виде таблетки микросферы взвешивают. Процент агрегации определяют из соотношения:

Наполненные таксолом микросферы (0,6% вес/вес) получают, растворяя таксол в 5%-ном (вес/об) растворе полимера в дихлорметане. Используют полимерную смесь сополимер этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота с соотношением 50:50. Фракции микросфер с "большим" размером и фракции микросфер с "маленьким" размером готовят, добавляя по каплям раствор таксол/полимер в 2,5%-ный раствор поливинилового спирта и 5%-ный раствор поливинилового спирта соответственно. Дисперсии перемешивают при температуре 40°С со скоростью 200 об/мин в течение 2 час, центрифугируют и промывают 3 раза водой, как указано ранее. Микросферы сушат на воздухе и размер частиц образца оценивают с помощью оптического микроскопа, снабженного предметным столиком. Для каждого образца определяют 300 микросфер. Готовят контрольные микросферы (без таксола) и размер их определяют, как описано ранее.

В. Эффективность инкапсулирования

Известные количества содержащих таксол микросфер растворяют в 1 мл дихлорметана, добавляют 20 мл 40%-ного раствора ацетонитрила в воде с температурой 50°С и перемешивают до тех пор, пока дихлорметан не испарится. Концентрацию таксола в 40%-ном ацетонитриле определяют методом жидкостной хроматографии высокого разрешения, используя в качестве подвижной фазы смесь вода:метанол:ацетонитрил (37:5:58) со скоростью подачи 1 мл/мин (применяют изократический насос фирмы "Beckman"), колонку С8 с обращенной фазой (фирмы "Beckman") и контролируют с помощью УФ-детектора на длине волны 232 нм. Чтобы определить эффективность высвобождения при использовании указанной методики экстракции, известные количества таксола в интервале 100-1000 мкг растворяют в 1 мл дихлорметана и подвергают по три образца той же процедуре экстракции, как описано ранее. Высвобождение лекарства всегда составляет более 85% и величины эффективности инкапсулирования соответствующим образом корректируются.

С. Изучение выделения лекарства

В снабженные закручивающейся крышкой стеклянные трубки емкостью 15 мл помещают 10 мл 10 мМ забуференного фосфатом физиологического раствора с рН 7,4 и 35 мг содержащих таксол микросфер. Трубки встряхивают при температуре 37°С, через определенные промежутки времени центрифугируют с ускорением 1500 g в течение 5 минут и жидкость над осадком сохраняют для анализа. Таблетки микросфер вновь суспендируют в свежем забуференном фосфатом физиологическом растворе (10 мл) при температуре 37°С и вновь помещают в инкубатор. Концентрации таксола определяют путем экстракции в 1 мл дихлорметана с последующим упариванием досуха в токе азота, растворением в 1 мл 40%-ного раствора ацетонитрила в воде и анализом с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения, как описано ранее.

D. Сканирующая электронная микроскопия

Микросферы помещают на держатель образцов, напыляют на них золото и получают микрофотографии с помощью сканирующего электронного микроскопа Philips 501B с рабочим напряжением 15 кВ.

Е. Изучение хорионалантоисной мембраны

До получения безоболочечной культуры оплодотворенные эмбрионы цыплят выдерживают в инкубаторе 4 дня. Содержимое яиц выдерживают 2 дня в инкубаторе при относительной влажности 90% и концентрации углекислого газа 3%. На шестой день инкубации аликвоты по 1 мг микросфер, содержащих 0,6% таксола, и контрольных микросфер (без таксола) помещают непосредственно на поверхность хорионалантоисной мембраны. По прошествии двух дней исследуют сосудистую систему с использованием стереомикроскола, сопряженного с видеокамерой; сигналы видеокамеры передают на компьютер и делают распечатку.

F. Результаты

Микросферы, полученные из 100%-ного сополимера этилена и винилацетата легко суспендируются в растворе поливинилового спирта, однако энергично агрегируют и коалесцируют или слипаются при последующей промывке в воде для удаления поливинилового спирта. Смешивание сополимера этилена и винилацетата с возрастающими пропорциями поли(dl)молочной кислоты приводит к получению микросфер, которые обладают меньшей тенденцией к агрегации и коалесценции при промывке водой, что показано на фиг.15А. Смесь 50:50 сополимера этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота образует микросферы, обладающие хорошей физической стабильностью, т.е. микросферы остаются дискретными и хорошо суспендируются, при этом агрегация и коалесценция минимальны.

В образцах микросфер с "маленькими" размерами фракций диапазон размеров >95% микросфер (по весу) составляет от 10 до 30 микрон, а в образцах микросфер с "большими" размерами фракций диапазон размеров >95% микросфер (по весу) составляет от 30 до 100 микрон. Отдельные примеры микрофотографий, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа, для наполненных таксолом микросфер 50:50 сополимера этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота в "маленьком" и "большом" диапазоне размеров приведены на фиг.15B и 15С соответственно. Микросферы являются сферическими и имеют гладкую поверхность; на поверхности микросфер не видно присутствия лекарства. Эффективность наполнения микросфер 50:50 сополимера этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота составляет 95-100% при изначальной концентрации таксола в интервале от 100 до 1000 мг таксола на 50 мг полимера. Заметной разницы (t-тест Стьюдента, р<0,05) между эффективностью инкапсулирования "маленьких" и "больших" микросфер не отмечается.

Время высвобождения таксола из 0,6%-ных (вес/об) наполненных 50:50 сополимера этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота приведены на фиг.15D для "маленьких" размеров (незакрашенные кружки) и "больших" размеров (закрашенные кружки) микросфер. Исследования скорости высвобождения проводят, трижды повторяя эксперименты для трех трубок. Профили высвобождения лекарства показывают две фазы: быструю первичную фазу высвобождения таксола или "взрывную" фазу, которая продолжается в течение первых четырех дней для микросфер обоих диапазонов размеров микросфер. За ней следует фаза значительно более медленного высвобождения. Не отмечается значительных различий в скоростях высвобождения между "маленьких" и "больших" микросфер. 10-13% от общего количества содержащегося в микросферах таксола высвобождается в течение 50 дней.

