препарат интерлейкина-2 и способ его получения

Формула изобретения

1. Способ получения препарата интерлейкина-2 (ИЛ-2), при котором с обеспечением сохранности целевого белка разрушают клетки дрожжевого продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2) и который не секретирует этот целевой белок, и отделяют водонерастворимую фракцию, отличающийся тем, что в препарате сохраняют водонерастворимые компоненты разрушенных клеток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дрожжевой продуцент представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791, который является продуцентом человеческого интерлейкина-2.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки разрушают в присутствии ингибиторов дрожжевых протеаз.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки разрушают с помощью высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что отделенную водонерастворимую фракцию промывают для более полного удаления водорастворимых компонентов.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что отделенную водонерастворимую фракцию высушивают.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что отделенную водонерастворимую фракцию обрабатывают ацетоном с последующим удалением ацетоновой фракции.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что после отделения водонерастворимой фракции готовят ее суспензию в воде, приливают эту суспензию к ацетону при соотношении объемов суспензии и ацетона от 1:5 до 1:20 с получением суспензии в ацетоне, фильтруют полученную ацетоновую суспензию и оставшийся на фильтре остаток высушивают.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что после отделения водонерастворимой фракции перед приготовлением ее суспензии в воде ее промывают для более полного удаления водорастворимых компонентов.

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что после высушивания отделенной водонерастворимой фракции к сухому остатку добавляют сухой солюбилизатор.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что солюбилизатор представляет собой додецилсульфат натрия.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что после добавления солюбилизатора добавляют воду.

13. Препарат интерлейкина-2, полученный способом по любому из пп.1-12.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области получения иммуномодулирующих лекарственных средств биотехнологическими методами и может быть использовано в фармацевтической промышленности. В частности, данное изобретение относится к способу получения препарата интерлейкина-2. Такой препарат может быть использован в целях иммуноориентированной терапии и, в частности, при лечении онкологических, инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний.

История открытия интерлейкина-2 (ИЛ-2) начинается с 1960-х годов, когда многочисленные исследования in vitro показали, что активированные лимфоциты выделяют медиатор, стимулирующий множество иммунных реакций in vitro и in vivo. Лишь в 1976 году этот медиатор идентифицировали как Т-клеточный ростовой фактор, получивший в 1979 году название ИЛ-2. Разработанные технологии получения его в культуре активированных лимфоцитов человека и очистки позволили получить первые препараты ИЛ-2 для исследовательских и клинических целей. Эти препараты получили название "лимфоцитарный" или "натуральный" ИЛ-2. В то же время ограниченные возможности масштабирования его производства не позволили его широко использовать до 1983 года, когда были разработаны технологии получения рекомбинантных белков, в частности ИЛ-2, с использованием генной инженерии и биотехнологии.

Известны способы получения препаратов ИЛ-2 из донорской крови. Однако препарат, содержащий компоненты крови человека, относится к потенциально опасным.

Известны также генноинженерные способы получения ИЛ-2. Многочисленные фирмы (Cetus Corp., Amgen, Inc., Hoffman-La Roche, Inc.) использовали методы генной инженерии и биотехнологии для получения рекомбинантного ИЛ-2 в качестве лекарственного препарата для лечения разных типов онкологических заболеваний.

В одном из способов получения рекомбинантного ИЛ-2 в качестве продуцента используют E.coli (кишечную палочку). Кишечная палочка представляет собой условно-патогенную флору. Поэтому препараты ИЛ-2 из E.coli требуют тщательной очистки и могут быть токсичными.

Дрожжевые клетки являются более привлекательными продуцентами гетерологичного ИЛ-2.

Известен (ЕР 0162898 А1, опубликованный 04.12.1985) способ получения препарата ИЛ-2 с использованием дрожжевого продуцента. В этом способе ИЛ-2 секретируется в культуральную среду и затем должен быть выделен из культуральной среды с помощью хроматографии, фильтрации, экстракции и т.п. Недостатком указанного способа является то, что секретируемые дрожжами белки гликозилируются, т.е. в их структуре в процессе секреции появляются дрожжевые углеводные остатки. Такие гликопротеины являются сильно иммуногенными для человека, что создает проблемы при дальнейшем применении их в терапии, например накопление у человека антител к таким гликозилированным белкам.