Микросферы, наполненные таксолом (0,6% вес/об), исследуют с помощью анализа с использованием хорионалантоисной мембраны, результаты которого представлены на фиг.15Е. Микросферы, полненные таксолом, высвобождают достаточное количество лекарства, чтобы создать лишенную сосудов зону в окружающих тканях (фиг.15F). Следует отметить, что к микросферам (MS на фиг.15Е и 15F) непосредственно примыкает зона, в которой полностью отсутствуют кровеносные сосуды (зона 1); далее от микросфер располагается область с разрушенными не функционирующими капиллярами (зона 2) и лишь на расстоянии приблизительно 6 мм от микросфер капилляры возвращаются к нормальному состоянию. В хорионалантоисных мембранах, обработанных контрольными микросферами (таксол отсутствует), сохраняется нормальная архитектура сети капилляров.

Обсуждение

Химиоэмболизация артерий является инвазивным хирургическим способом. Таким образом, в идеальном случае, химиоэмболитические составы, содержащие лекарства, подавляющие развитие сосудов, или противораковые лекарства, такие как таксол, высвобождают лекарство рядом с опухолью с концентрациями, достаточными для активного действия в течение длительного периода времени - порядка нескольких месяцев. Сополимер этилена и винилацетата представляет собой совместимый с тканями неразлагаемый полимер, который часто используют для контролируемой доставки макромолекул в течение длительных периодов времени (>100 дней).

Сополимер этилена и винилацетата первоначально выбирают в качестве полимерного биоматериала для приготовления микросфер с растворенным в полимерной матрице таксолом. Однако микросферы, полученные с использованием 100%-ного сополимера этилена и винилацетата, практически полностью агрегируют и коалесцируют при промывке.

Полимеры и сополимеры на основе молочной кислоты и гликолевой кислоты являются физиологически инертными и биосовместимыми и при гидролизе разлагаются на токсикологически приемлемые продукты. Сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты разлагаются гораздо быстрее, чем сополимер этилена и винилацетата, и наполненные лекарством микросферы, приготовленные с использованием указанных сополимеров, как правило, непригодны для продолжительного контролируемого высвобождения лекарства в течение нескольких месяцев. Dollinger и Sawan смешали поли(dl)молочную кислоту с сополимером этилена и винилацетата и показали, что время разложения поли(dl)молочной кислоты возрастает по мере возрастания доли сополимера этилена и винилацетата в смеси.

На фиг.15А показано, что увеличение доли поли(dl)молочной кислоты в смеси сополимер этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота приводит к уменьшению степени агрегации суспензии микросфер. Смеси с содержанием поли(dl)молочной кислоты в матрице сополимер этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота дают физически стабильные суспензии микросфер в воде или забуференном фосфатом солевом физиологическом растворе. Смесь 50:50 сополимер этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота выбирают для проведения дальнейших исследований.

Фракции микросфер с разными диапазонами размеров могут быть получены путем изменения концентрации эмульгатора - поливинилового спирта - в водной фазе. "Маленькие" микросферы получаются при большей концентрации поливинилового спирта, равной 5% (вес/об), в то время как "большие" микросферы получаются при концентрации поливинилового спирта, равной 2,5% (вес/об). Все остальные переменные при синтезе остаются одними и теми же для фракций микросфер обоих размеров. Большие концентрации эмульгатора приводят к более вязкой водной дисперсионной среде и к образованию более мелких капелек полимер/таксол/дихлорметан, эмульгированных в водной фазе и, таким образом, к более мелким микросферам. Наполненные таксолом микросферы содержат от 95 до 100% исходного количества таксола, добавленного в органическую фазу, инкапсулированную в твердых микросферах. Низкая растворимость таксола в воде способствует его перераспределению в органическую фазу, содержащую полимер.

Скорости высвобождения таксола из микросфер 50:50 сополимера этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота являются очень низкими, так что в течение 50 дней выделяется менее 15% содержащегося таксола. Первичная фаза взрывного высвобождения лекарства может быть вызвана диффузией лекарства из приповерхностной области микросфер (расположенных недалеко от поверхности микросфер).

Механизм высвобождения лекарства из неразлагаемых полимерных матриц, таких как сополимер этилена и винилацетата, как полагают, включает диффузию воды сквозь дисперсную фазу лекарства в полимере, растворение лекарства и диффузию растворенного вещества через ряд взаимопроникающих наполненных жидкостью пор. Смеси сополимера этилена и винилацетата и поли(dl)молочной кислоты, как было показано, являются несмешивающимися и образуют две фазы в широком диапазоне от 30 до 70% сополимера этилена и винилацетата в поли(dl)молочной кислоте. При изучении разложения забуференного фосфатом физиологического солевого раствора при 37°С вслед за индукционным или скрытым периодом поли(dl)молочная кислота гидролитически разлагается и подвергается эрозии из полимерной матрицы сополимера этилена и винилацетата : поли(dl)молочная кислота, оставляя неактивный скелет, похожий на губку. Хотя индукционный период и скорость разложения и эрозии поли(dl)молочной кислоты в полимерной матрице зависит от пропорции поли(dl)молочной кислоты в матрице и от процесса получения. Поли(dl)молочная кислота практически не теряется в течение 40-50 дней.

Хотя некоторая эрозия поли(dl)молочной кислоты из микросфер 50:50 сополимер этилена и винилацетата: поли(dl)молочная кислота могла произойти в течение 50 дней при исследовании скорости высвобождения лекарства в условиях in vitro (фиг.15С), наиболее вероятно, что основным механизмом высвобождения лекарства из смеси полимеров является диффузия растворенного вещества сквозь сеть пор в полимерной матрице.

По завершении исследования скорости высвобождения лекарства микросферы анализируют на остаточное содержание лекарства. Процентное содержание оставшегося таксола, сохраняющееся в течение 50 дней инкубации образца микросфер, составляет 94% (+/-9%) и 89% (+/-12%) для фракций микросфер с "большими" и "маленькими" размерами.

Микросферы, наполненные 0,6 мг на 1 г полимера (0,6%), обеспечивают активное подавление процесса развития кровеносных сосудов при размещении на хорионалантоисной мембране цыпленка (фиг.15Е и 15F).

Пример 12. Инкапсулирование таксола в микросферах поли( -капролактона). Подавление развития кровеносных сосудов наполненными таксолом микросферами в анализе с использованием хорионалантоисной мембраны

В этом примере оценивается профиль скорости выделения таксола из биоразлагаемых микросфер поли( -капролактона) в условиях in vitro и показана ингибируюшая активность таксола, выделившегося из микросфер, при нанесении на хорионалантоисную мембрану, по отношению к развитию кровеносных сосудов.