Известен также (ЕР 0152358, опубликованный 21.08.1985) способ получения препарата ИЛ-2, при котором разрушают клетки дрожжевой культуры, в которой был осуществлен синтез ИЛ-2, центрифугируют эти разрушенные клетки, обрабатывают осадок, полученный в результате центрифугирования, раствором додецилсульфата натрия для того, чтобы перевести ИЛ-2 в жидкую фазу, и экстрагируют ИЛ-2 из жидкой фазы. Экстракция ИЛ-2, осуществляемая в данном способе, является трудоемкой операцией и требует значительных затрат времени, оборудования и/или реактивов.

В целом, все известные до сих пор препараты рекомбинантного ИЛ-2 являются чрезвычайно дорогими, и существенный вклад в их стоимость вносит технология их выделения из клеток-продуцентов.

Задачей данного изобретения является создание более технологичного способа получения препарата ИЛ-2, который позволил бы получить препарат, не уступающий по активности и терапевтическим возможностям известным препаратам, при этом обеспечивающий возможность масштабного производства и не слишком высокой себестоимости.

Задача решается тем, что предложен способ получения препарата интерлейкина-2, при котором с обеспечением сохранности целевого белка разрушают клетки дрожжевого продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2) и который не секретирует этот целевой белок, и отделяют водонерастворимую фракцию, причем в препарате сохраняют водонерастворимые компоненты разрушенных клеток.

В частности, в данном способе дрожжевой продуцент представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791, который является продуцентом человеческого интерлейкина-2.

Вопреки сложившемуся мнению о необходимости тщательной очистки рекомбинантного белка авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что сохранение остатков клеточных стенок дрожжей в препарате рекомбинантного ИЛ-2 не только позволяет упростить его схему производства и получить более дешевый препарат, но также позволяет получить очень эффективный препарат, терапевтические свойства которого в некоторых ситуациях превосходят свойства известных препаратов ИЛ-2.

Осуществление способа получения препарата без экстракции (перевода) ИЛ-2 в жидкую фазу и его последующей экстракции из жидкой фазы приводит к неожиданному для такого исключения стадии результату. Результатом способа является не плохо очищенный продукт, а совершенно новый препарат ИЛ-2. Сохранившиеся в препарате остатки нерастворимой фракции клеточных стенок дрожжей не только не препятствуют эффекту ИЛ-2, но и служат своего рода адъювантом, то есть вспомогательным веществом, стимулирующим активацию Т-клеточного звена иммунитета млекопитающих. Перевод водонерастворимого ИЛ-2 в жидкую фазу с его последующей экстракцией считался до момента создания данного изобретения совершенно необходимым и усилия разработчиков ранее были направлены на разработку способов улучшения очистки. После создания данного изобретения становится ясно, что препарат ИЛ-2 следут получать без отделения от водонерастворимой фракции клеточных стенок дрожжей и усилия далее могут быть сосредоточены на улучшении качества самой фракции клеточных стенок.

В препарате, полученном таким способом, ИЛ-2 находится в неактивной форме, что обеспечивает возможность его длительного хранения. Для активации ИЛ-2 к препарату необходимо добавить солюбилизатор и воду.

Целесообразно разрушать клетки в присутствии ингибиторов протеаз, так как именно протеазы, освобождающиеся при разрушении дрожжевых клеток, могут явиться причиной разрушения целевого белка.

Предпочтительно разрушать клетки с помощью высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками в присутствии ингибиторов протеаз, так как в этом случае достигается хорошая степень разрушения клеток и не происходит разрушение целевого продукта.

В предпочтительном случае после отделения водонерастворимой фракции ее промывают для более полного удаления водорастворимых компонентов. При этом происходит более полное удаление водорастворимых протеаз, других дрожжевых белков, РНК, хромосомной и плазмидной ДНК и ДР.

Предпочтительно отделенную водонерастворимую фракцию высушивают. Высушивание может быть осуществлено сразу после отделения или после промывания.