Реагентами, которые используют в этих экспериментах, являются поли( -капролактон) с молекулярным весом 35000-45000, который покупают у компании "Polysciences" (Уоррингтон, штат Пенсильвания), дихлорметан ("Fisher Scientific Co.", Канада), поливиниловый спирт (PVP) с молекулярным весом 12000-18000, гидролизован на 99% (покупают у компании "Aldrich Chemical Co.", Миллуоки, штат Висконсин), и таксол от компании "Sigma Chemical Co." (Сент-Луис, штат Миссури). Если специально не оговаривается, все реактивы используют без дальнейшей очистки, всюду применяют дистиллированную воду.

А. Приготовление микросфер

Микросферы в основном получают по методике, приведенной в Примере 8, используя способ с испарением растворителя. Если коротко, то микросферы с 5%-ным (вес/вес) содержанием таксола получают, растворяя 10 мг таксола и 190 мг поликапролактона в 2 мл дихлорметана. добавляя 100 мл 1%-ного раствора поливинилового спирта PVP и перемешивая со скоростью 1000 об/мин при температуре 25°С в течение 2 час. Суспензию микросфер центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 10 минут ("Beckman GPR"), жидкость над осадком сливают и микросферы трижды промывают водой, микросферы сушат на воздухе и хранят при комнатной температуре. Контрольные микросферы (без таксола) получают, как указано ранее, получают также микросферы, содержащие 1% и 2% таксола. Размер микросфер определяют с помощью оптического микроскопа, снабженного предметным столиком.

В. Эффективность инкапсулирования

Известные количества содержащих таксол микросфер (приблизительно 5 мг) растворяют в 8 мл ацетонитрила и для осаждения полимера добавляют 2 мл воды. Смесь центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 10 минут и количество инкапсулированного таксола определяют по поглощению жидкости над осадком с помощью УФ-спектрометра (спектрофотометр с диодной матрицей Hewlett-Packard 8452А) на длине волны 232 нм.

С. Изучение выделения лекарства

Приблизительно 10 мг содержащих таксол мембран суспендируют в 20 мл 10 мМ забуференного фосфатом физиологического раствора с рН 7,4 в снабженных закручивающейся крышкой стеклянных пробирках. Пробирки встряхивают, переворачивая вверх-вниз при температуре 37°С и через определенные промежутки времени удаляют 19,5 мл жидкости над осадком (предварительно дав микросферам осесть на дно), отфильтровывают через мембранный фильтр с размерами пор 0,45 мм и сохраняют фильтрат для анализа на таксол. В каждую пробирку доливают равный объем забуференного фосфатом физиологического раствора, чтобы поддерживать одинаковые условия осаждения в течение всего эксперимента. Фильтрат экстрагируют 3×1 мл дихлорметаном, экстракты в дихлорметане упаривают досуха в токе азота, вновь растворяют в 1 мл ацетонитрила и анализируют методом жидкостной хроматографии высокого разрешения, используя в качестве подвижной фазы смесь вода : метанол : ацетонитрил (37:5:58) со скоростью подачи 1 мл/мин (изократический насос фирмы "Beckman"), колонку С8 с обращенной фазой ("Beckman") и УФ-детектор (Shimadzu SPD А) на длине волны 232 нм.

D. Изучение хорионалантоисной мембраны

До получения безоболочечной культуры оплодотворенные эмбрионы цыплят выдерживают в инкубаторе 4 дня. На шестой день инкубации аликвоты по 1 мг микросфер, содержащих 5% таксола, и контрольных микросфер (без таксола) помещают непосредственно на поверхность хорионалантоисной мембраны. По прошествии двух дней исследуют сосудистую систему с использованием стереомикроскопа, сопряженного с видеокамерой; сигналы видеокамеры передают на компьютер и делают распечатку.

Е. Сканирующая электронная микроскопия

Микросферы помешают на держатель образцов, напыляют на них золото и получают микрофотографии с помощью сканирующего электронного микроскопа Philips 501В с рабочим напряжением 15 кВ.

F. Результаты

Диапазон размеров для образцов микросфер лежит в интервале 30-100 мкм, хотя во всех наполненных таксолом и контрольных микросферах некоторые микросферы выпадают из этого диапазона. Эффективность наполнения поликапролактоновых микросфер таксолом всегда составляет более 95% для всех изученных лекарств, сканирующая электронная микроскопия показывает, что все микросферы имеют сферическую форму с шероховатой и покрытой ямками поверхностью. На поверхности микросфер не наблюдается следов твердого лекарства.

Выделение таксола с течением времени из поликапролактоновых микросфер, наполненных 1%, 2% и 5% таксола, показано на фиг.16А. Профили скорости высвобождения показывают две фазы. Для всех нагрузок лекарства существует первоначальная быстрая или "взрывная фаза" выделения таксола. Взрывная фаза продолжается в течение 1-2 дней для концентраций таксола 1% и 2% и 3-4 дня для 5%-ных микросфер. За первой фазой быстрого выделения следует фаза относительно медленного высвобождения лекарства. Для микросфер, содержащих 1% или 2% таксола, выделения таксола через 21 день не наблюдается. При нагрузке таксола, равной 5%, микросферы через 21 день выделяют 20% от общего содержания лекарства.

На фиг.16В показана хорионалантоисная мембрана, обработанная контрольными поликапролактоновыми микросферами, и на фиг.16С показана обработка 5%-ными микросферами, загруженными таксолом. Хорионалантоисная мембрана с контрольными микросферами показывает обычную архитектуру сети капилляров. Хорионалантоисная мембрана, обработанная поликапролактоновыми микросферами, наполненными таксолом, показывает явно выраженную регрессию сосудов и зоны, в которых сеть капилляров отсутствует.

G. Обсуждение

Метод получения наполненных таксолом микросфер испарением растворителя позволяет добиться очень высокой эффективности инкапсулирования таксола, составляющей 95-100%. Это объясняется плохой растворимостью таксола в воде и его гидрофобностью, которая способствует перераспределению таксола в фазу органического растворителя, содержащего полимер.

Двухфазный профиль выделения таксола является типичным для высвобождения многих лекарств из биоразлагаемых полимерных матриц. Поли( -капролактон) представляет собой алифатический полиэфир, который может разлагаться при гидролизе в физиологических условиях, нетоксичен и совместим с тканями. Разложение поликапролактона протекает заметно медленнее, чем разложение интенсивно изучаемых полимеров и сополимеров молочной и гликолевой кислот, а потому он удобен для разработки систем для продолжительной доставки лекарства. Первоначальная фаза или взрывная фаза высвобождения таксола, как полагают, вызвана диффузией лекарства из приповерхностной области микросфер (расположенных недалеко от поверхности микросфер). Высвобождение таксола во второй (медленной) стадии профиля высвобождения, вероятно, не связано с разложением или эрозией поликапролактона, поскольку исследования показывают, что в условиях in vitro в воде не наблюдается значительной потери веса или эрозии поверхности поликапролактона в течение 7,5 недель. Более медленная фаза выделения таксола, вероятно, связана с растворением лекарства внутри наполненных жидкостью пор в полимерной матрице и диффузией через поры. Большая скорость высвобождения при больших нагрузках таксола, вероятно, является результатом более интенсивной сети пор внутри полимерной матрицы.