В более препочтительном случае после отделения водонерастворимой фракции ее обрабатывают ацетоном с последующим удалением ацетоновой фракции. При этом разрушенные дрожжевые клетки обезвоживаются. Эта стадия позволяет также избавиться от липидных составляющих водонерастворимой фракции, что приводит к получению препарата с улучшенными физическими свойствами, он удобен в обращении и приятнее при терапевтическом применении.

При указанной обработке ацетоном готовят суспензию водонерастворимой фракции в воде, приливают эту суспензию к ацетону при соотношении объемов суспензии и ацетона от 1:5 до 1:20, предпочтительно 1:10, с получением суспензии в ацетоне, фильтруют полученную суспензию и оставшийся на фильтре остаток высушивают.Перед обработкой ацетоном водонерастворимую фракцию можно промыть, то есть промывку осуществляют после отделения водонерастворимой фракции перед приготовлением ее суспензии в воде.

В предпочтительном воплощении способа после стадии высушивания водонерастворимой фракции к этой высушенной фракции добавляют сухой солюбилизатор. Таким образом получают препарат в виде композиции высушенной водонерастворимой фракции и солюбилизатора. В препарате, полученном таким способом, ИЛ-2 также находится в неактивной форме, что обеспечивает возможность его длительного хранения. Для активации ИЛ-2 к такому препарату необходимо добавить воду. При таком добавлении концентрация солюбилизатора в растворе становится оптимальной, что обеспечивает образование правильной конформации белка и получение препарата, обладающего биологической активностью.

Целесообразно в качестве солюбилизатора использовать додецилсульфат натрия.

В одном из воплощений способа при получении препарата ИЛ-2 после добавления солюбилизатора добавляют воду. При таком способе получают препарат, в котором ИЛ-2 является активным, находится в оптимальной конформации и готов к непосредственному использованию.

Согласно изобретению также предлагается препарат интерлейкина-2, полученный вышеописанным способом в любом из его возможных вариантов. Полученный препарат имеет меньшую себестоимость и может использоваться в терапии перорально, что всегда, с точки зрения пациента, является более предпочтительным. Неожидано также обнаружилось, что такой препарат проявляет терапевтические эффекты, превосходящие эффекты препарата на основе очищенного ИЛ-2, получаемого известными способами.

На современном этапе развития биотехнологии и генной инженерии дрожжевые продуценты ИЛ-2 известны, могут быть получены в депозитариях или созданы заново.

Хотя наиболее распространенным дрожжевым продуцентом является Saccharomyces cerevisiae, такими продуцентами могут быть любые другие непатогенные дрожжи, например Saccharomyces bulardi или дрожжи рода Pichia, например Pichia pastoris, рода Kluyveromyces, например Kluyveromyces lactis, рода Hansenula, например Hansenula polymorpha, и тому подобные. Технология получения рекомбинантных плазмид, содержащих ген ИЛ-2, в частности человеческого ИЛ-2, хорошо известна. Также хорошо известна технология получения штаммов, содержащих такие рекомбинантные плазмиды.

В частности, примером дрожжевого продуцента человеческого ИЛ-2 является штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791. Этот штамм является продуцентом человеческого ИЛ-2. Конструкция вектора экспрессии, введенного в штамм дрожжей, такова, что клетки не секретируют целевой белок. Может быть использован также любой другой штамм, продуцирующий гетерологичный ИЛ-2.

Для каждого штамма-продуцента известны оптимальные условия, в которых будет происходить синтез ИЛ-2. Синтез ИЛ-2 может быть конститутивным или требовать индукции или дерепрессии, что определяется генетической конструкцией штамма-продуцента. В общем, с учетом особенностей выбранного штамма специалист способен выбрать условия культивирования, которые приведут к получению культуры дрожжевых клеток, в которых синтезирован ИЛ-2.