Было показано, что микросферы, содержащие 5% лекарства, высвобождают достаточное его количество, чтобы вызвать активное подавление процесса развития кровеносных сосудов при размещении на хорионалантоисной мембране. Ингибирование роста кровеносных сосудов приводит к появлению лишенной сосудов зоны, как это показано на фиг.16С).

Пример 13. Наполненные таксолом полимерные пленки, составленные этиленвинилацетатом и поверхностно-активным соединением

В основном получают пленки двух типов, как указано в Примере 10: пленки из этиленвинилацетата, наполненные таксолом, и смешанные пленки этиленвинилацетат/поверхностно-активное вещество (т.е. Pluronic F127, Span 80 и Pluronic L101), наполненные таксолом.

Исследованные поверхностно-активные вещества представляют собой гидрофобные поверхностно-активные вещества (Span 80 и Pluronic L101) и одно гидрофильное поверхностно-активное вещество (Pluronic F127). Плюроновые поверхностно-активные вещества сами являются полимерами, что является привлекательным, поскольку их можно смешать с этиленвинилацетатом, чтобы оптимизировать различные свойства по доставке лекарств. Span 80 представляет собой маленькую молекулу, которая тем или иным способом диспергируется в полимерной матрице и не образует смеси.

Поверхностно-активные вещества полезны для модифицирования скорости высвобождения таксола из пленок и оптимизации определенных физических свойств пленок. Одним свойством смешанных пленок, содержащих поверхностно-активное вещество, которое указывает на то, что можно контролировать скорости высвобождения. является их способность изменять скорость и степень набухания соединения в воде. Диффузия воды в матрицу полимер-лекарство критична для высвобождения лекарства из носителя. Фиг.17С и 17D показывают степень набухания пленок и как при этом изменяется содержание поверхностно-активного вещества в смеси. Пленки из чистого этиленвинилацетата не набухают в сколько-нибудь заметной степени в течение двух месяцев. Однако увеличивая содержание добавляемого к этиленвинилацетату поверхностно-активного вещества, можно увеличить степень набухания соединения, кроме того, набухание можно увеличить, повышая гидрофильность.

Результаты экспериментов с указанными пленками представлены далее на фиг.17А-Е. Если коротко, то фиг.17А показывает высвобождение таксола (в мг) с течением времени из пленок, полученных из чистого этиленвинилацетата. На фиг.17В указано процентное содержание таксола, остающегося в тех же пленках, как видно из этих двух чертежей, при увеличении нагрузки таксола (т.е. по мере увеличения весового процентного содержания таксола) скорость высвобождения лекарства возрастает, показывая ожидаемую концентрационную зависимость. По мере увеличения нагрузки таксола процент таксола, остающегося в пленке, возрастает, что указывает на то, что большая нагрузка является более предпочтительной для составов, предназначенных для длительного действия.

Физическая прочность и эластичность пленок исследуется на фиг.17Е. Если коротко, то фиг.17Е показывает кривые зависимости напряжения от деформации для пленок из чистого этиленвинилацетата и смесей этиленвинилацетат-поверхностно-активное вещество. Эти приближенные измерения напряжений показывают, что эластичность пленок возрастает по мере добавления Pluronic F127, а прочность на разрыв при пластической деформации увеличивается в зависимости от увеличения концентрации по мере добавления Pluronic F127. Эластичность и прочность являются важными параметрами при приготовлении пленки, которую можно использовать в конкретных медицинских целях, так чтобы не наблюдалась деформация материала.

Приведенные выше данные показывают способность определенных поверхностно-активных веществ контролировать высвобождение скорости высвобождения лекарства и изменять физические свойства носителя.

Пример 14. Включение метоксиполиэтиленгликоля 350 (MePEG) в поли( -капролактон) при получении композиции для контролируемой доставки таксола из пасты

Реагенты и оснастка, которую используют в этих экспериментах, включает метоксиполиэтиленгликоль 350 (MePEG), получаемый из компании "Union Carbide" (Дэнбери, штат Коннектикут). Метоксиполиэтиленгликоль 350 представляет собой жидкость при комнатной температуре и затвердевает при температуре от 10 до минус 5°С.

А. Получение таксолсодержащей пасты на основе MePEG/PCL

Пасту на основе MePEG/PCL получают, растворяя некоторое количество таксола в MePEG, а затем поликапролактон. Одно из преимуществ этого способа заключается в том, что не требуется применения дихлорметана.

В. Изучение температуры плавления

Температура плавления полимерных смесей PCL/MePEG может быть определена методом дифференциальной сканирующей калориметрии в интервале температур от 30 до 70°С со скоростью нагревания 2,5°С в минуту. Результаты этого эксперимента представлены на фиг.18A и 18В. Если коротко, то как показано на фиг.18А, температура плавления полимерной смеси (по данным термического анализа) уменьшается по мере увеличения содержания MePEG. Зависимость температуры плавления полимерных смесей от концентрации MePEG приведена на фиг.18А. Эти низкие величины температуры плавления приводят в итоге к увеличению времени необходимого для затвердевания расплавов полимерных смесей, как это показано на фиг.18В. Для затвердевания расплава смеси 30:70 MePEG/PCL требуется вдвое больше времени, чем для самого поликапролактона.

С. Измерение хрупкости

Введение MePEG в поликапролактон. видимо, приводит к получению менее хрупкого твердого вещества, по сравнению с самим поликапролактоном. В качестве "грубого" метода оценки взвешенную иглу бросают с равной высоты в смеси полимеров, содержащих от 0 до 30% MePEG в поликапролактоне, и измеряют расстояние, на которое игла проникает в твердое вещество. Полученный график приведен на фиг.18С. Приведенные значения являются средними из четырех измерений с точностью +/-1 S.D.

Для сравнения испытывают также образец парафина, в который игла проникает на длину 7,25 мм +/-0,3 мм.