В частности, штамм Y-791 сначала выращивают с подавлением синтеза ИЛ-2 на минимальной минеральной среде Sd1 с гистидином до достижения оптической плотности OD ₆₀₀ от 2,5 до 4,0, предпочтительно OD₆₀₀ =3,0. Синтез ИЛ-2 подавляется наличием в среде культивирования фосфата. Затем пересевают полученный инокулят в больший объем второй среды для культивирования, в которой синтез ИЛ-2 дерепрессирован, и культивируют до достижения фазы раннего стационара, то есть до оптической плотности OD₆₀₀ от 6,0 до 9,0, предпочтительно OD₆₀₀=7,5. В качестве второй среды для культивирования можно использовать среду Sd2 или среду ПЕП (пептон 20 г/л, глюкоза 20 г/л).

По окончании культивирования клетки можно отделить от культуральной среды центрифугированием или фильтрованием. Все дальнейшие манипуляции проводят с клетками, а культуральную среду отбрасывают. При использовании штамма Y-791 получают, как правило, от 8 до 12 г клеток на 1 литр питательной среды.

Полученную биомассу также можно использовать сразу или заморозить, для того чтобы использовать в дальнейшем в предложеном способе.

Отмечено, что препарат, содержащий неразрушенные клетки, обладает лишь следовой активностью ИЛ-2 по сравнению с препаратом из разрушенных клеток.

Разрушение дрожжевых клеток можно осуществлять любыми известными способами, обеспечивающими сохранение целевого белка. В частности физическими способами, например, с использованием высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками, с использованием высокого давления, методом замораживания-оттаивания. При этом обеспечение сохранности целевого продукта достигается добавлением к суспензии разрушаемых клеток ингибиторов протеаз, чтобы протеазы, выделяющиеся при разрушении дрожжевых клеток, не разрушили ИЛ-2. Ферментативный способ разрушения дрожжевых клеток также возможен, если удастся избежать протеолитического действия используемого агента на целевой белок.

Обеспечение сохранности целевого продукта достигается также проведением способа при пониженных температурах, например при температурах от 2 до 8°С, в частности при 4°С.

Примером высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками является дезинтегратор DynoMill. Разрушение предпочтительно приводить при температуре от 2 до 10°С и скорости вращения шнэка от 4000 до 6000 об/мин.

В качестве ингибитора дрожжевых протеаз традиционно используется фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), однако может быть использован любой другой ингибитор или коктейль ингибиторов протеаз. Достаточно использовать ФМСФ в количестве 1 мМ, однако может быть использовано иное подходящее количество ингибитора протеаз, которое может быть установлено по результатам контроля содержания ИЛ-2 в препарате методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Отделение водонерастворимой фракции осуществляется с помощью центрифугирования. При этом практически все водорастворимые компоненты дрожжевых клеток переходят в надосадочную жидкость (супернатант), который отбрасывается, а в осадке остаются водонерастворимые компоненты. При центрифугировании удаляются протеазы, растворимые белки, РНК, хромосомная и плазмидная ДНК и т.п. Отделение водонерастворимой фракции может быть осуществлено и другими доступными методами, в частности фильтрацией.

Центрифугирование целесообразно осуществлять при пониженных температурах, например при 4°С, и скорости вращения ротора от 4000 до 10000 тысяч об/мин.

В предлагаемом способе можно осуществить дополнительную обработку водонерастворимой фракции для более полного удаления водорастворимых компонентов, а именно промыть ее буферным раствором. В качестве такого буферного раствора можно использовать 0,005 М трис-HCl буферный раствор, рН 7,2.

Препарат целесообразно высушить. Высушивание препарата осуществляют для обеспечения возможности его хранения до последующего использования. В высушенном препарате находятся остатки дрожжевых оболочек вместе с целевым белком. В данном способе исключены стадии экстракции целевого белка из водонерастворимой фракции, что является неожиданным решением в данной области техники, так как обычно масса усилий сосредоточена именно на этой стадии. Все сохранившиеся в препарате водонерастворимые компоненты не только не препятствуют проявлению препаратом при определеных условиях своих целевых свойств, но иногда также потенцируют эти свойства.

Обычно применяют сушку лиофилизацией, но можно также использовать любые другие подходящие методы.