D. Изучение высвобождения таксола

Таблетки полимера (поликапролактона, содержащего 0%, 5%, 10% или 20% MePEG) выдерживают в инкубаторе в забуференном фосфатом солевом физиологическом растворе (рН 7,4) при температуре 37°С и с течением времени замеряют процент изменения веса полимера. Как видно из фиг.18D, весовые потери возрастают с увеличением первоначального содержания MePEG в смеси полимеров. Вероятно отмечаемые весовые потери вызваны высвобождением MePEG из полимерной матрицы в жидкость при инкубации. Это означает, что таксол должен легко высвобождаться из смесей MePEG/PCL, так как таксол до включения в поликапролактон вначале растворяют в MePEG.

Е. Влияние различных количеств MePEG на высвобождение таксола

Готовят термопасту, включающую от 0,8 до 20% MePEG в поликапролактоне. Ее наполняют 1% таксола. Высвобождение таксола с течением времени из таблеток весом 10 мг в забуференном фосфатом солевом физиологическом растворе при температуре 37°С изучают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения. Как показано на фиг.18Е, количество MePEG в композиции не оказывает влияния на количество высвобождаемого таксола.

F. Влияние различного содержания таксола на общее количество таксола, выделяемого из смеси 20% MePEG/PCL

Готовят термопасту, содержащую 20% MePEG в поликапролактоне, наполненную от 0,2 до 10% таксола. Высвобождение таксола с течением времени определяют, как указано ранее. Как показано на фиг.18F, количество таксола, высвобождаемого с течением времени, возрастает по мере нагрузки таксола. Если же построить график зависимости в процентах от общего количества высвободившегося таксола, то порядок становится обратным (фиг.18G). Таким образом, можно получить информацию об остаточном таксоле в пасте и, если можно допустить, что полученные результаты позволяют провести экстраполяцию, то можно оценить период времени, за который таксол высвободится из термопасты, содержащей 20% MePEG.

G. Анализ различных смесей MePEG/PCL на прочность

Для определения прочности "таблеток" твердого полимера с диаметром 0,88 см и средней толщиной 0,560 см используют машину для проведения нагрузочных испытаний СТ-40. Полимерные таблетки представляют собой смеси MePEG с концентрацией 0%, 5%, 10% или 20% в поликапролактоне.

Результаты этих испытаний приведены на фиг.18Н, где приведена зависимость предела прочности при пластической деформации и время разрушения от процентного содержания MePEG в смеси. Единственная переменная ANOVA показывает, что толщины таблеток в каждой группе одинаковы, как видно из фиг.18Н, добавление MePEG к поликапролактону уменьшает твердость полученного вещества.

Пример 15. Влияние содержащей таксол термопасты на развитие кровеносных сосудов in vivo

Оплодотворенные эмбрионы цыплят перед получением безоболочечной культуры выдерживают в инкубаторе в течение 4 дней, как описано в Примере 2. Содержимое яиц высвобождают из оболочки, выливают в круглодонную стерильную стеклянную чашку и покрывают крышкой от чашки Петри.

Таксол вводят в термопасту в количестве 5%, 10% и 20% (вес/об), как указано ранее (см. Пример 10), и используют в следующих экспериментах. Высушенную нарезанную термопасту затем нагревают до температуры 60°С и сдавливают между двумя листами парапленки, делая ее плоской, и дают остыть. 6 эмбрионов получают термопасту, содержащую 20% таксола, а 6 эмбрионов получают термопасту, полученную аналогично, но не содержащую таксола. По одному эмбриону умирает в каждой группе, т.е. в контрольной и подвергнутой обработке группе остается по пять эмбрионов.

Кроме того на 6-й день выдерживания в инкубаторе ненагруженную термопасту и термопасту, содержащую 20% таксола, нагревают до 60°С и помешают непосредственно на растущий край хорионалантоисной мембраны; такой обработке подвергают два эмбриона.

Не наблюдается отличий, полученных в этих двух различных способах нанесения, что указывает на то, что температура пасты в момент ее использования не является определяющим фактором.

Термопастой, содержащей 10% таксола, обрабатывают 11 хорионалантоисных мембран, а еще 11 хорионалантоисных мембран обрабатывают ненагруженной термопастой, в то время как термопастой, содержащей 5% таксола, обрабатывают 10 хорионалантоисных мембран, а еще 10 контрольных хорионалантоисных мембран обрабатывают ненагруженной термопастой. Через два дня (на 8 день инкубации) изучают сосудистую систему с помощью стереомикроскопа. Для усиления контраста деталей сосудов водят липозин II в виде непрозрачного белого раствора.

В эмбрионах, обработанных 5%-ной наполненной таксолом пастой, лишь у двух животных наблюдается максимальное ингибирование процесса развития кровеносных сосудов, в то время как у оставшихся восьми животных отмечается лишь пограничное влияние. У животных, обработанных 10%-ной наполненной таксолом термопастой, лишь у двух животных наблюдается максимальное ингибирование процесса развития кровеносных сосудов, в то время как у оставшихся девяти отмечается лишь пограничное влияние.

20%-ная наполненная таксолом термопаста вызывает появление обширных лишенных капилляров областей (см. фиг.19В) у всех пяти хорионалантоисных мембран, которые подвергают указанному воздействию. Наибольшая степень ингибирования определяется как лишенная капилляров область с размерами 6×6 мм. Все хорионалантоисные мембраны, подвергнутые обработке 20%-ной наполненной таксолом термопастой, показывают именно эту степень ингибирования процесса развития кровеносных сосудов. Для сравнения, контрольная (ненагруженная) термопаста не подавляет процесс развития кровеносных сосудов на хорионалантоисной мембране (см. фиг.19А); эта картина при большем увеличении (отметим, что край пасты виден вверху образца) показывает, что сосуды, примыкающие к пасте, не подвергаются воздействию термопасты. Это указывает на то, что наблюдаемый эффект вызван замедленным высвобождением таксола, а не благодаря выделенному количеству и самому полимеру или вторичному воздействию пасты на развивающуюся сосудистую систему.

Проведенные исследования показывают, что термопаста высвобождает достаточное количество вещества, подавляющего развитие кровеносных сосудов (в данном случае таксол), для ингибирования нормального развития кровеносной сосудистой системы хорионалантоисной мембраны.

Пример 16. Воздействие содержащей таксол термопасты на рост опухоли и на развитие опухоли in vivo.