В предлагаемом способе можно также осуществить дополнительную обработку водонерастворимой фракции ацетоном. Перед обработкой ацетоном водонерастворимую фракцию можно предварительно промыть буферным раствором. Обработка ацетоном заключается в следующем. Из водонерастворимой фракции готовят суспензию в воде и смешивают ее с ацетоном путем вливания суспензии в ацетон при перемешивании. Соотношение объемов водной суспензии и ацетона составляет от 1:5 до 1:20, преимущественно 1:10. Суспензия должна иметь достаточную густоту, примерно 60-80%, предпочтительно 75%. Обработку ацетоном проводят при температуре -20°С. Отделяют обезвоженные таким образом разрушенные дрожжевые клетки от ацетона путем вакуумной фильтрации либо центрифугированием при температуре от -10 до -30°С и оборотах от 2000 до 5000 об/мин. Полученный осадок разрушенных дрожжевых клеток можно промыть двух-десятикратным (предпочтительно, пятикратным) объемом ацетона и вновь отделить от ацетона вакуумной фильтрацией либо центрифугированием при температуре от -10 до -30°С и оборотах от 2000 до 5000 об/мин. Осадок сушат в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 20-30 часов. Ацетон обезвоживает препарат клеток, поэтому для получения сухого препарата не требуется лиофильная сушка.

В одном из воплощений способа препарат готовят в виде композиции высушенной водонерастворимой фракции разрушенных клеток и сухого солюбилизатора.

Солюбилизатор представляет собой вещество, которое способствует растворению в воде водонерастворимых веществ. Рекомбинантный ИЛ-2, синтезируемый внутри дрожжевой клетки, является водонерастворимым и связан с клеточной стенкой. Было обнаружено, что солюбилизатор также позволяет отделить ИЛ-2 от клеточной стенки. В качестве солюбилизатора могут быть использованы додецилсульфат натрия, лаурилсаркозинат, дезоксихолат, мочевина, Triton-Х100. Если в качестве солюбилизатора используется додецилсульфат натрия, его добавляют в количестве от 4,0 до 20,0% от массы сухой водонерастворимой фракции, предпочтительно 12%.

Когда препарат ИЛ-2 представлен в виде композиции высушенной водонерастворимой фракции разрушенных клеток и солюбилизатора, он может быть подготовлен к применению путем добавления воды. Достаточно к 100 мг препарата добавить от 1 до 10 мл, предпочтительно 5 мл, воды.

Сухой препарат может храниться при температуре от +4 до -20°С в течение 2 лет без добавления специальных стабилизирующих или консервирующих компонентов. Добавление воды к препарату должно осуществляться непосредственно перед употреблением.

При желании в препарат можно добавить стабилизаторы, антиоксиданты, наполнители или другие вещества, которые позволят придать препарату удобную фармацевтическую форму.

Таким образом, способ по изобретению может быть, в частности, осуществлен в одном из следующих вариантов: разрушение клеток дрожжей, отделение водонерастворимой фракции и ее высушивание; либо разрушение клеток дрожжей, отделение водонерастворимой фракции, промывание и высушивание этой фракции; либо разрушение клеток дрожжей, отделение водонерастворимой фракции, возможно, ее промывание, обработка ацетоном с удалением ацетоновой фракции и высушивание остатка; в любом из вариантов предпочтительно после высушивания приготовить препарат в виде композиции с сухим солюбилизатором.

Оценку биологической активности полученного препарата ИЛ-2 можно провести в международном стандартном тесте с культурой ИЛ-2-зависимых опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 (Hammerling U. et al. «Development and validation bioassay for interleukin-2». // J. Pharmaceut. & Biochem. Analysis, - 1992. - vol.10. - p.547. Gearing A.J.H. and Thorpe R. «The international standard for human interleukin-2. Calibration by international collaborative study.» // J.Immunol. Methods. - 1984. - vol.74. - p.39). Биологически активный рекомбинантный ИЛ-2 должен стимулировать пролиферацию этих клеток. Определение биологической активности проводят с использованием колориметрического метода с тетразолиевым красителем МТТ. Жизнеспособные клетки, стимулированные ИЛ-2, поглощают краситель и накапливают в цитоплазме нерастворимые в воде темно-синие кристаллы формазана (восстановленный МТТ). После удаления культуральной среды и полного растворения кристаллов в диметилсульфоксиде измеряют оптическую плотность полученного раствора на компьютеризованном фотометре при длине волны 530 и 690 нм. Темно-синее окрашивание раствора в пробах, содержащих ИЛ-2, должно быть зависимым от концентрации ИЛ-2, внесенного в культуральную среду. Сравнивая оптическую плотность пробы и стандарта активности ИЛ-2, определяют биологическую активность ИЛ-2 в инкубационной пробе.

Количество ИЛ-2 можно определить любым стандартным способом определения целевого белка, например методом электрофореза в полиакриламидном геле (Laemmli U. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". // Nature. - 1970. - 227. - p.680-685) или с применением иммуноферментного анализа (Gehman L.O. and Robb R.J. "An ELISA-based assay for quantitation of human interleukin-2." // J. Immunol. Methods. - 1984. - vol.74. - p.39), и др.

В общем, способ по изобретению альтернативно может включать в себя, состоять или по существу состоять из любых подходящих стадий, раскрытых в данном описании, и такой способ по изобретению может дополнительно или альтернативно исключать какую-либо стадию или объект, который использован в способе, известном из уровня техники, или который не является необходимым для достижения технического результата данного изобретения.

То же самое касается препарата по изобретению, который в принципе альтернативно может включать в себя, состоять или по существу состоять из любых подходящих компонентов, раскрытых в данном описании, и такой препарат по изобретению может дополнительно или альтернативно быть приготовлен так, что из него исключен какой-либо компонент, материал, ингредиент или объект, который использован в препарате, известном из уровня техники, или который не является необходимым для достижения технического результата данного изобретения.

Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают данное изобретение.

Пример 1. Получение препарата интерлейкина-2

1.1. Получение биомассы дрожжевого продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2)

Берут аликвоту штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-791, хранящуюся при -70°С в глицерине, и засевают в питательную среду Sd1, содержащую 50 мг/л гистидина. Состав среды Sd1; 0,67% Yeast nitrogen base ("Difco Laboratories", Detroit, Ml), 2% глюкозы. Соотношение массы клеток к объему среды Sd1 приблизительно составляет 0,2 г к 1 литру.

Культивирование в среде Sd1 ведут до значения оптической плотности OD ₆₀₀ от 2,5 до 4,0, предпочтительнее OD₆₀₀ =3,0.

По достижении требуемого значения оптической плотности переносят полученный таким образом инокулят в десятикратно больший объем среды Sd2 и ведут культивирование до значения OD ₆₀₀=7,5.

По окончании культивирования в среде Sd2 клетки отделяют от культуральной среды центрифугированием. Получают 10 г клеток из 1 л питательной среды. Все дальнейшие манипуляции проводят с клетками, а культуральную среду отбрасывают.

Состав питательной среды Sd2
Компонент среды	Количество на 1 л
Гистидин	0,05 г
(NH4 )-цитрат (безводный)	7,6 г
MgSO4	0,5 г
NaCl	0,1 г
CaCl2×6H 2O	0,1 г
KCl	1,5 г
КН 2PO4	0,03 г
Глюкоза	20 г
Н3ВО 3	0,5 мг
CuSO4×5H2O	0,04 мг
KI	0,1 мг
FeCl3 ×6Н2O	0,2 мг
MnSO4	0,4 мг
NaMoO4 ×2H2O	0,2 мг
ZnSO4×7H 2O	0,4 мг
Биотин	0,02 мг
Кальция пантотенат	2 мг
Фолиевая кислота	0,002 мг
Инозит	10 мг
Никотиновая кислота	0,4 мг
П-аминобензойная кислота	0,2 мг
Пиридоксина гидрохлорид	0,4 мг
Рибофлавин	0,2 мг
Тиамин	0,4 мг

1.2. Разрушение клеток дрожжевого продуцента ИЛ-2, в котором осуществлен синтез целевого белка (ИЛ-2)

Готовят 50%-ную суспензию клеток на буферном растворе А с добавлением ФМСФ (фенилметилсульфонилфторида) до конечной концентрации 1 mM. Раствор А представляет собой 0,005 М трис-HCl буферный раствор, рН 7,2. Проводят разрушение дрожжевых клеток на дезинтеграторе Dyno Mill при температуре от 2 до 10°С и скорости вращения шнека 3000 об/мин. Суспензию разрушенных клеток собирают в стаканы для центрифугирования.