Оплодотворенные эмбрионы цыплят перед получением безоболочечной культуры выдерживают в инкубаторе в течение 3 дней. Содержимое яиц высвобождают, удаляя оболочку, расположенную вокруг воздушного пространства, отделяя мембрану внутренней оболочки и протыкая противоположный конец оболочки, и позволяют содержимому яйца осторожно вылиться из тупого конца. Содержимое яйца выливают в круглодонную стерильную стеклянную чашку, покрывают крышкой от чашки Петри и помещают в инкубатор с относительной влажностью 90% и с содержанием диоксида углерода 3% (см. Пример 2).

Мышам вводят клетки MDAY-D2 (муриновая лимфоидная опухоль) и дают им вырасти в опухоли весом 0,5-1,0 г. Мышей умерщвляют, место расположения опухоли протирают спиртом, вырезают, помещают в стерильную среду для выращивания культуры и в ламинарном потоке нарезают кубиками размером 1 мм. Перед размещением отсеченных опухолей в девятидневные эмбрионы поверхность хорионалантоисной мембраны осторожно накалывают иглой номер 30 для облегчения имплантации опухоли. Через 8 дней инкубации (4 дня после удаления оболочки) на хорионалантоисные мембраны помещают опухоли и дают им вырасти на хорионалантоисных мембранах в течение четырех дней, чтобы установилось кровоснабжение. Указанным методом получают четыре эмбриона, при этом на каждом эмбрионе размещают 3 опухоли. Из этих эмбрионов одну опухоль обрабатывают термопастой, содержащей 20% таксола, вторую опухоль - ненаполненной термопастой, а третья опухоль не подвергается обработке. Обработку продолжают в течение двух дней и оценивают полученные результаты.

Эксплантанты опухолей MDAY-D2 секретируют факторы, стимулирующие развитие кровеносных сосудов, которые инициируют врастание капилляров (из хорионалантоисной мембраны) в тело опухоли, позволяя ей расти дальше. Поскольку все сосуды опухоли образуются из хорионалантоисной мембраны, а все клетки опухоли образуются из эксплантата, то становится возможным исследовать эффект от терапевтических воздействий на два указанных процесса независимо. Этот анализ используют для определения эффективности наполненной таксолом термопасты на (а) ингибирование развития сосудистой системы опухоли и (b) ингибиробание роста самих клеток опухоли. Прямая стереомикроскопическая оценка in vivo и гистологическое изучение фиксированных тканей в этом исследовании показывают следующее. В опухолях, обработанных термопастой, содержащей 20% таксола, наблюдается уменьшение количества кровеносных сосудов, которые снабжают опухоль (см. фиг.20С и 20D), уменьшение количества кровеносных сосудов внутри опухоли и уменьшение количества кровеносных сосудов по периферии опухоли (области, которая, как правило, наиболее насыщена сосудами в твердых опухолях), по сравнению с контрольными опухолями. Размеры и масса опухолей начинают уменьшаться в течение двух дней проведения исследований. Кроме того видно, что множество клеток эндотелия захватываются при делении клеток, указывая на то, что влияние оказывается и на разрастание клеток эндотелия. Часто отмечается захват клеток при митотическом делении. 4 эмбриона показывают устойчивую картину: термопаста, содержащая 20% таксола, подавляет сосудистую систему опухоли, в то время как термопаста не оказывает никакого эффекта.

Для сравнения в хорионалантоисных мембранах, обработанных термопастами, не содержащими таксола, опухоли имеют хорошо развитую сеть сосудов, при этом количество и плотность сосудов возрастает по сравнению с обычными окружающими тканями и наблюдается значительно больше кровеносных сосудов, чем в опухолях, обработанных пастой, наполненной таксолом. Вновь образовавшиеся сосуды проникают в опухоль со всех углов и напоминают спицы, присоединенные к середине колеса (см. фиг.20А и 20В). В процессе исследования размер и масса опухолей продолжали возрастать. При гистологическом изучении по периферии опухоли наблюдается множество расширенных тонкостенных капилляров и при клеточном делении наблюдается немного эндотелия. Ткани опухоли имеют хорошо развитую сосудистую сеть и распространяются повсюду.

В качестве примера в двух опухолях одинакового размера (первоначально на момент эксплантации), размещенных на одной и той же хорионалантоисной мембране, получают следующие результаты. Для опухоли, обработанной термопастой, наполненной 20% таксола, величина опухоли составляет 330 мм×597 мм; непосредственная периферия опухоли имеет 14 кровеносных сосудов, в то время как в теле опухоли имеется лишь 3-4 небольших капилляра. Для опухоли, обработанной ненаполненной термопастой, величина опухоли составляет 623 мм×678 мм; непосредственная периферия опухоли имеет 54 кровеносных сосуда, в то время как в теле опухоли имеется 12-14 небольших капилляров. Кроме того, сама окружающая хорионалантоисная мембрана содержит намного больше кровеносных сосудов по сравнению с областью, окружающей опухоль, обработанную таксолом. Эти исследования показывают, что термопаста высвобождает достаточные количества ингибитора развития кровеносных сосудов (в данном случае таксола), чтобы подавить патологическое развитие кровеносных сосудов, которое сопровождает рост и развитие опухоли. В этих условиях процесс развития кровеносных сосудов максимально стимулируется клетками опухоли, которые продуцируют факторы, способствующие развитию кровеносных сосудов и которые способны индуцировать врастание капилляров из окружающих тканей в тело опухоли. Термопаста, содержащая 20% таксола, способна блокировать этот процесс и ограничить способность тканей опухоли поддерживать адекватное кровоснабжение. Это приводит к уменьшению массы опухоли как за счет цитотоксического воздействия лекарства на сами клетки опухоли, так и за счет уменьшения снабжения ткани питательными веществами, необходимыми для роста и распространения опухоли.

Пример 17. Влияние термопасты, наполненной ингибитором развития кровеносных сосудов, на in vivo рост опухоли в муриновой опухолевой модели

Муриновая модель опухоли MDAY-D2 может быть использована для исследования влияния локального медленного высвобождения химиотерапевтических и подавляющих развитие кровеносных сосудов соединений, таких как таксол, на рост опухоли, метастазы опухоли и степень выживания животных. Клеточная линия MDAY-D2 выращивается в суспензии клеток, содержащей 5% сыворотки плода коровы в альфа-среде. Клетки выдерживают в инкубаторе при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода, и разбавляют в 15 раз через каждые 3 дня, до тех пор пока не получится достаточное количество клеток. После периода инкубации жизнеспособные клетки изучают с помощью оптического микроскопа, а затем центрифугируют с ускорением 1500 об/мин в течение 5 минут. Добавляют забуференный фосфатом солевой физиологический раствор, чтобы получить разбавление 1000000 клеток на миллилитр.