1.3. Отделение водонерастворимой фракции

Суспензию, полученную на стадии 1.2., центрифугируют при температуре 4°С и скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 45 минут. Надосадочную жидкость отбрасывают.

1.4. Высушивание водонерастворимой фракции

Осадок сушат в апарате для лиофильной сушки в течение 24 часов. Из 1 грамма выращенных клеток получают 100 мг пластинчатого стекловидного и довольно хрупкого лиофилизата серовато-бежевого цвета.

Пример 2. Получение препарата интерлейкина-2

Осуществляют стадии 1.1.-1.3 из примера 1. Далее осадок промывают 0,005 М трис-HCl буферным раствором, рН 7,2, после чего вновь центрифугируют при температуре 4°С и скорости вращения ротора 10000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Далее осуществляют стадию, как описано в 1.4.

Пример 3. Получение препарата интерлейкина-2

Осуществляют стадии 1.1.-1.3 из примера 1. Осадок промывают 0,005 М трис-HCl буферным раствором, рН 7,2, после чего вновь центрифугируют при температуре 4°С и скорости вращения ротора 10000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают.

Готовят 75% суспензию полученного осадка разрушенных клеток на охлажденной до 4°С воде, например, к 1 г осадка добавляют 0,3 мл воды. Приготовление суспензии проводят в ледяной бане.

Для проведения дальнейших манипуляций всю посуду и ацетон охлаждают до температуры -10 до -30°С. Соотношение объемов суспензии и ацетона составляет 1:10, например, для 1 мл суспензии требуется 10 мл ацетона.

Суспензию разрушенных дрожжевых клеток медленно вливают в ацетон и гомогенизируют в течение 5 минут.

Затем отделяют разрушенные дрожжевые клетки от ацетона фильтрованием при температуре от -10 до -30°С.

Промывают полученный осадок разрушенных дрожжевых клеток пятикратным объемом ацетона и вновь подвергают фильтрованию при температуре от -10 до -30°С.

Осадок переносят в эмалированную емкость и высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 18 часов.

В результате из 10 г сырых клеток дрожжей получают 1 г высушенного осадка разрушенных дрожжевых клеток в виде тонкого однородного беловато-бежевого порошка.

Пример 4. Добавление солюбилизатора

К 1 г порошка, полученного в примере 3, добавляют 120 мг додецилсульфата натрия (ДСН) и перемешивают. Препарат, полученный на этой стадии, для применения требует добавления воды.

Пример 5. Добавление воды

К 100 мг препарата, полученного в примере 4, добавляют 5 мл воды и перемешивают до получения суспензии.

Пример 6. Подготовка суспензии к определению количества и активности ИЛ-2

Суспензию, полученную в примере 5, центрифугируют в течение 5 минут при 10000 об/мин и отбирают супернатант, т.е. экстракт. Осадок отбрасывают. Для анализа полученного экстракта на специфическую активность и количественное содержание рИЛ-2 отбирают его аликвоту, например 10 мкл.

Наличие и количество ИЛ-2 в полученном экстракте подтверждают методом электрофореза, а его биологическую активность - в стандартном тесте на линии клеток CTLL-2.

Пример 7. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

Помимо пробы экстракта, для определения концентрации ИЛ-2 в гель также вносят тест-растворы бычьего сывороточного альбумина для построения калибровочной прямой в количествах 1, 2, 4, 6 и 8 мкг в лунку, а также маркеры молекулярных масс белков 94, 67, 43, 30, 20.1 и 14.4 кДа.

Анализ электрофореграммы подтверждает присутствие в пробе ИЛ-2 с молекулярной массой 15,3 кДа (по сравнению с маркерами молекулярных масс белков) и позволяет определить количество ИЛ-2, используя калибровочную прямую по бычьему сывороточному альбумину.

Пример 8. Биологическая активность полученного препарата ИЛ-2

В качестве стандарта для определения активности испытываемого ИЛ-2 в экстракте, полученном в примере 6, используют откалиброванный по международному эталонному реагенту образец ИЛ-2, хранящийся при температуре -70°С и размораживаемый только один раз.

Во все лунки со стандартом и пробами, содержащими 10 мкл экстракта, полученного в примере 6, добавляют по 100 мкл отмытых средой RPMI 1640 клеток CTLL-2 (1×10⁵ живых клеток в мл) и закрывают планшет неплотной крышкой. Инкубируют при 37°С в течение 42 часов. В пробах, содержащих ИЛ-2, имеет место пролиферация клеток CTLL-2. После инкубации в каждую лунку вносят 10 мкл раствора МТТ и инкубируют еще 6 часов. В жизнеспособных клетках, стимулированных ИЛ-2, образуются нерастворимые в воде темно-синие кристаллы формазана.

Планшеты центрифугируют в течение 5 мин при 2000 об/мин и удаляют супернатант из лунок резким стряхиванием жидкости. В каждую лунку добавляют по 100 мкл ДМСО и встряхивают планшеты на шейкере до полного растворения кристаллов формазана (около 15 мин).

На основании спектрофотометрических данных для стандартного и испытуемых образцов вычисляют активность ИЛ-2 в экстракте, рассчитывают его активность на 100 мг порошка, которая составляет в среднем 4-5 млн.

Пример 9. Лечение пищевой аллергии препаратом из примера 3

Препарат из примера 4 в количестве 100 мг разбавляли 5 мл воды и давали пациенту, страдающему аллергией на зеленое яблоко. Курс лечения составлял 5 дней по схеме: контакт с аллергеном производился через день, при этом в момент появления аллергической симптоматики пациент принимал композицию по изобретению. Контакт с зеленым яблоком и прием препарата по изобретению был осуществлен 3 раза.

На 15-й день после начала испытания PRICK-тест показал отсутствие реакции на зеленое яблоко. Контроль через 6 месяцев дал те же результаты.

Таким образом, препарат, полученный способом по изобретению, оказался успешным при терапии заболевания, которое до его создания не удавалось излечить полностью, так как все известные до сих пор препараты предлагали лишь симптоматическое лечение. Лечение пищевой аллергии некоторыми известными до сих пор препаратами на основе рекомбинантного ИЛ-2 ранее также не осуществлялось, так как предполагалось, что оно либо будет неэффективным, либо побочные эффекты, свойственные этим препаратам, превысят ожидаемую пользу.

Пример 10. Монотерапия ВИЧ-инфекции с использованием препарата из примера 4

Первые два курса проведены с препаратом «Ронколейкин^® сухой для инъекций» (Биотех, Россия), представляющим собой очищенный белок, вторые два курса - с препаратом, полученным способом по изобретению, принимаемым перорально.

Динамика CD4+ и вирусной нагрузки ВИЧ
Показатель	До начала лечения	После двух курсов Ронколейкин ®	После 3 курса препарат по изобретению	После 4 курса препарат по изобретению
CD4+(ед/мкл)	418	480	756	1066
ВИЧ (копий/мл)	41000	20000	1500	950

Динамика как первого этапа лечения (с Ронколейкином^®), так и второго (с препаратом по изобретению) является хорошей.

Существенное улучшение по динамике содержания CD4+ при применении препарата, полученного способом по изобретению, по сравнению с чистым ИЛ-2 для инъекций может быть вызвано тем, что препарат по изобретению обладает свойством не только усиливать пролиферацию клеток иммунной системы, но также обладает способностью их активировать, поскольку именно отсутствие фактора активации иногда приводит к отсутствию эффекта от введения ИЛ-2.

Таким образом, препарат, полученный способом по изобретению, наряду с биологически активным интерлейкином-2 содержит также набор веществ адъювантного типа, которые позволяют использовать этот препарат при неудаче лечения с помощью чистого ИЛ-2.

При этом препарат получен технологичным способом, способ его получения не требует чрезмерных затрат времени и особого оборудования. Полученный препарат активен при пероральном введении.