Женские особи мышей DBA/2j акклиматизируются после поступления в течение 3-4 дней. Каждой мыши вводят подкожно в заднебоковую часть в виде инъекции 100000 клеток MDAY-D2 в 100 мл забуференного фосфатом физиологического солевого раствора. Предыдущие исследования показывают, что указанная процедура приводит к развитию через 3-4 дня в месте инъекции наблюдаемой визуально опухоли, достигающей через 14 дней веса 1,0-1,7 г, которая дает наблюдаемые визуально метастазы в печени в течение 19-25 дней после инъекции. В зависимости от цели изучения терапевтическое вмешательство можно осуществить на любой стадии развития болезни.

Используя указанную выше животную модель, 20 мышам подкожно вводят инъекции 140000 клеток MDAY-D2 и дают опухолям вырасти. На 5-й день мышей разделяют группы по пять мышей в каждой. Место опухоли вскрывают хирургически под наркозом и локально обрабатывают термопастой, наполненной лекарством, или контрольной термопастой, не затрагивая окружающие опухоль ткани, и рану закрывают. Группы из пяти мышей либо не подвергают обработке (рану просто закрывают), вводят лишь полимер (поликапролактон), либо термопасту, содержащую 10% таксола, или термопасту, содержащую 20% таксола (инъекции вводят лишь 4 животным), имплантируют рядом с местом, где находится опухоль. На 16-й день мышей умерщвляют, опухоли извлекают и исследуют (поверхностно и гистологически) на предмет роста опухоли, метастазов опухоли, местной и общей токсичности вследствие обработки, воздействия на заживление раны, воздействия на развитие кровеносных сосудов опухоли и состояния пасты, оставшейся в месте иссечения.

Вес опухолей для каждого животного приведен в таблице III.

Таблица III

Животное No	Вес опухолей (г)
	Контроль (пустой)	Контроль (PCL)	Термопаста 10% таксола	Термопаста 20% таксола
1	1,387	1,137	0,487	0,114
2	0,589	0,763	0,589	0,192
3	0,461	0,525	0,447	0,071
4	0,606	0,282	0,274	0,042
5	0,353	0,277	0,362
Среднее значение	0,6508	0,6040	0,4318	0,1048
Станд. отклонение	0,4078	0,3761	0,1202	0,0653
Величина Р		0,7647	0,358	0,036

Термопаста, наполненная 20% таксола, уменьшает рост опухоли более чем на 85% (средний вес 0,105), по сравнению с контрольными животными (средний вес 0,681). У животных, подвергавшихся обработке только термопастой или термопастой, содержащей 10% таксола, наблюдается лишь умеренное воздействие на рост опухоли; вес опухоли уменьшился лишь на 10% и 35% соответственно (фиг.21А). Таким образом, термопаста, содержащая 20% таксола, оказывается более эффективной для подавления роста опухоли, чем термопаста, содержащая 10% таксола (см. фиг.21С; см. также фиг.21В).

Термопасту обнаруживают у некоторых животных в месте ее нанесения. Полимер в количестве от 0,026 до 0,078 г обнаруживают у 8 из 15 мышей. У каждого животного из группы, подвергавшейся обработке термопастой с 20% таксола, остается некоторое количество полимера, свидетельствуя о том, что он менее подвержен растворению. Гистологически у опухолей, обработанных термопастой, содержащей таксол, наблюдается меньший некроз клеток и тканей, чем у контрольных опухолей. Сосудистая система сокращается и часто наблюдаются клетки эндотелия, захваченные при клеточном делении. Наполненная таксолом термопаста не оказывает ощутимого воздействия на целостность или насыщенность клетками кожи или тканей, окружающих опухоль. На первый взгляд процесс заживление ран не нарушен.

Пример 18. Использование хирургических пленок, наполненных ингибитором развития кровеносных сосудов, для предотвращения ятрогенного метастатического высевания клеток опухоли в процессе операции удаления раковой опухоли

Стерильное, гибкое и эластичное полимерное соединение, содержащее лекарство, могло бы оказаться полезным в процессе хирургических операций по удалению раковых опухолей. Часто бывает необходимо изолировать нормальные окружающие ткани от злокачественных опухолей в процессе проведения операции удаления опухоли, чтобы предотвратить ятрогенное распространение заболевания на соседние органы вследствие случайного заражения раковыми клетками. Перед проведением операции с опухолью наполненную лекарством парапленку можно растянуть над нормальными тканями. Этот прием может оказаться наиболее полезным, если пленку разместить вокруг печени и других органов, расположенных в брюшной полости, при проведения хирургического удаления рака прямой кишки с целью предотвратить внутрибрюшинное распространение заболевания на печень. Биоразлагаемую пленку можно оставить in situ с тем, чтобы она обеспечивала продолжительную защиту.

Место иссечения - это именно то место, где возникает рецидив злокачественного образования после операции. Рецидив, как полагают, происходит вследствие загрязнения места раны раковыми клетками при хирургической операции. Чтобы изучить указанные вопросы, проводят эксперименты с целью определить способность пленок, наполненных ингибитором развития кровеносных сосудов, устранять отмеченное явление.

А. Материалы и методы

Получение хирургической пленки. Хирургические пленки получают, как описано в Примере 10. Изготавливают тонкие пленки размером приблизительно 1 см×1 см, содержащие либо один полимер (поликапролактон) или капролактон с 5% таксола.

Модель печеночной опухоли крысы. В первоначальном исследовании крыс Wister весом приблизительно 300 г анестезируют и в центре брюха делают разрез длиной 3-5 см. В наибольшей печеночной доли в паренхиме печени делают надрез размером 1 см и край печени отсекают. На разрез печени с помощью иглы номер 30 наносят один миллион живых глиомных клеток опухоли 9L (элюированных из клеточной культуры непосредственно перед проведением указанной процедуры), в виде суспензии в 100 мл забуференного фосфатом солевого физиологического раствора. Затем на отрезанный край печени накладывают хирургическую пленку и закрепляют ее по краям с помощью Gelfoam. Двум животным накладывают пленки из поликапролактона, содержащие 5% таксола, а двум животным накладывают лишь пленки из поликапролактона. Стенку брюшной полости закрывают с помощью 3,0 Dexon и кожными скобками. Общую анестезию прекращают и дают животным восстановиться. В последующие дни животных умерщвляют и печень исследуют гистологически.

В. Результаты

В двух образцах печени, обработанных одним только полимером, наблюдается локальный рост опухоли. Оба образца печени, обработанных полимером плюс таксол, полностью свободны от опухолей, что подтверждается гистологическим исследованием. Важно также то, что оболочка печени восстанавливается и вырастает над полимерной пленкой и над разрезанной поверхностью печени, свидетельствуя о том, что не оказывается существенного влияния на процесс заживления ран. Вокруг ни одной из хирургических пленок (содержащих лекарство и не содержащих лекарства) не наблюдается признаков локального токсического воздействия на печень.

С. Обсуждение

Проведенное исследование показываете, что хирургические пленки, размешенные вокруг нормальных тканей и мест иссечения во время проведения операция, могут снизить вероятность случайной имплантации клеток опухоли в нормальные окружающие ткани при резекции злокачественных опухолей. Это может быть использовано с целью сокращения серьезных проблем, вызванных местным рецидивом болезни в послеоперационный период.

Пример 19. Внутрисуставная инъекция биоразлагаемых микросфер, наполненных ингибитором развития кровеносных сосудов, при лечении артрита

Повреждение сустава при артрите является следствием сочетания развития воспалительной ткани (в том числе белых кровяных телец и продуктов белых кровяных телец) и ткани паннуса (ткани, составленной из неоваскулярной ткани, соединительной ткани и воспалительных клеток). Для предварительных исследований выбран таксол, поскольку таксол является потенциальным ингибитором реваскуляризации. Таким образом, таксол при большой местной концентрации может оказаться модифицирующим агентом при артрите.

Чтобы определить, оказывают ли микросферы пагубное воздействие на суставы, проводят следующие эксперименты. Если коротко, то получают микросферы просто из поликапролактона и микросферы из поликапролактона, наполненного таксолом, как описано в Примере 8.

Трем кроликам внутрисуставно вводят инъекции, содержащие микросферы с размерами 0,5-5,0 мкм, 10-30 мкм или 30-80 мкм, с общим объемом 0,2 мл (содержат 0,5 мг микросфер). Суставы ежедневно исследуют визуально (клинически). Через две недели животных умерщвляют и суставы исследуют гистологически на предмет воспаления и уменьшения количества протеогликанов.

Модели воспалительного артрита и остеоартрита у кролика используют для оценки метода использования микросфер для уменьшения воспаления синовиальной оболочки и деградации хрящевой ткани. Дегенеративный артрит индуцируют путем частичного разрыва крестообразной связки и мениска колена. Через 4-6 недель у кроликов развивается эрозия хряща, аналогичная наблюдаемой при остеоартрите человека. Воспалительный артрит индуцируют, вводя кроликам бычий сывороточный альбумин (БСА) в полном адъюванте Фрейнда. Через три недели кроликам с высоким содержанием антитела анти-БСА внутрисуставно вводят инъекцию бычьего сывороточного альбумина (5 мг). На седьмой день наблюдается опухание и явно выраженное воспаление синовиальной оболочки, уменьшение количества протеогликанов наблюдается через 7-14 дней, а эрозия хряща наблюдается через 4-6 недель.

Воспалительный артрит индуцируют, как указано ранее. Через 4 дня в суставы вводят инъекцию микросфер, содержащих 5% таксола, или носителя. Одну группу животных умерщвляют на 14 день, а другую группу - на 28 день. Суставы исследуют гистологически на предмет воспаления и деградации хряща. Цель эксперимента - установить, могут ли микросферы с таксолом оказывать влияние на воспаление сустава и деградацию хрящевой матрицы.

Можно также исследовать микросферы с ингибитором развития кровеносных сосудов в модели остеоартрита. Если коротко, то дегенеративный артрит индуцируют у кроликов, как указано выше, и на 4-й день вводят в суставы внутрисуставные инъекции микросфер (5% таксола и только носитель). Животных умерщвляют на 21-й или 42-й день и суставы исследуют гистологически на предмет деградации хряща.

Проводят исследования с целью изучить ингибиторы развития кровеносных сосудов, которые вводят внутрисуставно в виде микросфер, в качестве средств защиты хряща.

Результаты

Не содержащие лекарства микросферы из поликапролактона с различными размерами (0,5-5,0 мкм, 10-30 мкм или 30-60 мкм) вводят внутрисуставно в коленный сустав кролика. Результаты экспериментов представлены на фиг.22A-22D. Если коротко, то на фиг.22А приведена фотография синовиальной оболочки из суставов, в которые вводили забуференный фосфатом солевой физиологический раствор. На фиг.22 В приведена фотография суставов, в которые вводили микросферы. На фиг.22С приведена фотография хряща из суставов, в которые вводили забуференный фосфатом солевой физиологический раствор, а на фиг.22D приведена фотография хрящей из суставов, в которые вводили инъекции микросфер.

Как видно из приведенных фотографий, при гистологическом изучении не наблюдается различий между суставами, в которые вводили и в которые не вводили инъекции микросфер. Клинически в течение 14 дней, когда проводился эксперимент, воспаления суставов не наблюдается. По первой оценке не наблюдается воспаления суставов или повреждения хрящей в суставах, в которые водили микросферы, по сравнению с не подвергавшимся обработке нормальными суставами.

Заключения

Микросферы можно вводить внутрисуставно и при этом они не оказывают заметных изменений на поверхности сустава. Это свидетельствует о том, что указанный способ может оказаться эффективным средством целенаправленной доставки в течение длительного времени лекарственных средств в больной сустав, при этом сводится до минимума токсическое воздействие, которое может быть связано с системным назначением подобных биологически активных соединений.

Как указано ранее, можно изготовить микросферы, имеющие специфические размеры и обладающие определенной кинетикой высвобождения лекарств. Было также показано, что таксол является потенциальным ингибитором развития кровеносных сосудов и что он высвобождается из микросфер в количествах, достаточных для блокирования реваскуляризации при анализе с использованием хорионалантоисной мембраны. Таким образом, внутрисуставное введение микросфер, наполненных ингибитором развития кровеносных сосудов (в частности, наполненных таксолом), должно приводить к блокированию реваскуляризации, которая сопровождает такие заболевания, как ревматоидный артрит, и приводит к разрушению хряща в суставах. Таким образом, микросферы, наполненные лекарством, могут играть роль защищающих сустав средств, которые спасают сустав от необратимой деструкции, вызванной проникающими в него реваскуляризованными тканями паннуса.

Из вышесказанного очевидно, что специфические варианты осуществления настоящего изобретения приведены здесь для иллюстрации и могут быть предложены различные их модификации, не противоречащие сущности настоящего изобретения и не выходящие за границы притязаний по настоящему изобретению. Таким образом, изобретение ограничивается лишь приведенной далее формулой изобретения.